CN112538478B

CN112538478B - 一种长链非编码RNA lncRNA070974及其应用

Info

Publication number: CN112538478B
Application number: CN202011504636.1A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 姜丽丽; 刘林
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: CN112538478A

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA lncRNA070974及其应用，属于肿瘤细胞生物学领域；具体提供了一种长链非编码RNA lncRNA070974在制备抑制肿瘤细胞生长的制剂中的应用，尤其是在检测长链非编码RNA lncRNA070974表达水平的荧光定量PCR检测试剂中的应用。通过细胞增殖试验、平板克隆试验、流式细胞等发现抑制细胞中lncRNA070974水平，可以使细胞周期阻滞在G0/G1期，显著抑制细胞的增殖。因此，通过降低该长链非编码RNA的表达能显著抑制肿瘤细胞的生长，这也为该lncRNA070974成为多种癌症细胞潜在的抑制剂，用于癌症治疗提供了有利的科学依据。

Description

一种长链非编码RNA lncRNA070974及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞生物学领域，特别是涉及一种长链非编码RNAlncRNA070974及其应用。

背景技术

肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝癌的病因及确切分子机制尚不完全清楚，目前认为其发病是多因素、多步骤的复杂过程，受环境和饮食双重因素影响。继发性肝癌(转移性肝癌)可通过不同途径，如随血液、淋巴液转移或直接侵润肝脏而形成疾病。而现如今，肝癌在我国已是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位列癌症相关肿瘤死亡率第三位。HCC具有起病隐匿、恶性程度高、进展迅速、易转移、病死率高、总体预后不佳等特点，严重危害人类健康。因此，研究肝癌早期转移机制以及抑制方法对于提高肝癌的治愈具有重要的现实意义。

现今，肝癌的发生机制研究主要集中在蛋白编码基因，涉及到遗传学、表观遗传学、相关信号通路的研究，而蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列不足1％，而人基因组中绝大部分可转录的序列为非编码RNA。其中长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是非编码RNA中最重要的一类转录本，其广泛地存在于各种生物中，且随着生物复杂程度的升高，基因组中lncRNA序列的比例也相应地增大，并且LncRNA可作为功能蛋白质的信号(signal)、诱导(guide)、诱饵(decoy)或支架(scaffold)分子等多种方式，在染色质重构、基因转录、翻译及蛋白修饰等多重水平调控基因的表达，更重要的是，lncRNA的表达与功能失调已经与包括恶性肿瘤在内的人类多种疾病相关联，但是对于众多的lncRNA是如何在不同的疾病细胞中表达，一直是科研界所研究的重要方向。而本发明正是为了研究肝癌相关的lncRNA及其两者之间的相关性而提供了一种新的技术方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种长链非编码RNA lncRNA070974及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过降低长链非编码RNA的表达能显著抑制肿瘤细胞的生长，该lncRNA070974是多种癌症细胞潜在的抑制剂，有望用于癌症治疗。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种长链非编码RNA lncRNA070974，该长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供所述的长链非编码RNA lncRNA070974在制备抑制肿瘤细胞生长的制剂中的应用。

优选的是，抑制肿瘤细胞生长的制剂包括检测长链非编码RNAlncRNA070974表达水平的荧光定量PCR检测试剂。

优选的是，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。

优选的是，荧光定量PCR检测试剂含有用于快速扩增引物和巢式反应引物组，所述快速扩增引物如SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：5所示；所述巢式反应引物组如SEQ ID NO：6-SEQID NO：11所示。

本发明还提供一种检测癌细胞的试剂，所述试剂通过荧光定量PCR检测所述的lncRNA070974的表达水平，荧光定量PCR检测lncRNA070974的表达水平的试剂含有用于快速扩增引物和巢式反应引物组，所述快速扩增引物如SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：5所示；所述巢式反应引物组如SEQID NO：6-SEQ ID NO：11所示。

优选的是，试剂检测样本为肝癌细胞。

本发明还提供如所述的检测癌细胞的试剂在制备抑制肿瘤细胞生长试剂中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开一种长链非编码RNA IncRNA070974，前期研究中发现细胞内RNA结合蛋白HuR可以与多条非编码长链RNA结合，而其中长链非编码RNA lncRNA070974受到HuR的显著调控，降低HuR也明显影响细胞内的lncRNA070974表达。至今，这条长链非编码RNA尚未被报道，发明人第一次扩增得到这条长链非编码RNA，并且本发明通过细胞增殖试验、平板克隆试验、流式细胞分析试验等发现抑制细胞中lncRNA070974水平，可以使细胞周期阻滞在G0/G1期，显著抑制细胞的增殖。因此，通过降低该长链非编码RNA的表达能显著抑制肿瘤细胞的生长，这也为该lncRNA070974成为多种癌症细胞潜在的抑制剂，用于癌症治疗提供了有利的科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为lncRNA070974全长扩增电泳图；(a)5’和3’RACE的RNA电泳图，(b)lncRNA070974全长的电泳图；

图2为lncRNA070974在染色体上的基因定位及序列保守性分析；(a)lncRNA070974在染色体上的定位，(b)lncRNA070974序列与脊椎动物序列对比分析图；(c)lncRNA070974基因在细胞中的分布情况；

图3为干扰lncRNA070974分析干扰效率；

图4为干扰lncRNA070974对细胞增殖和细胞周期的影响；(a)CCK-8实验分析抑制lncRNA070974表达显著降低细胞的生长，(b)平板克隆实验验证，降低lncRNA070974可以减少克隆形成，(c)流式细胞仪分析，抑制lncRNA070974可以阻止细胞周期G0/G1，抑制细胞的生长。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

对长链非编码RNA的发明，在前期的研究中发现细胞内RNA结合蛋白HuR可以与多条非编码长链RNA结合，而其中长链非编码RNAlncRNA070974受到HuR的显著调控，降低HuR也明显影响细胞内的lncRNA070974表达。通过生物信息分析和荧光原位杂交实验，发现lncRNA070974定位于15号染色体长臂的26.3位上，其序列与灵长类动物有高度的相似性，而与其他生物同源性相差较大；定位于细胞质和细胞核中，主要分布于细胞质内(见表14)。

利用cDNA末端的快速扩增(RACE)技术，获得5’-RACE和3’-RACE产物，通过1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段长度分别为684bp、585bp。通过基因序列编码预测工具(CodingPotential Assessing Tool，CPAT)预测lncRNA070974的编码功能，其编码能力为0.0473，说明其没有编码功能。综合上述结果，证明发明人发现了一条新的长链非编码RNAlncRNA070974。

上述长链非编码RNA lncRNA070974虽然是新发现的长链非编码RNA，但是发明人认为其编码功能是通过网络软件预测出来的结果，而由于现有技术的各种限制因素的存在，其非编码功能可能存在不确定的问题。因此，为了更好、更准确的验证该长链非编码RNAlncRNA070974抑制细胞(尤其是肿瘤细胞)生长的功能，通过细胞增殖实验(Cell CountingKit-8、CCK8)、平板克隆实验、流式细胞等结果分析，发现抑制细胞中的lncRNA070974水平，可以使细胞周期阻滞在G0/G1期，显著抑制细胞的增殖，进而证实了该lncRNA070974确实是具备抑制肿瘤细胞生长的功能。其具体的试验验证过程详见实施例1。

实施例1

1、RNA干扰实验

在细胞12孔板中加入100μL的opti-MEM培养基，2.5μL的siRNA(浓度20μM，由吉玛生物合成，见表17)，2.5μL的

RNAiMAX试剂(由ThermoFisher购买)，混合均匀后，加入到培养皿中静置15min，铺8-10万个HepG2细胞，补加DMEM培养基(由Gibico公司购买)至1mL，混匀后放入到37℃、5％的CO₂培养箱中，培养24h。

2、RNA的提取和lncRNA070974全长的获得

利用Invitrogen TRIzol法(由Thermo Fisher购买)，按照试剂盒说明书进行RNA的提取；使用总RNA量的1000ng，按照PrimeScript^TM RTreagent Kit with gDNA Eraser(TakaRa，日本)试剂盒说明书进行逆转录。

将上步提取的RNA进行基因组DNA的去除，按照5’-RACE和3’-RACE试剂盒说明书(TakaRa，日本)进行操作，具体使用的引物见表1，

表1 RACE技术的引物序列表

注：其中V是除T之外的三个碱基；N为A、T、G中的任一碱基。

其中，5’RLM-RACE具体操作步骤如下：

(1)CIP水解RNA 5’端不完整的磷酸基团，在去酶离心管中加入以下反应体系(见表2)：

表2

再混匀、点离，37℃孵育1h。

(2)终止CIP反应，再次抽提RNA，在上述去酶离心管中加入以下组分(见表3)：

表3

首先，振荡仪上涡旋振荡混匀，4℃，14000g离心5min，将上清转移至新的1.5mL去酶EP管中；

其次，向上清中加入150μL氯仿，振荡仪上涡旋振荡混匀，4℃，14000g离心5min，将上清转移至新的1.5mL去酶EP管中；

然后，取上清，加入150μL异丙醇，涡旋振荡混匀，冰上放置10min，4℃，14,000g离心20min；

最后，弃上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀一次，4℃，12000rpm离心5min，弃上清，挥发干燥后加入15μL无酶超纯水溶解沉淀。

(3)TAP去除5'端帽子结构，在去酶离心管中加入以下组分(见表4)：

表4

再混匀，点离，37℃孵育1h；

(4)5'RACE Adapter连接，在去酶离心管中加入以下组分(见表5)：

表5

混匀，点离，37℃孵育1h；

(5)逆转录，在去酶离心管中加入以下组分(冰上操作)，见表6:

表6

混匀，点离，42℃孵育1h；产物放于-20℃保存；所用的随机10聚体引物购自北京维百奥生物科技有限公司。

(6)Outer 5'RLM-RACE PCR，在200μLEP管中加入以下组分(冰上操作)，见表7：

表7

混匀，点离，设置如下PCR反应程序，见表8：

表8

产物放于-20℃保存或用于下一步实验。

(7)内侧5'RLM-RACE PCR，在200μLEP管中加入以下组分(冰上操作)，见表9：

表9

混匀，点离，设置PCR反应程序同Outer 5'RLM-RACE PCR。产物放于-20℃保存或用于下一步实验。

3'RLM-RACE具体步骤如下：

(1)逆转录，在去酶离心管中加入以下组分，见表10：

表10

混匀，点离，42℃孵育1h；产物用于下一步实验。

(2)Outer 3’RLM-RACE PCR，在200μlEP管中加入以下组分(冰上操作)，见表11：

表11

混匀，点离,设置PCR反应程序同Outer 5'RLM-RACE PCR。

(3)Inner 3'RLM-RACE PCR，在200μLEP管中加入以下组分(冰上操作)，见表12：

表12

混匀，点离设置PCR反应程序同Outer 5’RLM-RACE PCR；产物用于下一步实验。

(4)PCR产物电泳

配制2％的琼脂糖凝胶(0.4g琼脂糖粉加入到40mL的1×TAE缓冲液中，微波炉融化后，待冷却至55℃左右，加入1μL Goldview核酸染色剂，混匀后倒入制胶板中)，凝固后进行电泳(电泳120V，30min)。

(5)目的片段回收

首先，选取将电泳结束后的凝胶，放入到凝胶成像仪中，然后选取目的大小条带相同的片段，使用刀片进行切割下来，放入到EP管中；

其次，加入适量的Binding Buffer(1：3加入，即0.1g凝胶加入300μL BindingBuffer)(购于上海生工有限公司)，恒温仪上55℃，使凝胶块彻底融化；

然后，将上述混合液加入到

DNA Mini Column回收柱中，室温，1000g离心1min；弃滤液，将柱子放回收集管，加入700μL SPW WashBuffer，室温，13000g离心1min，重复一次；

最后，在柱子中央加入20uL Elution Buffer，室温放置2min，13000g离心2min，收集滤液；即目的产物。

(6)目的片段与T-Vector pMD18连接，在200μL EP管中加入以下组分，见表13：

表13

混匀，点离，16℃连接反应过夜。对产物进行基因测序(由上海桑尼生物公司完成)，获得lncRNA070974的全长(见图1b，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)。

3、lncRNA070974的保守性及编码功能预测

首先，通过在Noncode数据库(http://www.noncode.org/)中输入lncRNA070974的全长序列，分析发现LncRNA070974的功能尚未被研究。

其次，在UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)上对LncRNA070974进行基因组定位，可见，LncRNA070974位于15号染色体长臂26.3区域(图2a)，通过lncLocator数据库(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/)对LncRNA070974的细胞定位进行生物信息学预测，发现LncRNA070974在细胞质和细胞核均有分布，但细胞质中占比66.18％(表14)。用PhyloP对100种生物中的LncRNA070974进行序列保守性分析，发现LncRNA070974在灵长类动物中同源性较高，与其他物种的序列同源性较低(图2b)。此外，还结合荧光原位杂交试验(FISH)验证了lncRNA070974主要定位于细胞质中(图2c)。

最后，使用CPAT(Coding Potential Assessing Tool)对lncRNA070974的蛋白编码潜能进行预测，与已知的蛋白HuR和已知的lncRNA HAGLROS相比，发现LncRNA070974不具有编码能力(表15)。

表14 lncLocator数据库预测LncRNA070974的细胞定位

表15 利用CPAT预测lncRNA070974的编码能力

4、荧光原位杂交技术

(1)试剂准备

预杂交液和杂交液的准备：分别将封闭液与预杂交缓冲液，按照1：99混合均匀；将封闭液与杂交液按照1：99混合均匀，两者在37℃孵育至透明澄清后使用；

配制通透液：0.5％Triton X-100的PBS；

(2)细胞处理

首先：取出24孔板，放入无菌的细胞爬片，每孔加入1×10⁴个细胞悬液，放入培养箱培养；待细胞密度约60％-70％时，每孔加入500μL 1×PBS，在摇床上清洗5min；

然后，加入4％多聚甲醛，室温静置固定10min，PBS洗涤三次；

最后使用，1mL预冷的通透液，4℃静置5min，PBS洗涤三次。

(3)装载探针

首先，每孔加入200μL预热至澄清的预杂交液，37℃封闭30min；

然后，避光条件下，将lncRNA Probe Mix、U6、18S内参探针储存液(20μM)恢复至室温，各取2μL加入150μL提前预热至澄清的杂交液中混匀；

再次，弃预杂交液，每孔加入150μL含有探针的杂交液，37℃避光条件下杂交过夜；

弃杂交液，42℃避光条件下，每孔加入500μL杂交洗液Ⅰ(含有0.1％Tween-20的4×SSC)轻晃洗涤5min，共三次；

分别在42℃避光条件下，每孔加入500μL杂交洗液Ⅱ(2×SSC)、500μL杂交洗液Ⅲ(1×SSC)，分别轻晃洗涤5min；

最后，使用PBS洗涤3次，然后使用DAPI进行细胞核染色，PBS洗涤3次。

(4)封片及观察

取出干净的载玻片，在玻片中央滴约10μL抗荧光淬灭剂；避光条件下，用镊子小心取出细胞爬片，倒扣在含有荧光淬灭剂的玻片上，在荧光显微镜40倍镜下观察荧光情况。

结果显示：lncRNA070974在细胞质和细胞核中均有分布，主要定位于细胞质中如图2c所示。

5、荧光定量PCR

使用

RPremix Ex TaqTM II试剂盒，采用如下表16所述引物；

表16

再按照说明书进行，加好体系，在BioRad仪器，按照以下程序进行：95℃3min，(95℃5s，60℃30s，72℃40s，循环40次)，72℃5min，95℃15s，60℃1min，95℃15s。反应后基因的相对表达水平，按照2^-△△Ct(△Ct值＝Ct_目的-Ct_内参，△△Ct值＝△Ct_实验组－△Ct_对照组)进行计算，求得基因的相对表达水平，以actin基因作为对照基因，分析获得si-lncRNA070974-2干扰效率最高，达到99％以上(见图3)，后期功能验证使用siRNA-2进行，具体序列见表17。

表17 LncRNA070974的干扰序列

6、CCK8检测细胞增殖

(1)si-control或si-RNA2处理HepG2细胞48h后，细胞密度约为70％-80％；

(2)将2组细胞进行胰蛋白酶消化，分别取2000个细胞，加入到96孔板中，待细胞贴壁后；

(3)弃去旧培养基，每孔加入100μL的10％CCK-8试剂的检测液，将细胞放回培养箱中孵育2h；

(5)用酶标仪在0h、24h、48h、72h进行检测其在450nm处的吸光度，用来反映活细胞数量；

结果发现，在培养24h时，si-lncRNA070974-2组细胞的生长受到明显的抑制作用，随着时间的延长这种抑制作用更为明显(图4a)。

7、平板克隆实验

(2)将2组细胞进行胰蛋白酶消化，分别取3000个细胞，加入到6孔板中，于37℃，5％CO₂条件下的培养箱中，培养7天后，换成正常培养基(10％FBS完全培养基)，继续培养7天后，克隆长成肉眼可见；

(3)使用PBS清洗2次，加入4％的多聚甲醛进行室温固定30min，弃去固定液，然后使用500μL的结晶紫染色30min；

(4)弃去染色液，使用双蒸水洗去没有结合染色液，进行室温干燥；

(5)进行显微镜拍照，并计算单克隆个数。

结果发现，si-lncRNA070974组单克隆的数目明显减少，说明降低lncRNA070974可以显著抑制细胞的生长(图4b)。

8、细胞周期检测：

(1)si-control或si-RNA2处理HepG2细胞48h后，弃旧培养基，1mLPBS清洗两遍，加入500μL不含EDTA的胰酶消化液，室温消化5min，将细胞转移至1.5mL的EP管中，4℃，2000rpm离心5min，弃上清，收集细胞沉淀；

(2)加入1mL预冷的PBS，4℃，1500rpm，离心5min，弃上清，洗涤细胞沉淀，重复一次；

(4)加入300μL预冷的PBS重悬细胞沉淀，缓慢加入700μL预冷的乙醇，晃动EP管，避免细胞成团难以成为单个细胞，4℃过夜固定细胞；

(5)将固定好的细胞4℃，1500rpm，离心5min，弃上清；

(6)加入1mL预冷的PBS，4℃，1500rpm，离心5min，弃上清，洗涤细胞沉淀，重复一次；

(7)加入500μL DNA染色液，涡旋振荡5-10秒混匀，室温避光孵育30min；

(8)选择最低上样速度，在流式细胞仪上进行检测，分析细胞周期变化。

结果显示，细胞周期阻滞在G0/G1期，说明降低lncRNA070974的水平可以使细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制细胞生长。因此，流式细胞仪分析，lncRNA070974可抑制细胞的增殖(图4c)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种长链非编码RNA lncRNA070974及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2008

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagagcgaga ccctgtctca atcaatcaat caaaaacgac agagatagat agatagatga 60

tagattgata gatgatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagcaacat 120

ggtctaaatg agtctaggag tggagtgtcc ttgaacttgg ggagaccacc ctccactgca 180

tttgcattat tgatactatg gctggagagg gccttttgcc taaaagcttg gagtatgttg 240

gggcccccga gagcaggtga gggccagagg ttcagatcag aggatggaaa aaggaggtgg 300

agaacaggaa agaaaaacat tttaataaga acaagcaggg gtgatggaaa gtatacacca 360

aggccattct ctagcatctt aaggttctgc ccagccagct gggaggccac tgggcactgg 420

ctgctggggg gaaaggaaga atctgctccc ctaccccagc cttcactgtt gctttcctcg 480

cacgaacccc agactctatc cttcctggtt ggctgtttaa gtcctttcct gacaccccag 540

gctttgtggc ttatctgagc acagaacagc atccttagat ggtacagcac tgagcaccca 600

ccttagatcc taggattcag tcccaccatc caaagcccct caccactaca gaccagccac 660

actaagggtg accagatatc ttagactccc ttttgaaaca acaggaacca aagtgcccag 720

ggcagagaac atcctgttgc caaaatagtg gttctcaacc agggatgact tttgtcttcc 780

aggggacatt tggcaacgtc tggagacatt ttgggttgtc acaactggaa ggatgtactc 840

acatccagtg ggtggaggcc aggaatgctg ctaagcaccc tgcaatgcac agcagccccc 900

atgacaaaga actgtccaga ccaaaatgtc aatagtgccg aggttgagaa attccggcca 960

aaagaaatgg aatcaaaaaa gaaaattgtt tgcaacttca tagagatacc ctcaatgaat 1020

aaaaccacat atggtttgac ttctgtccct gttcctatgc tgaagggaaa cttgtacaac 1080

tttccctttt taaagtaaag agataccacc ccactctttt ttttttttaa acacagcaac 1140

agaagggccc caagttaaaa ccagctctcc agcctaagga ctccacctgg tggtcctctc 1200

tggaattaaa tgaagttgag gttttatttt gtttaatttt ttcattattc agttattttg 1260

tttaacattt ttagttattt tgtttaaatt tttagttatt ttaactttta agttatttta 1320

tttcttagtt attttaactt gttattttaa tttttttagt tattttaact ttttaaagtt 1380

attttaattc tttagttatt ttgtttaact tttttagttt ttttagttaa acaaaagttg 1440

cagtgaccgg ggcaggtgtg atggctcagg cctgtaatcc cagcactttg ggaggccgag 1500

gcagggacag ggggcagggg aaatcacttc ttaggtcagg agctcaagac cagcctggca 1560

aacatgacaa aaccccgtct ctactaaaaa tataaaaatc agccaggcat ggtggcgagc 1620

gcctgtaatc ccagctactt gagaggctga ggcacgagaa tcacttgaac ctcatgttat 1680

tcctcatgag gcggaggttg cagtgagccg agattccgcc actgtactcc agcctgggca 1740

acagagcgag actccatctc agaaaacaaa gaagttccaa gtacaataca aagaaattcc 1800

ctcccaattt gagagtaagt tgccgatata ccctatgacc gccccccccc cgccaatact 1860

tcagtgggta tttcctatga acaacgacat tctccggcac agccatcaga ctcaggaaat 1920

taacatcggt atgttattac catcaaccct ctgactgaat tctagttctg ccagttgtcc 1980

caataaagtt cttagcaaaa aaaaaaaa 2008

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcaccacac cttctacaat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcctggatag caacgtacat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttgctttcc tcgcacgaac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgtggctgg tctgtagtgg 20

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> repeat_region

<222> (（34）)..(.（57）)

<223> v=a或g或c；n=a或t或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(35)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)..(37)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(39)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (41)..(41)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(43)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..(45)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (47)..(47)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(49)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (51)..(51)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (53)..(53)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(55)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (57)..(57)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 6

gcgagcacag aattaatacg actcactata ggtvnvnvnv nvnvnvnvnv nvnvnvn 57

<210> 7

<211> 45

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcugauggcg augaaugaac acugcguuug cuggcuuuga ugaaa 45

<210> 8

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtttgacttc tgtccctgtt cc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtgtgatgg ctcaggcctg ta 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtggagtcc ttaggctgga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tagtggtgag gggctttgga 20

Claims

1.长链非编码RNA lncRNA070974在制备抑制肿瘤细胞生长的制剂中的应用，其特征在于，通过下调lncRNA070974的特异性siRNA实现抑制肿瘤细胞生长；所述肿瘤细胞为肝癌细胞；所述长链非编码RNA lncRNA070974的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制肿瘤细胞生长的制剂包括检测长链非编码RNA lncRNA070974表达水平的荧光定量PCR检测试剂。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：荧光定量PCR检测试剂含有用于快速扩增引物和巢式反应引物组，所述快速扩增引物如SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：5所示；所述巢式反应引物组如SEQ ID NO：6-SEQ ID NO：11所示。