CN101250206B - 含有矢车菊素3-o-葡萄糖苷的有效部位及制备方法及应用 - Google Patents

含有矢车菊素3-o-葡萄糖苷的有效部位及制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位及制备方法及应用，其制备方法为：(1)提取：以黑豆皮为原料，加水常温提取，过筛，得提取液；(2)将提取液经大孔树脂吸附，用水及乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，减压浓缩，得浓缩物；(3)将浓缩物进行聚酰胺树脂吸附，用水及乙醇水溶液梯度洗脱，通过检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液减压浓缩，干燥，得到矢车菊素3-O-葡萄糖苷的含量大于50％的有效部位，实验证明，矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位高效无毒并具有较好的镇痛、抗急性炎症及抗佐剂性类风湿性关节炎的作用。

Description

含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位及制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种中药提取物，特别是涉及一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位及制备方法及在制备防治类风湿性关节炎药物或食品的应用。
背景技术
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节病变为主的慢性全身性自身免疫性疾病，属中医痹证范畴，与“历节病”、“白虎历节”、“顽痹”等相似。RA具有反复发作、致残率高等特点，是常见而难治性疾病，目前国内外尚无特效治疗方法[1]。西药治疗副作用大，有些患者不能耐受，而且不适当的西药治疗所致药源性疾病的发病率更高。中药不仅来源广泛、种类数量众多、毒副反应小，而且具有多环节、多层次、多靶点综合作用的特点，因此治疗RA有着独特的优势。近几十年来，我国在RA的临床和实验研究中，取得了长足的进展，初步显示了中药对RA具有较好的临床疗效和抗炎、镇痛、改善血液流变性、改善关节滑膜超微结构及免疫调节等药理作用[2]。从传统的中药及天然产物中寻找有效部位或有效成分治疗RA已成为研究热点。佐剂性关节炎动物模型在临床上类似类风湿性关节炎，常用于评价天然药物对RA的治疗作用及可能的作用机理研究[3-4]。
1.张银玲，陈文，彭雪芹，王甫英，江发寿，治疗类风湿性关节炎的中药研究概况，中国药业，2007，16(15)：1-3.
2.杨景峰，中医药治疗类风湿性关节炎的试验研究进展，现代中医药，2003，3：55-57.
3.陆生，梁崇礼，林月秋，类风湿性关节炎动物模型研究应用进展，中国实验动物学杂志，2001，11(2)：112-114.
4.李万瑶，林锦泉，赖秀丽，赖先娥，尹利华，峰针对佐剂性关节炎动物模型的试验研究，中国中医基础医学杂志，2001，7(8)：620-622.
发明内容
本发明的目的是提供一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
本发明的第二个目的是提供一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位在制备防治类风湿性关节炎药物或食品的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)提取：
提取的方法为下述步骤之一种：
①以黑豆皮、黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果为原料，加入所述原料质量3-12倍的水或酸水溶液为提取溶剂，在20-50℃提取1-6次，每次1-8小时，过80-120目筛，得提取液，所述酸水溶液中的酸的体积百分比浓度为1％～5％；
②以黑豆皮、黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果为原料，加入所述原料质量3-12倍的体积百分比浓度为10％～95％的乙醇水溶液或甲醇水溶液或乙醇酸水溶液或甲醇酸水溶液为提取溶剂，在20-50℃提取1-6次，每次1-8小时，过80-120目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度2-40，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶1～10的比例分散至水中，所述酸水溶液中的酸的体积百分比浓度为1％～5％；
(2)将所述步骤(1)获得的产物经大孔树脂吸附，用水及体积百分比浓度为10％～95％的乙醇水溶液或水及体积百分比浓度为10％～95％的甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为10～40的浓缩物；(3)将所述浓缩物按质量比为1∶3-5的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％-75％的乙醇水溶液或水及体积百分比浓度为5％-75％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
所述步骤(1)的提取优选的是：以黑豆皮、黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果为原料，加入所述原料质量10倍的酸水溶液为提取溶剂，在40-45℃提取3-5次，每次4-6小时，过100目筛，得提取液，所述酸水溶液中的酸的体积百分比浓度为1％～3％。
所述步骤(1)的提取优选的还可以是：以黑豆皮、黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果为原料，加入所述原料质量10倍的体积百分比浓度为40％～60％的乙醇酸水溶液为提取溶剂，在20-30℃提取3-5次，每次4-6小时，过100目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度2-40，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶4～5的比例分散至水中，所述酸水溶液中的酸的体积百分比浓度为1％～3％。
所述酸水溶液中的酸为盐酸、硫酸、磷酸、乙酸或柠檬酸。
所述大孔树脂的型号为AB-8型、HP20型、HPD100型、HPD100A型、HPD300型、X-5型、NKA-II型、D101型或DA201型。
一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：
提取的方法为下述步骤之一种：
①以黑豆皮、黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果为原料，加入所述原料质量3-12倍的水或酸水溶液为提取溶剂，在20-50℃提取1-6次，每次1-8小时，过80-120目筛，得提取液，所述酸水溶液中的酸的体积百分比浓度为1％～5％；
②以黑豆皮、黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果为原料，加入所述原料质量3-12倍的体积百分比浓度为10％～95％的乙醇水溶液或甲醇水溶液或乙醇酸水溶液或甲醇酸水溶液为提取溶剂，在20-50℃提取1-6次，每次1-8小时，过80-120目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度2-40，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶1～10的比例分散至水中，所述酸水溶液中的酸的体积百分比浓度为1％～5％；
(2)将所述步骤(1)获得的产物经大孔树脂吸附，用水及体积百分比浓度为10％～95％的乙醇水溶液或水及体积百分比浓度为10％～95％的甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为10～40的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶3-5的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％-75％的乙醇水溶液或水及体积百分比浓度为5％-75％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
所述步骤(1)的提取优选的是：以黑豆皮、黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果为原料，加入所述原料质量10倍的体积百分比浓度为40％～60％的乙醇酸水溶液为提取溶剂，在20-30℃提取3-5次，每次4-6小时，过100目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度2-40，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶4～5的比例分散至水中，所述酸水溶液中的酸的体积百分比浓度为1％～3％。
所述步骤(1)的提取优选的还可以是：以黑豆皮、黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、或桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果为原料，加入所述原料质量10倍的体积百分比浓度为40％～60％的乙醇酸水溶液为提取溶剂，在20-30℃提取3-5次，每次4-6小时，过100目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度2-40，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶4～5的比例分散至水中，所述酸水溶液中的酸的体积百分比浓度为1％～3％。
所述酸水溶液中的酸为盐酸、硫酸、磷酸、乙酸或柠檬酸。
所述大孔树脂的型号为AB-8型、HP20型、HPD100型、HPD100A型、HPD300型、X-5型、NKA-II型、D101型或DA201型。
一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位在制备防治类风湿性关节炎药物或食品的应用。
本发明的一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位利用液相色谱-质谱联用仪分析，其主要成分有矢车菊素3-O-半乳糖苷，矢车菊素3-O-葡萄糖苷，飞燕草素3-O-葡萄糖苷，且矢车菊素3-O-葡萄糖苷的含量大于50％。在此分析基础上，我们通过实验获知：含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位具有较好的镇痛、抗急性炎症的作用，同时更重要的是具有抗佐剂性类风湿性关节炎的作用。本发明的含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位来自于天然食物中，高效无毒，安全性极高，在防治类风湿性关节炎疾病方面的优势明显。因此在临床防治类风湿性关节炎疾病中具有广阔的应用前景，也可以应用于食品中用于预防类风湿性关节炎及其相关的急性炎症。
附图说明
图1为本发明的一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位的HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)提取：500g黑豆皮中加入5000g的水常压50℃温浸提取5次，提取时间分别为5、4、3、2、1小时，过滤，滤网的目数为120，得上清液；
(2)大孔树脂吸附分离：将(1)中提取液经HP20型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，每250ml作为一个接收体积，通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为40的浓缩物，矢车菊素3-O-葡萄糖苷的含量为31.7％；
(3)聚酰胺树脂分离：将浓缩物按质量比为1∶4的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、20％、70％的乙醇水溶液，通过薄层层析等方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度为10，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，矢车菊素3-O-葡萄糖苷的含量为54.3％。
利用HPLC进行矢车菊素3-O-葡萄糖苷含量测定，并利用HPLC-MS进行组分分析(结果见表6)。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、牵牛花色素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素3-O-葡萄糖苷标准品购自挪威Polyphenol公司。矢车菊素3-O-葡萄糖苷含量HPLC检测方法：
色谱柱：C-18 250×4.6mm
检测波长：520nm
流速：1.0ml/min
流动相：A：5％甲酸水溶液；    B：甲醇
Figure S2008100525269D00041
实施例2
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)以黑米为原料，加入原料质量3倍的盐酸水溶液为提取溶剂，盐酸水溶液的体积百分比浓度为1％，在45℃提取6次，每次8小时，过80目筛，得提取液；
(2)将提取液经AB-8型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为10的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶3的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、20％、50％、75％的乙醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
实施例3
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)以紫胡萝卜为原料，加入原料质量10倍的硫酸水溶液为提取溶剂，硫酸水溶液的体积百分浓度为2％，在40℃提取1次，4小时，过100目筛，得提取液；
(2)将提取液经HPD100型大孔树脂吸附，用水及体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为40的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶4的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、20％、50％、75％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
实施例4
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)以紫玉米须为原料，加入原料质量12倍的水溶液为提取溶剂，在20℃提取5次，每次1小时，过120目筛，得提取液；
(2)将提取液经HPD100A型大孔树脂吸附，用水及体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为30的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶5的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、20％、50％、75％的乙醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
实施例5
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)以紫玉米皮为原料，加入原料质量8倍的水溶液为提取溶剂，在50℃提取3次，每次6小时，过100目筛，得提取液；
(2)将提取液经HPD300型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为20的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶3的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、20％、50％、75％的乙醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
实施例6
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)以紫玉米粒为原料，加入原料质量3倍的体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液为提取溶剂，在20℃提取6次，每次1小时，过80目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度2，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶1的比例分散至水中；
(2)将所述步骤(1)获得的产物经X-5型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为40的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶4的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、20％、50％、75％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
实施例7
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)以紫玉米棒为原料，加入所述原料质量10倍的体积百分比浓度为40％的甲醇水溶液为提取溶剂，在30℃提取3次，每次4小时，过120目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度40，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶4的比例分散至水中；
(2)将所述步骤(1)获得的产物经NKA-II型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为40的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶4的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、20％、50％、75％的乙醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
实施例8
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)以紫甘薯为原料，加入所述原料质量12倍的体积百分比浓度为10％的乙醇酸水溶液提取溶剂，所述酸水溶液中的酸为盐酸，盐酸水溶液的体积百分比浓度为1％，在50℃提取1次，每次8小时，过100目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度10，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶10的比例分散至水中；
(2)将所述步骤(1)获得的产物经D101型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为40的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶5的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、15％、30％、50％的乙醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
实施例9
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)以桑椹果为原料，加入所述原料质量5倍的体积百分比浓度为60％的甲醇酸水溶液为提取溶剂，所述酸水溶液中的酸为柠檬酸，柠檬酸水溶液的体积百分比浓度为5％；在40℃提取5次，每次6小时，过100目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度10，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶5的比例分散至水中；
(2)将所述步骤(1)获得的产物经DA201型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为30的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶3的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、20％、50％、75％的乙醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
实施例10
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)以蓝莓果为原料，加入所述原料质量10倍的体积百分比浓度为60％的乙醇酸水溶液为提取溶剂，所述酸水溶液中的酸为乙酸，其体积百分比浓度为3％，在20℃提取5次，每次4小时，过100目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度2，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶4的比例分散至水中；
(2)将所述步骤(1)获得的产物经HP20型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为30的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶5的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、15％、30％、50％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
实施例11
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)以欧洲越桔为原料，加入所述原料质量10倍的体积百分比浓度为40％的乙醇酸水溶液为提取溶剂，所述酸水溶液中的酸为柠檬酸，其体积百分比浓度为1％，在30℃提取3次，每次6小时，过100目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度40，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶5的比例分散至水中；
(2)将所述步骤(1)获得的产物经AB-8型大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为40的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶5的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、15％、30％、50％的乙醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
实施例12
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，用下述方法制成：
(1)以欧洲越桔为原蓝靛果为原料，加入所述原料质量10倍的体积百分比浓度为40％的磷酸水溶液为提取溶剂，在30℃提取3次，每次6小时，过100目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度40，得到提取物；
(2)将所述步骤(1)获得的产物AB-8型经大孔树脂吸附，用水和体积百分比浓度为10％、30％、50％、70％、95％的乙醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为40的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶3的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％、20％、50％、75％的乙醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
实施例13
含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位的最大耐受量试验及抗炎活性测试
1.试验材料：动物：ICR小鼠，18～22g，雌雄兼用；SD大鼠，体重180～200g，雄性，北京试验动物研究中心提供。
2.试剂：含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位(矢车菊素3-O-葡萄糖苷含量大于50％)；阿司匹林购自湖南永可轻工业品进出口有限公司；角叉菜胶购自中国联星实业有限公司；电子分析天平，旋涡混匀器。
3.试验方法：(1)最大耐受量试验：将40只ICR小鼠分为两组，第1组，常水对照组；第2组，含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位组。每组20只，雌雄各半，禁食12h后，1天内给小鼠灌胃给药的含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位最大浓度0.4g/mL溶液，间隔4h给药1次。1天共给药3次，每次0.30ml/10g，连续观察7天。给药后正常颗粒料饲养，自由饮水，自然光照12h/12h，室温20～24℃，湿度60％。观察动物反应。(2)二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验：小鼠50只，雌雄各半，随机分5组，灌服含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位溶液、阿司匹林水溶液或等容水后1h，于小鼠右耳用微量注射器滴二甲苯0.02ml并令二甲苯浸满鼠耳两面，40min后小鼠拉颈处死，沿鼠耳根部基线用眼科剪剪下两耳，称取左、右耳片重量，以右耳与左耳重量差的mg数表示炎症反应强度。(3)角叉菜胶致大鼠足肿胀试验：大鼠40只随机分成5组，灌胃给药后1h，于每只大鼠右后脚足跖皮下注射1％角叉菜胶50μL致炎，玻璃容积法测量致炎前及致炎后1、3和5h足容积，计算肿胀度和各组的肿胀抑制率。
4.试验结果：(1)灌胃给药7天内小鼠无一死亡，给药第3、8天分别称重，体重变化两组没有差异，动物均增重。8天称重后逐只处死解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等各器官均无异常。含有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的有效部位灌胃给药的最大给药量为36g/kg，说明该提取物安全无毒。(2)测试结果显示含有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的有效部位能够显著抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，且呈现量效依赖关系，其高剂量组与阿司匹林组的抗炎作用相当。
表1含有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的有效部位对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响
Figure S2008100525269D00091
与对照组比较，**P＜0.01；采用T检验(n＝10)
(3)结果各药物组于致炎后1h与对照组比较均有显著性差异，致炎后3h和5h，高剂量组与对照组比较仍具有显著性差异，且与阳性药阿司匹林组作用相当，提示含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位对角叉菜胶所致大鼠足肿胀有明显抑制作用，结果见表3。
表2组合物对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响
Figure S2008100525269D00101
与对照组比较，**P＜0.01；T检验(n＝8)；EV：肿胀程度；EI：肿胀抑制率。
实施例14
一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位的镇痛活性测试
1.试验材料：动物：ICR小鼠，18～22g，雌雄兼用；北京试验动物研究中心提供。
2.试剂：含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位(矢车菊素3-O-葡萄糖苷含量大于50％)；
阿司匹林购自湖南永可轻工业品进出口有限公司；醋酸为分析纯，电子分析天平，旋涡混匀器。
3.试验方法：(1)醋酸扭体试验：小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，分别灌胃药物或等量水，药后1h，各鼠腹腔注射0.7％HAC生理盐水溶液0.2ml，观察注射HAC后20min内小鼠扭体反应的次数，并计算镇痛抑制百分率。
Figure S2008100525269D00102
(2)小鼠热板法试验：按赵一法进行试验，雌性小鼠于60±0.5℃热板测定小鼠舔后爪反应的潜伏期，选取于热板仪内不跳跃、于5～15s内出现反应的小鼠60只随机分5组，灌胃药物或等容水，药后1h，2h将小鼠置热板测定痛阈一次，超过60s不反应者立刻取出，反应时间按60s计。
4.试验结果：(1)醋酸扭体法试验结果显示含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的提取物能够一定程度抑制醋酸所致小鼠扭体反应。结果见表3。
表3含有矢车菊素3-O葡萄糖苷的有效部位对醋酸所致小鼠扭体的镇痛作用
与对照组比较，**P＜0.01；*P＜0.05；T检验(n＝10)。
(2)热板法测试结果显示该含有矢车菊素3-O葡萄糖苷的有效部位具有一定的镇痛作用，且低剂量随着作用时间延长，作用效果越发显著。详细结果见表4
表4组合物对热板试验小鼠舔足反应时间的影响(x±s，n＝12)
Figure S2008100525269D00112
实施例15
含有矢车菊素3-O葡萄糖苷的有效部位抗佐剂性类风湿性关节炎的作用
1.试验材料：动物：ICR小鼠，18～22g，雌雄兼用；SD大鼠，体重180～200g，雄性，北京试验动物研究中心提供。
2.试剂：含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位(矢车菊素3-O-葡萄糖苷含量大于50％)；
弗氏完全佐剂，Sigma公司产品；地塞米松注射液，江苏苏星制药有限公司。电子分析天平，旋涡混匀器。
3.试验方法：取雄性大鼠48只，体重160～180g，按体重随机分为6组，分别为对照组(NS 10mL/kg)；模型组(NS 10mI/kg)；地塞米松组(0.85mg/kg)；含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位低、中、高剂量(25、50、100mg/kg)组。各组每日ig给药1次，连续24d。实验开始后，先用容积法测量左、右后足跖容积，然后于第1天给药后1h，除对照组外，各组大鼠右后足跖SC弗氏完全佐剂0.1mL致炎。此后每3天测量大鼠右后足跖容积，并观察鼠耳红斑、尾部结节等出现情况及体重变化。计算并比较各组动物在不同时间的足跖肿胀度(足跖肿胀度＝致炎后足跖容积一致炎前足跖容积)。
4.试验结果：给佐剂后模型组大鼠右后足足跖肿胀度明显增加，且与对照组比较差异显著(P＜0.01)；而地塞米松组、含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位中、高剂量组大鼠右后足足跖肿胀度明显减小(P＜0.05、0.01)。表明含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位对佐剂诱发的原发性足跖肿胀具有良好的对抗作用。结果见表5。
Figure S2008100525269D00121
实施例16
表6含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位中各花青素的液质分析结果(保留时间、紫外吸收及质谱特征)
Figure S2008100525269D00131

Claims (5)

1.一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)提取：
提取的方法为下述步骤之一种：
①以黑豆皮、黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果为原料，加入所述原料质量3-12倍的水或酸水溶液为提取溶剂，在20-50℃提取1-6次，每次1-8小时，过80-120目筛，得提取液，所述酸水溶液中的酸的体积百分比浓度为1％～5％；
②以黑豆皮、黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果为原料，加入所述原料质量3-12倍的体积百分比浓度为10％～95％的乙醇水溶液或甲醇水溶液或乙醇酸水溶液或甲醇酸水溶液为提取溶剂，在20-50℃提取1-6次，每次1-8小时，过80-120目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度2-40，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶1～10的比例分散至水中，所述酸水溶液中的酸的体积百分比浓度为1％～5％；
(2)将所述步骤(1)获得的产物经大孔树脂吸附，用水及体积百分比浓度为10％～95％的乙醇水溶液或水及体积百分比浓度为10％～95％的甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱液通过薄层层析方法并结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将其合并，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，得糖度为10～40的浓缩物；
(3)将所述浓缩物按质量比为1∶3-5的比例分散至水中进行聚酰胺树脂吸附，用水及体积百分比浓度为5％-75％的乙醇水溶液或水及体积百分比浓度为5％-75％的甲醇水溶液梯度洗脱，通过薄层层析结合分析型HPLC检测，收集富含矢车菊素3-O-葡萄糖苷的组分，将洗脱液在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩，至糖度为10-40，干燥，得矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位。
2.根据权利要求1所述的一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位的制备方法，其特征是所述步骤(1)提取为：
以黑豆皮、黑米、紫胡萝卜、紫玉米须、紫玉米皮、紫玉米粒、紫玉米棒、紫甘薯、桑椹果、蓝莓果、欧洲越桔或蓝靛果为原料，加入所述原料质量10倍的体积百分比浓度为40％～60％的乙醇酸水溶液为提取溶剂，在20-30℃提取3-5次，每次4-6小时，过100目筛，在温度≤60℃，真空度为0.06～0.08MPa减压浓缩至糖度2-40，得到提取物，将所述提取物以质量比为1∶4～5的比例分散至水中，所述酸水溶液中的酸的体积百分比浓度为1％～3％。
3.根据权利要求1或2所述的一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位的制备方法，其特征是所述酸水溶液中的酸为硫酸、磷酸、乙酸或柠檬酸。
4.根据权利要求1或2所述的一种含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位的制备方法，其特征是所述大孔树脂的型号为AB-8型、HP20型、HPD100型、HPD100A型、HPD300型、X-5型、NKA-II型、D101型或DA201型。
5.权利要求1-4之一的方法制备的含有矢车菊素3-O-葡萄糖苷的有效部位，其特征是主要成分有矢车菊素3-O-半乳糖苷，矢车菊素3-O-葡萄糖苷，飞燕草素3-O-葡萄糖苷，且矢车菊素3-O-葡萄糖苷的含量大于50％。
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