CN101270078A - 抑制端粒酶活性的金属超分子化合物及用法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抑制端粒酶活性的金属超分子化合物及用法和用途。该金属超分子化合物，其具有如I所示结构，其中式III为Ni²⁺或Fe²⁺，配体分子式为C₂₅H₂₀N₄，配体结构如II所示，所述的抑制端粒酶活性的金属超分子化合物包括一对结构对映异构体：P和M。该金属超分子化合物抑制具有端粒酶活性的细胞的增殖，如肿瘤细胞的增殖，并且可以诱导肿瘤细胞衰老，因此该抑制端粒酶活性的金属超分子化合物可用作制成一种抗肿瘤药物。

Description

抑制端粒酶活性的金属超分子化合物及用法和用途

发明领域

本发明涉及抑制端粒酶活性的金属超分子化合物及用法和用途。

发明背景

肿瘤在全球范围内是仅次于心血管疾病的第二大杀手。对于癌症的治疗，人们已经开发了各种外科，内科和放射学抗癌方法及联合用于癌症的治疗，取得了相当的进步，但对于危害人类生命健康最严重，占恶性肿瘤90％以上的实体瘤的治疗未能取得满意的疗效。研究人员越来越深刻的意识到，要提高肿瘤治疗的疗效，开发防止与治疗癌症的有效方法，必须从肿瘤发生与发展的机制着手，才能取得新的突破性进展。

端粒是存在于真核细胞染色体DNA末端的特殊结构，由一段具有特定重复的DNA序列和端粒结合蛋白组成，起着维持染色体结构稳定的重要作用并参与细胞周期的调节。端粒酶是一种核糖核蛋白反转录酶，能够利用自身RNA为模板合成端粒DNA，使端粒延伸并维持其稳定。(Blackburn，1992，生物化学年度评论，61：113-129)人体正常细胞的生长和发育受到端粒酶活性严格调控。绝大多数正常体细胞无端粒酶活性表达，随着细胞分裂的进行，端粒逐渐缩短，决定了细胞分裂次数和细胞寿命。端粒的程序性缩短限制了转化细胞的生长能力，这很可能是肿瘤形成的一个抑制机制。端粒酶的重新表达在肿瘤细胞逃避衰老的过程中起着重要的作用，它的激活可稳定端粒长度甚至使细胞获得永生，其活性与恶性肿瘤的发生密切相关。至今为止，将近90％恶性肿瘤细胞和永生化细胞有端粒酶活性表达，而且许多肿瘤细胞的端粒酶活性远高于那些高度增殖的正常细胞，甚至在一些肿瘤中端粒酶活性高低与恶性程度一致(Kim等，1994，科学，266：2011-2014；Healy等，1995，肿瘤学研究，7：121-130)。在这些发现的基础上，端粒和端粒酶作为癌症治疗的潜在靶点已引起越来越多的关注，通过抑制端粒酶活性来抑制肿瘤生长成为治疗癌症的新方法。

因此，寻找能有效抑制端粒酶活性的物质对治疗癌症及其它端粒酶活性异常引起的疾病有非常重要的意义。研究发现，通过改变端粒DNA的结构可使端粒酶活性失常。端粒DNA序列形成四链结构，无法作为引物与端粒酶RNA组分碱基配对、结合，或者改变了端粒引物从端粒酶解离的速度而影响端粒的延伸，从而可以抑制端粒酶活性。因此设计、合成并筛选具有特异性稳定四股螺旋DNA结构试剂具有重要意义。这类化合物通过作用于端粒G-四联体抑制了端粒酶的活性(JulieE.Reed等，2006，J.Am.Chem.Soc，128：5992-5993；J-M Zhou等，2006，Oncogene，25：503-511)。

以核酸作为药物作用靶标治疗疾病应用广泛，如在癌症治疗方面，针对DNA结构的抗癌药物如顺铂、分子嵌插剂等。随着核酸分子识别领域研究的深入，金属超分子化合物被合成出来并引起极大兴趣。这类金属超分子化合物是由两个金属阳离子与三个基于亚胺的配体组成的配合物。不同于以往的小分子化合物与DNA的结合方式，这类化合物非共价的结合在DNA大沟区，更接近生物体内蛋白质等调控分子与DNA的结合及调控方式。这类金属超分子化合物能识别特定的DNA结构，提供一种全新的DNA识别模式，因而在药物制备上十分具有潜力。

发明内容

本发明第一个目的是提供抑制端粒酶活性的金属超分子化合物，其具有如I所示结构，

为Ni²⁺或Fe²⁺，配体分子式为C₂₅H₂₀N₄，配体结构如II所示：

所述的抑制端粒酶活性的金属超分子化合物包括一对结构对映异构体：P和M。

本发明发现抑制端粒酶活性的金属超分子化合物，包括金属镍超分子化合物P、M及金属铁超分子化合物P、M均能抑制端粒酶活性，其中P能显著抑制端粒酶活性。在具体的实施例中，P构型镍超分子化合物EC₅₀，端粒酶活性50％被抑制时的浓度的值仅为51.9nmol/l，P构型铁超分子化合物EC₅₀，端粒酶活性50％被抑制时的浓度的值更是只有21.5nmol/l。因此，本发明提供了金属超分子化合物作为新的端粒酶抑制剂。

本发明的抑制端粒酶活性的金属超分子化合物的合成方法，参照文献：(An inexpensive approach to supramolecular architecture(MichaelJ.Hannon等，1997，Chem.Commun.，18：1807-1808)。

本发明另一目的提供的上述的金属超分子化合物抑制端粒酶活性的方法。其步骤和条件如下：

细胞培养

COC1和K562细胞在37℃，5％CO₂的孵箱中培养，培养基为IMDM加10％胎牛血清，每两天换液一次，取对数生长期细胞进行实验；

Taq聚合酶活性分析

对于基于TRAP法的端粒酶活性检测方法，为排除由于样品对Taq酶活性的抑制而造成假阳性结果，有必要检测样品对Taq聚合酶活性影响，在PCR管中分别加入：oligo DNA 20ng，引物P1、P2各40pmol，dNTP 10pmol，10×ExTaq缓冲液5ul，ExTaq聚合酶2.5U，金属镍超分子化合物P或M，或者金属铁超分子化合物P或M浓度均为2umol/l，补充灭菌水至50ul，无金属超分子化合物的作为对照组，混匀后进行PCR反应，反应条件为94℃预热2分钟；94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，30个循环；最后72℃10分钟；4℃保存，反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察，照相；

端粒酶活性分析

端粒酶活性的检测使用ROCHE公司生产的Telomerase PCRELISA试剂盒，过程如下：

(1)制备细胞提取物

收获对数生长期COC1细胞并计数，1500rpm，4℃离心10分钟弃上清后加PBS洗涤细胞两次，弃上清后，按每2×10⁵个细胞加200ul裂解液，冰浴30分钟，15000rpm离心20分钟转移上清液到另一管中备用；

(2)TRAP反应

在每个PCR反应管中加入以下反应物：25ul反应混合液，其成分为Tris缓冲液，包含生物素标记的P1-TS引物，P2引物，dNTP，Taq酶，2ul细胞提取物，浓度分别为10，20，40，60，80和100nmol/l的金属镍超分子化合物P或浓度分别为50，100，150，300，500和1000nmol/l的金属镍超分子化合物M或者浓度分别为5，50，500，5000nmol/l的金属铁超分子化合物P或M；DEPC水补充体积至50ul；不加金属超分子化合物的样品作为阳性对照组；细胞提取物在85℃加热10分钟为加热失活组，作为阴性对照，充分混匀后置于PCR仪内按如下程序反应：25℃，30分钟；94℃，5分钟；再按94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，30秒循环30次；最后72℃保温10分钟，4℃终止反应；

(3)检测分析反应产物

每管取反应产物5ul到新的Ep管中，加入20ul变性剂，20℃作用10分钟，再加入225ul杂交缓冲液充分混匀，该杂交缓冲液含有地高辛标记的端粒重复序列特异性探针，37℃300rpm摇晃2小时，取100ul混合液加入到用链霉亲和素预包被的96孔酶标板每孔中，37℃孵育1小时，倒净，用PBS洗涤3次，加入100ul连有过氧化物酶的抗地高辛抗体溶液，20℃300rpm振摇30分钟，倒净抗体溶液，PBS洗涤5次后加入100ul TMB溶液，25℃反应20分钟，加入100ul终止液，立即用酶标仪测450nm光吸收值OD₄₅₀；细胞长期药物作用

COC1和K562细胞以2.0×10⁵个/瓶接种到25cm²培养瓶中，加入终浓度为1umol/l的金属镍超分子化合物或0.5umol/l的金属铁超分子化合物。不加化合物的为对照组。每3天收集一次细胞，血球计数板计数，取2.0×10⁵个重新接种到培养瓶中，剩余细胞用来做下述检测；

端粒长度测定

收集上述细胞，提取基因组DNA，采用荧光实时定量PCR测定端粒的相对长度。所用试剂购自大连宝生物工程有限责任公司。过程如下：

在每个PCR玻璃毛细管中加入以下反应物：10ul 2×Syber GreenPCR Master Mix，20～100ng基因组DNA，扩增端粒加入终浓度200nmol/l的端粒序列引物，扩增单拷贝基因36B4则加入终浓度300nmol/l的36B4序列引物，补充水到20ul。扩增在ROCHE Lightcycler system仪器上进行，程序如下：95℃，1分钟一个循环；然后95℃15秒，58℃15秒，72℃40秒循环40次扩增36B4或者95℃15秒，56℃15秒，72℃60秒循环35次扩增端粒基因，每一个样品分别进行2次PCR反应，分别测定扩增端粒序列的Ct值和扩增36B4序列的Ct值。为建立标准曲线，从未加化合物的细胞中提取基因组DNA，从3.125ng/管to 100ng/管成倍稀释加入到玻璃毛细管中并测定Ct值，Ct值的计算和标准曲线的建立使用LightCycler分析软件，用来计算样品相对端粒长度的T/S比率计算公式为T/S≈2^ΔΔCt，ΔΔC_t＝ΔC_t样品-ΔC_t对照，ΔC_t＝C_t36B4-C_t端粒。

本发明的第三个目的是给出抑制端粒酶活性的金属超分子化合物的用途。该金属超分子化合物抑制具有端粒酶活性的细胞的增殖，如肿瘤细胞的增殖，并且可以诱导肿瘤细胞衰老，因此该抑制端粒酶活性的金属超分子化合物可用作制成一种抗肿瘤药物。

由于超过85％的肿瘤细胞中都存在端粒酶活性，而且端粒酶活性直接影响了肿瘤细胞的增殖，从而抑制端粒酶活性可以抑制肿瘤细胞的活性。我们的研究结果表明金属镍和铁超分子化合物能够有效的抑制端粒酶活性，在人卵巢癌细胞COC1、人白血病细胞K562中长期作用，可以使端粒缩短，P21、P16蛋白表达量上调，促使肿瘤细胞发生衰老直至死亡。见图1-图5。

附图说明

图1是本发明的化合物对端粒酶活性抑制效果图。图a，图b：TRAP-ELISA检测金属超分子化合物对端粒酶活性抑制结果。c，d：TRAP检测后，PCR反应产物作10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，照相。图c，1→5：0，5，50，500，5000nmol/l P构型金属铁超分子化合物；图d，1→6：0，20，40，60，80，100nmol/l P构型金属镍超分子化合物。Ni(M)代表M构型金属镍超分子化合物；Ni(P)代表P构型金属镍超分子化合物；Fe(M)代表M构型金属铁超分子化合物；Fe(P)代表P构型金属镍超分子化合物。

图2是本发明的化合物P和M对Taq酶活性影响图。PCR反应结束后扩增产物进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，照相。泳道1是不加化合物的对照组，泳道2是加有2umol/l的金属镍超分子化合物P；；泳道3是加有2umol/l的镍化合物M；泳道4是加有2umol/l的金属铁超分子化合物P；泳道5是加有2umol/l的金属铁超分子化合物M。

图3是本发明的金属超分子化合物促使肿瘤细胞端粒长度缩短效果图。1，对照组，不加化合物；2，加入1umol/l P构型金属镍超分子化合物；3，加入1umol/l M构型金属镍超分子化合物；4，0.5umol/l P构型金属铁超分子化合物；5，0.5umol/l M构型金属铁超分子化合物。

图4是本发明的金属超分子化合物促使肿瘤细胞发生衰老效果图。a-c：K562细胞，培养60天。a：不加化合物，对照组；b：加入1umol/l M构型金属镍超分子化合物；c：加入1umol/l P构型金属镍超分子化合物。d-e：COC1细胞，培养49天。d：加入1umol/l M构型金属镍超分子化合物；e：加入1umol/l P构型金属镍超分子化合物。

图5是本发明的金属超分子化合物上调肿瘤细胞P21、P16蛋白表达量效果图。泳道1是对照组；泳道2是1umol/l M构型金属镍超分子化合物作用组；泳道3是1umol/l P构型金属镍超分子化合物作用组；泳道4是0.5umol/l M构型金属铁超分子化合物作用组；泳道5是0.5umol/l P构型金属铁超分子化合物作用组。实验重复3次。

具体实施方式

下面结合附图进一步对本发明进行说明：

以下分析了金属超分子化合物抑制端粒酶活性作用，以及使肿瘤细胞端粒长度缩短。然后通过SA-b-galactosidase法检测金属超分子化合物致使人卵巢癌细胞COC1及人白血病细胞K562发生衰老，且显著提高这些细胞的P21和P16蛋白表达含量。

实施例1  金属超分子化合物抑制端粒酶活性的方法

细胞培养

COC1和K562细胞在37℃，5％CO₂的孵箱中培养，培养基为IMDM加10％胎牛血清，每两天换液一次，取对数生长期细胞进行实验。

Taq聚合酶活性分析

对于基于TRAP法的端粒酶活性检测方法，为排除由于样品对Taq酶活性的抑制而造成假阳性结果，有必要检测样品对Taq聚合酶活性影响，在PCR管中分别加入：oligo DNA 20ng，引物P1、P2各40pmol，dNTP 10pmol，10×ExTaq缓冲液5ul，ExTaq聚合酶2.5U，金属镍超分子化合物P或M，或者金属铁超分子化合物P或M浓度均为2umol/l，补充灭菌水至50ul，无金属超分子化合物的作为对照组，混匀后进行PCR反应，反应条件为94℃预热2分钟；94℃ 30秒，50℃30秒，72℃ 30秒，30个循环；最后72℃ 10分钟；4℃保存，反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察，照相。

Taq聚合酶活性分析

端粒酶活性分析

端粒酶活性的检测使用ROCHE公司生产的Telomerase PCRELISA试剂盒，过程如下：

(1)制备细胞提取物

收获对数生长期COC1细胞并计数，1500rpm，4℃离心10分钟弃上清后加PBS洗涤细胞两次，弃上清后，按每2×10⁵个细胞加200ul裂解液，冰浴30分钟，15000rpm离心20分钟转移上清液到另一管中备用；

(2)TRAP反应

在每个PCR反应管中加入以下反应物：25ul反应混合液，其成分为Tris缓冲液，包含生物素标记的P1-TS引物，P2引物，dNTP，Taq酶，2ul细胞提取物，浓度分别为10，20，40，60，80和100nmol/l的金属镍超分子化合物P或浓度分别为50，100，150，300，500和1000nmol/l的金属镍超分子化合物M或者浓度分别为5，50，500，5000nmol/l的金属铁超分子化合物P或M。DEPC水补充体积至50ul；不加金属超分子化合物的样品作为阳性对照组；细胞提取物在85℃加热10分钟为加热失活组，作为阴性对照。充分混匀后置于PCR仪内按如下程序反应：25℃，30分钟；94℃，5分钟；再按94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，30秒循环30次；最后72℃保温10分钟，4℃终止反应。

(3)检测分析反应产物

每管取反应产物5ul到新的Ep管中，加入20ul变性剂，20℃作用10分钟，再加入225ul杂交缓冲液充分混匀，该杂交缓冲液含有地高辛标记的端粒重复序列特异性探针，37℃300rpm摇晃2小时，取100ul混合液加入到用链霉亲和素预包被的96孔酶标板每孔中，37℃孵育1小时，倒净，用PBS洗涤3次，加入100ul连有过氧化物酶的抗地高辛抗体溶液，20℃300rpm振摇30分钟。倒净抗体溶液，PBS洗涤5次后加入100ul TMB溶液，25℃反应20分钟，加入100ul终止液，立即用酶标仪测450nm光吸收值OD₄₅₀。细胞长期药物作用

COC1和K562细胞以2.0×10⁵个/瓶接种到25cm²培养瓶中，加入终浓度为1umol/l的金属镍超分子化合物P或M，或0.5umol/l的金属铁超分子化合物P或M。不加化合物的为对照组。每3天收集一次细胞，血球计数板计数，取2.0×10⁵个重新接种到培养瓶中，剩余细胞用来做下述检测。

端粒长度测定

收集上述细胞，提取基因组DNA，采用荧光实时定量PCR测定端粒的相对长度。所用试剂购自大连宝生物工程有限责任公司。过程如下：在每个PCR玻璃毛细管中加入以下反应物：10ul 2×Syber GreenPCR Master Mix，20～100ng基因组DNA，扩增端粒加入终浓度200nmol/l的端粒序列引物，扩增单拷贝基因36B4则加入终浓度300nmol/l的36B4序列引物。补充水到20ul。扩增在ROCHE Lightcycler system仪器上进行，程序如下：95℃，1分钟一个循环；然后95℃15秒，58℃15秒，72℃40秒循环40次扩增36B4或者95℃15秒，56℃15秒，72℃60秒循环35次扩增端粒基因。每一个样品分别进行2次PCR反应，分别测定扩增端粒序列和36B4序列的Ct值。为建立标准曲线，从未加化合物的细胞中提取基因组DNA，从3.125ng/管to 100ng/管成倍稀释加入到玻璃毛细管中并测定Ct值。Ct值的计算和标准曲线的建立使用LightCycler分析软件。用来计算样品相对端粒长度的T/S比率计算公式为T/S≈2^ΔΔCt，ΔΔC_t＝ΔC_t样品-ΔC_t对照，ΔC_t＝C_t36B4-C_t端粒。

实验结果

我们用基于TRAP的端粒酶活性检测方法检测金属镍和铁超分子化合物对端粒酶活性的影响。结果表明极低浓度的金属镍和铁超分子化合物即可显著抑制端粒酶活性，镍化合物P构型的IC₅₀值(抑制率为50％时的化合物浓度)仅为51.9nmol/l，M构型的IC₅₀为459nmol/l；铁化合物P构型的IC₅₀值仅21.5nmol/l，M构型的IC₅₀为250nM。其抑制效果具有剂量依赖效应，如图1所示。Taq聚合酶活性分析结果显示当化合物浓度为2umol/l时PCR反应无明显抑制，(图2)，而在远低于此浓度端粒酶活性已被显著抑制，说明金属超分子化合物对端粒酶活性的抑制不是由其对PCR反应抑制造成的假阳性结果。端粒长度检测结果进一步证明金属超分子化合物对端粒酶活性的抑制作用。P构型金属镍超分子化合物作用K562细胞35天后，端粒长度比对照组缩短了55％，M构型作用组也缩短了18％；P构型金属铁超分子化合物作用组则缩短了61％，M构型作用组缩短了24％。在COCl细胞中结果类似，见图3。最后，端粒长度减少68％大约5 kb左右后端粒不再缩短，细胞生长停滞期出现。

实施例2  金属超分子化合物促使肿瘤细胞衰老

细胞衰老的检测

细胞的衰老使用SA-b-galactosidase法检测。上述细胞用PBS洗涤后在2％甲醛/0.2％戊二醛中室温固定5分钟，PBS洗涤，加入β-Gal染液37℃温育16小时。β-Gal染液配方为1mg/ml5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，40mmol/l的柠檬酸/磷酸钠，pH＝6，5mmol/l亚铁氰化钾，5mmol/l铁氰化钾，150mmol/l的氯化钠，2mmol/l的氯化镁。光学显微镜镜检、照相。

P16、P21蛋白含量检测

化合物作用细胞后P16、P2l蛋白含量的变化应用Western blotting检测。具体步骤：PBS洗涤后，细胞加入裂解缓冲液，配方为10mmol/lTris-HCl，pH 7.4，5mmol/l MgCl₂，1mmol/l EDTA，25mmol/l NaF，100mmol/l Na₃VO₄and 1mmol/l dithiothreitol。细胞裂解液14000转/分离心10分钟。取上清，BCA法测定蛋白浓度。每孔加入40mg蛋白，15％SDS-PAGE，电转移至PVDF膜上。膜用含5％的脱脂牛奶的TBST封闭，TBST配方为10mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，0.1％Tween-20。洗涤后加鼠抗人P21或鼠抗人P16温育2小时，TBST洗涤3次，加入碱性磷酸酶偶联的马抗鼠IgG温育2小时。洗涤后，加入BCIP/NBT显色液，照相。

实验结果

SA-b-galactosidase法检测发现，金属超分子化合物作用于K562或COC1细胞50天后即导致细胞出现明显衰老特征：β-galactosidase活性在上述细胞中过量表达，且细胞变得肥大。P构型化合物效果好于M构型化合物，见图4。Western Blotting的检测结果进一步证实这一点。促使细胞衰老的关键因子P21和P16蛋白在化合物作用组的K562或COC1细胞中，表达量较对照组显著提高，且P构型化合物效果好于M构型化合物，见图5。这些结果表明金属超分子化合物能够使肿瘤细胞衰老，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。

Claims (3)

1、抑制端粒酶活性的金属超分子化合物，其特征在于，其具有如I所示结构，

为Ni²⁺或Fe²⁺，配体分子式为C₂₅H₂₀N₄，配体结构如II所示：

所述的抑制端粒酶活性的金属超分子化合物包括一对结构对映异构体：P和M。

2、一种用权利要求1所述的金属超分子化合物抑制端粒酶活性的方法，其特征在于，步骤和条件如下：

细胞培养

COC1和K562细胞在37℃，5％CO₂的孵箱中培养，培养基为IMDM加10％胎牛血清，每两天换液一次，取对数生长期细胞进行实验；

Taq聚合酶活性分析

对于基于TRAP法的端粒酶活性检测方法，为排除由于样品对Taq酶活性的抑制而造成假阳性结果，有必要检测样品对Taq聚合酶活性影响，在PCR管中分别加入：oligo DNA 20ng，引物P1、P2各40pmol，dNTP 10pmol，10×ExTaq缓冲液5ul，ExTaq聚合酶2.5U，金属镍超分子化合物P或M，或者金属铁超分子化合物P或M浓度均为2umol/l，补充灭菌水至50ul，无金属超分子化合物的作为对照组，混匀后进行PCR反应，反应条件为94℃预热2分钟；94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，30个循环；最后72℃10分钟；4℃保存，反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察，照相；

端粒酶活性分析

端粒酶活性的检测使用ROCHE公司生产的Telomerase PCRELISA试剂盒，过程如下：

(1)制备细胞提取物

收获对数生长期COC1细胞并计数，1500rpm，4℃离心10分钟弃上清后加PBS洗涤细胞两次，弃上清后，按每2×10⁵个细胞加200ul裂解液，冰浴30分钟，15000rpm离心20分钟转移上清液到另一管中备用；

(2)TRAP反应

在每个PCR反应管中加入以下反应物：25ul反应混合液，其成分为Tris缓冲液，包含生物素标记的P1-TS引物，P2引物，dNTP，Taq酶，2ul细胞提取物，浓度分别为10，20，40，60，80和100nmol/l的金属镍超分子化合物P或浓度分别为50，100，150，300，500和1000nmol/l的金属镍超分子化合物M或者浓度分别为5，50，500，5000nmol/l的金属铁超分子化合物P或M；DEPC水补充体积至50ul；不加金属超分子化合物的样品作为阳性对照组；细胞提取物在85℃加热10分钟为加热失活组，作为阴性对照，充分混匀后置于PCR仪内按如下程序反应：25℃，30分钟；94℃，5分钟；再按94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，30秒循环30次；最后72℃保温10分钟，4℃终止反应；

(3)检测分析反应产物

每管取反应产物5ul到新的Ep管中，加入20ul变性剂，20℃作用10分钟，再加入225ul杂交缓冲液充分混匀，该杂交缓冲液含有地高辛标记的端粒重复序列特异性探针，37℃300rpm摇晃2小时，取100ul混合液加入到用链霉亲和素预包被的96孔酶标板每孔中，37℃孵育1小时，倒净，用PBS洗涤3次，加入100ul连有过氧化物酶的抗地高辛抗体溶液，20℃300rpm振摇30分钟，倒净抗体溶液，PBS洗涤5次后加入100ul TMB溶液，25℃反应20分钟，加入100ul终止液，立即用酶标仪测450nm光吸收值OD₄₅₀；

细胞长期药物作用

COC1和K562细胞以2.0×10⁵个/瓶接种到25cm²培养瓶中，加入终浓度为1umol/l的金属镍超分子化合物或0.5umol/l的金属铁超分子化合物，不加化合物的为对照组，每3天收集一次细胞，血球计数板计数，取2.0×10⁵个重新接种到培养瓶中，剩余细胞用来做下述检测；

端粒长度测定

收集上述细胞，提取基因组DNA，采用荧光实时定量PCR测定端粒的相对长度，所用试剂购自大连宝生物工程有限责任公司，过程如下：

在每个PCR玻璃毛细管中加入以下反应物：10ul 2×Syber GreenPCR Master Mix，20～100ng基因组DNA，扩增端粒加入终浓度200nmol/l的端粒序列引物，扩增单拷贝基因36B4则加入终浓度300nmol/l的36B4序列引物，补充水到20ul，扩增在ROCHE Lightcycler system仪器上进行，程序如下：95℃，1分钟一个循环；然后95℃15秒，58℃15秒，72℃40秒循环40次扩增36B4或者95℃15秒，56℃15秒，72℃60秒循环35次扩增端粒基因，每一个样品分别进行2次PCR反应，分别测定扩增端粒序列的Ct值和扩增36B4序列的Ct值，为建立标准曲线，从未加化合物的细胞中提取基因组DNA，从3.125ng/管to 100ng/管成倍稀释加入到玻璃毛细管中并测定Ct值，Ct值的计算和标准曲线的建立使用LightCycler分析软件，用来计算样品相对端粒长度的T/S比率计算公式为T/S≈2^ΔΔCt，ΔΔC_t＝ΔC_t样品-ΔC_t对照，ΔC_t＝C_t36B4-C_t端粒。

3、如权利要求1所述的抑制端粒酶活性的金属超分子化合物的用途，其特征在于，其用作抗肿瘤药物。

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