CN101289693B - 一种用于胃组织的高表达piRNA探针及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于胃组织的高表达piRNA探针及其检测方法，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，寡聚核苷酸编码片段为至少一种下述piRNA序列：hsa_piR_009466，hsa_piR_005270，hsa_piR_000663，hsa_piR_012518，hsa_piR_001302，hsa_piR_000562，hsa_piR_001048，hsa_piR_002062和hsa_piR_011186；用上述高表达piRNA探针对胃组织的piRNA进行杂交检测，能检测出胃组织中异常高表达的piRNA，作为胃组织发生癌变的一种诊断标志，这些piRNA进一步可作为设计定向胃癌药物的靶点，因此本发明为胃癌的诊断和定向治疗提供了有利的依据。
Description
技术领域
本发明涉及piRNA，具体涉及一种用于检测胃组织的高表达piRNA探针及其检测方法。
背景技术
真核基因组中除了有编码蛋白质的基因外，还有一大部分DNA被转录成非编码RNA(noncoding RNAs，ncRNAs)。近年来的研究发现，许多ncRNA可在多个层次上调节着基因的表达，特别是小RNA在基因表达调控中的作用及其与疾病发生、发展的关系越来越引起了人们的重视。前期研究已经发现了2类对基因表达有重要调控作用的小RNA——短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)。
2006年俄罗斯、日本和美国的四家实验室几乎同时报道，在生物体内存在除siRNA和miRNA以外的另一类小RNA。这些小RNA与前2类小RNA的主要区别在于其长度更长(约为30个核苷酸)和采用不同的机制实现对基因表达的调控。因此，这类RNA被称为第三类小RNA。目前已从多种生物中发现了第三类小RNA。研究发现，它们可与小鼠和大鼠的阿格蛋白亚家族Piwi相互作用，因此根据其功能将其命名为Piwi相互作用RNA(Piwi-interacting RNA，piRNA)。
阿格蛋白(argonaute protein)的主要功能与小分子RNA相关的基因沉默作用有密切关系。RNA沉默作用通过降解mRNA、抑制翻译和重建染色体等方式调节基因的表达。RNA沉默主要通过RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)和转录的基因沉默RNA诱导起始复合物(RNA-induced initiation of transcriptional genesilencing，RITS)来发挥作用。这些复合物的主要成分包括小分子RNA和阿格蛋白。阿格蛋白家族是在所有RISC和RITS复合物中均存在的唯一共同成分。这说明阿格蛋白在小分子RNA相关的RNA沉默机制中具有独特的功能。也说明piRNA在基因表达调控中起着重要作用。
我国是胃癌高发区，现有的技术中均没有涉及到胃组织的癌变与哪些高表达的piRNA有关。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测胃癌组织的piRNA异常表达的探针，还提供了利用该探针检测胃癌组织的piRNA高表达的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于胃组织的高表达piRNA探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，所述的寡聚核苷酸编码片段为至少一种下述piRNA序列：hsa_piR_009466，hsa_piR_005270，hsa_piR_000663，hsa_piR_012518，hsa_piR_001302，hsa_piR_000562，hsa_piR_001048，hsa_piR_002062和hsa_piR_011186。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列和hsa_piR_005270序列组成。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_005270序列和hsa_piR_000663序列组成。
所述的寡聚核苷酸编码片段还包括下述piRNA序列：hsa_piR_001809，hsa_piR_000139，hsa_piR_001184，hsa_piR_001205，hsa_piR_001318，hsa_piR_011187，hsa_piR_000775和hsa_piR_000651。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列和hsa_piR_001809序列组成。
所述的寡聚核苷酸编码片段还包括下述piRNA序列：hsa_piR_001040，hsa_piR_001159，hsa_piR_000823，hsa_piR_000121、hsa_piR_001934，hsa_piR_000794，hsa_piR_000441和hsa_piR_000560。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列和hsa_piR_001040序列组成。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_001809序列和hsa_piR_001040序列组成。
寡聚核苷酸编码片段也可以为下述piRNA序列组成：hsa_piR_009466、hsa_piR_005270、hsa_piR_000663、hsa_piR_012518、hsa_piR_001302、hsa_piR_000562、hsa_piR_001048、hsa_piR_002062、hsa_piR_011186、hsa_piR_001809、hsa_piR_000139、hsa_piR_001184、hsa_piR_001205、hsa_piR_001318、hsa_piR_011187、hsa_piR_000775、hsa_piR_000651、hsa_piR_001040、hsa_piR_001159、hsa_piR_000823、hsa_piR_000121、hsa_piR_001934、hsa_piR_000794、hsa_piR_000441和hsa_piR_000560。
一种用上述高表达探针检测胃癌组织的piRNA的方法，依次包括总RNA提取、总RNA质量分析、微离心过滤得到小RNA样品、添加Poly(A)聚合酶和用Cy3和Cy5特异性荧光标记小RNA样品步骤，用所述的高表达piRNA探针对荧光标记的小RNA样品杂交检测。
化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段能与靶piRNA互补杂交；延伸臂片段能使与它连接的编码片段离片基有一定的距离，减少杂交空间阻碍；探针杂交的Tm值是通过化学修饰来平衡的。
探针是为光敏试剂原位合成的微流体芯片；piR＝piRNA。
上述piRNA在RNA基因数据库中都能找到，延伸臂片段可以用分子生物学上能减少杂交空间阻碍的任何延伸臂片段。
与现有技术相比，本发明的优点在于用于胃组织的高表达piRNA探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，寡聚核苷酸编码片段为至少一种下述piRNA序列：hsa_piR_009466，hsa_piR_005270，hsa_piR_000663，hsa_piR_012518，hsa_piR_001302，hsa_piR_000562，hsa_piR_001048，hsa_piR_002062和hsa_piR_011186，探针能对胃组织的piRNA进行杂交检测，能检测出异常高表达的piRNA，在癌变的胃组织中探针组成的每种piRNA的量就比正常的胃组织的每种piRNA的量高出许多，piRNA探针从而就检测出胃癌组织中piRNA异常变异，作为胃组织发生癌变的一种诊断标志，piRNA进一步可作为设计定向胃癌药物的靶点，因此本发明为胃癌的诊断和定向治疗提供了有利的依据。hsa_piR_001809，hsa_piR_000139，hsa_piR_001184，hsa_piR_001205，hsa_piR_001318，hsa_piR_011187，hsa_piR_000775和hsa_piR_000651和hsa_piR_001040，hsa_piR_001159，hsa_piR_000823，hsa_piR_000121、hsa_piR_001934，hsa_piR_000794，hsa_piR_000441和hsa_piR_000560的任一序列也是组成用于胃组织的高表达piRNA探针的聚核苷酸编码片段的成份；也能检测出胃癌组织中piRNA异常变异。
附图说明
图1为胃癌旁组织piRNA探针检测照片；
图2为胃癌组织piRNA探针检测照片；
图3为胃癌组织与胃癌旁组织piRNA探针检测差异比较照片。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，为光敏试剂原位合成的微流体芯片，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，其中寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列。
实施例2
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_005270序列。
实施例3
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列和hsa_piR_005270序列组成。
实施例4
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_005270序列和hsa_piR_000663序列组成。
实施例5
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_005270序列、hsa_piR_000663序列和hsa_piR_001809序列组成。
实施例6
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列和hsa_piR_001809序列组成。
实施例7
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_001809序列和hsa_piR_001040序列组成。
实施例8
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_005270序列和hsa_piR_001040序列组成。
实施例9
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段为下述piRNA序列组成：hsa_piR_009466、hsa_piR_005270、hsa_piR_000663、hsa_piR_012518、hsa_piR_001302、hsa_piR_000562、hsa_piR_001048、hsa_piR_002062、hsa_piR_011186、hsa_piR_001809、hsa_piR_000139、hsa_piR_001184、hsa_piR_001205、hsa_piR_001318、hsa_piR_011187、hsa_piR_000775、hsa_piR_000651、hsa_piR_001040、hsa_piR_001159、hsa_piR_000823、hsa_piR_000121、hsa_piR_001934、hsa_piR_000794、hsa_piR_000441和hsa_piR_000560。
寡聚核苷酸编码片段能与靶piRNA互补，延伸臂片段能使与它连接的编码片段离片基有一定的距离，减少杂交空间阻碍，探针杂交的Tm值是通过化学修饰来平衡的，探针是由光敏试剂原位合成为微流体芯片。
实施例10
一种用piRNA探针检测胃组织的高表达piRNA的方法，依次包括(1)总RNA提取：各自称取100mg胃癌组织和胃癌旁组织，分别加入到液氮中研磨至干粉状→加1mlTrizol→继续研磨至匀浆→转入1.5ml离心管中→12000×g离心10min→收集上清至新离心管中→室温放置5min→加入0.2ml氯仿→涡旋15-30s→室温放置3min→12000×g离心15min→收集上清→加两倍上清体积的异丙醇→-20℃沉淀过夜→12000×g离心15min，去上清→加1ml含有DEPC水75％乙醇(预冷)→7500×g离心5min→倒尽液体，轻微离心，除去管底残液→自然干燥3min→沉淀重溶于50μl DEPC·H2O，得到各自的总RNA；(2)总RNA质量分析：通过A230、A260、A280检测，以及对各自的总RNA采用琼脂糖凝胶电泳，根据18S rRNA和28S rRNA的比值分析总RNA质量；(3)微离心过滤得到小RNA样品：对各自的总RNA用微离心过滤柱过滤，分别得到片段小于300nt的胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品；(4)在胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品中分别添加Poly(A)聚合酶：使小RNA 3′端加上poly(A)尾巴；用Cy3和Cy5特异性荧光标记分别标记胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品：先用一个寡聚核苷酸与这个poly(A)尾巴连接，然后加入Cy3和Cy5特异性荧光标记；(5)用本发明的高表达piRNA探针分别对荧光标记的胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品进行杂交检测：把各自的小RNA样品加入至含有25％的甲酰胺的100μl 6×SSPE缓冲液中(0.90M NaCl，60mM Na2HPO4，6mM EDTA，pH 6.8)，然后置于用实施例1的探针合成的微流体芯片上进行杂交检测，杂交反应仪器为微循环泵杂交仪，杂交温度为34℃，杂交时间为过一夜后采集杂交图像；杂交图象用激光扫描仪(GenePix 4000B，Molecular Device)采集，分别得到如附图1和附图2的照片，对两种样品杂交图象组合差异比较得到如附图3的照片，杂交图像数据处理和分析用Array-Pro(Media Cybernetics)软件，数据处理和分析首先是扣除背景，计算重复点平均值和标准偏差，然后通过LOWESS(Locally-Weighted Regression)过滤进行标准化，数据处理结果采用Hierarchical clustering、K-means/medians clustering或者ANOVA(analysisof variance)等方法，得到如表1的结果；从附图1、附图2和附图3的比较可以看出胃癌组织的有些piRNA的量比胃癌旁组织的piRNA的量要高，从表1数据处理结果进一步说明了胃癌组织的piRNA的量比胃癌旁组织的piRNA的量要高许多，因此从胃组织的piRNA的量的异常提高就可以得出胃组织发生癌变的结果，本发明就为胃癌的诊断提供了依据，进一步可以选用这些piRNA作为对胃癌进行定向靶点治疗。
表1：胃癌组织和胃癌旁组织的piRNA的表达强度及其相互比较对数值
| 序号 | piRNA名称 | 癌旁组织 | 癌组织 | log2(癌组织/癌旁组织) |
| 1 | hsa_piR_009466 | 1.00 | 1,445.91 | 10.50 |
| 2 | hsa_piR_005270 | 10.61 | 874.85 | 6.37 |
| 3 | hsa_piR_000663 | 98.64 | 2,813.15 | 4.83 |
| 4 | hsa_piR_012518 | 114.67 | 1,732.59 | 3.92 |
| 5 | hsa_piR_001302 | 139.90 | 1,772.49 | 3.66 |
| 6 | hsa_piR_000562 | 38.90 | 329.97 | 3.08 |
| 7 | hsa_piR_001048 | 99.70 | 833.73 | 3.06 |
| 8 | hsa_piR_002062 | 53.90 | 388.28 | 2.85 |
| 9 | hsa_piR_011186 | 132.91 | 535.80 | 2.01 |
| 10 | hsa_piR_001809 | 80.54 | 292.69 | 1.86 |
| 11 | hsa_piR_000139 | 48.88 | 174.94 | 1.84 |
| 12 | hsa_piR_001184 | 1,200.04 | 3,893.66 | 1.70 |
| 13 | hsa_piR_001205 | 115.80 | 374.80 | 1.69 |
| 14 | hsa_piR_001318 | 2,605.71 | 7,721.21 | 1.57 |
| 15 | hsa_piR_011187 | 200.44 | 593.80 | 1.57 |
| 16 | hsa_piR_000775 | 1,788.99 | 5,259.26 | 1.56 |
| 17 | hsa_piR_000651 | 2,674.20 | 6,233.82 | 1.22 |
| 18 | hsa_piR_001040 | 1,381.62 | 2,959.81 | 1.10 |
| 19 | hsa_piR_001159 | 4,483.73 | 9,513.94 | 1.09 |
| 序号 | piRNA名称 | 癌旁组织 | 癌组织 | log2(癌组织/癌旁组织) |
| 20 | hsa_piR_000823 | 9,696.26 | 19,333.64 | 1.00 |
| 21 | hsa_piR_000121 | 407.96 | 714.37 | 0.81 |
| 22 | hsa_piR_001934 | 686.26 | 1,169.26 | 0.77 |
| 23 | hsa_piR_000794 | 5,269.06 | 7,535.16 | 0.52 |
| 24 | hsa_piR_000441 | 8,006.39 | 10,364.01 | 0.37 |
| 25 | hsa_piR_000560 | 8,297.56 | 10,614.31 | 0.36 |
Claims (2)
1.一种用于胃组织的高表达piRNA探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，其特征在于所述的寡聚核苷酸编码片段与hsa_piR_000823序列互补。
2.一种利用权利要求1所述的探针检测胃癌组织的piRNA的方法，依次包括总RNA提取、总RNA质量分析、微离心过滤得到小RNA样品、添加Poly(A)聚合酶和用Cy3和Cy5特异性荧光标记小RNA样品步骤，其特征在于用所述的高表达piRNA探针对荧光标记的小RNA样品杂交检测。
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