CN108004174B - 治理土壤污染的复合微生物菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明专利公开了一种复合微生物菌剂，包括如下重量份的原料组分：醋化醋杆菌培养物30～45份、禾谷镰刀菌培养物35～60份、酵母菌培养物10～20份、微球菌培养物15～20份和枯草芽孢杆菌培养物10～20份；该复合微生物菌剂通过醋化醋杆菌培养物和禾谷镰刀菌培养物、微球菌和枯草芽孢杆菌的混合培养物以及其他用于治理污染土壤的微生物混合制成的混合菌剂，对碱性土壤中的污染物石油烃进行安全有效的分解，同时菌种的混合培养以及培养基的调配有效抑制禾谷镰刀菌中有害孢子的形成。

Description

治理土壤污染的复合微生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种微生物菌剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种用于受有机物污染的碱性土壤处理的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
人为活动产生的污染物进入土壤并积累到一定程度，引起土壤质量恶化，并进而造成农作物中某些指标超过国家标准，导致土壤污染。污染物进入土壤的途径是多样的，废气中含有的污染物质，特别是颗粒物，在重力作用下沉降到地面进入土壤，废水中携带大量污染物进入土壤，固体废物中的污染物直接进入土壤或其渗出液进入土壤。其中石油的开采、冶炼、使用和运输过程的污染和遗漏事故，以及含油废水的排放、污水灌溉，各种石油制品的挥发、不完全燃烧物飘落等引起一系列土壤石油污染问题。
现有技术中，施用化学方法，如化学改良剂、表面活性剂或采取生物改良措施，增加土壤环境容量，增强土壤净化能力向土壤中施用石灰、碱性磷酸盐、氧化铁、碳酸盐和硫化物等化学改良剂，加速有机物的分解；但是因为我国土壤酸碱各异，尤其在滨海平原、河口三角洲、黄淮海平原受自然条件和土壤内在因素的综合影响而形成滨海盐渍区和黄淮海平原盐渍区，采用常用的化学方法处理受污染的土壤时，丰富的钙质、过量地施用石灰以及引灌碱质污水反而会加重土壤碱性情况的恶化。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种复合微生物菌剂。
本发明的第二目的是提供该复合微生物菌剂的制备方法。
本发明的第三目的是提供该复合微生物菌剂的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供了一种复合微生物菌剂，包括如下重量份的原料组分：醋化醋杆菌培养物30～45份、酵母菌培养物10～20份、禾谷镰刀菌培养物35～60份、微球菌培养物15～20份和枯草芽孢杆菌培养物10～20份。
其中，醋化醋杆菌培养物为醋化醋杆菌ATCC 8303培养物、醋化醋杆菌ATCC 23747培养物或醋化醋杆菌ATCC 23751培养物；禾谷镰刀菌培养物为谷镰刀菌ATCC 60881培养物、谷镰刀菌ATCC 46779培养物或谷镰刀菌ATCC 200362培养物；所述酵母菌培养物为假丝酵母NYNU 14719培养物；所述微球菌培养物为芽孢八叠球菌NBRC 105378培养物；所述枯草芽孢杆菌培养物为枯草芽孢杆菌ATCC 21556培养物。
进一步地，复合微生物菌剂还包括如下重量份的原料组分：链霉菌培养物2～5份，木霉菌培养物2～5份、青霉菌培养物2～5份和吸附剂420～1100份。
其中，链霉菌培养物为褐色链霉菌培养物或纤维素链霉菌培养物；木霉菌培养物为绿色木霉菌培养物或黑曲霉菌培养物；青霉菌培养物为柑橘青霉菌培养物或草酸青霉菌培养物；吸附剂的溶质为纤维粉、碳粉、高岭土和阴离子聚丙烯酰胺中的一种或几种，溶剂为水。
复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)扩大培养：将所述原料组分中的各菌种，分别通过摇瓶或固体培养基扩大培养，得到各菌种的培养物；
(2)混合培养：采用混合培养基A对醋化醋杆菌培养物、禾谷镰刀菌培养物和酵母菌培养(产生二氧化碳)物按重量份进行混合培养得到混合培养物A，酵母菌培养物和醋化醋杆菌培养物产生的酸性环境以及二氧化碳有效抑制了禾谷镰刀菌培养物致病孢子的产生，相反产生大量菌丝体，菌丝体产生大量酶，对土壤中的有机污染物起到有效降解的作用；采用混合培养基B对微球菌培养物、枯草芽孢杆菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物B；采用混合培养基C对链霉菌培养物、木霉菌培养物和青霉菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物C；
(3)在装有发酵培养基的发酵罐中，灭菌，冷却，采用压差法将混合培养物A、混合培养物B、混合培养物C分别压入发酵罐进行一级发酵，得到各混合培养物的一级发酵液；
(4)将步骤(3)得到的三种混合培养物的一级发酵液均匀混合，共同液压入二级发酵罐，得到二级混合发酵液；
(5)将二级混合发酵液用吸附剂吸附，控制有效活菌数≥1.5×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
优选地，步骤(1)扩大培养中，在表压0.1Mpa～0.15Mpa、121℃～125℃下灭菌0.5～1小时，放置冷却至常温后，对各菌种摇瓶培养，摇瓶培养的条件为：将醋化醋杆菌、微球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、链霉菌、木霉菌、青霉菌中的一种或几种分别接种于摇瓶中，于温度27～30℃，转速160rpm～180rpm摇床培养1～3天；同时，将禾谷镰刀菌置于固体培养基进行扩大培养，培养基为PDA斜面培养基，培养天数为1～3天，培养温度为24～25℃，遮光培养，抑制芽孢产生；其中，PDA培养基组分为：马铃薯淀粉50g/L、葡萄糖250g/L和琼脂15g/L。
进一步地，步骤(2)中，所述混合培养基A包含如下组分浓度的组分：麦芽浸膏5～10g/L、葡萄糖200～300g/L、酵母粉15～20g/L、琼脂10～15g/L和KH2PO4 20～30g/L，pH为5.5～6，培养完成后加入CaCO3用于固定酵母菌；所述混合培养基B包含如下浓度的组分：胰蛋白胨8～12g/L、大豆胨10～20g/L、牛肉膏粉2～5g/L、氯化钠5～8g/L、琼脂10～20g/L、MnSO4·H2O 3～5g/L，pH 7.3±0.2，其中，MnSO4·H2O的加入有利于产生芽孢。；所述混合培养基C包含如下组分浓度的组分：氯霉素0.1～0.5g/L、麦芽膏粉100～200g/L、琼脂10～15g/L，pH 6.0±0.2。
优选地，步骤(3)中，所述灭菌为高压蒸汽灭菌，温度为110℃～140℃，时间为0.5～2小时；所述冷却的温度为30～35℃；进一步地，一级发酵的冷却期间，始终保持罐内为正压状态，表压控制在0.05Mpa，采用压差法将种子液压入发酵罐，控制压力0.05Mpa，温度28℃，无菌空气通气量为罐容积的0.5～1倍；
优选地，步骤(3)和步骤(4)中，一级发酵与二级发酵的发酵培养基均包含如下百分比的组分：豆饼粉5.2～5.6％、玉米粉4.8～5.6％、Na2HPO4 2.2～2.7％、(NH4)2SO40.2～0.4％、NH4Cl 0.1～0.2％和CaCl2 0.1～0.2％。
进一步地，步骤(5)中，所述发酵液与吸附剂按照质量比为1:4～6，在温度28～30℃条件下置于搅拌机搅拌混合0.5～1小时；控制有效活菌数≥1.5×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
复合微生物菌剂在碱性土壤污染物处理中的应用，优选地，为碱性土壤中石油烃污染的处理的应用。
优选地，该复合微生物菌剂在受污染的碱性土壤处理中的应用方式为：将该复合微生物菌剂投放于待处理的土壤，所投放的复合微生物菌剂体积为待处理土壤体积的1～2％。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：通过醋化醋杆菌培养物和禾谷镰刀菌培养物以及其他用于治理污染土壤的微生物混合制成的混合菌剂，对碱性土壤中的有机污染物，特别是污染物石油烃进行安全有效的降解，同时菌种的混合培养以及化学试剂的添加有效抑制禾谷镰刀菌中有害孢子的形成。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案作详细的说明，如无特殊说明，下列原料均可从市售获得。
实施例1
原料组分：醋化醋杆菌ATCC 8303培养物30份、谷镰刀菌ATCC 60881培养物35份、芽孢八叠球菌NBRC 105378培养物15份、枯草芽孢杆菌ATCC 21556培养物10份、酵母菌NYNU14719培养物10份、褐色链霉菌ATCC 23896培养物2份、绿色木霉菌ATCC 26802培养物2份、柑橘青霉菌ATCC 48955培养物2份、吸附剂(溶质为纤维粉、碳粉、高岭土，溶剂为水)420份。
制备及应用：(1)扩大培养：将所述原料组分中的各菌种，分别通过摇瓶或固体培养基扩大培养，得到各菌种的培养物；在表压0.1Mpa、121℃下灭菌1小时，放置冷却至常温后，对各菌种摇瓶培养，摇瓶培养的条件为：将除了禾谷镰刀菌以外的原料组分中的其他各菌种分别接种于摇瓶中，于温度27℃，转速160rpm摇床培养3天；同时，将禾谷镰刀菌置于固体培养基进行扩大培养，培养基为PDA斜面培养基，培养天数为1天，培养温度为24℃，遮光培养，抑制芽孢产生。
(2)混合培养：采用混合培养基A对醋化醋杆菌培养物、禾谷镰刀菌培养物和酵母菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物A；混合培养基A：麦芽浸膏5g/L、葡萄糖200g/L、酵母粉15g/L、琼脂10g/L和KH2PO4 20g/L，pH为6，培养完成后加入CaCO3用于固定酵母菌；
采用混合培养基B对微球菌培养物、枯草芽孢杆菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物B；混合培养基B：胰蛋白胨8g/L、大豆胨10g/L、牛肉膏粉2g/L、氯化钠5g/L、琼脂10g/L、MnSO4·H2O 3g/L，pH 7.5。
采用混合培养基C对链霉菌培养物、木霉菌培养物和青霉菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物C；混合培养基C：氯霉素0.1g/L、麦芽膏粉100g/L、琼脂10g/L，pH6.2。
(3)在装有发酵培养基的发酵罐中，灭菌，温度为110℃，时间为0.5小时；冷却，冷却的温度为30℃，采用压差法将混合培养物A、混合培养物B、混合培养物C分别压入发酵罐进行一级发酵，得到各混合培养物的一级发酵液；
(4)将步骤(3)得到的三种混合培养物的一级发酵液均匀混合，共同液压入二级发酵罐，得到二级混合发酵液；一级发酵与二级发酵的发酵培养基均包含如下百分比的组分：豆饼粉5.2％、玉米粉4.8％、Na2HPO4 2.2％、(NH4)2SO4 0.2％、NH4Cl 0.1％和CaCl2 0.1％。
(5)将二级混合发酵液用吸附剂吸附，发酵液与吸附剂按照质量比为1:4，在温度28℃条件下置于搅拌机搅拌混合0.5小时；控制有效活菌数为1.5×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
(6)将该复合微生物菌剂投放于待处理的土壤，所投放的复合微生物菌剂体积为待处理土壤体积的2％。
实施例2
原料组分：醋化醋杆菌ATCC 23747培养物35份、谷镰刀菌ATCC 60881培养物50份、芽孢八叠球菌NBRC 105378培养物18份、枯草芽孢杆菌ATCC 21556培养物15份、酵母菌NYNU14719培养物15份、褐色链霉菌ATCC 23896培养物3份、绿色木霉菌ATCC 26802培养物3份、柑橘青霉菌ATCC 48955培养物3份和吸附剂(溶质为纤维粉、碳粉，溶剂为水)710份。
制备及应用：(1)扩大培养：将所述原料组分中的各菌种，分别通过摇瓶或固体培养基扩大培养，得到各菌种的培养物；在表压0.13Mpa、123℃下灭菌0.75小时，放置冷却至常温后，对各菌种摇瓶培养，摇瓶培养的条件为：将除了禾谷镰刀菌以外的原料组分中的其他各菌种分别接种于摇瓶中，于温度28℃，转速170rpm摇床培养2天；同时，将禾谷镰刀菌置于固体培养基进行扩大培养，培养基为PDA斜面培养基，培养天数为2天，培养温度为25℃，遮光培养，抑制芽孢产生。
(2)混合培养：采用混合培养基A对醋化醋杆菌培养物、禾谷镰刀菌培养物和酵母菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物A；混合培养基A：麦芽浸膏7g/L、葡萄糖250g/L、酵母粉17g/L、琼脂13g/L和KH2PO4 25g/L，pH为6，培养完成后加入CaCO3用于固定酵母菌；
采用混合培养基B对微球菌培养物、枯草芽孢杆菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物B；混合培养基B：胰蛋白胨10g/L、大豆胨15g/L、牛肉膏粉3g/L、氯化钠6g/L、琼脂15g/L、MnSO4·H2O 4g/L，pH 7.3；
采用混合培养基C对链霉菌培养物、木霉菌培养物和青霉菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物C；混合培养基C：氯霉素0.3g/L、麦芽膏粉150g/L、琼脂13g/L，pH6.0。
(3)在装有发酵培养基的发酵罐中，灭菌，温度为125℃，时间为1小时；冷却，冷却的温度为33℃，采用压差法将混合培养物A、混合培养物B、混合培养物C分别压入发酵罐进行一级发酵，得到各混合培养物的一级发酵液；
(4)将步骤(3)得到的三种混合培养物的一级发酵液均匀混合，共同液压入二级发酵罐，得到二级混合发酵液；一级发酵与二级发酵的发酵培养基均包含如下百分比的组分：豆饼粉5.4％、玉米粉5.2％、Na2HPO4 2.5％、(NH4)2SO4 0.3％、NH4Cl 0.15％和CaCl20.15％。
(5)将二级混合发酵液用吸附剂吸附，发酵液与吸附剂按照质量比为1:5，在温度29℃条件下置于搅拌机搅拌混合0.75小时；控制有效活菌数为2×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
(6)将该复合微生物菌剂投放于待处理的土壤，所投放的复合微生物菌剂体积为待处理土壤体积的1.5％。
实施例3
原料组分：醋化醋杆菌ATCC 23751培养物45份、谷镰刀菌ATCC 200362培养物60份、芽孢八叠球菌NBRC 105378培养物20份、枯草芽孢杆菌ATCC 21556培养物20份、酵母菌NYNU 14719培养物20份、纤维素链霉菌ATCC 3313培养物5份、黑曲霉菌AS 3.3289培养物5份、草酸青霉菌CGMCC No.9092培养物5份和吸附剂(溶质为纤维粉、碳粉、高岭土和阴离子聚丙烯酰胺，溶剂为水)1100份。
制备及应用：(1)扩大培养：将所述原料组分中的各菌种，分别通过摇瓶或固体培养基扩大培养，得到各菌种的培养物；在表压0.15Mpa、125℃下灭菌1小时，放置冷却至常温后，对各菌种摇瓶培养，摇瓶培养的条件为：将除了禾谷镰刀菌以外的原料组分中的其他各菌种分别接种于摇瓶中，于温度30℃，转速160rpm摇床培养1天；同时，将禾谷镰刀菌置于固体培养基进行扩大培养，培养基为PDA斜面培养基，培养天数为3天，培养温度为25℃，遮光培养，抑制芽孢产生。
(2)混合培养：采用混合培养基A对醋化醋杆菌培养物、禾谷镰刀菌培养物和酵母菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物A；混合培养基A：麦芽浸膏10g/L、葡萄糖300g/L、酵母粉20g/L、琼脂15g/L和KH2PO4 30g/L，pH为5.5，培养完成后加入CaCO3用于固定酵母菌；
采用混合培养基B对微球菌培养物、枯草芽孢杆菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物B；混合培养基B：胰蛋白胨12g/L、大豆胨20g/L、牛肉膏粉5g/L、氯化钠8g/L、琼脂20g/L、MnSO4·H2O 5g/L，pH 7.1；
采用混合培养基C对链霉菌培养物、木霉菌培养物和青霉菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物C；混合培养基C：氯霉素0.5g/L、麦芽膏粉200g/L、琼脂15g/L，pH5.8。
(3)在装有发酵培养基的发酵罐中，灭菌，温度为140℃，时间为2小时；冷却，冷却的温度为35℃，采用压差法将混合培养物A、混合培养物B、混合培养物C分别压入发酵罐进行一级发酵，得到各混合培养物的一级发酵液；
(4)将步骤(3)得到的三种混合培养物的一级发酵液均匀混合，共同液压入二级发酵罐，得到二级混合发酵液；一级发酵与二级发酵的发酵培养基均包含如下百分比的组分：豆饼粉5.6％、玉米粉5.6％、Na2HPO4 2.7％、(NH4)2SO4 0.4％、NH4Cl 0.2％和CaCl2 0.2％。
(5)将二级混合发酵液用吸附剂吸附，发酵液与吸附剂按照质量比为1:6，在温度30℃条件下置于搅拌机搅拌混合1小时；控制有效活菌数为1.5×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
(6)将该复合微生物菌剂投放于待处理的土壤，所投放的复合微生物菌剂体积为待处理土壤体积的2％。
实施例4
原料组分：醋化醋杆菌ATCC 23751培养物45份、谷镰刀菌ATCC 200362培养物60份、酵母菌NYNU 14719培养物20份、芽孢八叠球菌NBRC 105378培养物20份、枯草芽孢杆菌ATCC 21556培养物20份和吸附剂(溶质为纤维粉、高岭土，溶剂为水)500份。
制备及应用：具体步骤与实施条件与实施例3相同。
对比例1
原料组分：醋化醋杆菌ATCC 8303培养物45份、谷镰刀菌ATCC 60881培养物55份、酵母菌NYNU 14719培养物20份和吸附剂吸附剂(溶质为纤维粉、碳粉、高岭土和阴离子聚丙烯酰胺，溶剂为水)500份。
制备及应用：其他具体步骤与实施条件与实施例3相同。
对比例2
原料组分：芽孢八叠球菌NBRC 105378培养物60份、枯草芽孢杆菌ATCC 21556培养物60份和吸附剂500份。
制备及应用：其他具体步骤与实施条件与实施例3相同。
对比例3
原料组分：褐色链霉菌ATCC 23896培养物40份、绿色木霉菌ATCC 26802培养物40份、柑橘青霉菌ATCC 48955培养物40份和吸附剂吸附剂(溶质为纤维粉、碳粉、高岭土和阴离子聚丙烯酰胺，溶剂为水)500份。
制备及应用：其他具体步骤与实施条件与实施例3相同。
对比例4
原料组分：芽孢八叠球菌NBRC 105378培养物40份、枯草芽孢杆菌ATCC 21556培养物40份、褐色链霉菌ATCC 23896培养物10份、绿色木霉菌ATCC 26802培养物10份、柑橘青霉菌ATCC 48955培养物10份和吸附剂吸附剂(溶质为纤维粉、碳粉、高岭土和阴离子聚丙烯酰胺中的一种或几种，溶剂为水)500份。
制备及应用：其他具体步骤与实施条件与实施例3相同。
对比例5
原料组分：醋化醋杆菌ATCC 23751培养物45份、谷镰刀菌ATCC 200362培养物60份、酵母菌NYNU 14719培养物20份、褐色链霉菌ATCC 23896培养物5份、绿色木霉菌ATCC26802培养物5份、柑橘青霉菌ATCC 48955培养物5份和吸附剂吸附剂(溶质为纤维粉、碳粉、高岭土和阴离子聚丙烯酰胺中的一种或几种，溶剂为水)560份。
制备及应用：其他具体步骤与实施条件与实施例3相同。
使用上述实施例1～3以及对比例1～5中的复合微生物菌剂对受有机物如石油烃污染的碱性土壤中的污染物进行处理，通过对土壤中的有机污染物如石油烃标准化检测，结果如表1：
表1不同原料组分的复合微生物菌剂对受污染土壤中石油烃降解率的影响
Figure BDA0001522719510000081
Figure BDA0001522719510000091
由表1可知，实施例1～3对含重金属工业废水处理效果理想，对石油烃的降解率在70％以上；其中，实施例3降解石油烃的效果最好。对比例1～5说明当醋化醋杆菌、谷镰刀菌和酵母菌的混合培养物，或芽孢八叠球菌和枯草芽孢杆菌的混合培养物单独作用于受污染土壤时，污染物石油烃的降解率不超过38％；链霉菌、木霉菌和青霉菌的混合培养物对受污染土壤石油烃作用很小，约为4.98％；只有当醋化醋杆菌、谷镰刀菌、酵母菌、芽孢八叠球菌和枯草芽孢杆菌共同作用于受污染土壤时，才能对石油烃起到良好的降解作用；但是尤其当醋化醋杆菌、谷镰刀菌和酵母菌的混合培养物、芽孢八叠球菌和枯草芽孢杆菌的混合培养物与链霉菌、木霉菌和青霉菌的混合培养物共同作用于受污染土壤时，对石油烃的降解率最高可达到89.51％。由此可见，本发明中的复合微生物菌剂中的原料组分缺一不可，均对治理碱性土壤污染物之一石油烃起到不可忽视的作用。

Claims (2)

1.一种复合微生物菌剂，其特征在于：由如下重量份的原料组分组成：醋化醋杆菌培养物30~45份、禾谷镰刀菌培养物35~60份、酵母菌培养物10~20份、芽孢八叠球菌培养物15~20份、枯草芽孢杆菌培养物10~20份、链霉菌培养物2~5份，木霉菌培养物2~5份、青霉菌培养物2~5份和吸附剂420~1100份，所述醋化醋杆菌培养物为醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）ATCC 8303培养物、醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）ATCC 23747培养物或醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）ATCC 23751培养物；所述禾谷镰刀菌培养物为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）ATCC 60881培养物或禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）ATCC 200362培养物；所述酵母菌培养物为假丝酵母（Candida sp.）NYNU 14719培养物；所述芽孢八叠球菌培养物为芽孢八叠球菌（Sporosarcina luteola）NBRC 105378培养物；所述枯草芽孢杆菌培养物为枯草芽孢杆菌（Baclillus subtilis）ATCC 21556培养物、所述链霉菌培养物为褐色链霉菌（Streptomyces chromosuscus）ATCC 23896培养物或纤维素链霉菌（Streptomyces cellulosae）ATCC 3313培养物；所述木霉菌培养物为绿色木霉菌（Trichoderma viride）ATCC 26802培养物；所述青霉菌培养物为柑橘青霉菌（Penicillium italicum Wehmer， anamorph）ATCC 48955培养物或草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）CGMCC No.9092培养物；所述吸附剂的溶质为纤维粉、碳粉、高岭土和阴离子聚丙烯酰胺中的一种或几种，溶剂为水。
2.权利要求1所述的复合微生物菌剂在受石油烃污染的碱性土壤处理中的应用。
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