CN107159690A - 一种石油污染土壤修复剂体系的制备方法及实施工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种石油污染土壤修复剂体系的制备方法及实施工艺，涉及一种土壤修复剂制备方法及施用方法，其土壤修复剂体系，是由土壤调节液、石油烃降解菌剂、固体废料载体、生物聚合物菌剂和营养液构成；其实施工艺操作步骤为：先喷洒土壤调节液，然后喷洒石油烃降解菌剂，铺撒增氧剂，再喷洒生物聚合物菌剂，铺撒固体肥料载体颗粒，最后再次喷洒生物聚合物菌剂即可。本发明的石油污染土壤修复剂体系能够提高石油与土壤的溶解效果，促进石油烃微生物的生长，抑制有害微生物繁殖；对于5%或以下的石油污染土壤，在温度5～10℃条件石油降解率达39%～43.7%；在15～20℃条件石油降解率达59.8%，温度在25～30℃条件，石油降解率达87.5%以上。

Description

一种石油污染土壤修复剂体系的制备方法及实施工艺
技术领域
本发明涉及一种土壤修复剂的制备方法及施用方法，尤其涉及一种石油污染土壤修复剂体系的制备方法及实施工艺。
背景技术
石油产业是我国国民经济的支柱产业之一，对我国国民经济的发展具有重大的影响。油田开采经历了一次采油、二次采油和三次采油，目前普遍使用的化学三元复合驱技术，是国内外在三次采油阶段开发的一项高效提高采收率技术，但其对于土壤的污染极大，而且污染土壤很难再次利用。生物修复是一种较为环保的石油污染土壤进行处理方式，现有生物修复技术基本以典型的耕作法、堆放法和堆肥法为主，但其存在污染修复受环境限制因素大、土壤持水效率低、原油与修复物（肥料、菌、调节剂）接触效率低、修复周期长及修复效率不高等问题，难以得到大范围的推广。
发明内容
本发明对于上述现有技术的不足，提供了一种石油污染土壤修复剂体系的制备方法及实施工艺。
本发明的一种石油污染土壤修复剂体系，是由土壤调节液、石油烃降解菌剂、固体肥料载体、生物聚合物菌剂和营养液构成，
所述的土壤调节液是由生物脂肽表面活性剂10～20份、腐殖酸溶液1～10份、双氧水0.1～0.5份、水60～90份，混合均匀制得；
所述的石油烃降解菌剂是由1～5份的石油烃降解菌发酵原液与15～20份营养液，混合均匀制得；
所述的固体肥料载体是将秸秆、树叶和废弃果蔬残余中的一种或者几种的混合物粉碎为1～3mm颗粒，再与有机粪按质量比10:0.5的配比混合，然后用质量浓度为0.05%腐殖酸溶液浸润，常温25℃下，控制湿度30～50%，堆肥发酵2个月后，与增氧剂按10：0.1混合均匀，即得固体肥料载体；
所述的生物聚合物菌剂是由1～5份的生物聚合物菌发酵原液与15～20份营养液，混合均匀制得；
所述的营养液是由糖蜜0.1～1份、尿素0.1～1份、酵母粉0.01～0.1份、玉米浆干粉0.1～1份、磷酸氢二钾0.1～0.5份、水96～99份，混合均匀制得；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
作为本发明的进一步改进，所述的石油烃降解菌发酵原液的制备方法如下：
A、菌种诱变：将地衣芽孢杆菌CGMCC1.7461接种过夜培养，制得待诱变发酵液，然后将待诱变发酵液进行600～750微克/毫升NTG处理，按照1:1进行混匀，25℃保温30min，离心取下层细胞，洗涤细胞，于LB培养基中重悬、其细胞浓度为1.0×108～2.0×108个/ml，25℃培养过夜，稀释涂板，选择能够在10℃～25℃温度条件下，利用正十六烷、苯、菲和环己烷为单一碳源生长、对芳烃及环烷烃有较强的降解能力的菌种即为目标菌种；
B、发酵液制备：
a、目标菌种活化：斜面目标菌种挑出2环至含300ml液体培养基的500ml摇瓶中活化培养，温度25±2℃、100转/分震荡培养18～24小时，得到活化菌液；
b、制备种子液：将a步骤制得的活化菌液转接到5L摇瓶中培养，5L摇瓶装液量60%，接种量5%，温度25±2℃、100转/分震荡培养24～30小时，得到种子菌液；
c、初级发酵培养：将b步骤制得的种子菌液导入(200L)一级种子发酵罐中，种子罐装液量80%，接种量5%，控制通风量0.2～0.4vvm，搅拌转速100转/分，pH值控制在7.0～8.0，温度25±2℃，培养24～36小时后，得到一级发酵菌种；
d、发酵培养：将c步骤制得的以及发酵菌种导入（10m3）三级发酵罐，三级发酵罐按60%装液量，接种量5%，控制通风量0.2～0.4vvm，过程pH值控制在7.0～8.5，温度25±2℃，搅拌速度80转/分，培养30～48小时后，制得石油烃降解菌发酵原液，其中烃降解菌菌数在2×108个/m以上；
上述摇瓶及发酵罐培养基配方是：液态石蜡0.5～1份，氯化铵2～3份、酵母粉0.2～0.4份、磷酸二氢钾1.5～2份、七水硫酸镁0.2～0.5份、氯化锰0.1～0.5份、氯化钙0.2～0.5份、装液量控制在80%、培养温度25～30℃、控制通风量0.2～0.4vvm，搅拌速度控制在50～80rpm，以上均为质量份数；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
作为本发明的进一步改进，所述的生物聚合物菌发酵原液的制备方法如下：
A、菌种诱变：将野油菜黄单胞菌CGMCC1.1781接种过夜培养，制得待诱变发酵液，然后将待诱变发酵液进行600～750微克/毫升NTG处理，按照1:1进行混匀，25℃保温30min，离心取下层细胞，洗涤细胞，于LB培养基中重悬、其细胞浓度为1.0×108～2.0×108个/ml，25℃培养过夜，稀释涂板，选择可在20～40℃温度下，利用糖类为碳源产生生物复合多糖的菌种即为目标菌种；
B、发酵液制备：
a、目标菌种活化：斜面目标菌种挑出2环至含100ml液体培养基的500ml摇瓶中活化培养，温度25±2℃、150转/分震荡培养10～15小时，得到活化菌液；
b、制备种子液：a步骤制得的活化菌液转接到5L摇瓶中培养，5L摇瓶装液量20%，接种量10%，温度25±2℃、150转/分震荡培养10～15小时，得到种子菌液；
c、一级发酵培养：将b步骤制得的种子菌液导入(100L)一级种子发酵罐中，种子罐装液量50%，接种量10%，控制通风量0.5vvm，搅拌转速130转/分，pH值控制在7.0～8.0，温度25±2℃，培养8～13小时后，得到一级发酵菌种；
d、二级发酵培养：将c步骤制得的一集发酵菌种导入二级(1m3)种子罐，二级罐装液量50%，接种量10%，控制通风量0.5～0.6vvm，搅拌转速100转/分，pH值控制在7.0～8.0，温度25±2℃，培养5～8小时，制得二级发酵菌液；
e、发酵培养：将d步骤制得的制得二级发酵菌液导入（10m3）三级发酵罐，三级发酵罐按50%装液量，接种量10%，通风量0.7～0.8vvm，过程pH值控制在7.0～8.5，温度25±2℃，搅拌速度80转/分，培养6～8小时后，即制得生物聚合物菌发酵原液，控制微生物复合多糖在微生物发酵液中占1%～1.8%；
上述摇瓶及各级发酵罐培养基配方是：玉米糖浆10～20份、酵母膏5～7份、蛋白胨0.2～0.3份、磷酸二氢钾1.5～2份、七水硫酸镁0.3～0.5份、氯化钙0.1～0.2份、装液量为20～50%、培养温度25±2℃、pH值7～8，搅拌速度控制在80～150rpm，以上为质量份数；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
作为本发明的进一步改进，所述的固体肥料载体中的增氧剂是由过氧化钙和过氧化尿素按质量配比20：1混合而成。
作为本发明的进一步改进，所述的土壤调节液中的腐殖酸溶液的质量浓度大于50%。
一种石油污染土壤修复剂体系的实施工艺，其具体操作步骤如下：先喷洒土壤调节液，每平方米喷洒1～4L；然后喷洒石油烃降解菌剂，每平方米喷洒1～4L后，铺撒增氧剂，每平方米均匀铺撒100～200g；再喷洒生物聚合物菌剂，每平方米喷洒1～2L后，铺撒固体肥料载体颗粒1～2cm厚，最后再次喷洒生物聚合物菌剂，每平方米喷洒1～4L即可。
其中，生物复合驱油剂中的生物脂肽表面活性剂的制备方法为公开技术，其已被专利号为201110343413.6的发明专利《一种脂肽生物表面活性剂的工业化制备方法》所公开。
本发明的一种石油污染土壤修复剂体系的制备方法及实施工艺，适用于石油污染土壤的大规模原位生物修复，其有益效果为：
1）本发明以土壤调节剂中的生物脂肽表面活性剂作为乳化分散剂，提高石油与土壤的溶解效果，促进石油烃微生物的生长，抑制有害微生物繁殖；
2）引入的外源石油烃降解菌，其在中低温（5～10℃）下降解石油烃效率达到43.7%，同时，该菌在不含有石油烃的区域代谢多糖聚合物，该聚合多糖可激活本源石油烃降解菌，并且该物质形成粘液膜层，可暂时性覆盖石油烃降解环境，控制微环境水分与温度蒸发，保证环境湿度与温度，进一步提高石油污染的降解效率；
3）本发明专利所用固体秸秆、树叶、果蔬残余是废弃物的资源化利用，原料易得，工艺较简单，为微生物生长提供适宜的的基质，同时，载体经粉碎发酵制成肥料对固化微生物生长，保证微环境中营养物质、湿度、温度等指标，对提高本源土壤菌群活力、缓解板结污染土壤有重要作用；
4）土壤调节液、两种菌剂与营养剂、载体肥料三体系的优化实施工艺，5%或以下的石油污染土壤，在温度5～10℃条件石油降解率达39%～43.7%；在15～20℃条件石油降解率达59.8%，温度在25～30℃条件，石油降解率达87.5%以上。
具体实施方式
实施例1
本发明的一种石油污染土壤修复剂体系，是由土壤调节液、石油烃降解菌剂、固体肥料载体、生物聚合物菌剂和营养液构成，
所述的土壤调节液是由生物脂肽表面活性剂10份、腐殖酸溶液1份、双氧水0.1份、水60份，混合均匀制得，所述的土壤调节液中的腐殖酸溶液的质量浓度大于60%；
所述的石油烃降解菌剂是由1份的石油烃降解菌发酵原液与15份营养液，混合均匀制得；
所述的固体肥料载体是将秸秆、树叶和废弃果蔬残余中的一种或者几种的混合物粉碎为1mm颗粒，再与有机粪按质量比10:0.5的配比混合，然后用质量浓度为0.05%腐殖酸溶液浸润，常温25℃下，控制湿度30%，堆肥发酵2个月后的发酵混合物备用，使用前将发酵后的混合物与增氧剂按10：0.1混合配比制得，所述的增氧剂是由过氧化钙和过氧化尿素按质量配比20：1混合而成；
所述的生物聚合物菌剂是由1份的生物聚合物菌发酵原液与15份营养液，混合均匀制得；
所述的营养液是由糖蜜0.1份、尿素0.1份、酵母粉0.01份、玉米浆干粉0.1份、磷酸氢二钾0.1份、水96份，混合均匀制得；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
所述的石油烃降解菌发酵原液的制备方法如下：
A、菌种诱变：将地衣芽孢杆菌CGMCC1.7461接种过夜培养，制得待诱变发酵液，然后将待诱变发酵液进行600微克/毫升NTG处理，按照1:1进行混匀，25℃保温30min，离心取下层细胞，洗涤细胞，于LB（Luria-Bertani）培养基中重悬、其细胞浓度为1.0×108～2.0×108个/ml，25℃培养过夜，稀释涂板，选择能够在10℃～25℃温度条件下，利用正十六烷、苯、菲和环己烷为单一碳源生长、对芳烃及环烷烃有较强的降解能力的菌种即为目标菌种；
B、发酵液制备：
a、目标菌种活化：斜面目标菌种挑出2环至含300ml液体培养基的500ml摇瓶中活化培养，温度25±2℃、100转/分震荡培养18小时，得到活化菌液；
b、制备种子液：将a步骤制得的活化菌液转接到5L摇瓶中培养，5L摇瓶装液量60%，接种量5%，温度25±2℃、100转/分震荡培养24小时，得到种子菌液；
c、初级发酵培养：将b步骤制得的种子菌液导入(200L)一级种子发酵罐中，种子罐装液量80%，接种量5%，控制通风量0.2vvm，，搅拌转速100转/分，pH值控制在7.0，温度25±2℃，培养24小时后，得到一级发酵菌种；
d、发酵培养：将c步骤制得的以及发酵菌种导入（10m3）三级发酵罐，三级发酵罐按60%装液量，接种量5%，控制通风量0.2vvm，过程pH值控制在7.0，温度25±2℃，搅拌速度80转/分，培养30小时后，制得石油烃降解菌发酵原液，其中烃降解菌菌数在2×108个/m以上；
上述摇瓶及发酵罐培养基配方是：液态石蜡0.5份、氯化铵2份、酵母粉0.2份、磷酸二氢钾1.5份、七水硫酸镁0.2份、氯化锰0.1份、氯化钙0.2份、装液量控制在80%、培养温度25℃、控制通风量0.2vvm，搅拌速度控制在50rpm，以上均为质量份数；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
所述的生物聚合物菌发酵原液的制备方法如下：
A、菌种诱变：将野油菜黄单胞菌CGMCC1.1781接种过夜培养，制得待诱变发酵液，然后将待诱变发酵液进行600微克/毫升NTG处理，按照1:1进行混匀，25℃保温30min，离心取下层细胞，洗涤细胞，于LB（Luria-Bertani）培养基中重悬、其细胞浓度为1.0×108～2.0×108个/ml，25℃培养过夜，稀释涂板，选择可在20～40℃温度下，利用糖类为碳源产生生物复合多糖的菌种即为目标菌种；
B、发酵液制备：
a、目标菌种活化：斜面目标菌种挑出2环至含100ml液体培养基的500ml摇瓶中活化培养，温度25±2℃、150转/分震荡培养10小时，得到活化菌液；
b、制备种子液：a步骤制得的活化菌液转接到5L摇瓶中培养，5L摇瓶装液量20%，接种量10%，温度25±2℃、150转/分震荡培养10小时，得到种子菌液；
c、一级发酵培养：将b步骤制得的种子菌液导入(100L)一级种子发酵罐中，种子罐装液量50%，接种量10%，控制通风量0.5vvm，搅拌转速130转/分，pH值控制在7.0～8.0，温度25±2℃，培养8小时后，得到一级发酵菌种；
d、二级发酵培养：将c步骤制得的一集发酵菌种导入二级(1m3)种子罐，二级罐装液量50%，接种量10%，控制通风量0.5vvm，搅拌转速100转/分，pH值控制在7.0～8.0，温度25±2℃，培养5小时，制得二级发酵菌液；
e、发酵培养：将d步骤制得的制得二级发酵菌液导入（10m3）三级发酵罐，三级发酵罐按50%装液量，接种量10%，通风量0.7vvm，过程pH值控制在7.0～8.5，温度25±2℃，搅拌速度80转/分，培养6小时后，即制得生物聚合物菌发酵原液，其中微生物复合多糖在微生物发酵液产品中占1.2%；
上述摇瓶及各级发酵罐培养基配方是：玉米糖浆10份、酵母膏5份、蛋白胨0.2份、磷酸二氢钾1.5份、七水硫酸镁0.3份、氯化钙0.1份、装液量为20%、培养温度25±2℃、pH值7，搅拌速度控制在80rpm；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
实施例2
本发明的一种石油污染土壤修复剂体系，是由土壤调节液、石油烃降解菌剂、固体肥料载体、生物聚合物菌剂和营养液构成，
所述的土壤调节液是由生物脂肽表面活性剂20份、腐殖酸溶液10份、双氧水0.5份、水90份，混合均匀制得，其中腐殖酸溶液的质量浓度为70%；
所述的石油烃降解菌剂是由5份的石油烃降解菌发酵原液与20份营养液，混合均匀制得；
所述的固体肥料载体是将秸秆、树叶和废弃果蔬残余中的一种或者几种的混合物粉碎为1～3mm颗粒，再与有机粪按质量比10:0.5的配比混合，然后用质量浓度为0.05%腐殖酸溶液浸润，常温25℃下，控制湿度50%，堆肥发酵2个月后的发酵混合物备用，使用前将发酵后的混合物与增氧剂按10：0.1混合配比制得，其中增氧剂是由过氧化钙和过氧化尿素按质量配比20：1混合而成；
所述的生物聚合物菌剂是由5份的生物聚合物菌发酵原液与20份营养液，混合均匀制得；
所述的营养液是由糖蜜1份、尿素1份、酵母粉0.1份、玉米浆干粉1份、磷酸氢二钾0.5份、水99份，混合均匀制得；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
所述的石油烃降解菌发酵原液的制备方法如下：
A、菌种诱变：将地衣芽孢杆菌CGMCC1.7461接种过夜培养，制得待诱变发酵液，然后将待诱变发酵液进行750微克/毫升NTG处理，按照1:1进行混匀，25℃保温30min，离心取下层细胞，洗涤细胞，于LB培养基中重悬、其细胞浓度为1.0×108～2.0×108个/ml，25℃培养过夜，稀释涂板，选择能够在10℃～25℃温度条件下，利用正十六烷、苯、菲和环己烷为单一碳源生长、对芳烃及环烷烃有较强的降解能力的菌种即为目标菌种；
B、发酵液制备：
a、目标菌种活化：斜面目标菌种挑出2环至含300ml液体培养基的500ml摇瓶中活化培养，温度25±2℃、100转/分震荡培养24小时，得到活化菌液；
b、制备种子液：将a步骤制得的活化菌液转接到5L摇瓶中培养，5L摇瓶装液量60%，接种量5%，温度25±2℃、100转/分震荡培养30小时，得到种子菌液；
c、初级发酵培养：将b步骤制得的种子菌液导入(200L)一级种子发酵罐中，种子罐装液量80%，接种量5%，控制通风量0.3vvm，搅拌转速100转/分，pH值控制在8.0，温度25±2℃，培养36小时后，得到一级发酵菌种；
d、发酵培养：将c步骤制得的以及发酵菌种导入（10m3）三级发酵罐，三级发酵罐按60%装液量，接种量5%，控制通风量0.3vvm，过程pH值控制在8.5，温度25±2℃，搅拌速度80转/分，培养48小时后，制得石油烃降解菌发酵原液，其中烃降解菌菌数在2×108个/m以上；
上述摇瓶及发酵罐培养基配方是：液态石蜡1份、、氯化铵3份、酵母粉0.4份、磷酸二氢钾2份、七水硫酸镁0.5份、氯化锰0.5份、氯化钙0.5份、装液量控制在80%、培养温度30℃、控制通风量0.3vvm，搅拌速度控制在80rpm，以上均为质量份数；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
所述的生物聚合物菌发酵原液的制备方法如下：
A、菌种诱变：将野油菜黄单胞菌CGMCC1.1781接种过夜培养，制得待诱变发酵液，然后将待诱变发酵液进行750微克/毫升NTG处理，按照1:1进行混匀，25℃保温30min，离心取下层细胞，洗涤细胞，于LB培养基中重悬、其细胞浓度为1.0×108～2.0×108个/ml，25℃培养过夜，稀释涂板，选择可在20～40℃温度下，利用糖类为碳源产生生物复合多糖的菌种即为目标菌种；
B、发酵液制备：
a、目标菌种活化：斜面目标菌种挑出2环至含100ml液体培养基的500ml摇瓶中活化培养，温度25±2℃、150转/分震荡培养15小时，得到活化菌液；
b、制备种子液：a步骤制得的活化菌液转接到5L摇瓶中培养，5L摇瓶装液量20%，接种量10%，温度25±2℃、150转/分震荡培养15小时，得到种子菌液；
c、一级发酵培养：将b步骤制得的种子菌液导入(100L)一级种子发酵罐中，种子罐装液量50%，接种量10%，控制通风量0.5vvm，搅拌转速130转/分，pH值控制在7.0～8.0，温度25±2℃，培养13小时后，得到一级发酵菌种；
d、二级发酵培养：将c步骤制得的一集发酵菌种导入二级(1m3)种子罐，二级罐装液量50%，接种量10%，控制通风量0.6vvm，搅拌转速100转/分，pH值控制在8.0，温度25±2℃，培养6小时，制得二级发酵菌液；
e、发酵培养：将d步骤制得的制得二级发酵菌液导入（10m3）三级发酵罐，三级发酵罐按50%装液量，接种量10%，通风量0.8vvm，过程pH值控制在8.5，温度25±2℃，搅拌速度80转/分，培养7小时后，即制得生物聚合物菌发酵原液，其中微生物复合多糖在微生物发酵液产品中占1.6%；
上述摇瓶及各级发酵罐培养基配方是：玉米糖浆20份、酵母膏7份、蛋白胨0.3份、磷酸二氢钾2份、七水硫酸镁0.5份、氯化钙0.2份、装液量为50%、培养温度25±2℃、pH值8，搅拌速度控制在150rpm，以上为质量份数；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
实施例3
本发明的一种石油污染土壤修复剂体系，是由土壤调节液、石油烃降解菌剂、固体肥料载体、生物聚合物菌剂和营养液构成，
所述的土壤调节液是由生物脂肽表面活性剂15份、腐殖酸溶液5份、双氧水0.3份、水70份，混合均匀制得，其中腐殖酸溶液的质量浓度为70%；
所述的石油烃降解菌剂是由3份的石油烃降解菌发酵原液与18份营养液，混合均匀制得；
所述的固体肥料载体是将秸秆、树叶和废弃果蔬残余中的一种或者几种的混合物粉碎为2mm颗粒，再与有机粪按质量比10:0.5的配比混合，然后用质量浓度为0.05%腐殖酸溶液浸润，常温25℃下，控制湿度30～50%，堆肥发酵2个月后的发酵混合物备用，使用前将发酵后的混合物与增氧剂按10：0.1混合配比制得，其中增氧剂是由过氧化钙和过氧化尿素按质量配比20：1混合而成；
所述的生物聚合物菌剂是由3份的生物聚合物菌发酵原液与18份营养液，混合均匀制得；
所述的营养液是由糖蜜0.5份、尿素0.5份、酵母粉0.05份、玉米浆干粉0.5份、磷酸氢二钾0.3份、水97份，混合均匀制得；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
所述的石油烃降解菌发酵原液的制备方法如下：
A、菌种诱变：将地衣芽孢杆菌CGMCC1.7461接种过夜培养，制得待诱变发酵液，然后将待诱变发酵液进行700微克/毫升NTG处理，按照1:1进行混匀，25℃保温30min，离心取下层细胞，洗涤细胞，于LB培养基中重悬、其细胞浓度为1.0×108～2.0×108个/ml，25℃培养过夜，稀释涂板，选择能够在10℃～25℃温度条件下，利用正十六烷、苯、菲和环己烷为单一碳源生长、对芳烃及环烷烃有较强的降解能力的菌种即为目标菌种；
B、发酵液制备：
a、目标菌种活化：斜面目标菌种挑出2环至含300ml液体培养基的500ml摇瓶中活化培养，温度25±2℃、100转/分震荡培养18～24小时，得到活化菌液；
b、制备种子液：将a步骤制得的活化菌液转接到5L摇瓶中培养，5L摇瓶装液量60%，接种量5%，温度25±2℃、100转/分震荡培养28小时，得到种子菌液；
c、初级发酵培养：将b步骤制得的种子菌液导入(200L)一级种子发酵罐中，种子罐装液量80%，接种量5%，控制通风量0.4vvm，搅拌转速100转/分，pH值控制在7.5，温度25±2℃，培养30小时后，得到一级发酵菌种；
d、发酵培养：将c步骤制得的以及发酵菌种导入（10m3）三级发酵罐，三级发酵罐按60%装液量，接种量5%，控制通风量0.4vvm，过程pH值控制在8.0，温度25±2℃，搅拌速度80转/分，培养36小时后，制得石油烃降解菌发酵原液，其中烃降解菌菌数在2×108个/m以上；
上述摇瓶及发酵罐培养基配方是：液态石蜡0.7份、氯化铵2～3份、酵母粉0.3份、磷酸二氢钾1.8份、七水硫酸镁0.3份、氯化锰0.3份、氯化钙0.3份、装液量控制在80%、培养温度28℃、控制通风量0.4vvm，搅拌速度控制在70rpm，以上均为质量份数；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
所述的生物聚合物菌发酵原液的制备方法如下：
A、菌种诱变：将野油菜黄单胞菌CGMCC1.1781接种过夜培养，制得待诱变发酵液，然后将待诱变发酵液进行700微克/毫升NTG处理，按照1:1进行混匀，25℃保温30min，离心取下层细胞，洗涤细胞，于LB培养基中重悬、其细胞浓度为1.0×108～2.0×108个/ml，25℃培养过夜，稀释涂板，选择可在20～40℃温度下，利用糖类为碳源产生生物复合多糖的菌种即为目标菌种；
B、发酵液制备：
a、目标菌种活化：斜面目标菌种挑出2环至含100ml液体培养基的500ml摇瓶中活化培养，温度25±2℃、150转/分震荡培养12小时，得到活化菌液；
b、制备种子液：a步骤制得的活化菌液转接到5L摇瓶中培养，5L摇瓶装液量20%，接种量10%，温度25±2℃、150转/分震荡培养12小时，得到种子菌液；
c、一级发酵培养：将b步骤制得的种子菌液导入(100L)一级种子发酵罐中，种子罐装液量50%，接种量10%，控制通风量0.5vvm，搅拌转速130转/分，pH值控制在7.5，温度25±2℃，培养10小时后，得到一级发酵菌种；
d、二级发酵培养：将c步骤制得的一集发酵菌种导入二级(1m3)种子罐，二级罐装液量50%，接种量10%，控制通风量0.55vvm，搅拌转速100转/分，pH值控制在7.5，温度25±2℃，培养8小时，制得二级发酵菌液；
e、发酵培养：将d步骤制得的制得二级发酵菌液导入（10m3）三级发酵罐，三级发酵罐按50%装液量，接种量10%，通风量0.75vvm，过程pH值控制在8.0，温度25±2℃，搅拌速度80转/分，培养8小时后，即制得生物聚合物菌发酵原液，其中微生物复合多糖在微生物发酵液产品中占1.8%；
上述摇瓶及各级发酵罐培养基配方是：玉米糖浆15份、酵母膏6份、蛋白胨0.25份、磷酸二氢钾1.8份、七水硫酸镁0.4份、氯化钙0.15份、装液量为40%、培养温度25±2℃、pH值7.5，搅拌速度控制在100rpm，以上为质量份数；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
利用实施例1、实施例2或实施例3所制得的一种石油污染土壤修复剂体系，其具体实施工艺操作步骤如下：先喷洒土壤调节液，每平方米喷洒1～4L；然后喷洒石油烃降解菌剂，每平方米喷洒1～4L后，铺撒增氧剂（由过氧化钙和过氧化尿素按质量配比20：1混合而成），每平方米均匀铺撒100～200g；再喷洒生物聚合物菌剂，每平方米喷洒1～2L后，铺撒固体肥料载体颗粒1～2cm厚，最后再次喷洒生物聚合物菌剂，每平方米喷洒1～4L即可；喷洒的过程需按照顺序和用量依次连续喷洒，对处理原油污染土壤，可定期按实际土壤湿度喷洒土壤调节液及石油烃降解菌营养液，控制土壤湿度30%～50%，可提高原油降解时间。

Claims (6)

1.一种石油污染土壤修复剂体系，是由土壤调节液、石油烃降解菌剂、固体肥料载体、生物聚合物菌剂和营养液构成，
所述的土壤调节液是由生物脂肽表面活性剂10～20份、腐殖酸溶液1～10份、双氧水0.1～0.5份、水60～90份，混合均匀制得；
所述的石油烃降解菌剂是由1～5份的石油烃降解菌发酵原液与15～20份营养液，混合均匀制得；
所述的固体肥料载体是将秸秆、树叶和废弃果蔬残余中的一种或者几种的混合物粉碎为1～3mm颗粒，再与有机粪按质量比10:0.5的配比混合，然后用质量浓度为0.05%腐殖酸溶液浸润，常温25℃下，控制湿度30～50%，堆肥发酵2个月后，与增氧剂按10：0.1混合均匀，即得固体肥料载体；
所述的生物聚合物菌剂是由1～5份的生物聚合物菌发酵原液与15～20份营养液，混合均匀制得；
所述的营养液是由糖蜜0.1～1份、尿素0.1～1份、酵母粉0.01～0.1份、玉米浆干粉0.1～1份、磷酸氢二钾0.1～0.5份、水96～99份，混合均匀制得；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
2.如权利要求1所述的一种石油污染土壤修复剂体系，其特征在于所述的石油烃降解菌发酵原液的制备方法如下：
A、菌种诱变：将地衣芽孢杆菌CGMCC1.7461接种过夜培养，制得待诱变发酵液，然后将待诱变发酵液进行600～750微克/毫升NTG处理，按照1:1进行混匀，25℃保温30min，离心取下层细胞，洗涤细胞，于LB培养基中重悬、其细胞浓度为1.0×108～2.0×108个/ml，25℃培养过夜，稀释涂板，选择能够在10℃～25℃温度条件下，利用正十六烷、苯、菲和环己烷为单一碳源生长、对芳烃及环烷烃有较强的降解能力的菌种即为目标菌种；
B、发酵液制备：
a、目标菌种活化：斜面目标菌种挑出2环至含300ml液体培养基的500ml摇瓶中活化培养，温度25±2℃、100转/分震荡培养18～24小时，得到活化菌液；
b、制备种子液：将a步骤制得的活化菌液转接到5L摇瓶中培养，5L摇瓶装液量60%，接种量5%，温度25±2℃、100转/分震荡培养24～30小时，得到种子菌液；
c、初级发酵培养：将b步骤制得的种子菌液导入一级种子发酵罐中，种子罐装液量80%，接种量5%，控制通风量0.2～0.4vvm，搅拌转速100转/分，pH值控制在7.0～8.0，温度25±2℃，培养24～36小时后，得到一级发酵菌种；
d、发酵培养：将c步骤制得的以及发酵菌种导入三级发酵罐，三级发酵罐按60%装液量，接种量5%，控制通风量0.2～0.4vvm，过程pH值控制在7.0～8.5，温度25±2℃，搅拌速度80转/分，培养30～48小时后，制得石油烃降解菌发酵原液；
摇瓶及发酵罐培养基配方是：液态石蜡0.5～1份、氯化铵2～3份、酵母粉0.2～0.4份、磷酸二氢钾1.5～2份、七水硫酸镁0.2～0.5份、氯化锰0.1～0.5份、氯化钙0.2～0.5份、装液量控制在80%、培养温度25～30℃、控制通风量0.2～0.4vvm，搅拌速度控制在50～80rpm，以上均为质量份数；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
3.如权利要求1所述的一种石油污染土壤修复剂体系，所述的生物聚合物菌发酵原液的制备方法如下：
A、菌种诱变：将野油菜黄单胞菌CGMCC1.1781接种过夜培养，制得待诱变发酵液，然后将待诱变发酵液进行600～750微克/毫升NTG处理，按照1:1进行混匀，25℃保温30min，离心取下层细胞，洗涤细胞，于LB培养基中重悬、其细胞浓度为1.0×108～2.0×108个/ml，25℃培养过夜，稀释涂板，选择可在20～40℃温度下，利用糖类为碳源产生生物复合多糖的菌种即为目标菌种；
B、发酵液制备：
a、目标菌种活化：斜面目标菌种挑出2环至含100ml液体培养基的500ml摇瓶中活化培养，温度25±2℃、150转/分震荡培养10～15小时，得到活化菌液；
b、制备种子液：a步骤制得的活化菌液转接到5L摇瓶中培养，5L摇瓶装液量20%，接种量10%，温度25±2℃、150转/分震荡培养10～15小时，得到种子菌液；
c、一级发酵培养：将b步骤制得的种子菌液导入一级种子发酵罐中，种子罐装液量50%，接种量10%，控制通风量0.5vvm，搅拌转速130转/分，pH值控制在7.0～8.0，温度25±2℃，培养8～13小时后，得到一级发酵菌种；
d、二级发酵培养：将c步骤制得的一集发酵菌种导入二级种子罐，二级罐装液量50%，接种量10%，控制通风量0.5～0.6vvm，搅拌转速100转/分，pH值控制在7.0～8.0，温度25±2℃，培养5～8小时，制得二级发酵菌液；
e、发酵培养：将d步骤制得的制得二级发酵菌液导入三级发酵罐，三级发酵罐按50%装液量，接种量10%，通风量0.7～0.8vvm，过程pH值控制在7.0～8.5，温度25±2℃，搅拌速度80转/分，培养6～8小时后，即制得生物聚合物菌发酵原液；
摇瓶及各级发酵罐培养基配方是：玉米糖浆10～20份、酵母膏5～7份、蛋白胨0.2～0.3份、磷酸二氢钾1.5～2份、七水硫酸镁0.3～0.5份、氯化钙0.1～0.2份、装液量为20～50%、培养温度25±2℃、pH值7～8，搅拌速度控制在80～150rpm；
以上均为质量份数、质量比和质量百分比。
4.如权利要求1所述的一种石油污染土壤修复剂体系的制备方法，其特征在于固体肥料载体中的增氧剂是由过氧化钙和过氧化尿素按质量配比20：1混合而成。
5.如权利要求1所述的一种石油污染土壤修复剂体系的制备方法，其特征在于土壤调节液中的腐殖酸溶液的质量浓度大于50%。
6.一种石油污染土壤修复剂体系的实施工艺，其具体操作步骤如下：先喷洒土壤调节液，每平方米喷洒1～4L；然后喷洒石油烃降解菌剂，每平方米喷洒1～4L后，铺撒增氧剂，每平方米均匀铺撒100～200g；再喷洒生物聚合物菌剂，每平方米喷洒1～2L后，铺撒固体肥料载体颗粒1～2cm厚，最后再次喷洒生物聚合物菌剂，每平方米喷洒1～4L即可。
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