CN101230378A

CN101230378A - 生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法

Info

Publication number: CN101230378A
Application number: CNA2008100175335A
Authority: CN
Inventors: 张存莉; 杜婷; 孟贤静; 金玉鑫; 朱玮
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2008-07-30
Anticipated expiration: 2028-02-22
Also published as: CN101230378B

Abstract

本发明公开了一种生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法。该方法包括：将植物黑刺菝葜材料，干燥粉碎成粉末；将其和水置于生物反应器中，调节pH值和温度，分别加入纤维素酶、果胶酶或纤维素果胶复合酶，淀粉酶，糖化酶等其中一种酶或其中两种或三种酶组成的复合酶，或依次加入其中的两种或三种、四种酶进行酶生物催化反应；酶反应结束后，加入一定浓度的酸水溶液进行水解；然后过滤，滤渣用碱性水溶液洗剂至中性；采用弱极性或中等极性的有机溶剂浸取一定时间，最后蒸发浓缩，结晶得到产品。本发明的优点是皂苷元的提取率高，生产成本低，污染物少。

Description

生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法

技术领域

本发明涉及一种利用生物酶催化法提取拉肖皂苷元(laxogenin)的方法，属于天然产物领域。

背景技术

拉肖皂苷元[(25R)-3β-Hydroxy-5α-spirostan-6-one]，英文名为Laxogenin，是一种具有多种用途的甾体皂苷元。具有强烈的抑制磷酸二脂酶、血小板聚集、癌发促进剂的活性和促进植物生长和种子萌发的作用(Mimaki Y等，phytochemistry，1993，34：799；何祥久等，药学学报，2003，38(6)：433-437；松田匡由等，日木生药学会第41回年会讲演要旨集，2A-5，1994，日本扎幌；Martín A等.J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，2001，261-266；K.Wada等，Agric.Biol.Chem.1984，48，719.)；同时还是一种合成薤白皂苷1和合成油菜素甾醇类植物激素类似物的原料(Biao Yu等，J.Org.Chem.2002，67(25)，9099-9102；MartínA等.J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，2001，261-266)。

目前，报道了一种从黑刺菝葜植物中制备拉肖皂苷元的方法，其首先提取植物中的总皂苷，然后加入稀酸水解，再萃取纯化得到拉肖皂苷元(从黑刺菝葜植物中制备拉肖皂苷元的方法，申请号为200710199224.X)。这种方法提取皂苷元不彻底，损失较大，而且有一定环境污染。

中草药成分复杂，有活性成分，也有如蛋白质、果胶、淀粉、植物纤维等非活性成分，这些成分影响植物细胞中活性成分的浸出。选用恰当的酶，在常温、常压条件下就能起催化作用，可通过酶反应较温和地将植物组织中的淀粉、蛋白质、果胶等杂质分解去除，能有效的提高拉肖皂苷元的提取率，还可以保护皂苷元的结构不变，且减少了污染物的排放，实现了“绿色工业”。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用生物酶催化法提取黑刺菝葜植物中拉肖皂苷元的方法，以该法生产拉肖皂苷元成本低，能有效的提高提取率，并保护皂苷元的结构不变，且减少了污染物的排放。

为了实现上述目的，本发明的技术解决方案是首先将中药黑刺菝葜根茎、块根、须根、茎、叶、卷须等部位材料，干燥，粉碎成20～120目的粉末；按照一定的固液比，将粉末和水置于生物反应器中，搅拌成匀浆，调节pH值和温度，分别加入纤维素酶、果胶酶或纤维素果胶复合酶，淀粉酶，糖化酶等其中一种酶或其中两种或三种酶组成的复合酶，或依次加入其中的两种或三种、四种酶，进行酶生物催化反应；酶催化反应结束后，加入一定量的硫酸、盐酸、磷酸、甲酸或醋酸等有机酸配成浓度在0.5～8mol/L酸水解液，20～100℃水浴水解0.5～6h；过滤，滤渣用1～10％的碱性水溶液洗剂至中性；采用弱极性或中等极性的有机溶剂并按水解产物质量与溶剂体积的比值为1∶15～60的溶剂量提取2～10h，最后蒸发浓缩，结晶得到产品。

在使用这些方法进行制备时，一般包括以下几个步骤：

(1)原料处理

随着材料粉末粒径的减少，皂苷元的提取率会相应的有所提高。这是因为皂苷和淀粉颗粒大量存在于薄层细胞中，外部被很薄的细胞壁皮层组织包裹。减少粒径可以使皂苷裸露出来，和催化剂充分接触，因此原料粒径的减少，在一定程度上可以提高收率。但是粒径过小的颗粒，会大量吸收水分而形成糊剂，这使得处理悬浮液十分困难。同时，粉碎粒度过小，细胞中的天然色素等杂质会大量进入溶液中，这会导致提取的皂苷元纯度下降。

综合产品的收率和纯度两个因素，黑刺菝葜原材料的粉碎粒度以20～120目的粉碎粒径提取效果最佳。

(2)酶生物催化反应

纤维素酶和果胶酶可以促进β-D-葡萄糖苷键的水解而破坏植物的细胞壁，可以使果胶质等连接细胞的中层等充分分解掉，有利于有效成分的析出；淀粉酶可部分分解淀粉使粘稠的原料液粘度降低，进一步使皂苷裸露出来；糖化酶可使皂苷元连接的糖链部分断裂，减少催化剂进攻皂苷时的位阻，使反应皂苷的水解条件更易进行。

按照固液比1∶1～1∶20(原料的质量克数和水的体积毫升比)将原料粉末和水置于生物反应器中，调节pH值，按照原料的质量克数与酶液的毫升体积比10000∶1～1000∶5，分别加入纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶等其中一种酶或其中两种或三种酶组成的复合酶，或依次加入其中的两种或三种、四种酶，按照下表所示控制最适酶解温度和pH值，酶解1～5h。

酶催化反应的pH值和温度

酶种类	酶活力(U/g)	最适pH值	最适酶解温度(℃)
酶种类	酶活力(U/g)	最适pH值	最适酶解温度(℃)	纤维素酶	≥2000	4.5～6.5	30～55
果胶酶	≥1000	4.0～10	25～60	纤维素酶	≥2000	4.5～6.5	30～55
果胶酶	≥1000	4.0～10	25～60	淀粉酶法	≥1500	4.0～7.5	50～80
复合酶	≥1500	4.0～6.5	40～65	淀粉酶法	≥1500	4.0～7.5	50～80
复合酶	≥1500	4.0～6.5	40～65	糖化酶	≥50000	4.5～6.5	60～70

(3)酸水解反应

生物酶法催化降解皂苷侧链的作用只能将皂苷降解为次级苷，而不能完全的脱去糖链成为皂苷元，所以生物催化反应必须和水解法协同作用，才能提高提取收率。

酶催化反应结束后，加入一定量的硫酸、盐酸、磷酸、甲酸或醋酸等有机酸配成浓度在0.5～8mol/L酸水解液，20～100℃水浴水解0.5～6h。

(4)中和反应

过滤，滤渣用1～10％的碱性水溶液洗剂至中性，干燥，研磨得粉状提取物。

碱性水溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸氢钾等的水溶液。

(5)皂苷元的提取

采用弱极性或中等极性的有机溶剂并按水解产物质量与溶剂体积的比值为1∶15～60的溶剂量回流浸取2～10h，最后蒸发浓缩，结晶干燥得到拉肖皂苷元产品。

用弱极性或中等极性的有机溶剂如汽油、环己烷、正己烷、氯仿或乙酸乙酯等作为萃取剂萃取

本发明提供的方法环境污染小，提取率高，生产成本低。生产的拉肖皂苷元可用于开发治疗心血管和抗肿瘤等药物及植物激素产品，也可作为化学合成的原料。

可通过物理化学性质及质谱或波谱数据鉴定拉肖皂苷元。

性状：白色晶体(CHCl₃-MeOH)，可溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。紫外灯下显淡兰色荧光。

质谱：EI-MS m/z(rel.int.)：430[M]⁺(8)，358(23)，316(45)，301(25)，287(55)，139(100)，122(8)，115(41)。

氢波谱数据：0.77(3H，s，H-18)，0.77(3H，s，H-19)，0.79(3H，d，J 6.3，H-27)，0.97(3H，d，J 6.7，H-21)，2.20(1H，dd，J 3.0，J 12.8，5-H)，3.35(1H，t，J10.4，26-Hax)，3.48(1H，m，26-Heq)，3.56(1H，m，3-H)，4.41(1H，m，16-H)。

碳波谱数据：36.6(C-1)，30.6(C-2)，70.5(C-3)，30.0(C-4)，56.8(C-5)，210.6(C-6)，46.7(C-7)，37.3(C-8)，53.9(C-9)，40.9(C-10)，21.3(C-11)，39.5(C-12)，40.9(C-13)，56.5(C-14)，31.5(C-15)，80.4(C-16)，62.0(C-17)，16.4(C-18)，13.2(C-19)，41.6(C-20)，14.4(C-21)，109.3(C-22)，31.3(C-23)，28.7(C-24)，30.2(C-25)，66.8(C-26)，17.1(C-27)。

具体实施方式

实施例1黑刺菝葜干燥根茎25g，粉碎成100目，加入蒸馏水120mL，调节pH值为6.0，加入活力为15000U/g的纤维素酶0.04mL、活力为1000U/g的果胶酶0.05mL，升温至50℃，酶解130min；调节温度75℃，反应液pH值为5.5，加入活力为2000U/g的淀粉酶0.05mL，进行淀粉酶催化反应，其催化反应终点根据碘试剂的显色反应来确定，当碘试剂遇反应液不再显蓝色时视为催化终点；然后降温至60℃，调节反应液pH值为5.5，加入活力为100000U/g的糖化酶0.02mL，酶解120min；过滤后加入一定量的浓H₂SO₄配成硫酸浓度2mol/L的水解液，于100℃酸水解4h。过滤，滤渣用10％的NaOH溶液洗涤至中性，干燥，研磨得到粉状提取物。提取物置于索式提取器中，200mL氯仿回流提取6h后，用旋转蒸发器浓缩提取液并将产物结晶，抽滤，最后在真空干燥箱80℃～100℃中干燥后得拉肖皂苷元0.53g，提取率95％。

实施例2将25g黑刺菝葜干燥根茎，粉碎成50目，加入蒸馏水100mL，调节反应液pH值为5.5，在温度70℃下加入活力为2000U/g的淀粉酶0.03mL处理1h；调节料液温度55℃，加入活力为15000U/g的果胶酶0.05mL处理2h；调节料液温度65℃，加入活力为100000U/g的糖化酶0.02mL，酶解2h；过滤后加入一定量的浓HCI配成盐酸浓度3mol/L的水解液，于50℃进行酸水解4h。过滤，滤渣用3％的碳酸钠水溶液洗涤至中性，干燥，研磨得到粉状提取物。将干燥的粉状水解物置于提取罐中，用200mL汽油回流提取6h后，减压回收溶剂并将产物结晶，抽滤，最后在真空干燥箱80℃中干燥后得拉肖皂苷元0.55g，提取率96％。

实施例3

将25g黑刺菝葜干燥块根，粉碎成90目，加入蒸馏水100mL，调节反应液pH值为6.0，反应温度50℃，加入活力为20000U/g的纤维素酶果胶酶复合酶制剂0.05mL酶解2h；加入活力为2000U/g的淀粉酶0.04mL处理1h；调节料液温度65℃，加入活力为100000U/g的糖化酶0.02mL，酶解2h；过滤后加入一定量的浓HCI配成盐酸浓度3mol/L的水解液，于50℃进行酸水解4h。过滤，滤渣用3％的碳酸钠水溶液洗涤至中性，干燥，研磨得到粉状提取物。将干燥的粉状水解物置于提取罐中，用150mL乙酸乙酯回流提取5h后，减压回收溶剂并将产物结晶，抽滤，最后在真空干燥箱90℃中干燥后得拉肖皂苷元0.65g，提取率95％。

Claims

1.生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法，其特征在于首先将中药黑刺菝葜根茎、块根、须根、茎、叶、卷须等材料，干燥，粉碎成20～120目的粉末；按照一定的固液比，将粉末和水置于生物反应器中，搅拌成匀浆，调节pH值和温度，分别加入纤维素酶、果胶酶或纤维素果胶复合酶，淀粉酶，糖化酶等其中一种酶或其中两种或三种酶组成的复合酶，或依次加入其中的两种或三种、四种酶，进行酶生物催化反应；酶催化反应结束后，加入一定量的硫酸、盐酸、磷酸、甲酸或醋酸等有机酸配成浓度在0.5～8mol/L酸水解液，20～100℃水浴水解0.5～6h；过滤，滤渣用1～10％的碱性水溶液洗剂至中性；采用弱极性或中等极性的有机溶剂并按水解产物质量与溶剂体积的比值为1∶15～60的溶剂量提取2～10h，最后蒸发浓缩，结晶得到产品。

2.如权利要求1所述的生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法，其特征在于在使用这些方法进行制备时，一般包括以下几个步骤：

原料处理：黑刺菝葜材料干燥、粉碎成20～120目粉末。

酶生物催化反应：按照固液比1∶1～1∶20(原料的质量克数和水的体积毫升比)将原料粉末和水置于生物反应器中，调节pH值和温度，按照原料的质量克数与酶液的毫升体积比10000∶1～1000∶5，分别加入纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶等其中一种酶或其中两种或三种酶组成的复合酶，或阶梯法加入各种酶，即依次加入其中的两种或三种、四种酶，酶解1～5h。

酸水解反应：酶催化反应结束后，加入一定量的硫酸、盐酸、磷酸、甲酸或醋酸等有机酸配成浓度在0.5～8mol/L酸水解液，20～100℃水浴水解0.5～6h。

中和反应：过滤，滤渣用1～10％的碱性水溶液洗剂至中性，干燥，研磨得粉状提取物。

皂苷元的提取：采用弱极性或中等极性的有机溶剂并按水解产物质量与溶剂体积的比值为1∶15～60的溶剂量回流浸取2～10h，最后蒸发浓缩，结晶干燥得到拉肖皂苷元产品。

3.如权利要求2所述的生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法，其特征在于加入的各种生物酶最适酶解温度和pH值如下表所示：

酶催化反应的最适pH值和温度

酶种类酶活力(U/g) 最适pH值最适酶解温度(℃) 纤维素酶 ≥2000 4.5～6.5 30～55 果胶酶 ≥1000 4.0～10 25～60 淀粉酶法 ≥1500 4.0～7.5 50～80 复合酶 ≥1500 4.0～6.5 40～65 糖化酶 ≥50000 4.5～6.5 60～70

4.如权利要求2所述的生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法，其特征在于中和反应所需的碱性水溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸氢钾等的水溶液。

5.如权利要求2所述的生物酶催化法提取拉肖皂苷元的方法，其特征在于拉肖皂苷元的提取采用弱极性或中等极性的有机溶剂如汽油、环己烷、正己烷、氯仿或乙酸乙酯等作为萃取剂。