CN103830278A

CN103830278A - 活菌冻干粉以及三联活菌制剂的制备方法

Info

Publication number: CN103830278A
Application number: CN201210477296.7A
Authority: CN
Inventors: 汪忠慧; 张军东; 王树海; 于鸿晶; 王莎莎
Original assignee: SHANGHAI SINE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI SINE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2014-06-04

Abstract

活菌冻干粉以及三联活菌制剂的制备方法。提供了一种制造活菌冻干粉的方法，所述方法包括如下步骤：（a）将菌种在种子培养基中接种，得到接种产物；（b）将步骤（a）所得接种产物置于发酵培养基中发酵，发酵期间通过加入碱维持发酵液pH不变，得到发酵产物；（c）混合发酵产物与保护剂冻干得到冻干菌粉；所述菌种选自长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和/或粪链球菌。

Description

活菌冻干粉以及三联活菌制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及活菌冻干粉以及三联活菌制剂的制备方法，更具体涉及包含长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌的活菌冻干粉以及三联活菌制剂的制备方法。

背景技术

双岐杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌是人和动物体内常见的正常菌群重要成员，集中粘附在下肠道粘膜，对机体发挥有益作用，能抑制外籍病原菌的入侵，其代谢产物提供宿主必须的维生素，参与和协助营养的消化和吸收。上述细菌能激发机体的免疫功能。减少肠源性毒性的吸收。由于消化系统疾病或大量使用抗生素及随着年龄的增长，体内双岐杆菌逐渐减少。为保持上述有益菌的正常水平，人们开始研究含有这些有益菌的制剂。

中国专利CN101244090公开了一种双岐三联活菌制剂及其制备方法。该文献报道改进双岐杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌的种子液培养基和发酵培养基来提高双岐杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌稳定性的方法。但是发酵液活菌数及菌体活性不是不是令人很满意。

因此，需要一种具有较高活菌量、菌体活性强的发酵液来制备活菌冻干粉以及三联活菌制剂的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提高长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌及粪肠球菌的发酵液活菌数；提高菌的活性、提高冻干时存活率。

本发明所涉及的种液及发酵培养基使种子活性增强，发酵过程调节pH使发酵液菌体维持最佳生长状态，活菌量提高，能达到50-900亿个/mL的高密度培养（CN101244090所公开的为1-100亿个/ml），完全能够满足生产需求；本文所提供的发酵菌体产物生长状态好，活性强，在原有的冻干保护剂及冻干工艺情况下，能提高冻干制剂的活菌量及冻干存活率，延长其保存时间，提高冻干粉的稳定性。

本发明一方面提供了一种制造活菌冻干粉的方法，所述方法包括如下步骤：

（a）将菌种在种子培养基中接种，得到接种产物；

（b）将步骤（a）所得接种产物置于发酵培养基中发酵，发酵期间通过加入碱维持发酵液pH不变，得到发酵产物；

（c）混合发酵产物与保护剂冻干得到冻干菌粉；

所述菌种选自长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和/或粪链球菌。

在本发明的一个优选实例中，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水或其组合。

在本发明的一个优选实例中，所述碱以碱的水溶液形式使用。

在本发明的一个优选实例中，所述发酵液的pH值维持在4.5-8.0的范围内。

在本发明的一个优选实例中，所述发酵液的pH值维持在6.0-7.0范围内。

本发明另一方面提供了一种制造三联活菌制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

（i）根据本发明所述的方法分别制备长型双歧杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉和粪链球菌菌粉；以及

（ii）混合上述长型双歧杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉和粪链球菌菌粉得到三联活菌制剂。

本发明另一方面提供了用本发明所述的方法制备的活菌冻干粉。

本发明另一方面提供了用本发明所述的方法制备的三联活菌制剂。

具体实施方式

在本发明中，如果没有特别的说明，百分数（％）或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。

在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。

在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。

在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。

在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。

如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。

如果没有特别指出，本发明所述的百分数（包括重量百分数）的基准都是所述组合物的总重量。

本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。

在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。

在本文中，除非另有说明，各反应都在常温常压下进行。

在本文中，除非另有说明，各个反应步骤可以顺序进行，也可以不按顺序进行。例如，各个反应步骤之间可以包含其他步骤，而且反应步骤之间也可以调换顺序。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。

在本文中，除非另有说明，“不变”表示变化在±10％以内，较好在±5％以内，更好在±2％以内，最后在±1％。

冻干粉及三联活菌制剂的制备方法

（a）将菌种在种子培养基中接种，得到接种产物；

（c）混合发酵产物与保护剂冻干得到冻干菌粉；

所述菌种选自长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和/或粪链球菌。

在上述步骤（a）中，所述接种菌种的方法是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道怎样对所述菌种进行接种。具体的接种方法可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述接种方法包括火焰接种法，即用镊子夹住乙醇棉花，点燃后，在种子罐接种头上下燃烧，火焰消毒。然后旋开种子罐接种头盖，在火焰下快速将装有种子接种瓶的橡皮管插入接种头上。缓慢打开接种口阀门，将种子倒入罐内。

在上述步骤（b）中，发酵接种产物的方法是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可知道怎样对接种产物进行发酵。具体的发酵方法可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述发酵方法包括液态培养方法（即所用培养基是一种或多种水溶液如：蛋白胨水、营养肉汤等）、固态培养方法（培养基是含有固态物如：琼脂、明胶等的培养基，呈凝固状或者半凝固状）。

在上述步骤（b）中，本发明所述的碱是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接推导出哪些碱可用于本发明。在本发明的一个优选实例中，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水或其组合。在本发明的另一个优选实例中，所述碱可以碱的水溶液形式使用。

在上述步骤（b）中，所述发酵液维持的最佳pH值优选在4.5-8.0的范围内。在本发明的一个优选实例中，所述发酵液的最佳pH值在5.5-7.5范围内，最好为6.0-7.0。

在上述步骤（c）中，所述冻干方法是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以知道进行冻干的具体方法。具体的冻干方法可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述冻干方法包括低温冷冻干燥法，所述冷冻干燥是指通过升华从冻结的生物产品中去掉水份或其他溶剂的过程。升华指的是溶剂，比如水，像干冰一样，不经过液态，从固态直接变为气态的过程。

本发明所述的长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌在本领域中是常规的，它已经公开在已授权的US6368591中，其中长型双歧杆菌的保藏号为CCTCCM98003，嗜酸乳杆菌的保藏号为CCTCC M98004，粪链球菌的保藏号为CCTCCM98005。

长型双歧杆菌为厌氧性细菌，革兰氏染色阳性，着色不均匀，无芽孢，无荚膜，无鞭毛，菌体呈直形或弯曲状，可出现“Y”或“V”型的分叉状，棒状等多多形态。在本发明的一个优选实例中，所述长型双歧杆菌为长型双歧杆菌（6－1）（CCTCCM98003）。

嗜酸乳杆菌为兼性厌氧菌，革兰氏染色阳性、无芽孢，无荚膜，无鞭毛，两端圆的短杆球杆状，单个或成双排列。在本发明的一个优选实例中，所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌YIT2004（CCTCC M98004）。

粪链球菌为兼性厌氧菌，革兰氏染色阳性、无芽孢，无荚膜，无鞭毛，卵圆形，多成双排列，也呈短链。在本发明的一个优选实例中，所述粪链球菌为粪链球菌YIT0027（CCTCC M98005）。

种子培养基

在本发明中的上述方法中，所述种子培养基是常规的。在本发明的一个优选实例中，所述种子培养基具体可参见CN101244090A中所述的种子培养基（包括第一种子培养基和第二种子培养基）。CN101244090A所公开的内容以全文引用的方式插入本文中。

第一种子培养基

在本发明的一个优选实例中，用于长型双歧杆菌的种子培养基优选称为第一种子培养基。所述第一种子培养基在本领域中是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接得到哪些种子培养基可用于接种长型双歧杆菌。具体的第一种子培养基可参见《长双歧杆菌增菌培养基的优化》（《食品工业科技》2004年第04期）。

但是，为了得到更加稳定的长型双歧杆菌，优选使用特定的种子培养基。在本发明的一个优选实例中，所述第一种子培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-1.5重量％的营养物质和0.15-5重量％的矿物盐和84.00-97.65重量%的溶剂。在本发明的另一个优选实例中，所述第一种子培养基包含如下组分：

在所述第一种子培养基中，所述氮源是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道哪些具体氮源可用于本发明中。具体氮源的例子可参见CN1119154C。在本发明的一个优选例子中，所述氮源选自脱脂奶粉、蛋白胨、胰胨、铵盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述氮源选自脱脂奶粉、硫酸铵中的一种或两种。通常，以所述第一种子培养基的总重量计，所述氮源的含量为1.1-6.5重量％，较好为1.5-5.5重量％，更好为2.0-5.0重量％，最好为3.0-4.0重量％。

在所述第一种子培养基中，所述碳源是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些碳源可用于本发明中。具体碳源的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖、异乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种。在本发明的另一个实例中，所述碳源选自葡萄糖、异乳糖中的一种或两种。通常，以所述第一种子培养基的总重量计，所述碳源的含量为0.8-2.8重量％，较好为1.0-2.5重量％，更好为1.5-2.0重量％。

在所述第一种子培养基中，所述营养物质是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些营养物质可用于本发明中。具体营养物质的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述营养物质是酵母粉。通常，以所述第一种子培养基的总重量计，所述营养物质的含量为0.6-1.5重量％，较好为0.7-1.2重量％，更好为0.8-1.0重量％。

在所述第一种子培养基中，所述矿物盐（矿物质）是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些矿物盐可用于本发明中。具体的矿物盐的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述矿物盐选自磷酸盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述矿物盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或多种。通常，以所述第一种子培养基的总重量计，所述矿物盐的含量为0.15-5重量％，较好为0.5-4.5重量％，更好为1.0-3.0％，最好为1.5-2.5重量％。

在所述第一种子培养基中，所述溶剂是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些溶剂可用于本发明中。具体溶剂的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述溶剂是生物学培养基中常用的溶剂，例如水（纯水）等。

第二种子培养基

在本发明的一个优选实例中，用于嗜酸乳杆菌和/或粪链球菌的种子培养基优选称为第二种子培养基。所述第二种子培养基在本领域中是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接得到哪些种子培养基可用于接种嗜酸乳杆菌。具体的第二种子培养基可参见《嗜酸乳杆菌增菌培养基的优化》（《食品工业科技》2002年第06期）和《嗜酸乳杆菌、粪链球菌保健酸奶发酵剂的研究》（安徽农业技术师范学院学报2000年第01期）

但是，为了得到更加稳定的嗜酸乳杆菌，优选使用特定的第二种子培养基。在本发明的一个优选实例中，所述第二种子培养基含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-3重量％的碳源、0.5-25重量％的营养物质和65.5-98.2重量%的溶剂。在本发明的另一个优选实例中，所述第二种子培养基包含：

在所述第二种子培养基中，所述氮源是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道哪些具体氮源可用于本发明中。具体氮源的例子可参见CN1119154C。在本发明的一个优选例子中，所述氮源选自脱脂奶粉、蛋白胨、胰胨、铵盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述氮源选自胰胨、蛋白胨中的一种或两种。通常，以所述第二子培养基的总重量计，所述氮源的含量为1.1-6.5重量％，较好为1.5-5.5重量％，更好为2.0-5.0重量％，最好为3.0-4.0重量％。

在所述第二种子培养基中，所述碳源是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些碳源可用于本发明中。具体碳源的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖、异乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种。在本发明的另一个实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖中的一种或两种。通常，以所述第二子培养基的总重量计，所述碳源的含量为0.5-2.8重量％，较好为1.0-2.5重量％，更好为1.5-2.0重量％。

在所述第二种子培养基中，所述营养物质是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些营养物质可用于本发明中。具体营养物质的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述营养物质选自西红柿、泡菜汁、酵母粉中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述营养物质选自西红柿、酵母粉中的一种或多种。通常，以所述第二种子培养基的总重量计，所述营养物质的含量为0.5-25重量％，较好为5-20重量％，更好为10-15重量％。

在所述第二种子培养基中，所述溶剂是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些溶剂可用于本发明中。具体溶剂的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述溶剂是生物学培养基中常用的溶剂，例如水（纯水）等。

发酵培养基

在本发明中的上述方法中，所述发酵培养基是常规的。在本发明的一个优选实例中，所述发酵培养基具体可参见CN101244090A中所述的发酵培养基（包括第一发酵培养基和第二发酵培养基）。CN101244090A所公开的内容以全文引用的方式插入本文中。

第一发酵培养基

在本发明的一个优选实例中，用于长型双歧杆菌的发酵培养基优选称为第一发酵培养基。所述第一发酵培养基是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可知道哪些发酵培养基可用于发酵长型双歧杆菌。具体的发酵培养基可参见CN1119145C。

但是，为了得到更加稳定的长型双歧杆菌，优选使用特定的第一发酵培养基。在本发明的一个优选实例中，所述第一发酵培养基包含1.1-6.5重量％的氮源、0.5-3重量％的碳源、0.6-2.0重量％的营养物质和0.15-5重量％的矿物盐和84.00-97.65重量%的溶剂。在本发明的一个优选实例中，所述第一发酵培养基包含：

在所述第一发酵培养基中，所述氮源是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道哪些具体氮源可用于本发明中。具体氮源的例子可参见CN1119154C。在本发明的一个优选例子中，所述氮源选自脱脂奶粉、蛋白胨、胰胨、铵盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述氮源选自脱脂奶粉、硫酸铵中的一种或两种。通常，以所述第一发酵培养基的总重量计，所述氮源的含量为1.1-6.5重量％，较好为1.5-5.5重量％，更好为2.0-5.0重量％，最好为3.0-4.0重量％。

在所述第一发酵培养基中，所述碳源是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些碳源可用于本发明中。具体碳源的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖、异乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种。在本发明的另一个实例中，所述碳源选自葡萄糖、异乳糖中的一种或两种。通常，以所述第一发酵培养基的总重量计，所述碳源的含量为0.8-2.8重量％，较好为1.0-2.5重量％，更好为1.5-2.0重量％。

在所述第一发酵培养基中，所述营养物质是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些营养物质可用于本发明中。具体营养物质的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述营养物质是酵母粉。通常，以所述第一发酵培养基的总重量计，所述营养物质的含量为0.6-2.0重量％，较好为0.7-1.5重量％，更好为0.8-1.0重量％。

在所述第一发酵培养基中，所述矿物盐（矿物质）是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些矿物盐可用于本发明中。具体的矿物盐的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述矿物盐选自磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述矿物盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸镁和碳酸钙中的一种或多种。通常，以所述第一发酵培养基的总重量计，所述矿物盐的含量为0.15-5重量％，较好为0.5-4.5重量％，更好为1.0-3.0％，最好为1.5-2.5重量％。

在所述第一发酵培养基中，所述溶剂是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些溶剂可用于本发明中。具体溶剂的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述溶剂是生物学培养基中常用的溶剂，例如水（纯水）等。

第二发酵培养基

在本发明的一个优选实例中，用于嗜酸乳杆菌和粪链球菌的发酵培养基优选称为第二发酵培养基。所述第二发酵培养基是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可知道哪些发酵培养基可用于本发明中发酵嗜酸乳杆菌和粪链球菌。在本发明的一个优选实例中，所述第二发酵培养基含1.1-6.5重量％的氮源、0.2-4重量％的碳源、0.5-25重量％的营养物质、0.001-0.5重量％的矿物质和65.5-98.2重量%的溶剂，所述第二发酵培养基包含：

在所述第二发酵培养基中，所述氮源是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可直接知道哪些具体氮源可用于本发明中。具体氮源的例子可参见CN1119154C。在本发明的一个优选例子中，所述氮源选自脱脂奶粉、蛋白胨、胰胨、铵盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述氮源选自胰胨、蛋白胨中的一种或两种。通常，以所述第二发酵培养基的总重量计，所述氮源的含量为1.1-6.5重量％，较好为1.5-5.5重量％，更好为2.0-5.0重量％，最好为3.0-4.0重量％。

在所述第二发酵培养基中，所述碳源是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些碳源可用于本发明中。具体碳源的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖、异乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖、麦芽糖中的一种或多种。在本发明的另一个实例中，所述碳源选自葡萄糖、乳糖中的一种或两种。通常，以所述第二发酵培养基的总重量计，所述碳源的含量为0.5-2.8重量％，较好为1.0-2.5重量％，更好为1.5-2.0重量％。

在所述第二发酵培养基中，所述营养物质是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些营养物质可用于本发明中。具体营养物质的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述营养物质选自西红柿、泡菜汁、酵母粉中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述营养物质选自西红柿、酵母粉中的一种或多种。通常，以所述第二发酵培养基的总重量计，所述营养物质的含量为0.5-25重量％，较好为5-20重量％，更好为10-15重量％。

在所述第二发酵培养基中，所述矿物盐（矿物质）是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些矿物盐可用于本发明中。具体的矿物盐的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述矿物盐选自乙酸盐、磷酸盐、硫酸盐、碳酸盐中的一种或多种。在本发明的另一个优选实例中，所述矿物盐选自乙酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰和碳酸钙中的一种或多种。通常，以所述第一发酵培养基的总重量计，所述矿物盐的含量为0.15-5重量％，较好为0.5-4.5重量％，更好为1.0-3.0％，最好为1.5-2.5重量％。

在所述第二发酵培养基中，所述溶剂是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接知道哪些溶剂可用于本发明中。具体溶剂的例子可参见CN1119145C。在本发明的一个优选实例中，所述溶剂是生物学培养基中常用的溶剂，例如水（纯水）等。

保护剂

在本发明中的上述方法中，所述保护剂是常规的。在本发明的一个优选实例中，所述保护剂具体可参见CN101244090A中所述的保护剂（包括第一保护剂和第二保护剂）。CN101244090A所公开的内容以全文引用的方式插入本文中。

在本发明的一个优选实例中，用于长型双歧杆菌的保护剂优选称为第一保护剂。所述第一保护剂是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以知道哪些具体的保护剂可用于本发明中，例如参见CN1119154C。在本发明的一个优选实例中，所述第一保护剂包含脱脂奶粉8-50%、谷氨酸钠0.01-10%、异乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、淀粉5-30%，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述脱脂奶粉的含量为10-40％、较好为15-35％、更好为20-30％、最好为22-28％，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述谷氨酸钠的含量为0.1-8％、较好为0.5-5％、更好为1-3％、最好为1.5-2.5％，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述异乳糖的含量为10-45％、较好为15-35％、更好为20-30％、最好为22-25％，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述Vc-Na的含量为0.1-4％、较好为0.5-3％、更好为1-2.5％、最好为1.5-2％，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述淀粉的含量为8-25％、较好为10-20％、更好为12-18％、最好为13-17％，以所述第一保护剂的总重量计。

在本发明的一个优选实例中，用于嗜酸乳杆菌和粪链球菌的保护剂优选称为第二保护剂。所述第二保护剂包含脱脂奶粉6-70%、谷氨酸钠0.01-10%、异乳糖8-50%、Vc-Na0.01-5%、淀粉4-30%，以所述第二保护剂的总重量计。在本发明的一个优选实例中，所述脱脂奶粉的含量为10-60％、较好为20-50％、更好为30-40％、最好为33-37％，以所述第二保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述谷氨酸钠的含量为0.1-8％、较好为0.5-5％、更好为1-3％、最好为1.5-2.5％，以所述第二保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述异乳糖的含量为10-45％、较好为15-35％、更好为20-30％、最好为22-25％，以所述第一保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述Vc-Na的含量为0.1-4％、较好为0.5-3％、更好为1-2.5％、最好为1.5-2％，以所述第二保护剂的总重量计。在本发明的另一个优选实例中，所述淀粉的含量为5-25％、较好为10-20％、更好为12-18％、最好为13-17％，以所述第二保护剂的总重量计。

在本发明的一个优选实例中，所述第二保护剂包含下列物质：

脱脂奶粉	谷氨酸钠	异乳糖	Vc-Na	淀粉
					2重量份	0.5重量份	2.5重量份	0.2重量份	1重量份

在本发明中，所述脱脂奶粉是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以直接得到哪些脱脂奶粉可用于本发明中。在本发明的一个优选实例中，所述脱脂奶粉选自市售脱脂奶粉。

在本发明中，所述谷氨酸钠是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以直接得到哪些谷氨酸钠可用于本发明中。在本发明的一个优选实例中，所述谷氨酸钠选自市售谷氨酸钠。

在本发明中，所述异乳糖是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以直接得到哪些异乳糖可用于本发明中。在本发明的一个优选实例中，所述异乳糖选自市售异乳糖。

在本发明中，所述Vc-Na是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以直接得到哪些Vc-Na可用于本发明中。在本发明的一个优选实例中，所述Vc-Na选自市售Vc-Na。

在本发明中，所述淀粉是常规的，本领域的普通技术人员根据现有技术可以直接得到哪些淀粉可用于本发明中。在本发明的一个优选实例中，所述淀粉选自市售淀粉。

本发明另一方面提供了一种制造三联活菌制剂的方法，所述方法包括：

（i）根据本发明的方法分别制备长型双歧杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉和粪链球菌菌粉；以及

冻干粉以及三联活菌制剂

本发明一方面提供了一种用本发明的方法制备的活菌冻干粉。

本发明另一方面提供了用本发明的方法制备的三联活菌制剂。

其他

所述三联活菌制剂可制成各种合适的剂型，例如口服液、片剂、胶囊、口崩片等等。在本发明的一个优选实例中，所述剂型为胶囊。在本发明的另一个优选实例中，所述剂型为片剂。

在本发明中，所述三联活菌制剂可通过本领域中已知的方法制成各种剂型，例如可根据CN1119154C所述方法制成片剂、胶囊、颗粒剂等等。例如：

胶囊制造方法：原辅料预处理、烘粉、原辅料混合过筛、胶囊填充、装瓶、装箱；

颗粒制造方法：原辅料预处理、制粒、烘粉、原辅料混合过筛、散剂填充、装泡罩、装单中盒、装箱；

片剂制造方法：原辅料预处理、制粒、烘粉、原辅料混合过筛、压片、内包装、装盒、装箱

实施例

发酵液活菌计数方法：

无菌取生长好的发酵液3ml，加入27ml稀释液（灭菌生理氯化钠溶液或者其他适宜的稀释液）中，充分摇匀，做10倍系列稀释，最终稀释度在10^-7或10^-8。取最终稀释度的菌液100μl，滴入适合活菌（长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌或粪肠球菌）生长的培养基平皿上，共做3个平皿，并以玻棒涂布均匀，置适宜条件下培养，到期观察每个平皿菌落生长情况，并计数。当平皿菌落数小于10或大于300时，应调整最终稀释度，重新测定。根据3个平皿菌落数总数按下列公式计算活菌数：

活菌数（CFU/ml）=（3个平皿菌落数之和÷3）×10×最终稀释度。

冻干粉活菌计数方法：

无菌取制备好的冻干粉3g，加入27ml稀释液（灭菌生理氯化钠溶液或者其他适宜的稀释液）中，充分摇匀，做10倍系列稀释，最终稀释度在10^-7或10^-8。取最终稀释度的菌液100μl，滴入适合活菌（长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌或粪肠球菌）生长的培养基平皿上，共做3个平皿，并以玻棒涂布均匀，置适宜条件下培养，到期观察每个平皿菌落生长情况，并计数。当平皿菌落数小于10或大于300时，应调整最终稀释度，重新测定。根据3个平皿菌落数总数按下列公式计算活菌数：

活菌数（CFU/g）=（3个平皿菌落数之和÷3）×10×最终稀释度。

碱液的配制和碱液加入方式：

准确称取碱性物质氢氧化钠。加入一定量体积的水，配制成浓度为1%—40%的碱性溶液，较好浓度为10-35%，更好为25-30%。在本发明的实施例中，所述氢氧化钠的浓度为30％。溶液配制好后，进行蒸汽灭菌处理，灭菌温度100℃-121℃之间，时间为10-30分钟。灭菌结束后，冷却至室温。在400L发酵液接种后，发酵罐补料系统上装上碱液，根据在线检测的pH值自动流加碱液，维持发酵液工艺规定的pH值。

实施例1.制备长双歧杆菌的种液培养基

用500ml的纯水溶解下表1所示数量的葡萄糖（购自河北圣雪葡萄糖有限公司）、酵母粉（德国MERCK KGAA.）、硫酸铵（江苏永华精细化学品有限公司，AR级）、磷酸二氢钾（汕头金砂化工厂有限公司，AR级）、磷酸氢二钾（汕头金砂化工厂有限公司，AR级）和异乳糖（意大利INALCO S.P.A.），得到溶液。并用1500ml纯水将下表1所示数量的脱脂奶粉（新西兰FONTERRALTD.）用匀浆机（上海标本模型厂，DS-1）打匀，得到混悬液。

将上述溶液和混悬液经过胶体磨（温州鹿城乳化机械公司，JM-L80）研磨均匀后放至种子瓶中，然后用饮用水加至4000g配制成长型双歧杆菌的种子培养基，再加入少许稀氢氧化钠溶液调节培养基的pH。

封好上述种子瓶口，并将所述种子瓶在消毒锅中于121℃消毒10-15分钟。

表1

4000g的配制量

组分	处方1	处方2	处方3	处方4	处方5
						脱脂奶粉	44g	44g	196g	260g	260g

葡萄糖	12g	12g	58g	80g	80g
						酵母粉	24g	54g	54g	54g	60g
硫酸铵	3g	55g	55g	55g	100g
						磷酸二氢钾	1g	20g	12g	12g	20g
磷酸氢二钾	2g	80g	43g	2g	80g
						异乳糖	8g	40g	32g	8g	40g

实施例2.制备嗜酸乳杆菌及粪链球菌的种液培养基

用500ml的纯水溶解下表2所示数量的葡萄糖（河北圣雪葡萄糖有限公司）、酵母粉（德国MERCK KGAA.）、乳糖（上海申美医药开发科技有限公司）、西红柿汁(上海浦东新区金杨街道鑫鑫副食品经营部），得到溶液。并用1500ml纯水将下表2所示数量的胰胨（德国MERCK KGAA.）和蛋白胨（日本制药株式会社）用匀浆机（上海标本模型厂，DS-1）打匀，得到混悬液。

将上述溶液和混悬液经过胶体磨研磨均匀后放至种子瓶中，然后用饮用水加至4000g配制成长型双歧杆菌的种子培养基，再加入少许稀氢氧化钠溶液调节培养基的pH。

表2

4000g的配制量

组分	处方1	处方2	处方3	处方4	处方5
						西红柿汁	18g	18g	500g	920g	920g
葡萄糖	6g	6g	60g	100g	100g
						酵母粉	2g	43g	43g	43g	80g
胰胨	40g	160g	160g	160g	200g
						蛋白胨	4g	60g	36g	4g	60g
乳糖	2g	20g	13g	2g	20g

实施例3.制备长双歧杆菌的发酵培养基

将下表所示除碳酸钙以外的组分倒入不锈钢桶中，再将30kg饮用水倒入不锈钢桶内，同时用不锈钢棒搅拌，得到培养基的混悬液，将所得混悬液倒入胶体磨中研磨均匀。将研磨均匀的混悬液倒入装有搅拌机的发酵罐中，用水补充至400kg。开启发酵罐搅拌机，同时调节培养基的pH值，再加入下表所示的碳酸钙，得到发酵培养基。将所述发酵培养基于121℃进行10-15分钟的消毒。

表3

400kg的配制量

实施例4.制备嗜酸乳杆菌及粪链球菌的发酵培养基

将下表所示的组分倒入不锈钢桶中，再将30kg饮用水倒入不锈钢桶内，同时用不锈钢棒搅拌，得到培养基的混悬液，将所得混悬液倒入胶体磨中研磨均匀。将研磨均匀的混悬液倒入装有搅拌机的发酵罐中，用水补充至400kg。开启发酵罐搅拌机，同时调节培养基的pH值，得到发酵培养基。将所述发酵培养基于121℃进行10-15分钟的消毒。

表4

400kg的配制量

实施例5.制备长型双歧杆菌菌泥

将长型双歧杆菌种子（购自中国生物制品检定所）40ml分别置于装有实施例1中所得种子培养基（处方1-5）的5000ml玻璃血清瓶中，于37.0±2.0℃接种，分别得到接种产物A1-A5。

将长双岐杆菌种液产物A1-A5接入实施例3所得400kg发酵液中，保持37℃恒温、通氮气保持厌氧条件。在培养时，通过补加碱液维持pH不变。培养10-20小时后发酵结束，得到发酵产物B1-B5。

将上述发酵产物B1-B5分别通入上海离心机械研究所生产的GQ142管式离心机的离心管进行常温离心。通入的发酵液体流量控制在4000~9000毫升/分钟，离心90-150分钟结束后取出离心管，从离心管中挖出菌泥C1-C5放入不锈钢桶。

实施例6：制备嗜酸乳杆菌菌泥

将嗜酸乳杆菌（购自中国生物制品检定所）40ml分别置于装有实施例2中所得种子培养基（处方1-5）的5000ml玻璃血清瓶中37.0±2.0℃接种，分别得到接种产物D1-D5。

将上述接种产物D 1-D5将嗜酸乳杆菌种液产物接入实施例4所得400kg发酵液中，保持37℃恒温、通入空气。在培养时，通过补加碱液维持pH不变。培养10-20小时后发酵结束，得到发酵产物E1-E5。

将上述发酵产物E1-E5分别通入上海离心机械研究所生产的GQ142管式离心机的离心管进行常温离心。通入的发酵液体流量控制在4000~9000m1/min，离心40-80分钟结束后取出离心管，从离心管中挖出菌泥F1-F5放入不锈钢桶。

实施例7：制备粪链球菌菌泥

将粪链球菌（购自中国生物制品检定所）40ml分别置于装有实施例2中所得种子培养基（处方1-5）的5000ml玻璃血清瓶中37.0±2.0℃接种，分别得到接种产物G1-G5。

将粪链球菌种液产物G1-G5接入实施例4所得400kg发酵液中，保持37℃恒温、通入空气。在培养时，通过补加碱液维持pH不变。培养10-20小时后发酵结束，得到发酵产物。

将上述发酵产物H1-H5分别通入上海离心机械研究所生产的GQ142管式离心机的离心管进行常温离心。通入的发酵液体流量控制在4000~9000m1/min，离心40~80分钟结束后取出离心管，从离心管中挖出菌泥I1-I5放入不锈钢桶。

实施例8：制备长型双歧杆菌菌粉

在实施例5所得菌泥C1-C5中加入分别下表所示组成的保护剂（其中菌泥C1-C5中分别加入处方1-处方5的保护剂），同时用胶体磨循环研磨均匀。将所得均匀混合物放入冷冻干燥机（北京天利科技，GLZ-6）中进行冻干。在冻干过程中，对板层进口温度进行降温预冻，使产品预冻到-40℃左右。预冻后，开冷凝使冷阱降至-40℃，然后开真空泵对箱体进行抽空。箱体真空达到真空设定值（15pa）后，开始对产品进行升温。当产品颜色一致时，冻干结束，即得菌粉J1-J5。

表5

组分	处方1	处方2	处方3	处方4	处方5
						奶粉	3kg	3.75kg	4.5kg	6kg	7.5kg
谷氨酸钠	750g	900g	1.05kg	1.2kg	1.35kg
						异乳糖	6kg	7.5kg	5.25kg	4.5kg	2.7kg
Vc-Na	750g	600g	450g	300g	150g

淀粉

4.5kg

2.25kg

3.75kg

3kg

3.3kg

实施例9：制备嗜酸乳杆菌菌粉

在实施例6所得菌泥F1-F5中加入分别下表所示组成的保护剂（其中菌泥F1-F5中分别加入处方1-处方5的保护剂），同时用胶体磨循环研磨均匀。将所得均匀混合物放入冷冻干燥机（北京天利科技，GLZ-6）中进行冻干。在冻干过程中，对板层进口温度进行降温预冻，使产品预冻到-40℃左右。预冻后，开冷凝使冷阱降至-40℃，然后开真空泵对箱体进行抽空。箱体真空达到真空设定值（15pa）后，开始对产品进行升温。当产品颜色一致时，冻干结束，即得菌粉K1-K5。

表6

组分	处方1	处方2	处方3	处方4	处方5
						奶粉	1.6kg	2kg	2.4kg	3.2kg	4kg
谷氨酸钠	400g	480g	560g	640g	720g
						异乳糖	3.2kg	4kg	2.8kg	2.4kg	1.44kg
Vc-Na	400g	320g	240g	160g	80g
						淀粉	2.4kg	1.2kg	2kg	1.6kg	1.76kg

实施例10：制备粪链球菌菌粉

在实施例7所得菌泥I1-I5中加入分别下表所示组成的保护剂（在菌泥I1-I5中分别加入处方1-处方5的保护剂），同时用胶体磨循环研磨均匀。将所得均匀混合物放入冷冻干燥机（北京天利科技，GLZ-6）中进行冻干。在冻干过程中，对板层进口温度进行降温预冻，使产品预冻到-40℃左右。预冻后，开冷凝使冷阱降至-40℃，然后开真空泵对箱体进行抽空。箱体真空达到真空设定值（15pa）后，开始对产品进行升温。当产品颜色一致时，冻干结束，即得菌粉L1-L5。

表7

对比例

重复CN101244090A的实施例1-10，得到如下对比数据：

表8

表9

表9

表10

	本发明的实施例8	CN101244090A的实施例8
				冻干粉中的活菌数	冻干粉中的活菌数
J1	100-900亿个/g	5-100亿个/g
			J2	100-900亿个/g	5-100亿个/g
J3	100-900亿个/g	5-100亿个/g
			J4	100-900亿个/g	5-100亿个/g
J5	100-900亿个/g	5-100亿个/g

表11

	本发明的实施例9	CN101244090A的实施例9
				冻干粉中的活菌数	冻干粉中的活菌数
K1	100-800亿个/g	5-100亿个/g
			K2	100-800亿个/g	5-100亿个/g
K3	100-800亿个/g	5-100亿个/g
			K4	100-800亿个/g	5-100亿个/g
K5	100-800亿个/g	5-100亿个/g

表12

	本发明的实施例10	CN101244090A的实施例10
				冻干粉中的活菌数	冻干粉中的活菌数
L1	100-700亿个/g	5-100亿个/g
			L2	100-700亿个/g	5-100亿个/g
L3	100-700亿个/g	5-100亿个/g
			L4	100-700亿个/g	5-100亿个/g
L5	100-700亿个/g	5-100亿个/g

Claims

1.一种制造活菌冻干粉的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)将菌种在种子培养基中接种，得到接种产物；

(b)将步骤(a)所得接种产物置于发酵培养基中发酵，发酵期间通过加入碱维持发酵液pH不变，得到发酵产物；

(c)混合发酵产物与保护剂冻干得到冻干菌粉；

所述菌种选自长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和/或粪链球菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水或其组合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱以碱的水溶液形式使用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵液的pH值维持在4.5-8.0的范围内。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵液的pH值维持在6.0-7.0范围内。

6.一种制造三联活菌制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)根据权利要求1所述的方法分别制备长型双歧杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉和粪链球菌菌粉；以及

(ii)混合上述长型双歧杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉和粪链球菌菌粉得到三联活菌制剂。

7.用权利要求1所述的方法制备的活菌冻干粉。

8.用权利要求6所述的方法制备的三联活菌制剂。