CN101301657A - 用于石油及其产品污染的土壤的微生物修复产品及修复方法 - Google Patents

Abstract

一种用于石油及石油产品污染的土壤的微生物修复产品及修复方法。该产品由：石油烃类化合物的降解菌，生物营养素，生物表面活性剂，土壤活化剂组成，四种组分单独保存。其修复方法按照一定的比例和步骤投加上述四种物质，同时搅拌，完成生物修复的接种，随后定期喷洒生物营养素和土壤活化剂的稀释液，同时增补水分并进行土壤的翻耕曝氧，直至达到要求的指标为至。本发明将降解菌株固化在麦麸上，解决了微生物的长期存储的问题，在使用时，只需用温水将微生物激活即可获得所需要的具有活性的微生物，该方法既可采用原位生物修复，也可采用异位生物修复。

Description

用于石油及其产品污染的土壤的微生物修复产品及修复方法

【技术领域】：

本发明属于石油及石油产品污染土壤的生物修复技术领域，涉及一种用于石油及石油产品污染土壤微生物修复的产品及修复方法，它可以实现石油及石油产品污染土壤的原位微生物修复和异位微生物修复。

【背景技术】：

生物修复技术是指利用微生物或植物，将土壤、地下水或海洋中的危害性污染物降解成二氧化碳和水或其它无公害物质的工程技术；污染土壤的生物修复技术主要包括植物修复技术和微生物修复技术。

植物修复技术是利用植物能够忍耐和超量积累环境中污染物的特性将污染物直接吸收、挥发或钝化而清除环境中污染物的处理技术，主要表现在以下三个方面：(1)植物吸收。主要利用超积累植物对污染物的吸收作用，把污染物从地下转移到地上，随后，收割地上部分进行集中处理，从而达到降低土壤中污染物含量的目的；(2)植物挥发。主要指污染物通过植物的代谢作用产生毒性小的挥发性物质；(3)植物钝化。是指植物通过根系将污染物质吸附于土壤的表面，从而降低污染物的有效形态，达到减轻污染物的目的。

微生物修复技术是利用自然环境中的土著菌、人为投加的外来菌或基因工程菌的生命代谢作用分解污染环境中的污染物，从而降低或去除污染物的毒性以达到修复环境的目的。通常采用向污染治理系统中投加从自然界中筛选出的优势菌种或通过基因组合技术产生的高效菌种或降解酶等措施，以增强降解作用、提高降解速率，这种措施通常被称为生物强化技术。石油及石油产品污染土壤的生物修复技术是微生物修复技术的一种应用特例，它是在微生物的作用下，利用空气中的氧气将污染土壤的石油及石油产品分解成二氧化碳和水，消除石油及石油产品对土壤的污染作用，恢复土壤的特性。石油及石油产品污染土壤的修复技术可分为原位修复技术和异位修复技术，原位修复技术也称为原地修复技术，它是通过在污染地点进行微生物的接种，依靠自然环境条件，利用微生物和空气中的氧实现石油及石油产品分解氧化处理。异位修复技术是通过将污染土壤转移到一个固定的地点，人为地创造有利于微生物生长的环境条件(如温度、湿度、水分、氧气及适宜的培养基等)，最终实现石油及石油产品的分解氧化处理。

利用生物修复(Bioremediation)技术来净化环境，使受污染的宝贵资源如水资源(包括地面水和地下水)、土壤等得以重新利用，同时还可进一步强化环境的自净能力。这一技术在解决环境问题过程中所显示的独特功能和显著优越性充分体现在它是一个纯生态过程。在处理环境污染物方面具有速度快、消耗低、效率高、成本低、反应条件温和以及无二次污染等显著优点，加之其技术开发所预示的广阔的市场前景。

在国外，利用生物修复技术恢复石油及石油产品污染的土壤和地下水的工程应用范例很多，归纳总结可以分为以下两种方法：一种是利用石油及石油产品污染土壤中固有的天然菌株，这些天然的降解石油烃类物质的菌株分为好氧菌株和厌氧菌株。对于以好氧菌株为主体的生物修复技术，主要用于地表土壤的生物修复，通常采用给土壤通风或通入氧气或通过土壤的翻耕曝氧等方式，提供菌株降解石油烃类物质所需要的氧气，同时，加入一些培养基(如氮、磷、硫等)，为微生物提供除了碳源以外的其它营养元素。确保微生物生命活动的顺利进行，进而达到利用微生物的生命活动来将石油烃类污染物转化为无害的无机物，即：二氧化碳和水。对于以厌氧菌株为主体的生物修复技术，主要用于地下土壤的生物修复，因为地下土壤本身就为微生物的生长提供了一种厌氧环境，因此，主要通过注入一些液态的培养基，为微生物提供除了碳源以外的其它营养元素。确保微生物生命活动的顺利进行，进而达到利用微生物的生命活动来将石油烃类污染物转化为无害的有机物，即：甲烷等气体。该技术能够充分利用土壤的固有菌株，实现土壤污染的微生物修复，但由于完全依赖土壤的固有菌株，生物修复需要的时间长，处理成本高，无法适应经过高温处理以回收土壤中的石油烃类物质后残留的含有固体废弃物的生物修复。另一种方法是在土壤固有细菌存在的基础上，再加入高效降解石油烃类物质的菌株，同时加入一些培养基(如氮、磷、硫等)的强化生物修复方法。该方法的优点是生物修复速度快，但要求新加入的菌株不会影响后续土壤环境的生态体系。

在国内，该技术仅处于研究和小型试验阶段，1998年中国科学院沈阳应用生态研究所在辽河油田开展了被原油污染的土壤的修复技术小型试验，其研究的石油降解菌微生物对于原油具有一定的降解作用。同时，该研究所以苜蓿草和水稻为试验植物，开展了二种植物条件下土壤中矿物油和多环芳烃的生物修复技术，以20号柴油和多环芳烃的混合物为标准样品，探讨了该二种植物对土壤中20号柴油和多环芳烃降解速率的影响以及试验过程中有机肥料对降解过程的影响，试验取得了初步成果，但还未得到推广应用；从1998年起，中国科学院成都生物技术研究所也致力于高效石油降解菌微生物的研究工作，目前正处于研究阶段。1999年，武汉大学环境科学系开展了土壤微生物降解石油污染物的试验研究，试验分别采用了武汉石油化工厂石油污染的土壤和江汉油田王北9-7油井附近石油污染的土壤为研究对象，通过对土壤中优势石油降解菌的分离，利用不同的培养基进行石油降解菌群的驯化培养，然后将石油降解菌群接种到污染源中，分别对石油浓度为4、6、8g/L在投加培养基的条件下进行了室内降解试验，筛选出了三种3株高效石油降解细菌，取得了16天降解能力分别达到65.4％、59.8％和58.6％的效果，经鉴定菌株分别属于加单胞菌属、微球菌属和黄单胞菌属。但未见有应用的报道。

相关专利技术

1、国外相关专利技术概述

根据资料调研分析，国外用于石油管线泄露等事故污染的土壤治理的相关专利的情况如下：

(1)、1990年9月14日，美国Stillman，Neil W；Mesa，AZ发明了酵母菌和表面活性剂联合作用的生物修复技术，该技术产品是由二部分组成，第一部分是酵母菌液组成，它含有85～92％(W/W)的水，约5～9％(W/W)的粗糖，约1.5％(W/W)的麦芽，约0.2％(W/W)的酵母菌。第二部分是表面活性剂，其组成是83～88％(W/W)的水，约2％(W/W)的表面活性剂，2～3％(W/W)硼酸钠，0.1～0.5％(W/W)柠檬酸，0.1～1％(W/W)乳酸，约2％(W/W)三聚磷酸盐和1-2％(W/W)谷氨酸一钠。它被用于加速水中石油的生物降解速度。

(2)、美国发明者FINNEY，Jerry，W于1995年3月13日发明了一种生物修复工艺和产品，该技术产品和工艺主要用于市政污水处理过程中产生的固体废弃物，它主要包括以下两个阶段，第一阶段是使土著微生物与市政污泥混合堆积，加入碱使PH值达到10以上，进行微生物的驯化，进而形成一种具有复合生物量的堆积物。第二阶段是给这种堆积物中添加营养物质(包括N，P，S，K等物质)，并保持较高的湿度，实现污泥中包括有机污染物的生物降解。

(3)、美国发明者Dickerson；Theodore从废弃的棉籽中发现了天然的石油降解微生物并于1997年3月11日，发明了一种石油烃类污染土壤的生物修复工艺和材料，其商品名称为OILGATOR

-污油降解素产品。可用于吸附和分解石油烃类污染物，特别是废油和类似的物质。该材料是一种纤维素类的材料，它是棉花脱籽后的废弃原料，使用硫酸和氨水处理后形成的粉末状的纤维素，该纤维素中含有天然固化的微生物，同时含有微生物生长所需要的营养物质，其组成是95％的纤维素和3～8％的硫酸铵。该产品具有选择性吸附烃类物质的特性，使用时，首先将该粉末状的材料与原油污染土壤充分混合，利用产品选择性吸附特性，使原油成分吸附到纤维素中，然后加水激活产品中的微生物，同时通过定期翻耕以提供微生物生长和降解石油烃类物质所需要的氧气。由于该材料在制作的过程中已经固化了微生物所需要的营养成分，因此，在操作过程中不需要再加入营养成分。

目前，国外与本专利密切有关的专利技术是美国发明者Dickerson；Theodore于1997年3月11日，发明的一种石油烃类污染土壤的生物修复工艺和材料，其商品名称为OILGATOR

-污油降解素产品，该产品通过美国联邦部门性能评估的、作为美国政府指定的油污处理的无二次污染的环保产品，同时通过了欧共体SITE的评估认证。该产品已经在美国、加拿大、欧洲、日本等区域应用。

该产品对于在常温下呈现流动状态的石油烃类物质具有良好的生物修复作用，比较适用于石油产品(如：汽油、柴油、轻质油等)污染土壤的生物修复，而对于在常温下处于非流动状态的石油烃类物质，由于通常情况下，很难使该产品与污染土壤混合的十分均匀，微生物只能与土壤中的石油油珠的外侧相接触，因此，不能达到应有的处理效果，并造成生物修复时间的延长。同时，由于降解菌株与营养物质均固化在同一产品中，在处理过程中，营养物质的补充将通过投加产品量来实现，进而造成处理成本的增加。另外，由于石油烃类污染的土壤，通常会出现板结现象，因而，会在土壤环境中造成部分厌氧环境，这也不利于以耗氧微生物为主体的生物降解作用。

2、国内相关专利技术概述

根据资料调研分析，国内用于石油管线泄露等事故污染的土壤治理的专利仅有一项：

2001年4月20日，中国科学院沈阳应用生态研究所的张培军等人发明了名为“一种降解石油固体菌剂的制备方法”，它是采用真菌菌种中的毛霉1株，青霉1株，曲霉1株，木霉1株和白薯真菌2株，分别取所述属中的一株，经过斜面培养、摇瓶培养、固体培养得单一固体培养物，将每一种固体培养物等量混合均匀制得该成品。它可适用于稀油、稠油、特稠油和高凝油污染土壤的生物修复。

该发明将油泥废弃物放在

150×200陶瓷盆中，投加2.5％(W/W)的固体菌剂，同时加入复合有机肥(含有机质39.3％，总氮1.82％，五氧化二磷5.69％，氧化钾2.62％)，客土10％(W/W)，水分20％(W/W)，PH值为7，在温度为22-36％℃的条件下，堆腐处理60天，处理物中的石油烃的去除率为51.2％，比不加固体菌剂的高28.77％。

由于石油是一种复杂的有机烃的混合物，不同结构和不同分子量的烃类物质需要降解的微生物菌株是不同的，因此，这种混合的菌剂针对性较强，从原理上分析，生物降解速度比较快。但仍然还存在着与上述专利类似的技术问题，即：仍然要确保微生物与原油分子的充分接触，才能获得有效的生物修复作用。

【发明内容】：

本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种用于石油及石油产品污染土壤的微生物修复的产品及被污染土壤的微生物修复方法。

本发明提供的用于石油及石油产品污染的土壤的微生物修复产品，该产品是由以下四种组分组成的：石油烃类化合物的降解菌，生物营养素，生物表面活性剂，土壤活化剂，四种组分单独保存。

所述的石油烃类化合物的降解菌，是一种粉末状物质：

(A)该物质含有混合型的降解菌，属于非病原和异养型微生物群体；混合型的降解菌主要由真菌和细菌组成，其中真菌类占微生物总量的60％-70％，细菌类占微生物总量的30％-40％；

真菌类：出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulans(deBary)Arnaud)10％-13％，常现青霉(PenicilliumFreguentans westling)9％-11％，杂色曲霉(Aspergillus Versicolor)8％-9％，产黄青霉(PenicilliumChrysogenum Thom)7％-9％，镰刀菌属(Fusarium Lk.)7％-9％；粉红头孢霉属(Cephaesosp OriumOud.)6％-8％，绿色木霉(Tichoderma Viride Pers.Ex Fr.)5％-7％，黑曲霉属(Aspergillus Niger Nan)5％-7％；

细菌类：醋酸细菌属(Acetobacter)9％-11％，芽孢杆菌属(Bacillus)5％-7％，产碱菌属(Acaligenes)5％-6％，黄杆菌属(Flavobacterium)4％-6％，节细菌属(Arthrobacter)4％-5％，微球菌(Micrococcus)2％-4％；

(B)该物质是采用常规固体培养的方式，以石油烃类化合物为培养过程中的唯一碳源，对土壤中的微生物进行培养驯化以水为连续相，以麦麸作为微生物的附着载体，扩大培养14天后，将培养液进行过滤，滤出麦麸，并干化后形成的粉末状物质；

(C)该物质是以麦麸为主体的粉末状材料，其中麦麸重量占总重量的98％，前述中滤出的麦麸中携带的培养基的重量占麦麸总重量的2％，容重为0.6，外观为淡棕色。

3、按照权利要求1所述的产品，其特征在于所述的生物营养素是一种黑色的液体物质，该液体物质用于为石油烃类化合物的降解菌在进行污染土壤生物修复时提供营养成分，其组成为：

水重量占总重量的93.43％；

有机营养物质占总重量的5.085％，其中微生物发酵提炼物蛋白质的含量为3.2％，腐殖酸为1.0％，蔗糖为0.08％，果糖为0.03％，葡萄糖为0.025％，尿素为0.75％；

无机营养物质占总重量的1.515％，其中：氯化钠的含量为0.165％，氨的含量为0.15％，硫酸铵的含量为0.3％，磷酸二氢钾的含量为0.3％，磷酸氢二钾的含量为0.3％，硫酸镁的含量为0.09％，硫酸锌的含量为0.075％，氯化钙的含量为0.045％，硝酸钙的含量为0.03％，硫酸铁的含量为0.03％，硫酸锰的含量为0.03％，

该液体物质比重为1.05。

4、按照权利要求1所述的产品，其特征在于所述的生物表面活性剂是一种清澈的液体，用于改善原油的分散特性，增进以水溶液状态存在的细菌与原油的接触面积，进而达到强化生物降解的作用，其组成为：

水占总重量的86.5％；

烷基苯磺酸钠占总重量的12％；

微生物发酵提炼物蛋白质占总重量的1.5％；该液体物质的比重为1.01。

5、按照权利要求1所述的产品，其特征在于所述的土壤活化剂是一种淡黄色的液体，用于改善土壤的特性，使其变得更加蓬松不易板结，增加土壤的透气性，为微生物的降解反应创造良好的环境，其组成为：

水占总重量的92.45％；

有机物占总重量的6％，组成为：腐殖酸的含量为3％，蛋白质的含量为1.5％，-亚麻酸的含量为0.75％，氨基酸的含量为0.15％，维生素B2的含量为0.3％，维生素A的含量为0.15％，维生素B6的含量为0.09％，维生素E的含量为0.06％；；

无机物占总重量的1.55％，组成为：氯化钠的含量为0.15％，氯化镁的含量为0.8％，硫酸镁的含量为0.15％，硫酸锌的含量为0.45％；

该液体物质的比重为1.02。

一种以上所述的产品用于石油及石油产品污染的土壤或固体物质的微生物修复方法，具体步骤为：

第一、修复时，用温度20-30℃温水(水中不应含有杀菌剂成分)将石油烃类化合物的降解菌激活并保存在水中，形成石油烃类化合物的生物降解菌液，通常的比例是1Kg的菌种，用8-10升的水来激活，先用水浸泡0.5-2.0小时，并去除麦麸载体后使用；菌种一旦用水激活建议尽快使用，放置时间不应超过24小时。

第二、将上步的生物降解菌液与生物表面活性剂和土壤活化剂的稀释液相混合，形成混合液，将该混合液喷洒于石油或石油产品污染的土壤中，翻耕土壤使混合菌液与污染的土壤充分混合；

第三、将生物营养素稀释，配成稀释液，每周喷洒一次生物营养素和土壤活化剂的稀释液，同时，增补水分并进行土壤的翻耕曝氧，直至土壤的含油率下降到1％重量分数以下后，更改为每2周喷洒一次生物营养素和土壤活化剂，直至达到要求的指标为至；

处理时环境温度要求10℃以上，其中，生物营养素、生物表面活性剂、土壤活化剂三种产品的稀释比例为(5-10)∶1。

在进行土壤的原位生物修复时，修复土壤的厚度应控制在30厘米以内，并在接种后的一个月内，平均一周翻耕土壤一次；随后两周翻耕一次，并随时加水以保持土壤的含水率在30％以上，其中加入的水不应含有杀菌剂成分。

所述的石油烃类化合物的降解菌、生物营养素、生物表面活性剂和土壤活化剂的用量如下：对于含油率为＜10％重量分数的污染土壤，厚度为30厘米，面积为100平方米的处理面积，需要投加使用固体粉末状石油烃类化合物的降解菌1公斤～2公斤，液体生物表面活性剂5公斤～10公斤，液体生物营养素75公斤～100公斤，土壤活化剂20公斤～30公斤；

初次投加时，按照上述剂量，首先将降解菌菌种和生物表面活性剂一次性全部投加，土壤活化剂和生物营养素首次投加总量的20％重量分数，随后按照上述的操作步骤均量投加。

对于含油率大于10％、小于15％重量分数的污染土壤，降解菌增加原投放量的50％，其他各种物质的增加量为原投放量，操作参数不变；

根据污染土壤中含油量的不同和对处理后土壤中残留含油量要求的差异，处理时间一般为16-26周。

本发明的优点和积极效果：

1、本发明采用麦麸固化石油烃类降解菌的驯化培养技术，将降解菌株固化在麦麸上，并干化使微生物以休眠状态存在于麦麸上，在使用时，只需用温水将微生物激活即可获得所需要的具有活性的微生物。解决了微生物的长期存储的问题。

2、石油烃类降解菌产品是一种含有多种不同菌株的复合菌群，可适应石油这种含有不同分子量和不同分子结构烃类化合物的生物降解。

3、利用该种技术产品进行生物修复时，既可以采用原位生物修复的方法，也可以采用异位生物修复的方法。

4、在生物修复过程中，采用定期投加生物营养素的方法，可以保证生物修复过程中，始终保持微生物的营养平衡，为实现石油烃类污染物的快速降解创造了必要的营养环境。另外，该生物营养素由于包含了在发酵过程中提炼的营养物质以及腐殖酸和糖类物质，对于不同处理阶段的弱势菌株的培养具有重要的意义，为实现弱势菌株向优势菌株的转化，进而加快石油烃类物质的降解速度，缩短处理时间提供了必要的储备菌株。

5、针对石油特别是石蜡基石油或稠油在常温状态下，大多数情况下为凝固状态，以水溶液状态接种的微生物难以大面积的接触石油，进而影响处理效果的实际情况，创造性地将胶体化学和表面化学中使用的以改变润湿性作用的表面活性剂应用到生物修复技术之中，增大了微生物与石油的接触面积，提高了生物修复的效率。同时，在其中添加了微生物发酵提炼物，可以增进微生的活性，促进微生物的生长。

6、针对石油污染土壤容易板结成块形成部分厌氧环境的现状，将广泛应用于盐碱地的改良治理，具有改善土壤的特性，使其变得更加蓬松不易板结的土壤改良剂引入生物修复技术中，增加了土壤的透气性，为微生物的降解反应创造良好的环境，同时，添加了各种养份，特别是含有少量微生物生长所需要的氨基酸形成了该种生物表面活性剂，使其还具有增进微生的活性，促进微生物的生长的功效。

【附图说明】：

图1是使用本发明产品修复污染土壤的生物降解曲线；

图2是使用本发明产品的生物修复现场试验曲线；

图3是使用本发明产品的现场试验生物降解曲线。

【具体实施方式】：

实施例1：

本发明提供的用于石油及石油产品污染的土壤的微生物修复产品，由以下四种组分组成的：石油烃类化合物的降解菌，生物营养素，生物表面活性剂，土壤活化剂，四种组分单独保存。

1、所述的石油烃类化合物的降解菌，是一种粉末状物质：

(A)该物质含有混合型的降解菌，属于非病原和异养型微生物群体；混合型的降解菌主要由真菌和细菌组成，其中真菌类占微生物总量的60％-70％，细菌类占微生物总量的30％-40％；

真菌类：出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulans(deBary)Arnaud)10％-13％，常现青霉(PenicilliumFreguentans westling)9％-11％，杂色曲霉(Aspergillus Versicolor)8％-9％，产黄青霉(PenicilliumChrysogenum Thom)7％-9％，镰刀菌属(Fusarium Lk.)7％-9％；粉红头孢霉属(Cephaesosp OriumOud.)6％-8％，绿色木霉(Tichoderma Viride Pers.Ex Fr.)5％-7％，黑曲霉属(Aspergillus Niger Nan)5％-7％；

细菌类：醋酸细菌属(Acetobacter)9％-11％，芽孢杆菌属(Bacillus)5％-7％，产碱菌属(Acaligenes)5％-6％，黄杆菌属(Flavobacterium)4％-6％，节细菌属(Arthrobacter)4％-5％，微球菌(Micrococcus)2％-4％；

(B)该物质是采用常规固体培养的方式，以石油烃类化合物为培养过程中的唯一碳源，对土壤中的微生物进行培养驯化以水为连续相，以麦麸作为微生物的附着载体，扩大培养14天后，将培养液进行过滤，滤出麦麸，并干化后形成的粉末状物质；

(C)该物质是以麦麸为主体的粉末状材料，其中麦麸重量占总重量的98％，前述中滤出的麦麸中携带的培养基的重量占麦麸总重量的2％，容重为0.6，外观为淡棕色。

3、按照权利要求1所述的产品，其特征在于所述的生物营养素是一种黑色的液体物质，该液体物质用于为石油烃类化合物的降解菌在进行污染土壤生物修复时提供营养成分，其组成为：

水重量占总重量的93.43％；

有机营养物质占总重量的5.085％，其中微生物发酵提炼物蛋白质的含量为3.2％，腐殖酸为1.0％，蔗糖为0.08％，果糖为0.03％，葡萄糖为0.025％，尿素为0.75％；

无机营养物质占总重量的1.515％，其中：氯化钠的含量为0.165％，氨的含量为0.15％，硫酸铵的含量为0.3％，磷酸二氢钾的含量为0.3％，磷酸氢二钾的含量为0.3％，硫酸镁的含量为0.09％，硫酸锌的含量为0.075％，氯化钙的含量为0.045％，硝酸钙的含量为0.03％，硫酸铁的含量为0.03％，硫酸锰的含量为0.03％，

该液体物质比重为1.05。

4、按照权利要求1所述的产品，其特征在于所述的生物表面活性剂是一种清澈的液体，用于改善原油的分散特性，增进以水溶液状态存在的细菌与原油的接触面积，进而达到强化生物降解的作用，其组成为：

水占总重量的86.5％；

烷基苯磺酸钠占总重量的12％；

微生物发酵提炼物蛋白质占总重量的1.5％；该液体物质的比重为1.01。

5、按照权利要求1所述的产品，其特征在于所述的土壤活化剂是一种淡黄色的液体，用于改善土壤的特性，使其变得更加蓬松不易板结，增加土壤的透气性，为微生物的降解反应创造良好的环境，其组成为：

水占总重量的92.45％；

有机物占总重量的6％，组成为：腐殖酸的含量为3％，蛋白质的含量为1.5％，-亚麻酸的含量为0.75％，氨基酸的含量为0.15％，维生素B2的含量为0.3％，维生素A的含量为0.15％，维生素B6的含量为0.09％，维生素E的含量为0.06％；；

无机物占总重量的1.55％，组成为：氯化钠的含量为0.15％，氯化镁的含量为0.8％，硫酸镁的含量为0.15％，硫酸锌的含量为0.45％；

该液体物质的比重为1.02。

以上四种组分单独保存。

修复实例1：

2004年3月，在室内，分别称取17Kg经过烘干恒重的土放入6个塑料大盆中，取不含水的原油，加热到40℃，将原油全部融化成液态，分别称取0.85Kg的石油倒入前3个大盆中，再称取2.55Kg的石油倒入后3个大盆中，立刻搅拌，使石油与土壤充分混合，形成含油率为5％(W/W)和15％(W/W)的模拟污染土壤。

(1)称取0.8g石油烃类化合物的降解菌放入1#烧杯中，称取1.2g石油烃类化合物的降解菌放入2#烧杯中，分别给两个烧杯中加入500mL、30℃的温水，搅拌，放置2.0小时，用滤纸过滤去除杂质，过滤后的液体分别保留在1#和2#烧杯中。

(2)称取4g的生物表面活性剂液体加入到1#烧杯中，称取6g生物表面活性剂液体加入到2#烧杯中，分别搅拌，形成溶液。

(3)称取8g生物营养素液体和2.4g土壤活化剂，同时加入3#烧杯中，同时称取12g生物营养素液体和3.6g土壤活化剂放入4#烧杯中，分别并加水100mL的水稀释并搅拌均匀。

(4)首先，按照将1#烧杯溶液倒入前3个模拟样品中，充分搅拌后，将3#烧杯溶液倒入其中。搅拌拌均匀，然后浇入6000Ml的水，搅拌均匀。将2#烧杯溶液倒入后3个模拟样品中，充分搅拌后，将4#烧杯溶液倒入其中。搅拌拌均匀，然后浇入6000Ml的水，搅拌均匀。

(5)然后，将3#烧杯中的溶液倒入前3个模拟样品中，充分搅拌；将4#烧杯中的溶液倒入后3个模拟样品中，充分搅拌；

(6)按照步骤(3)配制溶液，每周喷洒一次生物营养素和土壤活化剂的稀释液，同时，增补水分并进行土壤的翻耕曝氧，直至土壤的含油率下降到1％重量分数以下后，更改为每2周喷洒一次生物营养素和土壤活化剂，直至达到要求的指标为至；

试验结果发现：对于含油率为5％(W/W)的土壤，降解一个月后，土壤中的含油量可达到2％以下(1.9％)；二个月后，土壤中的含油率可以下降到0.7％以下；三个月后，土壤中的含油率可以下降到0.3％以下(0.18％)，达到了国家农用污泥中污染物控制标准GB4284-84中矿物油含量指标。

对于含油率为15％(W/W)的土壤，降解一个月后，土壤中的含油量在7％以下；二个月后，土壤中的含油量为5.5％，并且降解速度缓慢；四个月以后，土壤中的含油量达到2％以下。

其结果见图1，使用本发明产品修复污染土壤的生物降解曲线。

修复实例2：

在某油田一口井场上开展试验，污染土壤的面积约为40m²，厚度30cm，测试初始含油率为8.231％。按照厚度为30厘米，面积为100平方米的处理面积，需要投加使用固体粉末状石油烃类化合物的降解菌1公斤～2公斤，液体生物表面活性剂5公斤～10公斤，液体生物营养素75公斤～100公斤，土壤活化剂20公斤～30公斤的比例(土壤的容重为1.5计算)，计算投加量。按照同上述修复实例1的操作步骤和操作参数进行处理试验，试验于2004年8月14日开始接种，8月15日开始取样分析，试验于10月20日由于气候关系取样暂时停止，试验结果为：经过二个月的处理，土壤的含油率可降为1.654％。试验曲线如图2，使用本发明产品的生物修复现场试验曲线。

修复实例3：

试验地点选择在某油田的污泥回收点，试验的面积为20m²，厚度30cm，经检测污泥的初始含油量为6.10％，按照上述的操作步骤和操作参数进行处理试验，试验是2003年8月6日进行，到2003年9月30日进入冬季，2004年5月14日继续进行检测评价。通过近7个月的反应含油率下降到0.185％，达到国标要求的指标。试验结果见图3。

Claims (9)

1、一种用于石油及石油产品污染的土壤的微生物修复产品，其特征在于该产品是由以下四种组分组成的：石油烃类化合物的降解菌，生物营养素，生物表面活性剂，土壤活化剂，四种组分单独保存。

2、按照权利要求1所述的产品，其特征在于所述的石油烃类化合物的降解菌，是一种粉末状物质：

(A)该物质含有混合型的降解菌，属于非病原和异养型微生物群体；混合型的降解菌主要由真菌和细菌组成，其中真菌类占微生物总量的60％-70％，细菌类占微生物总量的30％-40％；

真菌类：出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulans(deBary)Arnaud)10％-13％，常现青霉(PenicilliumFreguentans westling)9％-11％，杂色曲霉(Aspergillus Versicolor)8％-9％，产黄青霉(PenicilliumChrysogenum Thom)7％-9％，镰刀菌属(Fusarium Lk.)7％-9％；粉红头孢霉属(Cephaesosp OriumOud.)6％-8％，绿色木霉(Tichoderma Viride Pers.Ex Fr.)5％-7％，黑曲霉属(Aspergillus Niger Nan)5％-7％；

细菌类：醋酸细菌属(Acetobacter)9％-11％，芽孢杆菌属(Bacillus)5％-7％，产碱菌属(Acaligenes)5％-6％，黄杆菌属(Flavobacterium)4％-6％，节细菌属(Arthrobacter)4％-5％，微球菌(Micrococcus)2％-4％；

(B)该物质是采用常规固体培养的方式，以石油烃类化合物为培养过程中的唯一碳源，对土壤中的微生物进行培养驯化，以水为连续相，以麦麸作为微生物的附着载体，扩大培养14天后，将培养液进行过滤，滤出麦麸，并干化后形成的粉末状物质；

(C)该物质是以麦麸为主体的粉末状材料，其中麦麸重量占总重量的98％，前述中滤出的麦麸中携带的培养基的重量占麦麸总重量的2％，容重为0.6，外观为淡棕色。

3、按照权利要求1所述的产品，其特征在于所述的生物营养素是一种黑色的液体物质，该液体物质用于为石油烃类化合物的降解菌在进行污染土壤生物修复时提供营养成分，其组成为：

水重量占总重量的93.43％；

有机营养物质占总重量的5.085％，其中微生物发酵提炼物蛋白质的含量为3.2％，腐殖酸为1.0％，蔗糖为0.08％，果糖为0.03％，葡萄糖为0.025％，尿素为0.75％；

无机营养物质占总重量的1.515％，其中：氯化钠的含量为0.165％，氨的含量为0.15％，硫酸铵的含量为0.3％，磷酸二氢钾的含量为0.3％，磷酸氢二钾的含量为0.3％，硫酸镁的含量为0.09％，硫酸锌的含量为0.075％，氯化钙的含量为0.045％，硝酸钙的含量为0.03％，硫酸铁的含量为0.03％，硫酸锰的含量为0.03％，

该液体物质比重为1.05。

4、按照权利要求1所述的产品，其特征在于所述的生物表面活性剂是一种清澈的液体，用于改善原油的分散特性，增进以水溶液状态存在的细菌与原油的接触面积，进而达到强化生物降解的作用，其组成为：

水占总重量的86.5％；

烷基苯磺酸钠占总重量的12％；

微生物发酵提炼物蛋白质占总重量的1.5％；该液体物质的比重为1.01。

5、按照权利要求1所述的产品，其特征在于所述的土壤活化剂是一种淡黄色的液体，用于改善土壤的特性，使其变得更加蓬松不易板结，增加土壤的透气性，为微生物的降解反应创造良好的环境，其组成为：

水占总重量的92.45％；

有机物占总重量的6％，组成为：腐殖酸的含量为3％，蛋白质的含量为1.5％，-亚麻酸的含量为0.75％，氨基酸的含量为0.15％，维生素B2的含量为0.3％，维生素A的含量为0.15％，维生素B6的含量为0.09％，维生素E的含量为0.06％；；

无机物占总重量的1.55％，组成为：氯化钠的含量为0.15％，氯化镁的含量为0.8％，硫酸镁的含量为0.15％，硫酸锌的含量为0.45％；

该液体物质的比重为1.02。

6、一种权利要求1所述的产品用于石油及石油产品污染的土壤或固体物质的微生物修复方法，其特征在于具体步骤为：

第一、修复时，用温度20-30℃温水将石油烃类化合物的降解菌激活并保存在水中，形成石油烃类化合物的生物降解菌液，通常的比例是1Kg的菌种，用8-10升的水来激活，先用水浸泡0.5-2.0小时，并去除麦麸载体后使用；

第二、将上步的生物降解菌液与生物表面活性剂和土壤活化剂的稀释液相混合，形成混合液，将该混合液喷洒于石油或石油产品污染的土壤中，翻耕土壤使混合菌液与污染的土壤充分混合；

第三、用不含杀菌剂的水稀释生物营养素，配成稀释液，每周喷洒一次生物营养素和土壤活化剂的稀释液，同时，增补水分并进行土壤的翻耕曝氧，直至土壤的含油率下降到1％重量分数以下后，更改为每2周喷洒一次生物营养素和土壤活化剂，直至达到要求的指标为至；

处理时环境温度要求10℃以上，其中，生物营养素、生物表面活性剂、土壤活化剂三种产品的稀释比例为(5-10)∶1。

7、按照权利要求6所述的修复方法，其特征是，在进行土壤的原位生物修复时，修复土壤的厚度应控制在30厘米以内，并在接种后的一个月内，平均一周翻耕土壤一次；随后两周翻耕一次，并随时加水以保持土壤的含水率在30％以上，其中加入的水不应含有杀菌剂成分。

8、按照权利要求6或7所述的修复方法，其特征是，所述的石油烃类化合物的降解菌、生物营养素、生物表面活性剂和土壤活化剂的用量如下：对于含油率为＜10％重量分数的污染土壤，厚度为30厘米，面积为100平方米的处理面积，需要投加使用固体粉末状石油烃类化合物的降解菌1公斤～2公斤，液体生物表面活性剂5公斤～10公斤，液体生物营养素75公斤～100公斤，土壤活化剂20公斤～30公斤；

初次投加时，按照上述剂量，首先将降解菌菌种和生物表面活性剂一次性全部投加，土壤活化剂和生物营养素首次投加总量的20％重量分数，随后按照上述的操作步骤均量投加。

9、按照权利要求6或7所述的修复方法，其特征是，对于含油率大于10％、小于15％重量分数的污染土壤，降解菌增加原投放量的50％，其他各种物质的增加量为原投放量，操作参数不变；

根据污染土壤中含油量的不同和对处理后土壤中残留含油量要求的差异，处理时间一般为16-26周。

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