发明内容
本发明的目的为提供一种治疗肝病的药物组合物,它包含免疫调节剂与香豆草醚类化合物。
本发明的另一目的是提供一种药物组合物在制备治疗肝病的药物中的用途。
本发明的另一目的是提供一种治疗肝病的药盒。
本发明的另一目的是提供一种化合物在制备减轻肝病治疗药物的毒副作用的制剂中的用途
在本发明的第一方面,提供了一种治疗肝病的药物组合物,它含有以下组分:
(a)免疫调节剂,所述免疫调节剂选自干扰素;
(b)式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯,或者含有该化合物的植物提取物,
式中,
R1代表氢原子、羟基、甲氧基,
R2代表氢原子、C1-8烷基,优选具有1~4个碳原子的直链或支链的烷基,最优选甲基,
R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基;
(c)药学上可接受的载体;
其中,免疫调节剂和香豆草醚类化合物占组合物总重量的0.001-99.9%,并且所含的免疫调节剂与香豆草醚类化合物的摩尔比为1:1×108-1:1×104,较佳地为1:5×107-1:5×104,更佳地为1:1×107-1:1×105。
在另一优选例中,所述的免疫调节剂选自下组:IFN-α、IFN-β、IFN-γ。
在另一优选例中,所述的药学上可接受的盐或酯是式I化合物与选自下组的酸所形成的盐或酯:氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸。
在另一优选例中,所述的药学上可接受的盐是式I化合物与选自下组的碱金属或碱土金属所形成的盐:钠、钾、钙、镁等。
在另一优选例中,所述的式I化合物或所述的提取物是从菊科植物中提取的。
在另一优选例中,所述的菊科植物选自醴肠(Eclipta prostrate Linn)、蟛蜞菊(Wedelia chinensis)、旱莲草(Eclipta alba),或其组合。
在另一优选例中,所述的式I化合物是具有式II的蟛蜞菊内酯或其药学上可接受的盐或酯:
在另一优选例中,所述的肝病选自下组:病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌。
在另一优选例中,所述的病毒性肝炎选自下组(按病原学分类):甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎。
在另一优选例中,所述的自身免疫性肝病选自下组:自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎。
在另一优选例中,所述的药物组合物的剂型选自下组:注射剂、注射用无菌粉末、片剂、胶囊、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、栓剂。
在本发明的第二方面,提供了一种组合物在制备治疗肝病的药物中的用途,所述的组合物含有:
(a)免疫调节剂,所述免疫调节剂选自干扰素;
(b)式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯,或者含有该化合物的植物提取物,
式中,
R1代表氢原子、羟基、甲氧基,
R2代表氢原子、C1-8烷基,优选具有1~4个碳原子的直链或支链的烷基,最优选甲基,
R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基;
(c)药学上可接受的载体;
其中,免疫调节剂和香豆草醚类化合物占组合物总重量的0.001-99.9%,并且所述免疫调节剂与所述香豆草醚类化合物的摩尔比为1:1×108-1:1×104,较佳地为1:5×107-1:5×104,更佳地为1:1×107-1:1×105,所述的组合物用于制备治疗以下肝病的药物:病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌。
在另一优选例中,所述的免疫调节剂选自下组:IFN-α、IFN-β、IFN-γ。
在另一优选例中,所述的药学上可接受的盐或酯是式I化合物与选自下组的酸所形成的盐或酯:氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸。
在另一优选例中,所述的药学上可接受的盐是式I化合物与选自下组的碱金属或碱土金属所形成的盐:钠、钾、钙、镁等。
在另一优选例中,所述的式I化合物或所述的提取物是从菊科植物中提取的。
在另一优选例中,所述的菊科植物选自醴肠(Eclipta prostrate Linn)、蟛蜞菊(Wedelia chinensis)、旱莲草(Eclipta alba),或其组合。
在另一优选例中,所述的式I化合物是具有式II的蟛蜞菊内酯或其药学上可接受的盐或酯:
在另一优选例中,所述的病毒性肝炎选自下组(按病原学分类):甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎。
在另一优选例中,所述的自身免疫性肝病选自下组:自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎。
在另一优选例中,所述的药物组合物的剂型选自下组:注射剂、注射用无菌粉末、片剂、胶囊、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、栓剂。
本发明的第三方面提供了一种治疗肝病的药盒,其中,含有以下成分:
(a)第一剂,所述第一剂中含有干扰素;
(b)第二剂,所述第二剂中含有香豆草醚类化合物,所述香豆草醚类化合物为式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯,或者含该化合物的植物提取物,
式中,
R1代表氢原子、羟基、甲氧基,
R2代表氢原子、C1-8烷基,优选具有1~4个碳原子的直链或支链的烷基,
R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基。
本发明的第四方面提供了一种化合物的用途,所述化合物选自式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯,或者含有该化合物的植物提取物,
其中,所述用途为所述化合物在制备减轻肝病治疗药物的毒副作用的制剂中的用途。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究发现,免疫调节剂(如IFN-α、IFN-β、IFN-γ)与某种植物提取物(如香豆草醚类化合物)一起施用时,对于病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌等肝病的治疗可发挥协同作用,可以增加疗效,并可以减少药物用量。
组合物
本发明的药物组合物含有以下组分:
(a)免疫调节剂,所述免疫调节剂选自干扰素;
(b)式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯,或者含有该化合物的植物提取物,
式中,
R1代表氢原子、羟基、甲氧基,
R2代表氢原子、C1-8烷基,优选具有1~4个碳原子的直链或支链的烷基,最优选甲基,
R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基;
(c)药学上可接受的载体,
其中,免疫调节剂和香豆草醚类化合物占组合物总重量的0.001-99.9%,并且免疫调节剂与香豆草醚类化合物的摩尔比为1:1×108-1:1×104,较佳地为1:5×107-1:5×104,更佳地为1:1×107--1:1×105。
在本发明中,优选的免疫调节剂选自下组:IFN-α、IFN-β、IFN-γ。
在本发明中,优选的香豆草醚类化合物为具有式II的蟛蜞菊内酯或其药学上可接受的盐或酯:
本发明的这些治疗肝病的药物组合物中,所含的免疫调节剂与香豆草醚类化合物的摩尔比为1:1×108-1:1×104,较佳地为1:5×107-1:5×104,更佳地为1:1×107-1:1×105。所述比例可随所选的有效成分的种类以及所要治疗的疾病及症状的程度等适量增减。
本发明的药物组合物可以是普通型(即活性成分的浓度适合于直接使用),也可以是浓缩型(即活性成分的浓度需经稀释后才可使用)。在本发明的组合物中所含的有效成分,即免疫调节剂与香豆草醚类化合物为组合物总重量的0.001-99.9wt%,较佳地为0.01-90wt%,更佳地为0.05-50wt%,最佳地为0.1-20wt%。可根据所选的有效成分的种类以及所要治疗的疾病及症状的程度等适当增减。
用途
本发明的药物组合物可用于治疗肝病,代表性的例子包括(但并不限于):病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌。
所用的活性成分的有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。对大部分大型哺乳动物而言,每天施以有效成分的总剂量(即免疫调节剂和香豆草醚类化合物的总重量)约为0.01-1000mg。通常,成人临床给药量的范围为0.01-200mg/日,优选为0.05-100mg/日。
在使用本发明药物组合物治疗肝病时,还可与其他治疗剂联用。例如与选自下组的一种或多种辅助活性成分联用:
抗病毒药物:利巴韦林、单磷酸阿糖腺苷、拉米夫定、阿昔洛韦、泛昔洛韦、胸腺肽;
免疫抑制剂:强的松、甲基强的松龙、雷公藤、硫唑嘌呤、环孢素、他克莫司(FK506)、雷帕霉素、霉酚酸脂、咪唑立宾;
抗肝纤维化药物:维甲酸、S-腺苷甲硫氨酸、秋水仙碱、己酮可可碱;
护肝药物:硫普罗宁、葡醛酸钠、还原型谷胱甘肽、甘草酸二胺、门冬氨酸鸟氨酸。
本发明还包括治疗肝病的方法,它包括给哺乳动物施用药物有效量的本发明药物组合物。
通常,当本发明组合物用于上述用途时,它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型,如片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、口服液、醑剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、注射剂、注射用无菌粉末、栓剂等。
本发明的化合物可经过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。
上述剂型中可经口服给药的剂型为:片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、醑剂。固态载体包括:淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖、白陶土、微粉硅胶、滑石粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮。而液态载体包括:无菌水、乙醇、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制备药物组合物的过程中通常使用的佐剂包括:调味剂、着色剂、防腐剂(如羟苯烷基丁酯、苯甲酸钠、山梨酸)和抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯)。
上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括:注射剂、注射用无菌粉末,它们是将药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。溶剂包括:无菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外,还需加入抑菌剂(如苯甲醇、羟苯丁酯、硫柳汞)、等渗调节剂(如氯化钠、葡萄糖)、助悬剂(如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素)、增溶剂(吐温-80、卵磷酯)、抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠)和填充剂(如乳糖、甘露醇)。
从易于制备和给药的立场看,优选的药物组合物是固态组合物,尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。优选口服给药。
在本发明中,除了将免疫调节剂和香豆草醚类化合物配制在一起形成组合物之外,还可以将两者单独配制成药物组合物,然后将两种组合物制剂置于同一药盒中,形成含有免疫调节剂组合物和香豆草醚类化合物组合物两种组合物的药盒。使用时,可以将这种药盒中的两种组合物分别(同时或先后)施用,或者混合在一起施用。
本发明的优点在于:
1、强协同效应。本发明的治疗肝病的药物组合物,与单独的免疫调节剂或香豆草醚类化合物相比,对于病毒性肝炎、自身免疫性肝病、肝硬化、肝癌的治疗具有较强的协同作用。
2、显著降低免疫调节剂,尤其是干扰素的用量,从而减少毒副作用。
以下结合具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则所有的百分比和份数均按重量计。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1旱莲草(Eclipta alba)中提取化合物蟛蜞菊内酯
(1)浸泡及过滤
旱莲草全草300kg,完全浸入0.75吨乙醇(浓度95%)中→浸泡过夜(10小时)→粗滤,从而除去全草残渣(保留)→净滤(抽滤)或高速离心(10000rpm,10分钟),从而除去灰尘及细渣→绿色澄清滤液。
(2)乙醇回收
蒸馏回收乙醇,温度不超过60℃→每次回馏2小时,将反应釜中的浸膏移出至收集桶中(浸膏呈深墨绿色,略粘稠状)→重复上述步骤,直至回收全部乙醇。
(3)二次浸泡及回馏
回收乙醇0.75吨,重新浸泡全草残渣→浸泡过夜,粗滤、净滤及蒸馏回收要求同前。得到浸膏。
(4)乙酸乙酯萃取
取上述浸膏50-80℃(更佳地60-70℃)加热水振荡混匀,热水加量为浸膏体积的50倍,抽滤得到热水相液。按照水相:酯相体积比为1:1的比例加入萃取用的乙酸乙酯,充分混匀震荡后,静置,待水相/酯相分层。移出乙酸乙酯层,50℃真空减压蒸馏至干燥,加入少量乙醇溶解,置于烧杯中于4℃保存过夜,底部出现沉淀。减压抽滤获得沉淀,50℃烘箱干燥,得到粗品。
(5)产品的分离精制
取粗品5g,拌样于10g200~300目硅胶,进行硅胶柱层析(200g,200—300目),用石油醚-丙酮梯度洗脱,每100mL收集一次,分别得到不同极性组份,合并所需的组份(TLC石油醚-丙酮1:1,Rf=1/3)。将合并的组份浓缩后,再拌样于硅胶进行柱层析,用二氯甲烷-丙酮梯度洗脱,每50mL收集一次,分别得到不同极性组份,合并所需的组份(TLC二氯甲烷-丙酮3:1,Rf=1/6)。将合并的组份浓缩后,再拌样于硅胶进行柱层析,用甲苯-丙酮-甲酸梯度洗脱,每50mL收集一次,分别得到不同极性组份,合并所需的组份(TLC甲苯-丙酮-甲酸10:10:1,Rf=1/2)。将合并的组份浓缩后,再拌样于硅胶进行柱层析,用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱,每25mL收集一次,分别得到不同极性组份,合并所需的组份(TLC二氯甲烷-甲醇20:1,Rf=1/6)。得到纯度>90%的产品,收率约1%。
(6)标准品精制
将纯度>90%的样品30mg溶于70%甲醇中,用Lichroprep RP-18(40~63μ)柱进行反相洗脱,用TLC检测,收集70%洗脱下来的样品,合并得到纯度>98%的标准品。收率约90%。标准品的性状、分子式、熔点和IR,EIMS,1HNMR,13CNMR峰的归属如下:
灰白色粉末,分子式:C16H10O7,mp315℃(分解),UVλmax(MeOH,nm):211.5(4.65),247(4.40),304(4.01)(sh),350(4.48)。IR(KBr)cm-13300,1715,1640,1620,1445,1415,1320,1205,1155,1070。EIMS m/z(%):314(M+,100),313(22),299([M-CH3],28),285(5),271([M-CH3-CO],8),243([M-CH3-CO-CO],28),187(17),69(42)。1HNMR(δ):7.23(s),7.14(s),6.58(d,J=2.3Hz),6.42(d,J=2.3Hz),3.90(s)
13CNMR(δ):158.0(C-1),101.1(C-2),159.6(C-3),95.6(C-4),99.3(C-5),161.1(C-6),95.0(C-7),155.5(C-8),155.0(C-9),104.7(C-10),145.2(C-11),144.3(C-12),99.0(C-13),114.0(C-14),148.7(C-15),55.7(C-16)。
结果表明,获得的化合物是具有式II的蟛蜞菊内酯:
将通过上述方法提取得到的蟛蜞菊内酯(以下称AP-1),用于以下各实施例中。
实施例2蟛蜞菊内酯增强IFN-γ细胞因子的活力
JAK/STAT信号传导系统是IFN和I型细胞因子广泛采用的信号传导通路。这些细胞因子首先激活JAK激酶,而后磷酸化并且激活STAT蛋白,活化的STAT蛋白发生核转位,对基因的表达进行调控。
实验材料:
1)细胞株:稳定转染了STAT1-luciferase报告基因质粒的HepG2细胞
2)待测药物:AP-1,IFN-γ(Sigma,Cat.NO.TO157)
3)荧光素酶检测试剂盒(Promega,Cat.NO.E4550)
实验方法:
1)将生长状态良好的HepG2细胞用胰酶消化,以DMEM培养基重悬细胞并调整细胞浓度至1×106个/ml,取1ml细胞悬液接种于96孔板内,在37℃、5%CO2培养箱中培养过夜,直至细胞完全贴壁;
2)当细胞生长至密度为60-70%时,将其随机分为以下5组:
a、阴性对照组(图中简称con),不加IFN-γ和AP-1;
b、DMSO组,加入DMSO至终浓度为0.5%;
c、AP-1组,加入AP-1至终浓度为50μM,孵育5小时;
d、IFN-γ组,加入IFN-γ至终浓度为100IU/ml,设5个时间梯度,分别为0、2、5、10、24小时;
e、联合用药组(图中简称AP-1+IFN-γ),加入AP-1至终浓度为50μM,再加入终浓度为100IU/ml的IFN-γ,并设5个时间梯度,分别为0、2、5、10、24小时。
3)取出96孔板,小心吸弃培养基,用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3次;
4)每孔加入100μl1x荧光素酶裂解液(CCLR),轻轻摇动10-15分钟,待细胞完全裂解后将其吸入1.5ml的eppendorf管中,漩涡震荡1分钟,13200rpm离心2分钟,将上清液吸入另一离心管中;
5)在96孔检测板中加入20μl细胞裂解液和100μl荧光素酶底物,轻轻混匀,于Luminometer(TECAN GENion)中检测。
以上实验重复3组细胞,将所得结果用SPSS统计软件进行one-way方差分析。
实验结果:见图1、图2。
结果表明,蟛蜞菊内酯能进一步增强由IFN-γ诱导的JAK/STAT信号传导通路的活化,联合用药组与AP-1组、IFN-γ组相比具有显著性差异(p<0.01),提示蟛蜞菊内酯可能通过激活JAK/STAT信号传导通路,调控某些炎症相关基因的表达,从而发挥肝保护作用。另外,由图可知蟛蜞菊内酯对IFN-γ的活力的增强作用呈时间依赖性。
实施例3AP-1与IFN-α合用对ConA诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用
1992年,Tiegs等成功地应用刀豆蛋白A(ConA)诱发了小鼠特异性肝损伤,近年来其逐渐发展成为研究免疫细胞介导的肝损害的主要实验模型。
刀豆蛋白(Concanavalin,ConA是植物凝集素,具有促有丝分裂作用,作为有丝分裂原刺激T淋巴细胞表达多种细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2介导肝损伤,ConA诱导T淋巴细胞依赖性肝损伤病理与人类自身免疫性肝病、急慢性病毒性肝炎相似,并能被免疫抑制剂所缓解。
给予ConA后8小时,即见血浆ALT、AST、LDH明显升高,肝内大量T淋巴细胞浸润,部分汇管区淋巴细胞浸润呈“套袖”样改变,大量肝细胞核破裂、出现凋亡小体和脂肪变性等。这些均证明,T淋巴细胞与本模型发病机制密切相关。而自身免疫性肝病、病毒性肝炎等所致的肝损害,均与免疫细胞的活化密切相关。
实验动物:雄性SPF级KM小鼠,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,体重为18-22g,SPF级动物房饲养,12h光照/12h黑暗,自由摄取饲料和水。
实验方法:
1.造模方法:小鼠尾静脉注射剂量为20mg/kg的ConA;
2.给药情况:小鼠禁食不禁水13小时后,将其分别随机分为5组(每组10只):(1)正常组,(2)模型组,(1)(2)组小鼠腹腔注射体积为0.1ml/10g的蒸馏水;(3)IFN-α组,小鼠腹腔注射剂量为2.5×106IU/kg的rhIFN-α2a(沈阳三生制药有限公司);(4)AP-1组,小鼠灌胃给药,剂量为10mg/kg的AP-1;(5)联合用药组,小鼠腹腔注射剂量为5×105IU/kg的rhIFN-α2a,同时灌胃剂量为10mg/kg的AP-1。以上各组,分别于造模前5小时、1小时给药。
本实验通过ConA造模前提前两次给药(分别为5小时和1小时),从而使药物在血液中的浓度明显升高,达到治疗有效量。
造模8小时后摘眼球取血,4℃静置30分钟,3500rpm离心8分钟。取血清,用赖氏法通过A492间接测定血清中的ALT含量。
计算抑制率:
抑制率=(模型组A492—实验组A492)/模型组A492×100%。
计算每组平均值,用SPSS统计软件进行单因素方差分析,以及进行两两组间比较。
实验结果:见表1。
表1AP-1与IFN-α合用对ConA诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用
组别 | 性别 | 数量(只) | 平均体重(g) | 吸光度A492(X±SD) | 抑制率(%) |
(1)正常组 | 雄 | 10 | 19.35 | 0.009±0.001 | - |
(2)模型组 | 雄 | 10 | 18.73 | 0.112±0.018△ | - |
(3)IFN-α组 | 雄 | 10 | 18.65 | 0.078±0.004* | 30.36% |
(4)AP-1组 | 雄 | 10 | 18.78 | 0.069±0.013* | 38.39% |
(5)联合用药组 | 雄 | 10 | 19.02 | 0.029±0.003** | 74.11% |
*表示p<0.05,与模型组相比有显著性差异;
△表示p<0.05,与正常组相比有显著性差异;
**表示p<0.01,与模型组相比具有极显著差异。
结果表明,模型组小鼠血清中ALT含量(0.112±0.018)与正常组(0.009±0.001)相比具有显著差异,表明造模成功;(3)、(4)、(5)组小鼠血清中ALT含量明显低于模型组,差异有显著性,抑制率分别为30.36%、38.39%和74.11%。AP-1与IFN-α联合用药可明显降低小鼠血清中ALT的含量,同时还可减少IFN-α的剂量、降低其副作用,对免疫性肝病具有预防性的保护作用。
实施例4AP-1与IFN-α合用体外抗乙型肝炎病毒的药效研究
实验材料:
1.细胞株:HBV基因转染的人肝癌细胞系(HepG22.2.15),购自武汉大学细胞保藏中心。
2.试剂:IFN-α2b,购自先灵葆雅公司;MTT、ELISA试剂盒,购自北京华美生物工程公司。
实验方法:
1.细胞培养及药物作用细胞生长至对数生长期后,用0.25%胰酶消化细胞,调整细胞浓度至1×105/ml。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中,每孔100μl,放置细胞培养箱(37℃,5%)中培养4d。将细胞分为4组:1)IFN-α组,每孔加入一定量的IFN-α,至终浓度为500IU/ml;2)AP-1组,每孔加入100μl AP-1,至终浓度为0.5μg/ml;3)联合用药组,每孔加入IFN-α以及AP-1,至终浓度分别为500IU/ml和0.5μg/ml;4)空白对照组,加入等量的细胞培养基。以上各组均设6个复孔。
2.MTT比色分析法检测细胞吸光度值培养箱中培养66h后,每孔加入5mg/ml的MTT20μl,37℃放置4h。每孔加入三联液(5%SDS,10mM HCl,5%异丙醇),37℃过夜。490nm测吸光度值(OD)。对OD值进行t检验,并计算药物对细胞生长的抑制率:抑制率=(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100%。
3.HBsAg、HBeAg的检测用酶联免疫吸附试验(ELISA法)分别检测每孔HBsAg、HBeAg的P/N值,操作按试剂盒说明书进行,根据公式计算抑制率:药物对HBsAg或HBeAg的抑制率=(对照组平均P/N-给药组平均P/N)/对照组平均P/N×100%。
4.统计学处理采用SPSS10.0软件,配对t检验。
实验结果:见表2、3、4。
表2药物对HepG22.2.15细胞生长的抑制作用(Mean±SD,n=6)
组别 | 剂量 | OD值 | 抑制率(%) |
空白对照组 | - | 1.38±0.05 | - |
IFN-α组 | 500IU/ml | 0.87±0.04* | 36.96 |
AP-1组 | 0.5μg/ml | 0.81±0.16* | 41.30 |
联合用药组 | 500IU/ml+0.5μg/ml | 0.33±0.08** | 76.09 |
*表示p<0.05,与空白对照组相比,有显著性差异;
**表示p<0.01,与空白对照组相比,有极显著差异。
表3药物对HBsAg表达的抑制作用(Mean±SD,n=6)
组别 | 剂量 | OD值 | 抑制率(%) |
空白对照组 | - | 0.12±0.01 | - |
IFN-α组 | 500IU/ml | 0.08±0.01* | 33.33 |
AP-1组 | 0.5μg/ml | 0.07±0.01* | 41.67 |
联合用药组 | 500IU/ml+0.5μg/ml | 0.03±0.01** | 75.00 |
*表示p<0.05,与空白对照组相比,有显著性差异;
**表示p<0.01,与空白对照组相比,有极显著差异。
表4药物对HBeAg表达的抑制作用(Mean±SD,n=6)
组别 | 剂量 | OD值 | 抑制率(%) |
空白对照组 | - | 0.68±0.08 | - |
IFN-α组 | 500IU/ml | 0.42±0.09* | 38.24 |
AP-1组 | 0.5μg/ml | 0.45±0.09* | 33.82 |
联合用药组 | 500IU/ml+0.5μg/ml | 0.22±0.06** | 67.65 |
*表示p<0.05,与空白对照组相比,有显著性差异;
**表示p<0.01,与空白对照组相比,有极显著差异。
结果表明,由表2可见,IFN-α、AP-1组以及联合用药组均可抑制HepG22.2.15细胞的生长,且联合用药组抑制效果尤为显著,与空白对照组相比,具有极显著性差异(p<0.01)。
由表3、4可见,IFN-α、AP-1组以及联合用药组均能抑制HepG22.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg,与空白对照组相比,差异具有显著性。
因此,本实验结果提示,联合用药能较好的抑制HepG22.2.15细胞的生长以及病毒颗粒的产生和分泌。
实施例5AP-1与IFN-γ合用抗四氯化碳诱导的肝纤维化
实验动物:纯系SD雄性大鼠50只,体重180-210g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,SPF级动物房饲养,普通颗粒饲料及葵花籽喂养。
实验试剂:AST、ALT试剂盒,购自中生北控生物科技股份有限公司;PLD、SA试剂盒,购自上海海军医学研究所生物技术中心。
实验方法:
1.造模方法:每只大鼠按0.3ml/100g体重给予40%四氯化碳橄榄油溶液,双下肢轮流皮下注射,每周2次,连续12周。
2.给药情况:将大鼠分别随机分为5组(每组10只):(1)正常组,(2)模型组,大鼠腹腔注射体积为0.1ml/10g的蒸馏水;(3)IFN-γ组,大鼠每天腹腔注射剂量为50000IU的大鼠重组IFN-γ(R&D公司,1μg=10000IU);(4)AP-1组,大鼠灌胃给药,每天剂量为10mg/kg的AP-1;(5)联合用药组,大鼠每天腹腔注射剂量为10000IU的大鼠重组IFN-γ,同时灌胃剂量为10mg/kg的AP-1。以上各组,分别于造模6周后开始给药。
造模12周后摘眼球取血,4℃静置30分钟,3500rpm离心8分钟。取血清,测定血清中的天门冬氨酸氨基酸转移酶(ALT)、丙氨酸氨基转移酶(AST)、唾液酸(SA)、脯氨酸肽酶(PLD)含量(按试剂盒说明书进行操作)。
处死大鼠,取肝脏称重,并计算肝指数。肝指数=肝重量/体重。
实验结果:见表5、6、7。
表5药物对大鼠肝指数的影响(Mean±SD,n=10)
组别 | 数量(只) | 体重(g) | 肝重(g) | 肝指数(%) |
(1)正常组 | 10 | 207.26±29.66 | 9.27±3.86 | 4.47 |
(2)模型组 | 10 | 182.35±36.22 | 13.58±3.03 | 7.45△ |
(3)IFN-γ组 | 10 | 176.27±25.68 | 12.76±2.66 | 7.24 |
(4)AP-1组 | 10 | 198.36±32.89 | 10.35±3.38 | 5.22* |
(5)联合用药组 | 10 | 202.56±21.12 | 9.68±3.25 | 4.78** |
*表示p<0.05,与模型组相比,有显著性差异;
△表示p<0.05,与正常组相比,有显著性差异;
**表示p<0.01,与模型组相比,有极显著性差异。
表6药物对大鼠血清AST、ALT含量的影响(Mean±SD,n=10)
组别 | 数量(只) | ALT(U) | AST(U) |
(1)正常组 | 10 | 50.87±11.48 | 217.89±42.37 |
(2)模型组 | 10 | 181.26±21.38△ | 523.65±61.26△ |
(3)IFN-γ组 | 10 | 109.56±8.44* | 419.44±58.77* |
(4)AP-1组 | 10 | 126.78±27.63* | 399.58±48.26* |
(5)联合用药组 | 10 | 72.34±15.83** | 271.28±40.66** |
*表示p<0.05,与模型组相比,有显著性差异;
△表示p<0.05,与正常组相比,有显著性差异;
**表示p<0.01,与模型组相比,有极显著性差异。
表7药物对大鼠血清SA、PLD含量的影响(Mean±SD,n=10)
组别 | 数量(只) | SA(U) | PLD(μg/ml) |
(1)正常组 | 10 | 583.85±28.22 | 5291.66±504.57 |
(2)模型组 | 10 | 896.34±68.78△ | 7877.26±866.35△ |
(3)IFN-γ组 | 10 | 735.69±83.48* | 6817.38±790.50* |
(4)AP-1组 | 10 | 710.23±57.68* | 6599.34±1925.33* |
(5)联合用药组 | 10 | 599.34±70.21** | 5493.89±766.24** |
*表示p<0.05,与模型组相比,有显著性差异;
△表示p<0.05,与正常组相比,有显著性差异;
**表示p<0.01,与模型组相比,有极显著差异。
结果表明,(1)(5)组大鼠毛发有光泽,活动多,精神状态好,食欲佳;而(2)(3)(4)组大鼠毛发凌乱无光泽,食欲差,精神萎靡活动少,对外界刺激反应慢。说明联合用药组能显著降低IFN-γ的毒副作用,改善大鼠的毛发及精神状态。
由表5可见,与模型组相比,(3)(4)(5)组大鼠的肝指数均有所下降,且(5)组尤为突出。说明联合用药能够显著降低肝硬化大鼠的肝指数。
由表6可见,模型组大鼠血清AST、ALT水平与正常组相比显著升高,p<0.05。(3)(4)(5)组药物可显著降低大鼠血清中的AST、ALT水平,联合用药效果尤为显著(p<0.01)。
PLD和SA含量增加是肝纤维细胞增殖旺盛的重要标志。由表7可知,模型组大鼠血清SA、PLD含量较正常组显著升高,p<0.05。(3)(4)(5)组药物对血清SA、PLD水平均有降低作用,差异具有显著性,p<0.05。其中,联合用药效果尤为显著,p<0.01。
实施例6片剂的制备
利用常规技术,混合以下组分,然后直接压片,制备片剂形式的药物组合物,其配方如下:
实施例7注射剂的制备
①将尼泊金加于500ml注射用水中,加入羧甲基纤维素钠,混匀,浸泡过夜(24小时),全溶后,用210目尼龙布过滤;
②将溶液①水浴加热,加入吐温-80,混匀;
③至水浴沸腾,加入蟛蜞菊内酯,混匀,继续加热30分钟,取出冷却至室温;
④另将IFN-α冻干粉加注射用水适量进行溶解;
⑤将③和④溶液混合,G6垂熔玻璃漏斗过滤,加无菌注射用水至1000ml,混匀,灌封,即得。
实施例8药盒的制备
药盒的组分:
第一剂:蟛蜞菊内酯片剂
按照以下处方制备蟛蜞菊内酯片剂100片
第二剂:干扰素片剂
按照以下处方制备干扰素片剂100片
将制得的蟛蜞菊内酯片剂100片以及干扰素片剂100片放置在同一药盒中,使用时可按照1:1(片数比)的配比服用,两剂可同时服用,也可以先后服用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。