CN101244089B - 嗜酸乳杆菌/粪肠球菌培养基、制剂及其工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种三联活菌制剂，它包括：长型双歧杆菌菌粉；嗜酸乳杆菌菌粉；粪链球菌菌粉。本发明还提供了致病上述三联活菌制剂的方法以及所用的保护剂、发酵培养基和种子培养基。

Description

嗜酸乳杆菌/粪肠球菌培养基、制剂及其工艺
技术领域
本发明涉及三联活菌制剂及其制备方法，更具体涉及包含长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌的三联活菌制剂及其制备方法。
背景技术
双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌是人和动物体内参见的正常菌群重要成员，集中粘附在下肠道粘膜，对机体发挥有益作用，能抑制外籍病原菌的入侵，其代谢产物提供宿主必需的维生素，参与和协助营养的消化和吸收。上述细菌能激发机体的免疫功能。减少肠源性毒性的吸收。由于消化系统疾病或大量使用抗生素及随着年龄的增长，体内双歧杆菌逐渐减少。为保持上述有益菌的正常水平，人们开始研究含有这些有益菌的制剂。如中国专利CN1103584公开了三株口服液及其制法，其含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌。但是，该口服液稳定性差，菌的存活率低，不宜长期保存。
中国专利CN1119154C公开了一种双歧三联活菌制剂及其制备方法。该文献提出可以使用特定保护剂来提高双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌的稳定性。虽然使用上述保护剂可在一定程度上提高双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌的稳定性，但是进一步提高稳定性的效果并不十分令人满意。
另外，目前并没有文献报道改进双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌的种子液培养基和发酵培养基来提高双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌稳定性的方法。
因此，本领域中需一种具有较高的稳定性新的三联活菌制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的三联活菌制剂，它具有较高的稳定性。
本发明的另一个目的在于提供一种制备上述三联活菌制剂的方法，所述方法能方便地制备所述三联活菌制剂。
本发明一方面提供了一种三联活菌制剂，它包括：
长型双歧杆菌菌粉；
嗜酸乳杆菌菌粉；
粪链球菌菌粉，
所述长型双歧杆菌菌粉包含长型双歧杆菌和第一保护剂，所述第一保护剂包含脱脂奶粉8-50％、谷氨酸钠0.01-10％、异乳糖8-50％、Vc-Na0.01-5％、淀粉5-30％，以所述第一保护剂的总重量计，
所述嗜酸乳杆菌菌粉包含嗜酸乳杆菌菌粉包含嗜酸乳杆菌和第二保护剂，所述粪链球菌菌粉包含粪链球菌和第二保护剂，所述第二保护剂包含脱脂奶粉6-70％、谷氨酸钠0.0l-10％、异乳糖8-50％、Vc-Na0.01-5％、淀粉4-30％，以所述第二保护剂的总重量计。
本发明另一方面提供了一种保护剂，所述保护剂包含包含脱脂奶粉6-70％、谷氨酸钠0.01-10％、异乳糖8-50％、Vc-Na0.01-5％、淀粉4-30％，以所述保护剂的总重量计。
本发明还提供了一种制造所述三联活菌制剂的方法，所述方法包括：
(a)将长型双歧杆菌在第一种子培养基中接种，得到长型双歧杆菌接种产物；
(b)将嗜酸乳杆菌在第二种子培养基中接种，得到嗜酸乳杆菌接种产物；
(c)将粪链球菌在第二种子培养基中接种，得到粪链球菌接种产物；
(d)将步骤(a)所得长型双歧杆菌接种产物置于第一发酵培养基中发酵，得到长型双歧杆菌发酵产物；
(e)将步骤(b)所得嗜酸乳杆菌接种产物置于第二发酵培养基中发酵，得到嗜酸乳杆菌发酵产物；
(f)将步骤(c)所得粪链球菌接种产物置于第二发酵培养基中发酵，得到粪链球菌发酵产物；
(g)混合长型双歧杆菌与第一保护剂，冻干得到长型双歧杆菌菌粉；
(h)将嗜酸乳杆菌和粪链球菌分别与第二保护剂混合，分别冻干得到嗜酸乳杆菌菌粉和粪链球菌菌粉；
(i)混合上述长型双歧杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉和粪链球菌菌粉得到三联活菌制剂。
在本发明的一个优选实例中，所述第一种子培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的营养物质和0.15-5重量％的矿物盐和84.00-97.65重量％的溶剂。
在本发明的另一个优选实例中，所述第二种子培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的营养物质和65.5-98.2重量％的溶剂。
在本发明的另一个优选实例中，所述第一发酵培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的营养物质和0.15-5重量％的矿物盐和84.00-97.65重量％的溶剂。
在本发明的另一个优选实例中，所述第二发酵培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的营养物质和65.5-98.2重量％的溶剂。
本发明还提供了一种种子培养基，所述种子培养基含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的营养物质和65.5-98.2重量％的溶剂。
本发明又提供了一种发酵培养基，所述发酵培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的营养物质和65.5-98.2重量％的溶剂。
本发明进一步提供了所述三联活菌制剂在治疗便秘中的用途。
本发明发酵液配制生产工艺使活菌收得率提高；细菌冻干时所用的保护剂，明显提高细菌的存活率；使用该活菌冻干粉制备成的制剂，延长了细菌存活期，提高制剂稳定性。
具体实施方式
三联活菌制剂
本发明一方面提供了一种三联活菌制剂，它包括：
长型双歧杆菌菌粉；
嗜酸乳杆菌菌粉；
粪链球菌菌粉，
所述长型双歧杆菌菌粉包含长型双歧杆菌和第一保护剂，所述第一保护剂包含脱脂奶粉8-50％、谷氨酸钠0.01-10％、异乳糖8-50％、Vc-Na0.01-5％、淀粉5-30％，以所述第一保护剂的总重量计。
所述嗜酸乳杆菌菌粉包含嗜酸乳杆菌菌粉包含嗜酸乳杆菌和第二保护剂，所述粪链球菌菌粉包含粪链球菌和第二保护剂，所述第二保护剂包含脱脂奶粉6-70％、谷氨酸钠0.01-10％、异乳糖8-50％、Vc-Na0.01-5％、淀粉4-30％，以所述第二保护剂的总重量计。
本发明所述的长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌在本领域中是常规的，它已经公开在已授权的US6368591中，其中长型双歧杆菌的保藏号为CCTCCM98003，嗜酸乳杆菌的保藏号为CCTCC M98004，粪链球菌的保藏号为CCTCCM98005。
长型双歧杆菌为厌氧性细菌，革兰氏染色阳性，着色不均匀，无芽孢，无荚膜，无鞭毛，菌体呈直形或弯曲状，可出现“Y”或“V”型的分叉状，棒状等多多形态。在本发明的一个优选实例中，所述长型双歧杆菌为长型双歧杆菌(6—1)(CCTCCM98003)。
嗜酸乳杆菌为兼性厌氧菌，革兰氏染色阳性、无芽孢，无荚膜，无鞭毛，两端圆的短杆球杆状，单个或成双排列。在本发明的一个优选实例中，所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌YIT2004(CCTCC M98004)。
粪链球菌为兼性厌氧菌，革兰氏染色阳性、无芽孢，无荚膜，无鞭毛，卵圆形，多成双排列，也呈短链。在本发明的一个优选实例中，所述粪链球菌为粪链球菌YIT0027(CCTCC M98005)。
保护剂
在本发明中，所述第一保护剂是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以知道哪些具体的保护剂可用于本发明中，例如参见CN1119154C。在本发明的一个优选实例中，所述第一保护剂包含脱脂奶粉8-50％、谷氨酸钠0.01-10％、异乳糖8-50％、Vc-Na0.01-5％、淀粉5-30％，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述脱脂奶粉的含量为10-40％、较好为15-35％、更好为20-30％、最好为22-28％，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述谷氨酸钠的含量为0.1-8％、较好为0.5-5％、更好为1-3％、最好为1.5-2.5％，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述异乳糖的含量为10-45％、较好为15-35％、更好为20-30％、最好为22-25％，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述Vc-Na的含量为0.1-4％、较好为0.5-3％、更好为1-2.5％、最好为1.5-2％，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述淀粉的含量为8-25％、较好为10-20％、更好为12-18％、最好为13-17％，以所述第一保护剂的总重量计。
在本发明中，所述第二保护剂包含脱脂奶粉6-70％、谷氨酸钠0.01-10％、异乳糖8-50％、Vc-Na0.01-5％、淀粉4-30％，以所述第二保护剂的总重量计。在本发明的一个优选实例中，所述脱脂奶粉的含量为10-60％、较好为20-50％、更好为30-40％、最好为33-37％，以所述第二保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述谷氨酸钠的含量为0.1-8％、较好为0.5-5％、更好为1-3％、最好为1.5-2.5％，以所述第二保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述异乳糖的含量为10-45％、较好为15-35％、更好为20-30％、最好为22-25％，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述Vc-Na的含量为0.1-4％、较好为0.5-3％、更好为1-2.5％、最好为1.5-2％，以所述第二保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述淀粉的含量为5-25％、较好为10-20％、更好为12-18％、最好为13-17％，以所述第二保护剂的总重量计。
在本发明的一个优选实例中，所述第二保护剂由下列物质组成：
 
脱脂奶粉 谷氨酸钠 异乳糖 Vc-Na 淀粉
2重量份 0.5重量份 2.5重量份 0.2重量份 1重量份
在本发明中，所述脱脂奶粉是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以直接得到哪些脱脂奶粉可用于本发明中。在本发明的一个优选实例中，所述脱脂奶粉选自市售脱脂奶粉。
在本发明中，所述谷氨酸钠是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以直接得到哪些谷氨酸钠可用于本发明中。在本发明的一个优选实例中，所述谷氨酸钠选自市售谷氨酸钠。
在本发明中，所述异乳糖是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以直接得到哪些异乳糖可用于本发明中。在本发明的一个优选实例中，所述异乳糖选自市售异乳糖。
在本发明中，所述VcNa是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以直接得到哪些VcNa可用于本发明中。在本发明的一个优选实例中，所述VcNa选自市售VcNa。
在本发明中，所述淀粉是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以直接得到哪些淀粉可用于本发明中。在本发明的一个优选实例中，所述淀粉选自市售淀粉。
制造三联活菌制剂的方法
本发明另一方面提供了一种制造上述三联活菌制剂的方法，所述方法包括：
(a)将长型双歧杆菌在第一种子培养基中接种，得到长型双歧杆菌接种产物；
(b)将嗜酸乳杆菌在第二种子培养基中接种，得到嗜酸乳杆菌接种产物；
(c)将粪链球菌在第二种子培养基中接种，得到粪链球菌接种产物；
(d)将步骤(a)所得长型双歧杆菌接种产物置于第一发酵培养基中发酵，得到长型双歧杆菌发酵产物；
(e)将步骤(b)所得嗜酸乳杆菌接种产物置于第二发酵培养基中发酵，得到嗜酸乳杆菌发酵产物；
(f)将步骤(c)所得粪链球菌接种产物置于第二发酵培养基中发酵，得到粪链球菌发酵产物；
(g)混合长型双歧杆菌与第一保护剂，冻干得到长型双歧杆菌菌粉；
(h)将嗜酸乳杆菌和粪链球菌分别与第二保护剂混合，分别冻干得到嗜酸乳杆菌菌粉和粪链球菌菌粉；
(i)混合上述长型双歧杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉和粪链球菌菌粉得到三联活菌制剂。
在上述步骤(a)中，所述接种长型双歧杆菌的方法是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道怎样对所述长型双歧杆菌进行接种。具体的接种方法可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述接种方法包括火焰接种法，即用镊子夹住乙醇棉花，点燃后，在种子罐接种头上下燃烧，火焰消毒。然后旋开种子罐接种头盖，在火焰下快速将装有种子接种瓶的橡皮管插入接种头上。缓慢打开接种口阀门，将种子倒入罐内。
在上述步骤(b)中，接种所述嗜酸乳杆菌的方法是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道怎样对所述嗜酸乳杆菌进行接种。具体的接种方法可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述接种方法包括火焰接种法，即用镊子夹住乙醇棉花，点燃后，在种子罐接种头上下燃烧，火焰消毒。旋开种子罐接种头盖，在火焰下快速将装有种子接种瓶的橡皮管插入接种头上。缓慢打开接种口阀门，将种子倒入罐内。
在上述步骤(c)中，接种所述粪链球菌的方法是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道怎样对所述粪链球菌进行接种。具体的接种方法可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述接种方法包括火焰接种法，即用镊子夹住乙醇棉花，点燃后，在种子罐接种头上下燃烧，火焰消毒。旋开种子罐接种头盖，在火焰下快速将装有种子接种瓶的橡皮管插入接种头上。缓慢打开接种口阀门，将种子倒入罐内。
在上述步骤(d)中，发酵长型双歧杆菌接种产物的方法是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可知道怎样对长型双歧杆菌接种产物进行发酵。具体的发酵方法可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述发酵方法包括液态培养方法(即所用培养基是一种或多种水溶液如：蛋白胨水、营养肉汤等)、固态培养方法(培养基是含有固态物如：琼脂、明胶等的培养基，呈凝固状或者半凝固状)。
在上述步骤(e)中，发酵嗜酸乳杆菌接种产物的方法是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可知道怎样对嗜酸乳杆菌接种产物进行发酵。具体的发酵方法可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述发酵方法包括液态培养方法(培养基是一种或多种水溶液如：蛋白胨水、营养肉汤等)、固态培养方法(培养基是含有不同浓度固态物如：琼脂、明胶等的培养基，呈凝固状或者半凝固状)。
在上述步骤(f)中，发酵粪链球菌接种产物的方法是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可知道怎样对粪链球菌接种产物进行发酵。具体的发酵方法可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述发酵方法包括液态培养方法(培养基是一种或多种水溶液如：蛋白胨水、营养肉汤等)、固态培养方法(培养基是含有不同浓度固态物如：琼脂、明胶等的培养基，呈凝固状或者半凝固状)。
在上述步骤(g)和(h)中，所述冻干方法是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以知道进行冻干的具体方法。具体的冻干方法可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述冻干方法包括低温冷冻干燥法，所述冷冻干燥是指通过升华从冻结的生物产品中去掉水份或其他溶剂的过程。升华指的是溶剂，比如水，像干冰一样，不经过液态，从固态直接变为气态的过程。
第一种子培养基
在上述步骤(a)中，所述第一种子培养基在本领域中是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接得到哪些种子培养基可用于接种长型双歧杆菌。具体的第一种子培养基可参见《长双歧杆菌增菌培养基的优化》(《食品工业科技》2004年第04期)。
但是，为了得到更加稳定的长型双歧杆菌，优选使用特定的种子培养基。在本发明的一个优选实例中，所述第一种子培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的营养物质和0.15-5重量％的矿物盐和84.00-97.65重量％的溶剂。在本发明的另一个优选实例中，所述第一种子培养基包含如下组分：
Figure S07137649020070312D000081
在所述第一种子培养基中，所述氮源是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道哪些具体氮源可用于本发明中。具体氮源的例子可参见CN1119154C。在本发明的一个优选例子中，所述氮源选自脱脂奶粉、蛋白胨、胰胨、铵盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述氮源选自脱脂奶粉、硫酸铵中的一种或两种。通常，以所述第一种子培养基的总重量计，所述氮源的含量为1.1-6.5重量％，较好为1.5-5.5重量％，更好为2.0-5.0重量％，最好为3.0-4.0重量％。
在所述第一种子培养基中，所述碳源是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些碳源可用于本发明中。具体碳源的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖、异乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种。在本发明的另一个实例中，所述碳源选自葡萄糖、异乳糖中的一种或两种。通常，以所述第一种子培养基的总重量计，所述碳源的含量为0.8-2.8重量％，较好为1.0-2.5重量％，更好为1.5-2.0重量％。
在所述第一种子培养基中，所述营养物质是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些营养物质可用于本发明中。具体营养物质的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述营养物质是酵母粉。通常，以所述第一种子培养基的总重量计，所述营养物质的含量为0.6-1.5重量％，较好为0.7-1.2重量％，更好为0.8-1.0重量％。
在所述第一种子培养基中，所述矿物盐(矿物质)是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些矿物盐可用于本发明中。具体的矿物盐的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述矿物盐选自磷酸盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述矿物盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或多种。通常，以所述第一种子培养基的总重量计，所述矿物盐的含量为0.15-5重量％，较好为0.5-4.5重量％，更好为1.0-3.0％，最好为1.5-2.5重量％。
在所述第一种子培养基中，所述溶剂是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些溶剂可用于本发明中。具体溶剂的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述溶剂是生物学培养基中常用的溶剂，例如水(纯水)等。
第二种子培养基
在上述步骤(b)和(c)中，所述第二种子培养基在本领域中是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接得到哪些种子培养基可用于接种嗜酸乳杆菌。具体的第二种子培养基可参见《嗜酸乳杆菌增菌培养基的优化》(《食品工业科技》2002年第06期)和《嗜酸乳杆菌、粪链球菌保健酸奶发酵剂的研究》(安徽农业技术师范学院学报2000年第01期)
但是，为了得到更加稳定的嗜酸乳杆菌，优选使用特定的第二种子培养基。在本发明的一个优选实例中，所述第二种子培养基含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的营养物质和65.5-98.2重量％的溶剂。所述第二种子培养基包含：
在所述第二种子培养基中，所述氮源是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道哪些具体氮源可用于本发明中。具体氮源的例子可参见CN1119154C。在本发明的一个优选例子中，所述氮源选自脱脂奶粉、蛋白胨、胰胨、铵盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述氮源选自胰胨、蛋白胨中的一种或两种。通常，以所述第二子培养基的总重量计，所述氮源的含量为1.1-6.5重量％，较好为1.5-5.5重量％，更好为2.0-5.0重量％，最好为3.0-4.0重量％。
在所述第二种子培养基中，所述碳源是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些碳源可用于本发明中。具体碳源的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖、异乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种。在本发明的另一个实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖中的一种或两种。通常，以所述第二子培养基的总重量计，所述碳源的含量为0.5-2.8重量％，较好为1.0-2.5重量％，更好为1.5-2.0重量％。
在所述第二种子培养基中，所述营养物质是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些营养物质可用于本发明中。具体营养物质的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述营养物质选自西红柿、泡菜汁、酵母粉中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述营养物质选自西红柿、酵母粉中的一种或多种。通常，以所述第二种子培养基的总重量计，所述营养物质的含量为0.5-25重量％，较好为5-20重量％，更好为10-15重量％。
在所述第二种子培养基中，所述溶剂是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些溶剂可用于本发明中。具体溶剂的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述溶剂是生物学培养基中常用的溶剂，例如水(纯水)等。
发酵培养基
在上述步骤(d)中，所述第一发酵培养基是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可知道哪些发酵培养基可用于发酵长型双歧杆菌。具体的发酵培养基可参见CN1119145C。
但是，为了得到更加稳定的长型双歧杆菌，优选使用特定的第一发酵培养基。在本发明的一个优选实例中，所述第一发酵培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的营养物质和0.15-5重量％的矿物盐和84.00-97.65重量％的溶剂。在本发明的一个优选实例中，所述第一发酵培养基包含：
Figure S07137649020070312D000121
在所述第一发酵培养基中，所述氮源是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道哪些具体氮源可用于本发明中。具体氮源的例子可参见CN1119154C。在本发明的一个优选例子中，所述氮源选自脱脂奶粉、蛋白胨、胰胨、铵盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述氮源选自脱脂奶粉、硫酸铵中的一种或两种。通常，以所述第一发酵培养基的总重量计，所述氮源的含量为1.1-6.5重量％，较好为1.5-5.5重量％，更好为2.0-5.0重量％，最好为3.0-4.0重量％。
在所述第一发酵培养基中，所述碳源是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些碳源可用于本发明中。具体碳源的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖、异乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种。在本发明的另一个实例中，所述碳源选自葡萄糖、异乳糖中的一种或两种。通常，以所述第一发酵培养基的总重量计，所述碳源的含量为0.8-2.8重量％，较好为1.0-2.5重量％，更好为1.5-2.0重量％。
在所述第一发酵培养基中，所述营养物质是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些营养物质可用于本发明中。具体营养物质的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述营养物质是酵母粉。通常，以所述第一发酵培养基的总重量计，所述营养物质的含量为0.6-1.5重量％，较好为0.7-1.2重量％，更好为0.8-1.0重量％。
在所述第一发酵培养基中，所述矿物盐(矿物质)是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些矿物盐可用于本发明中。具体的矿物盐的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述矿物盐选自磷酸盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述矿物盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或多种。通常，以所述第一发酵培养基的总重量计，所述矿物盐的含量为0.15-5重量％，较好为0.5-4.5重量％，更好为1.0-3.0％，最好为1.5-2.5重量％。
在所述第一发酵培养基中，所述溶剂是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些溶剂可用于本发明中。具体溶剂的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述溶剂是生物学培养基中常用的溶剂，例如水(纯水)等。
在上述步骤(e)和(f)中，所述第二发酵培养基是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可知道哪些发酵培养基可用于本发明中发酵嗜酸乳杆菌和粪链球菌。在本发明的一个优选实例中，所述第二发酵培养基含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的营养物质和65.5-98.2重量％的溶剂，所述第二发酵培养基包含：
Figure S07137649020070312D000131
在所述第二发酵培养基中，所述氮源是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道哪些具体氮源可用于本发明中。具体氮源的例子可参见CN1119154C。在本发明的一个优选例子中，所述氮源选自脱脂奶粉、蛋白胨、胰胨、铵盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述氮源选自胰胨、蛋白胨中的一种或两种。通常，以所述第二发酵培养基的总重量计，所述氮源的含量为1.1-6.5重量％，较好为1.5-5.5重量％，更好为2.0-5.0重量％，最好为3.0-4.0重量％。
在所述第二发酵培养基中，所述碳源是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些碳源可用于本发明中。具体碳源的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖、异乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种。在本发明的另一个实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖中的一种或两种。通常，以所述第二发酵培养基的总重量计，所述碳源的含量为0.5-2.8重量％，较好为1.0-2.5重量％，更好为1.5-2.0重量％。
在所述第二发酵培养基中，所述营养物质是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些营养物质可用于本发明中。具体营养物质的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述营养物质选自西红柿、泡菜汁、酵母粉中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述营养物质选自西红柿、酵母粉中的一种或多种。通常，以所述第二发酵培养基的总重量计，所述营养物质的含量为0.5-25重量％，较好为5-20重量％，更好为10-15重量％。
在所述第二发酵培养基中，所述溶剂是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些溶剂可用于本发明中。具体溶剂的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述溶剂是生物学培养基中常用的溶剂，例如水(纯水)等。
在上述步骤(g)-(h)中所述的第一保护剂和第二保护剂的定义如上述。
其他
所述三联活菌制剂可制成各种合适的剂型，例如口服液、片剂、胶囊、口崩片等等。在本发明的一个优选实例中，所述剂型为胶囊。在本发明的另一个优选实例中，所述剂型为片剂。
在本发明中，所述三联活菌制剂可通过本领域中已知的方法制成各种剂型，例如可根据CN1119154C所述方法制成片剂、胶囊、颗粒剂等等。例如：
1.胶囊制造方法：原辅料预处理、烘粉、原辅料混合过筛、胶囊填充、装瓶、装箱；
2.颗粒制造方法：原辅料预处理、制粒、烘粉、原辅料混合过筛、散剂填充、装泡罩、装单中盒、装箱；
3.片剂制造方法：原辅料预处理、制粒、烘粉、原辅料混合过筛、压片、内包装、装盒、装箱
实施例
西红柿汁的制备
准确称取果色艳丽，果皮光亮、肉质厚、无柄、无斑点、无裂痕的西红柿(可根据实际需要量决定)。将上述经过初步筛选后的西红柿放入水池中洗干净后放置于干净的筐中。将洗净的西红柿依次放入粉碎机中粉碎后倒入加热灭菌锅中灭菌。加热灭菌后的西红柿汁离心后即制备成西红柿汁。
实施例1：制备接种长型双歧杆菌的种子培养基
用500ml的纯水溶解下表1所示数量的葡萄糖(购自河北圣雪葡萄糖有限公司)、酵母粉(德国MERCK KGAA.)、硫酸铵(江苏永华精细化学品有限公司，AR级)、磷酸二氢钾(汕头金砂化工厂有限公司，AR级)、磷酸氢二钾(汕头金砂化工厂有限公司，AR级)和异乳糖(意大利INALCO S.P.A.)，得到溶液。并用1500ml纯水将下表1所示数量的脱脂奶粉(新西兰FONTERRALTD.)用匀浆机(上海标本模型厂，DS-1)打匀，得到混悬液。
将上述溶液和混悬液经过胶体磨(温州鹿城乳化机械公司，JM-L80)研磨均匀后放至种子瓶中，然后用饮用水加至4000g配制成长型双歧杆菌的种子培养基，再加入少许稀氢氧化钠溶液调节培养基的pH。
封好上述种子瓶口，并将所述种子瓶在消毒锅中于121℃消毒10-15分钟。
表1
4000g的配制量
 
组分 处方1 处方2 处方3 处方4 处方5
脱脂奶粉 44g 44g 196g 260g 260g
葡萄糖 12g 12g 58g 80g 80g
酵母粉 24g 54g 54g 54g 60g
硫酸铵 3g 55g 55g 55g 100g
磷酸二氢钾 1g 20g 12g 12g 20g
磷酸氢二钾 2g 80g 43g 2g 80g
异乳糖 8g 40g 32g 8g 40g
实施例2：制备接种嗜酸乳杆菌和粪链球菌的种子培养基
用500ml的纯水溶解下表2所示数量的葡萄糖(河北圣雪葡萄糖有限公司)、酵母粉(德国MERCK KGAA.)、乳糖(上海申美医药开发科技有限公司)、西红柿汁(上海浦东新区金杨街道鑫鑫副食品经营部)，得到溶液。并用1500ml纯水将下表2所示数量的胰胨(德国MERCK KGAA.)和蛋白胨(日本制药株式会社)用匀浆机(上海标本模型厂，DS-1)打匀，得到混悬液。
将上述溶液和混悬液经过胶体磨研磨均匀后放至种子瓶中，然后用饮用水加至4000g配制成长型双歧杆菌的种子培养基，再加入少许稀氢氧化钠溶液调节培养基的pH。
封好上述种子瓶口，并将所述种子瓶在消毒锅中于121℃消毒10-15分钟。
表2
4000g的配制量
 
组分 处方1 处方2 处方3 处方4 处方5
西红柿汁 18g 18g 500g 920g 920g
葡萄糖 6g 6g 60g 100g 100g
酵母粉 2g 43g 43g 43g 80g
胰胨 40g 160g 160g 160g 200g
蛋白胨 4g 60g 36g 4g 60g
乳糖 2g 20g 13g 2g 20g
实施例3：制各长型双歧杆菌发酵培养基
将下表3所示除碳酸钙以外的组分倒入不锈钢桶中，再将30千克饮用水倒入不锈钢桶内，同时用不锈钢棒搅拌，得到培养基的混悬液。将所得混悬液倒入胶体磨中碾磨均匀。将碾磨均匀的混悬液倒入装有搅拌机的发酵罐中，用水补充至400kg。开启发酵罐搅拌机，同时用NaOH调节培养基的pH值，再加入下表3所示的加碳酸钙，同时用水加至400kg，得到发酵培养基。将所述发酵培养基于121℃进行10-15分钟的消毒。
表3
400kg的配制量
 
组分 处方1 处方2 处方3 处方4 处方5
脱脂奶粉 4.4kg 4.4kg 20kg 26kg 26kg
葡萄糖 2kg 2kg 9kg 12kg 12kg
酵母粉 2.4kg 6.2kg 6.2kg 6.2kg 6kg
硫酸铵 0.2kg 2.3kg 2.3kg 2.3kg 4kg
磷酸二氢钾 0.1kg 1.1kg 1.1kg 0.1kg 2kg
磷酸氢二钾 0.1kg 4kg 2.1kg 0.1kg 4kg
碳酸钙 0.2kg 10kg 5.3kg 0.2kg 10kg
实施例4：制各嗜酸乳杆菌和/或粪肠杆菌发酵培养基
将下表4所示除西红柿汁以外的组分倒入不锈钢桶中，再将30千克饮用水倒入不锈钢桶内，同时用不锈钢棒搅拌，得到培养基的混悬液。将所得悬浮液倒入胶体磨中碾磨均匀。将碾磨均匀的悬浮液倒入装有搅拌机的发酵罐中，用水补充至总体积为40升。开启发酵罐搅拌机，同时用NaOH调节培养基的pH值，再加入下表4所示的西红柿汁，同时用水加至400kg，得到发酵培养基。将所述发酵培养基于121℃进行10-15分钟的消毒。
表4
400kg的配制量
 
组分 处方1 处方2 处方3 处方4 处方5
西红柿汁 1.8kg 1.8kg 50kg 92kg 92kg
葡萄糖 0.6kg 0.6kg 6kg 10kg 10kg
酵母粉 0.2kg 4.3kg 4.3kg 4.3kg 8kg
胰胨 4kg 16kg 16kg 16kg 20kg
蛋白胨 0.4kg 6kg 3.6kg 0.4kg 6kg
乳糖 0.2kg 2kg 1.3kg 0.2kg 2kg
实施例5：制备长型双歧杆菌菌泥
将长型双歧杆菌种子(购自中国生物制品检定所)40ml分别置于装有实施例1中所得种子培养基(处方1-5)的5000ml玻璃血清瓶中，于37.0±2.0℃接种，分别得到接种产物A1-A5。
将上述接种产物A1-A5分别置于装有实施例3所得发酵培养基(处方1-5)的600L发酵罐(张家港江南化工机械厂)中37.0±2.0℃、罐压0.05±0.03MPa发酵，得到发酵产物B1-B5。
将上述发酵产物B1-B5分别通入上海离心机械研究所生产的GQ142管式离心机的离心管进行常温离心。通入的发酵液体流量控制在4000～9000毫升/分钟，离心90-150分钟结束后取出离心管，从离心管中挖出菌泥C1-C5放入不锈钢桶。
实施例6：制备嗜酸乳杆菌菌泥
将嗜酸乳杆菌(购自中国生物制品检定所)40ml分别置于装有实施例2中所得种子培养基(处方1-5)的5000ml玻璃血清瓶中37.0±2.0℃接种，分别得到接种产物D1-D5。
将上述接种产物D1-D5分别置于实施例4所得发酵培养基(处方1-5)600L发酵罐(张家港江南化工机械厂)中37.0±2.0℃、罐压0.05±0.03MPa发酵，得到发酵产物E1-E5。
将上述发酵产物E1-E5分别通入上海离心机械研究所生产的GQ142管式离心机的离心管进行常温离心。通入的发酵液体流量控制在4000～9000ml/min，离心40-80分钟结束后取出离心管，从离心管中挖出菌泥F1-F5放入不锈钢桶。
实施例7：制备粪链球菌菌泥
将粪链球菌(购自中国生物制品检定所)40ml分别置于装有实施例2中所得种子培养基(处方1-5)的5000ml玻璃血清瓶中37.0±2.0℃接种，分别得到接种产物G1-G5。
将上述接种产物F1-F5分别置于装有实施例4所得发酵培养基(处方1-5)的600L发酵罐(张家港江南化工机械厂)中37.0±2.0℃、罐压0.05±0.03MPa发酵，得到发酵产物H1-H5。
将上述发酵产物H1-H5分别通入上海离心机械研究所生产的GQ142管式离心机的离心管进行常温离心。通入的发酵液体流量控制在4000～9000ml/min，离心40～80分钟结束后取出离心管，从离心管中挖出菌泥I1-I5放入不锈钢桶。
实施例8：制备长型双歧杆菌菌粉
在实施例5所得菌泥C1-C5中加入分别下表所示组成的保护剂(其中菌泥C1-C5中分别加入处方1-处方5的保护剂)，同时用胶体磨循环研磨均匀。将所得均匀混合物放入冷冻干燥机(北京天利科技，GLZ-6)中进行冻干。在冻干过程中，对板层进口温度进行降温预冻，使产品预冻到-40℃左右。预冻后，开冷凝使冷阱降至-40℃，然后开真空泵对箱体进行抽空。箱体真空达到真空设定值(15pa)后，开始对产品进行升温。当产品颜色一致时，冻干结束，即得菌粉J1-J5。
表5
 
组分 处方1 处方2 处方3 处方4 处方5
奶粉 3kg 3.75kg 4.5kg 6kg 7.5kg
谷氨酸钠 750g 900g 1.05kg 1.2kg 1.35kg
异乳糖 6kg 7.5kg 5.25kg 4.5kg 2.7kg
Vc-Na 750g 600g 450g 300g 150g
淀粉 4.5kg 2.25kg 3.75kg 3kg 3.3kg
实施例9：制备嗜酸乳杆菌菌粉
在实施例6所得菌泥F1-F5中加入分别下表所示组成的保护剂(其中菌泥F1-F5中分别加入处方1-处方5的保护剂)，同时用胶体磨循环研磨均匀。将所得均匀混合物放入冷冻干燥机(北京天利科技，GLZ-6)中进行冻干。在冻干过程中，对板层进口温度进行降温预冻，使产品预冻到-40℃左右。预冻后，开冷凝使冷阱降至-40℃，然后开真空泵对箱体进行抽空。箱体真空达到真空设定值(15pa)后，开始对产品进行升温。当产品颜色一致时，冻干结束，即得菌粉K1-K5。
表6
 
组分 处方1 处方2 处方3 处方4 处方5
奶粉 1.6kg 2kg 2.4kg 3.2kg 4kg
谷氨酸钠 400g 480g 560g 640g 720g
异乳糖 3.2kg 4kg 2.8kg 2.4kg 1.44kg
Vc-Na 400g 320g 240g 160g 80g
淀粉 2.4kg 1.2kg 2kg 1.6kg 1.76kg
实施例10：制备粪链球菌菌粉
在实施例7所得菌泥I1-I5中加入分别下表所示组成的保护剂(在菌泥I1-I5中分别加入处方1-处方5的保护剂)，同时用胶体磨循环研磨均匀。将所得均匀混合物放入冷冻干燥机(北京天利科技，GLZ-6)中进行冻干。在冻干过程中，对板层进口温度进行降温预冻，使产品预冻到-40℃左右。预冻后，开冷凝使冷阱降至-40℃，然后开真空泵对箱体进行抽空。箱体真空达到真空设定值(15pa)后，开始对产品进行升温。当产品颜色一致时，冻干结束，即得菌粉L1-L5。
表7
 
组分 处方1 处方2 处方3 处方4 处方5
奶粉 1.6kg 2kg 2.4kg 3.2kg 4kg
谷氨酸钠 400g 480g 560g 640g 720g
异乳糖 3.2kg 4kg 2.8kg 2.4kg 1.44kg
Vc-Na 400g 320g 240g 160g 80g
淀粉 2.4kg 1.2kg 2kg 1.6kg 1.76kg
实施例11：制备三联活菌胶囊
按下表所示数量的组分投入到多向运动混合机(HDA-600，温州市制药设备厂)中混合30分钟，得到均匀混合物。使用胶囊填充机(浙江富昌机械有限公司全自动胶囊充填机，NJP-2000B)制得胶囊M1-M5各60万粒，其中胶囊Mi包含长型双歧杆菌菌粉Ji、嗜酸乳杆菌菌粉Ki和粪链球菌菌粉Li，i为1到5的整数。
表8
 
公斤数
长型双歧杆菌菌粉J1-J5(≥10×108CPU/g) 12.0kg
嗜酸乳杆菌菌粉K1-K5(≥5.0×108CPU/g) 6.0kg
粪链球菌菌粉L1-L5(≥5.0×108CPU/g) 3.0kg
预胶化淀粉 52.5kg
乳糖 52.5kg
实施例12：制备三联活菌散剂
将下表所示的组分投入多向运动混合机(HDA-600，温州市制药设备厂)中混合30-40，得到均匀混合物。开启散剂填充机(上海松川包装机械厂多列包装机，SL-8)将所述均匀混合物制成散剂N1-N5各10万支，散剂Ni包含长型双歧杆菌菌粉Ji、嗜酸乳杆菌菌粉Ki和粪链球菌菌粉Li，i为1到5的整数。
其中空白颗粒如下制备：将下表10所示的组分喷雾制粒后，经100℃烘箱干燥。
表9
 
用量
长型双歧杆菌菌粉J1-J5 9.2kg
嗜酸乳杆菌菌粉K1-K5 4.0Kg
粪链球菌菌粉L1-L5 2.5Kg
空白颗粒 82.5Kg
牛奶固体香精 0.4Kg
柠檬固体香精 0.1Kg
表10
散剂空白制粒处方
 
用量
脱脂奶粉 70kg
麦芽糊精 21kg
异乳糖 14kg
HPMC(2910)0.3％ 150g
95％乙醇 25kg
水 25kg
实施例13：稳定性试验
将下述菌粉分别用铝塑袋抽真空封口包藏，置于相对应的温度中，每月取出测菌量。
 
保存温度：2-8℃
保存时间    J1           K1               L1
0 5.7×109     7.8×109           7.1×109
3月 6.2×109     4.5×109           6.3×109
6月 4.1×109     3.0×109           5.0×109
12月 2.1×109     3.7×109           1.0×109
24月 8.9×107     2.4×108           1.9×108
 
保存温度：2-8℃
保存时间    J2             K2               L2
0 6.1×109      7.1×109          5.9×109
3月 3.1×109      7.7×109          6.7×109
6月 2.0×109      6.7×109          3.8×109
12月 9.8×108      5.0×109          8.8×108
24月 3.0×108      1.7×108          7.6×107
 
保存温度：2-8℃
保存时间 　　J5　　　　　　　L5　　　　　　L5
0 3.8×109　　　　8.2×109　　　　7.9×109
3月 4.4×109　　　　7.6×109　　　　8.0×109
6月 3.0×109　　　　3.8×109　　　　6.7×109
12月 1.3×109　　　　8.7×108　　　　7.8×108
24月 1.2×108　　　　3.7×108　　　　2.0×108
 
保存温度：25℃
保存时间 　J1　　　　　　　K1　　　　　　L1
0 5.7×109　　　　7.8×109　　　　7.1×109
3月 6.2×109        4.5×109        6.3×109
6月 8.2×108        1.0×109        4.7×108
12月 2.3×108        3.2×108        1.8×108
18月 7.7×107        8.3×107        7.8×107
 
保存温度：25℃
保存时间    J2               K2              L2
0 6.1×109         7.1×109        5.9×109
3月 3.1×109         7.7×109        6.7×109
6月 7.7×108         8.3×108        5.0×108
12月 3.5×108         1.9×108        2.0×108
18月 8.0×107         5.6×107        4.7×107
 
保存温度：25℃
保存时间     J5         L5          L5
0 3.8×109    8.2×109    7.9×109
3月 4.4×109    7.6×109    8.0×109
6月 3.9×108    5.0×108    8.1×108
12月 1.0×108    8.8×107    1.3×108
18月 5.7×107    7.8×107    6.7×107
 
保存温度：37℃
保存时间     J1          K1          L1
0 5.7×109    7.8×109    7.1×109
1月 1.7×109    3.1×109    30×109
2月 2.3×108    7.8×108    6.7×108
3月 1.8×107    1.5×108    9.7×107
 
保存温度：37℃
保存时间     J2          K2          L2
0 6.1×109    7.1×109    5.9×109
1月 8.3×108    7.8×108    4.6×108
2月 3.0×108    4.7×108    3.9×108
3月 5.6×107    3.7×107    4.5×107
 
保存温度：37℃
保存时间     J5          L5          L5
0 3.8×109    8.2×109    7.9×109
1月 8.9×108    1.1×109    9.7×108
2月 1.7×108    5.1×108    9.8×107
3月 1.1×108    5.8×107    3.4×107
对比例1-3
根据CN1119154C的实施例1-3分别制备微生物制剂，即对比例1-3。用与实施例13相同的方法测试对比例1-3所得微生物制剂中的长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠杆菌的稳定性，结果如下：
 
+ 保存温度：2-8℃(对比例1)
保存时间     B          L          S
0 3.3×109   3.0×109    3.0×109
3月 2.0×109   1.7×109    2.4×109
6月 5.7×108   8.0×108    1.0×109
12月 1.0×108   4.1×108    7.0×109
24月 1.6×107   6.0×107    1.1×107
 
保存温度：2-8℃(对比例2)
保存时间     B          L          S
0 1.3×109   8.0×109    2.0×109
3月 1.0×109   6.4×109    1.0×109
6月 7.9×108   3.7×109    9.2×108
12月 3.0×108   1.0×109    6.5×108
24月 8.8×106   1.7×107    7.1×107
 
保存温度：2-8℃(对比例3)
保存时间     B          L          S
0 2.0×1010   1.0×1010   3.1×109
3月 1.0×1010   8.3×109    1.0×109
6月 8.0×109    5.4×109    7.4×108
12月 8.0×108    2.0×109    4.0×108
24月 3.6×107    4.5×107    9.0×106
 
保存温度：25℃(对比例1)
保存时间      B          L          S
0 3.3×109    3.0×109    3.0×109
6月 5.6×108    4.1×108    7.0×108
12月 7.2×107    8.1×107    1.0×108
18月 1.0×107    2.6×107    5.1×107
 
保存温度：25℃(对比例2)
保存时间     B          L          S
0 1.3×109    8.0×109    2.0×109
6月 3.0×108    1.0×109    7.6×108
12月 5.0×107    4.6×107    2.3×108
18月 8.6×106    1.0×107    7.1×107
 
保存温度：25℃(对比例3)
保存时间     B          L          S
0 2.0×1010    1.0×1010    3.1×109
6月 7.0×109     2.8×109     5.7×108
12月 2.1×108     8.7×108     1.0×108
18月 5.6×107     4.0×108     4.0×107
 
保存温度：37℃(对比例1)
保存时间     B          L          S
0 3.3×109    3.0×109    3.0×109
1月 5.7×108    8.0×108    7.0×109
2月 1.0×107    2.3×107    1.7×107
3月 6.3×106    5.2×106    4.7×106
 
保存温度：37℃(对比例2)
保存时间      B          L          S
0 1.3×109    8.0×109    2.0×109
1月 6.6×108    7.3×108    3.7×108
2月 4.5×107    6.0×107    4.8×107
3月 6.4×106    7.0×106    5.8×106
 
保存温度：37℃(对比例3)
保存时间     B          L          S
0 2.0×1010    1.0×1010    3.1×109
1月 8.0×109     8.4×109     6.0×108
2月 7.1×108     6.1×108     5.1×107
3月 6.2×107     5.9×107     7.0×106
其中，B表示长型双歧杆菌，L表示嗜酸乳杆菌，S表示粪链球菌。
实施例14：三联活菌制剂的应用
使功能性便秘患者口服实施例1所制得的胶囊M1，每天三次，每次一粒，所得结果如下：
1)有效性结果：
本研究共入组病例141例。结果显示：功能性便秘患者服用胶囊M1持续一个月后，日均排便次数较治疗前(0.30，0.35)显著增多至0.63次/日，P<0.0001，2周治疗后，周Bristol分型均值显著改善(0.61，0.63至1.76)，P<0.0001。
便秘的伴随症状疗效评价：在治疗1个月后便秘伴随症状改善有效率为46.2％，在治疗3个月后伴随症状改善有效率为81.5％。
对单个症状改善情况的分析显示：服用胶囊M1持续一个月后单个症状积分较治疗前显著降低(P<0.05)。
对便秘常见症状的总积分改善情况分析显示：功能性便秘患者服用胶囊M1持续一个月后总积分较治疗前显著下降(P<0.001)。
2)安全性结果：无不良反应发生。
实施例15：三联活菌制剂的应用
本实施例描述了本发明三联活菌制剂治疗腹泻的效果。
A.入选病例
1.成人急性腹泻：
(1)轻型或者普通型急性菌痢：
*轻型—体温38℃以下，临床症状不明显，腹泻次数不超过4次-5次/日，大便稀烂，肉眼不见脓血，培养阳性。
*普通型—体温38-39℃，白血球<20000/ml，有轻度里急后重，大便5-15次/日，带粘液或脓血，神志清醒，无嗜睡、惊厥，心血管功能良好，呼吸平稳。
(2)原因不明急性腹泻(包括细菌性和病毒性等)：起病急，有不洁饮食史，腹泻水便>3次/日，大便外观无脓血，镜检高倍视野白细胞<15个。
2.成人慢性腹泻：大便>2-3次/日，大便性状不正常，持续2-3个月以上，反复发作以及近期又犯者。
3.成人便秘：大便>2-3次/天，变硬干结，且有排便困难，常需依靠开塞露或润肠剂，症状持续1周以上者。
4.小儿各种病因的急、慢性腹泻(感染性或非感染性)或便秘之0+-13周岁门诊或住院病儿。
B.研究方法
病人于治疗前停用其它药物(抗生素、激素、其它止泻药或润肠剂)，将实施例12所得的胶囊M2让患者服用，剂量如下：成人每次5粒，2-3次/日；0+-1周岁的儿童每次1粒，3次/日；1-6周岁的儿童每次2粒，3次/日；6-13周岁的儿童每次3粒，3次/日。根据卡方检验和Ridit分析进行统计学处理。
C.结论：
1.用实施例12所得胶囊M2治疗成人或儿童轻、中型的急性腹泻和原因不明的慢性腹泻共401例。总疗效为87.5％。另外，胶囊M2治疗急性腹泻的效果优于治疗慢性腹泻(二者疗效相比有显著性差异P<0.05)。治疗成人和儿童急性腹泻的总有效率分别为92.3％和90.7％；而对慢性腹泻的总有效率则分别为80.0％和76.3％。
2.胶囊M2除了可用于治疗原因不明的腹泻外，尚对感染性腹泻(病原包括：痢疾杆菌、沙门氏菌、致病大肠菌、空肠弯曲菌、气单胞菌及轮状病毒等)有疗效。其中401例病例中有52例治疗前检查出病原菌(细菌类)，有8例检查出轮状病毒，治疗有52例中有50例(96.2％)转阴，8例轮状病毒性肠炎患者治疗后全部显效。
3.胶囊M2对慢性腹泻的疗效虽不及急性腹泻，但确有一定效果。慢性腹泻患者试验前均有不同程度的服过其它药物而无明显效果，或长期被诊断为“肠激惹综合症”，服用胶囊M2后80.0％的成人和76.3％的儿童患者痊愈。
4.胶囊M2有调整肠道菌群的功能。从对19例成人和16例儿童腹泻患者治疗前后主要菌群的检测结果看，治疗前病人都不同程度的存在肠菌群紊乱，主要表现在：肠杆菌需氧或兼性厌氧菌偏高，双歧杆菌等厌氧菌偏低，治疗后随着临床症状的消失上述状况得到改善，肠菌群恢复正常。
5.未发现服用胶囊M2后有明显副作用。

Claims (4)

1.一种三联活菌制剂，它包括： 
长型双歧杆菌菌粉； 
嗜酸乳杆菌菌粉； 
粪链球菌菌粉， 
所述长型双歧杆菌菌粉包含长型双歧杆菌和第一保护剂，所述第一保护剂由以下组分组成：脱脂奶粉8-50%、谷氨酸钠0.1-8%、异乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、淀粉5-30%，以所述第一保护剂的总重量计， 
所述嗜酸乳杆菌菌粉包含嗜酸乳杆菌和第二保护剂，所述粪链球菌菌粉包含粪链球菌和第二保护剂，所述第二保护剂由以下组分组成：脱脂奶粉6-70%、谷氨酸钠0.01-10%、异乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、淀粉4-30%，以所述第二保护剂的总重量计。 
2.一种保护剂，所述保护剂由以下组分组成：脱脂奶粉8-50%、谷氨酸钠0.1-8%、异乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、淀粉5-30%，以所述保护剂的总重量计。 
3.一种制造权利要求1所述三联活菌制剂的方法，所述方法包括： 
（a）将长型双歧杆菌在第一种子培养基中接种，得到长型双歧杆菌接种产物； 
（b）将嗜酸乳杆菌在第二种子培养基中接种，得到嗜酸乳杆菌接种产物； 
（c）将粪链球菌在第二种子培养基中接种，得到粪链球菌接种产物； 
（d）将步骤（a）所得长型双歧杆菌接种产物置于第一发酵培养基中发酵，得到长型双歧杆菌发酵产物； 
（e）将步骤（b）所得嗜酸乳杆菌接种产物置于第二发酵培养基中发酵，得到嗜酸乳杆菌发酵产物； 
（f）将步骤（c）所得粪链球菌接种产物置于第二发酵培养基中发酵，得到粪链球菌发酵产物； 
（g）混合长型双歧杆菌与第一保护剂，冻干得到长型双歧杆菌菌粉； 
（h）将嗜酸乳杆菌和粪链球菌分别与第二保护剂混合，分别冻干得到嗜酸乳杆菌菌粉和粪链球菌菌粉； 
（i）混合上述长型双歧杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉和粪链球菌菌粉得到三联 活菌制剂， 
所述第一种子培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的营养物质和0.15-5重量％的矿物盐和84.00-97.65重量%的溶剂， 
所述第二种子培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的营养物质和65.5-98.2重量%的溶剂， 
所述第一发酵培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的营养物质和0.15-5重量％的矿物盐和84.00-97.65重量%的溶剂， 
所述第二发酵培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的营养物质和65.5-98.2重量%的溶剂。 
4.权利要求1所述的三联活菌制剂在制备治疗便秘的药物中的用途。 
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