CN101307082A - 半乳糖-青蒿素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种半乳糖一青蒿素及其制备方法，有以下步骤：(1)制备二氢青蒿素；(2)UDP－半乳糖的制备；(3)半乳糖－青蒿素的制备。本发明利用糖基转移酶催化青蒿素的糖基化反应，其合成过程条件温和，操作方便，产物纯度高，收率较高。经初步细胞实验证明，对正常细胞无毒副作用，而抑制肿瘤细胞Hela的活性比青蒿素母体更好。采用本发明方法制备的半乳糖－青蒿素易于制剂，具有成药的前景。

Description

半乳糖-青蒿素及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程制药领域，具体涉及一种半乳糖-青蒿素及其制备方法。

背景技术

酶催化合成是现代有机合成中不可缺的生物催化方法，可对不加保护的高官能团底物进行条件温和、环境友好地转化，得到具有高度的区域选择性和立体选择性产物。具有简化合成路线，反应产物不复杂，易于分离纯化，可避免合成过程中使用有毒物质及溶剂等优点。近来研究表明利用酶催化合成的维生素A类与葡糖醛酸以氧连接的结合物，跟母体化合物相比，可以提高癌症的化学预防活性或降低毒性。

青蒿素分子具有较多的环链，使得青蒿素及其衍生物对以下因素十分敏感：500nm以下的光、氧气、痕量的金属、强酸、较高的热等，所以青蒿素及其衍生物极易发生氧化和异构化而分解变质，从而给青蒿素的保存、结构修饰、衍生物的分离纯化等过程中带来许多困难。因此利用糖基修饰青蒿素时，充分考虑青蒿素的稳定性差和与糖基反应时的区域选择性、立体选择性等问题显得尤为重要。

早在70年代，Esders等在Candida bogorionsis中发现有UDP-葡萄糖甾体糖基转移酶的存在。九十年代初，Ullmann等深入的研究发现UDP-葡萄糖甾体糖基转移酶可以将UDP-葡萄糖的糖基转到不同的甾醇上去，比如胆固醇、麦角幽醇等。而wojciechowski等对生物合成甾体皂苷的3-糖基转移酶做了大量的工作，他们从茄子中提取纯化甾体皂苷的糖基转移酶并表征了它的特性，表明部分纯化的糖基转移酶能把糖基转移给甾体皂苷元。Danieli在2001年报道了半乳糖转移酶选择性地把半乳糖转移到人参皂苷上。

2004年Berteau等从土豆中得到三种糖基转移酶cDNA编码，其中有一种表现出UDP-糖基转移酶的活性，这也是第一次克隆的糖基转移酶进行半萜内酯化合物的生物合成，并第一次证实了单一的酶可以对半萜内酯和生物碱进行糖苷化。随后进行的研究表明克隆的其他半萜内酯糖基转移酶有同样的糖基转移活性，它们对底物专一性限制更小。以葡萄糖和半乳糖作为底物均可进行糖苷化甾体皂苷，但以葡萄糖作为底物时的选择性稍差些。

采用酶催化将原料糖基添加到含氧环上需要特定的糖基转移酶的作用。许多大环内酯类的糖基转移酶具有底物灵活性的特点。根据其针对的底物灵活性不同，可把糖基转移酶分为对脱氧糖具有灵活性、对底物内酯环具有灵活性、对脱氧糖和内酯环都具有灵活性三种。由于青蒿素的内酯环具有药理活性，属于结构中的活性部位，所以应该采用对脱氧糖具有灵活性的糖基转移酶。根据本发明需要，采用糖基转移酶催化半萜内酯化合物青蒿素的糖基化反应。

目前，化学方法合成糖基化青蒿素衍生物包括以下步骤：(1)制备二氢青蒿素；(2)全乙酰吡喃溴代糖的制备；(3)糖基化青蒿素衍生物的制备。在此过程中，为了将糖环定位地引入青蒿素，首先要进行糖基的保护，进行反应，反应结算后还需要脱保护，增加了反应的步骤，降低了反应效率，并且产品收得率一般在20-30％之间。同时下游的分离纯化复杂，费时费力，在反应过程中需用到的某些溶剂，如：丙酮、二氯甲烷等，还会对产物或环境造成污染。

为了提高青蒿素的水溶性及其药理活性，需要寻找有更好治疗效果和选择性的青蒿素衍生物。

发明内容

本发明的目的，是提供一种半乳糖-青蒿素及其制备方法。本发明利用糖基转移酶催化青蒿素的糖基化反应，其合成过程条件温和，操作方便，产物纯度高，收率较高。经初步细胞实验证明，对正常细胞无毒副作用，而抑制肿瘤细胞Hela的活性比青蒿素母体更好。采用本发明方法制备的半乳糖-青蒿素易于制剂，具有成药前景。

本发明所述半乳糖-青蒿素，具有以下结构式：

其化学名称为(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3，6，9-三甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二塞平-10-O-半乳糖基，分子式C₂₁H₃₄O₁₀，分子量为446.51，命名为：半乳糖-青蒿素(或糖基化青蒿素)。

半乳糖-青蒿素的制备方法，包括以下步骤：

(1).制备二氢青蒿素

取青蒿素，加入NaHB₄及无水甲醇室温下搅拌24h，蒸馏分离甲醇，残液水溶后，用乙酸乙酯萃取，蒸去溶剂，干燥得产品-二氢青蒿素，其中青蒿素与NaHB₄的摩尔比为1∶0.8～1.5。

(2).UDP-半乳糖的制备

取半乳糖溶解，搅拌、分离，取上清，加入无水乙醇，取出沉淀后加水溶解，加入尿苷二磷酸(UDP)，超声波处理，取超声波处理后的溶液，温度30℃，1400rpm，＜20hPa的真空，真空离心除氨后，室温放置2h，得到UDP-半乳糖，其中半乳糖与尿苷二磷酸的摩尔比为1∶0.8～1.5。

(3).半乳糖-青蒿素的制备

取二氢青蒿素溶解于叠氮钠中，加入UDP-半乳糖以及的半乳糖糖基转移酶，加pH7.4的磷酸缓冲液稀释，在200r/min的转速下，溶液在37℃恒温下孵育3天后，50mmol/L的叠氮钠，pH7.4的磷酸缓冲液中透析，得到半乳糖-青蒿素，其中二氢青蒿素与叠氮钠的摩尔比为1∶0.8～2.5。

步骤(3)中溶液恒温的温度为30～40℃，较好的是32℃～37℃，最好的是32℃或37℃。

在确定本发明的半乳糖-青蒿素制备方法时，还对酶催化反应的不同反应条件进行了优化。

为了便于进行糖基化反应，首先需要将青蒿素还原为带有羟基的二氢青蒿素。糖基转移酶的催化机理是将一分子核苷酸活化的糖基给体中的单糖高区域选择性地转移到糖基受体中特定的羟基上去，具有立体专一性。本发明选择在食品中常见的、应用广泛的半乳糖作为给体原料进行糖基化反应。

本发明通过控制反应条件，对酶催化合成半乳糖-青蒿素的反应过程进行优化，经过细致的实验探索发现，不同pH的缓冲体系对于酶催化反应关系密切。本发明采用检测其酶活的方法，确定在酶催化反应中缓冲体系pH在7-8范围活性最好。同时反应温度、反应时间、半乳糖使用量及转速等因素均在一定程度上影响反应的效率，通过比较得出最佳反应条件为：采用pH为7.4的磷酸缓冲液体系，半乳糖使用量为12.5mmol，在32℃转速为200r/min的反应条件下反应6小时，半乳糖-青蒿素糖基化百分率达到最高。

由于青蒿素对氧化剂非常敏感，尤其接触到溶液中的氧气易被氧化。实验过程中发现将青蒿素及其糖基化衍生物以固态形式暴露于空气中，两天后荧光分光光度计难以确认，一周后会完全被氧化；如将它们的溶液暴露于空气中，半小时后溶液颜色会变暗，并有不明沉淀物出现。因此制备过程中必须防止青蒿素自身氧化，本发明的合成反应在叠氮钠保护反应体系中进行，以防与空气中的氧气接触。

本发明还对半乳糖-青蒿素进行了结构鉴定和糖基化的分析，证明其具有良好的糖基化。本发明通过对半乳糖-青蒿素结构的鉴定，确认糖基确实引入到青蒿素分子上，并且通过糖基修饰青蒿素可以提高其母体的抗肿瘤活性。

本发明的优点是：

1.青蒿素与糖同样有着突出的生物活性，都在生命过程中扮演非常重要的角色，在有些方面表现出相似或相近的性质，如糖及其衍生物能与细胞膜表面上的糖蛋白或糖脂类受体分子结合，而青蒿素则与位于细胞核上的青蒿素受体结合；二者同在抗肿瘤、抗菌方面有良好的效果等。可以预期，采用本发明方法将青蒿素与糖的结合制备成糖基化青蒿素衍生物，能很好的发挥二者的协同作用。

2.青蒿素与糖在其他性质方面也可以有效互补，如糖有良好的溶解性，而青蒿素溶解性差，二者的结合可以赋予青蒿素或糖及其衍生物以新的物理和化学特性，从而改变分子极性、溶解性及吸收代谢以提高药物分子的活性，降低毒副作用等，青蒿素也可激活糖的生物活性，因此，采用本发明方法将青蒿素与糖的结合制备成糖基化青蒿素衍生物，可以增强青蒿素的生物和药用价值。

3.在细胞表面的大量受体分子几乎都是糖蛋白或糖脂类，因而青蒿素与糖的结合必然具有很强的靶向性，因此，采用本发明方法将青蒿素与糖的结合制备成糖基化青蒿素衍生物，可以选择性的靶向给药，解决青蒿素药物治疗选择性差的问题，减少对身体其他组织的损伤，增加药物的生物利用度，提高疗效，减低毒副作用，还可缓慢释放药物作用基团，起到控制或缓释作用。

4.本发明首次尝试了利用糖基转移酶来催化青蒿素的糖基化反应。在试验过程中，发现糖基活化对于酶催化糖基化反应非常重要，如果能将给体和受体充分活化，则反应效率大大提高。本发明采用UDP(尿苷二磷酸)活化糖基制备糖基给体，然后通过薄层层析扫描法定量检测半乳糖糖基给体原料在糖基转移酶催化下修饰青蒿素的反应过程中的糖基化百分率，结果发现在反应6h后就达到了68％。与化学方法的收率20.5％相比，酶催化反应大大提高了反应效率，而且发现半乳糖糖基转移酶的底物专一性很强，仅与半乳糖基给体发生反应。酶催化青蒿素糖基化合成方法条件温和，操作方便，产物纯度很高，因而具有推广意义。

根据青蒿素和糖分子的特殊结构，基于糖基转移酶催化糖苷化反应的原理、效率和特异性，本发明采用酶催化的方法进行青蒿素糖基化修饰，针对糖基转移酶具有严格的底物专一性，以半乳糖为糖基给体，对酶催化反应的可行性进行探索，确定了优化的反应条件，合成得到一种半乳糖-青蒿素，然后通过红外光谱、核磁共振、质谱等手段对其结构进行分析，并对其体外抗肿瘤的活性展开研究。以探讨酶催化合成方法应用于青蒿素的可行性，以及是否对化合物的活性产生影响，也为其他化合物的糖基化修饰研究奠定基础。

本发明所述半乳糖-青蒿素的合成，合成思路新颖，产物结构特殊，为青蒿素衍生物的合成以及其他活性药物的糖基化修饰提供了新的思路。

本发明所述的半乳糖-青蒿素可以与药物载体一起组成药物制剂进行使用。经检测，所述半乳糖-青蒿素对正常细胞的生长抑制作用很小，毒副作用很小，而对Hela肿瘤细胞的抑制作用增强，可以用于制备治疗宫颈癌等引起的疾病的药物。

附图说明

图1为半乳糖-青蒿素的合成示意图；

图2为半乳糖-青蒿素与青蒿素对体外培养肿瘤细胞的生长抑制作用的比较图；

图3为半乳糖-青蒿素与青蒿素对体外培养正常细胞的生长抑制作用的比较图。

具体实施方式

材料：

NaHB₄及无水甲醇、乙酸乙酯、半乳糖、叠氮钠购于国药集团化学试剂厂，均为化学纯

青蒿素标准品              中国药品生物制品检定所

尿苷二磷酸                上海楷洋生物技术有限公司

糖基转移酶                国药集团化学试剂厂

硅胶G                     北京化学试剂厂

DMEM培养基                美国Gibco公司

无水乙醇                  成都华西生物制品厂，分析纯

台盼蓝                    上海化学试剂厂，分析纯

胰酶                                     Sigma公司产品

蛋白酶K                                  Sigma公司产品

新生小牛血清                             Sigma公司产品

小鼠成纤维(293)细胞购自中科院协和医学中心

201D-II型旋转蒸发仪                      郑州长城科工贸有限公司

2XZ-1型旋片式真空泵                      浙江黄岩求精真空泵厂

DF-101T型集热式恒温加热磁力搅拌器        江苏金坛市虹盛实验仪器厂

注：H¹NMR由Varian INOVA-400型核磁共振仪测定(CDCl₃作溶剂，TMS作内标，化学位移δ以ppm为单位)；MS由Finnigan-MAT 4510型质谱仪测定(EI)；IR由美国热电Varon傅立叶红外光谱仪测定(KBr压片法)

净化工作台                             蚌埠产水平式双人超净工作台

水平式离心机                           北京医用离心机厂(LD4-2A)

AEL-40SM电子天平                       日本岛津

CO₂培养箱                              日本平泽公司生产CPD-172型

Whatman 3mm滤纸                        USA

倒置相差显微镜                         日本Olymmpus

自动纯净水蒸馏器                       上海亚容生化仪器厂

Hamilton微量注射器                     辽宁中山医疗器械厂

96孔培养板                             Denmark

25cm²培养瓶                            Denmark

75cm²培养瓶                            Denmark

各种国产玻璃器材：如吸管、试管、离心管、培养瓶、培养皿、配液瓶等等，均需经过高温灭菌处理。

高速离心机、-20℃及-70℃低温冰箱

薄层层析：烧杯；玻璃板(8cm×18cm)；层析缸( 15cm×30cm)；毛细管

0.5mm)；玻棒；喷雾器；烘箱；尺、铅笔；干燥器。

实施例1.受体的合成——青蒿素的还原

在25mL三颈瓶中加入2.81g(0.01mol)青蒿素、0.454g(0.012mol)NaHB₄及10mL无水甲醇室温下搅拌24h。滤液减压蒸馏回收甲醇。残液用250mL水溶解，然后用50mL乙酸乙酯萃取三次，有机层用少量水洗涤，水洗液及水层合并。再用乙酸乙酯萃取，合并有机层。蒸去溶剂，干燥得产品-二氢青蒿素；

实施例2.给体的合成——UDP-半乳糖的制备

取2.0g半乳糖溶解于500mL双蒸水的烧瓶中，在磁力搅拌器上匀速搅拌2h。在高速离心机上12000rpm，离心20min，取上清。将上步所得450mL 0.4％半乳糖溶液，加入450mL无水乙醇，轻轻搅拌；取出乳白色的絮状沉淀放入烧瓶中，挤去多余水分，加去离子水450mL，搅拌至完全溶解。

取复溶的半乳糖溶液20mL，分别加入不同体积的UDP；用20MHz、强度36％的超声波处理30min。除去溶液中的游离UDP，取1.5mL Ep管10只，每只加入1mL超声处理后的溶液；打开真空离心机，设定温度30℃，1400rpm，＜20hPa的真空，依次放入干燥120min，管内体积减少至500μL，加双蒸水补足1000μL；每种溶液的除氨时间相同。结束后，室温放置2h后，测定pH值。将上步中的各溶液收集5mL，测定电导率和TDS等，即得到UDP-半乳糖溶液。

实施例3.酶催化合成过程——半乳糖-青蒿素的制备

参见图1。将1.4107g(相当于5mmol)的二氢青蒿素溶解于50mmol/L的叠氮钠中，加入UDP-半乳糖10mmol，以及5μmol的半乳糖糖基转移酶，最后加pH7.4的磷酸缓冲液稀释至10mL。在200r/min的转速下，整个溶液恒温37℃孵育3天。然后在50mmol/L的叠氮钠，pH7.4的磷酸缓冲液中用透析袋充分透析，以除去未结合的半乳糖分子，得到半乳糖-青蒿素(或糖基化青蒿素)。

所述半乳糖-青蒿素的化学名称为(3R，5aS，6R，8aS，9R，12S，12aR)-八氢-3，6，9-三甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4，3-j]-1，2-苯并二塞平-10-O-半乳糖基，分子式C₂₁H₃₄O₁₀，分子量为446.51，结构式为：

试验之前所有样品冷冻于-70℃冰箱中备用。

本发明的合成反应在叠氮钠保护反应体系中进行，以防止青蒿素与空气中的氧气接触使青蒿素自身氧化。

实施例4.薄层层析法检测糖基化反应过程的可行性

硅胶板8cm×18cm(自制)，在100℃活化0.5h，移液器点样，吹干，在层析缸中展开，展开结束吹干，放入显色剂中，取出吹干，200℃加热1min显色。重复点样4次，根据迁移距离判断产物，然后观测各产物斑点的颜色深浅程度。观测结果如表1所示。

表1不同底物反应体系的薄层层析定性分析结果

(-：无斑点；++：显色清晰stain clearly；++++：显色过深)

从表1分析可知，以半乳糖为糖基给体产生了糖基化衍生物，在10％青蒿素受体溶液时产物颜色更深，且半乳糖自身不自聚。因此选择10％青蒿素受体溶液进行实验。

实施例5.半乳糖-青蒿素的结构表征

本实施例采用核磁共振、质谱和红外光谱对半乳糖-青蒿素的结构进行鉴定：

核磁共振：¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ：1.83～0.82(m，20H，CH₃，CH or CH₂)，2.19(m，1H，CH)，2.51(s，4H，OH)，3.78～3.49(m，4H，CH or CH₂)，4.98～4.81(m，1H，CH)，6.24(m，2H，CH)；

质谱：LC-MS(APCI：CHCl₃)m/z(％)：445.49(M-1⁺，100)；

红外光谱：IR(KBr cm^-1)3380(O-H stretching)，2946，2924(CH₃，CH or CH₂sp³C-H stretching)，1134，1027，1041(C-O stretching)。

以上分析数据表明，合成产物的结构与所设计产物的结构吻合。实施例6.半乳糖-青蒿素对正常细胞及肿瘤细胞的抑制作用

(1)配制药物工作浓度

以40μmol/L作为实验浓度。将上述合成的半乳糖-青蒿素及青蒿素的原液用DMEM培养液稀释成浓度分别为40μmol/L的工作液。

(2)接种细胞

取对数生长期小鼠成纤维293细胞、人宫颈癌Hela细胞分别用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用10％DMEM完全培养基配成单个细胞悬液。进行细胞计数后，按照5×10⁴个/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔体积200μL。将培养板移入CO₂培养箱中，在37℃5％CO₂饱和湿度的条件下培养24小时。

(3)加药

待上述细胞完全贴壁生长后，将培养液吸弃，换上含有40μmol/L的半乳糖-青蒿素和青蒿素的培养基，继续培养8，12，24，36，48小时，各浓度分别设计4个复孔。

(4)呈色

在培养结束前4小时，每孔加入MTT溶液20μL。继续孵育4小时，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液后，每孔加入150μL DMSO，振荡均匀，使结晶物充分溶解。

(5)比色

选择490nm波长，在自动酶标仪上检测各孔吸光度值(OD值)，记录结果。

(实验重复三次)

(6)按下式计算各种浓度药物对细胞的增殖抑制活性

相对抑制率＝(对照孔平均OD值-加药孔平均OD值)/对照孔平均OD值×100％。

(7)统计分析

用SPSS 10.0for windows统计软件处理。检测数据以均数±标准差(x±s)表示，并采用方差分析及t检验，P＞0.05表示无显著性差异，P＜0.05表示有显著性差异。

实验在40μmol/L的浓度下，半乳糖-青蒿素对Hela细胞生长增殖的抑制作用，结果如表2所示。

表2 半乳糖-青蒿素及青蒿素对体外培养肿瘤细胞Hela的生长抑制作用(％，x±s)

从表2可以看出，半乳糖-青蒿素对肿瘤细胞Hela的生长具有抑制作用和明显的细胞毒作用，并且抑制效果比对照组青蒿素更好，作用时间达48h时，抑制率分别为68.06％和35.54％。随着糖基化青蒿素处理细胞的时间延长，抑制率增大，说明在一定范围内，抑瘤效果具有时间依赖性。

根据表2的抑制率，分别得出相同剂量(40μmol/L)半乳糖-青蒿素与青蒿素作用于细胞不同时间的抑制率见图2。

为证明半乳糖-青蒿素的抗肿瘤活性具有特异性，还检测了其对正常细胞293的抑制作用(见图3)。当作用时间为48h，糖基化青蒿素浓度从40μmol/L提高到200μmol/L时，对体外培养的293正常细胞的生长抑制作用变化不大，抑制率从10.80％提高到19.56％，远远低于对肿瘤细胞的抑制率68.06％，说明半乳糖-青蒿素具有较特异性的抑制肿瘤细胞生长的特性；且半乳糖-青蒿素抑制正常细胞生长率低于青蒿素，说明经过修饰后毒性降低。

结论：

目前青蒿素结构改造主要采用传统的化学合成方法，此方法产率较低、下游分离纯化工作困难。本发明则利用生物酶催化的方法，对青蒿素进行糖基修饰，产物纯度高、特异性好，且收率较高。

另外，对于青蒿素的修饰主要停留在简单小分子取代的水平上，还没有涉及到一些大分子对青蒿素化合物的修饰。本发明亦利用小分子单糖进行修饰，展示出较好的功能活性。随着人们对多糖类物质的研究越来越深入，多糖与青蒿素结合可能会达到事半功倍的效果。同时，与其他已知的和将来新发现的活性物质结合，以期望产生共效、促效作用，从而获得“me-too”和“me-better”的优化产物。

Claims (7)

1.一种半乳糖-青蒿素，其特征在于，具有以下结构式：

2.制备权利要求1所述的半乳糖-青蒿素的制备方法，其特征在于有以下步骤：

(1).制备二氢青蒿素

取青蒿素，加入NaHB₄及无水甲醇室温下搅拌24h，蒸馏分离甲醇，残液水溶后，用乙酸乙酯萃取，蒸去溶剂，干燥得产品-二氢青蒿素；

(2).UDP-半乳糖的制备

取半乳糖溶解，搅拌、分离，取上清，加入无水乙醇，取出沉淀后加水溶解，加入尿苷二磷酸(UDP)，超声波处理，取超声波处理后的溶液，温度30℃，1400rpm，＜20hPa的真空，真空离心除氨后，室温放置2h，得到UDP-半乳糖；

(3).半乳糖-青蒿素的制备

取二氢青蒿素溶解于叠氮钠中，加入UDP-半乳糖以及半乳糖糖基转移酶，加pH7.4的磷酸缓冲液稀释，在200r/min的转速下，溶液恒温下孵育3天后，50mmol/L的叠氮钠，pH7.4的磷酸缓冲液中透析，得到半乳糖-青蒿素。

3.根据权利要求2所述的半乳糖-青蒿素的制备方法，其特征在于：步骤(1)中青蒿素与NaHB₄的摩尔比为1∶0.8～1.5。

4.根据权利要求2所述的半乳糖-青蒿素的制备方法，其特征在于：步骤(2)中半乳糖与尿苷二磷酸的摩尔比为1∶0.8～1.5。

5.根据权利要求2所述的半乳糖-青蒿素的制备方法，其特征在于：步骤(3)中二氢青蒿素与叠氮钠的摩尔比为1∶0.8～2.5。

6.根据权利要求2所述的半乳糖-青蒿素的制备方法，其反应特征在于：步骤(3)中溶液恒温的温度为30～40℃。

7.根据权利要求6所述的半乳糖-青蒿素的制备方法，其反应特征在于：步骤(3)中溶液恒温的温度为32℃～37℃。

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