CN101230037A - 一种抗癌药物化合物及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学药物技术领域，特别涉及一种抗癌药物化合物及其合成方法，本发明是将多种化学原料经四步合成而得的一种抗癌药物化合物，化学名称为N－[4－氯－3－(三氟甲基)苯基]－{[4－(N－甲基－甲氨酰)(4－吡啶硫基)苯基]氨基}－羧酰胺，见化学结构式：其能有效地抑制Raf和VEGFR蛋白激酶的活性，并且能广泛抑制多种类型的人肿瘤细胞系生长，并进一步诱导肿瘤细胞凋亡，在人肿瘤异种移植模型研究中，具有被开发成为新的抗肝癌药物的巨大潜能。

Description

一种抗癌药物化合物及其合成方法

技术领域：

本发明属于化学药物技术领域，特别涉及一种抗癌药物化合物及其合成方法。

背景技术：

原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤，高发于我国、东南亚、非洲东南部和地中海沿岸。我国肝癌发病率位居全球之首，在国内位居肿瘤的第2位，特别是东南沿海高发，江苏省更是高达第1位。肝癌发病凶险、进展快、死亡率高、治疗效果差。中国内地、东南亚及非洲是全球三个肝癌高发地区。世界卫生组织年度健康报告显示，肝癌发病率为23.7/10万。全球每年有62万人死于肝癌(中国占45％)。最新的资料表明，我国肝癌年死亡率占全部恶性肿瘤的18.8％，已由70年代的第三位上升到第二位，在城市肝癌年死亡率仅次于肺癌，在农村肝癌年死亡率仅次于胃癌，男性增加64.83％，女性增加54.41％，城市增加38.79％，农村增加71.96％。

由于起病隐袭，大多数患者在确诊时已达中晚期，往往失去了手术根治机会，初诊患者中仅10％～15％可以根治性切除，而术后5年复发率高达50％～80％。晚期患者治疗非常棘手，效果很差，生存时间短(诊断后平均生存时间仅3～4个月)，平均5年生存率仅5％。因此，肝癌的确存在早期诊断率低、手术切除率低、预后恶劣等特点，因此被称为“癌中之王”。有关肝癌的治疗手段，目前主要有手术(切除、肝移植)、肝动脉介入治疗(TAI和TACE)、经皮消融、系统化疗以及传统医药治疗等。国内外学者一直致力于肝癌治疗研究。我国的吴孟超、汤钊猷院士在70、80年代曾进行了许多有意义的探索，如改进手术方法，包括小肝癌的诊治、肝癌的不规则切除和二期切除等，贡献巨大。对于中晚期肝癌，肝动脉介入治疗是最重要的保守治疗手段，对部分患者具有明显的疗效。然而，介入治疗临床应用受到诸多限制，不少病例并不符合介入治疗的特征，比如，有严重的肝肾功能不全、重度腹水、骨髓造血功能抑制或凝血功能障碍，肿瘤太大(占肝脏体积的≥70％)、门静脉主干癌栓完全闭塞、重度门脉高压、合并活动性消化道溃疡和远处转移的患者就不能采取介入治疗。此时，虽然可以采取全身化疗方法来治疗，然而肝癌细胞对多种化疗药物抗拒，传统的化疗药物疗效很低；同时，患者通常存在病毒性肝炎、肝硬变等基础肝病，肝功能不良，对化疗的耐受性差，往往不能接受强烈化疗。近年来，临床上正在积极探索一些新的化疗药物如奥沙利铂、吉西他滨和卡培他滨等应用于肝癌治疗，已有苗头，但都仍然在研究之中，还未获得最终结果。因此可以说，这20多年来，对中晚期肝癌的治疗是原地踏步，没有取得实质性突破，正如漫漫长夜之中，渴望黎明的曙光。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种能有效地抑制Raf和VEGFR蛋白激酶的活性，并且能广泛抑制多种类型的人肿瘤细胞系生长，并进一步诱导肿瘤细胞凋亡的抗癌药物化合物及其合成方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗癌药物化合物，化合物N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺，其化学结构式为：

核磁共振氢谱(H NMR)分析结果(300MHz，DMSO-d₆)：δ2.77(d，J＝4.8，3H，-NHCH₃)；7.16(m，3H，芳香簇环)；7.37(d，J＝2.5Hz，1H，芳香簇环)；7.62(m，4H，芳香簇环)；8.11(d，J＝2.5Hz，1H，芳香簇环)；8.49(d，J＝5.5Hz，1H，芳香簇环)；8.77(br d，1H，-NHCH₃)；8.89(s，1H，-NHCO-)；9.12(s，1H，-NHCO-)；化学电离质谱和高分辨质谱确认(C₂₁H₁₆N₄ClF₃SO₂)的分子量是434.5。

一种抗癌药物化合物的合成方法，合成步骤如下：

第一步：4-氯吡啶-2-碳酰氯的制备

在温度为40～50℃和充有氩气的条件下，在180～200毫升二氯亚砜中缓慢加入6～8毫升N，N，-二甲基甲酰胺，搅拌10～20分钟，然后在30～40分钟表内缓慢加入460～480克2-吡啶羧酸，刚开始为绿色后来变橙色最后变为紫色，将反应溶液加热到72～85℃并产生大量二氧化硫，反应16～18小时后产生黄色固体物沉淀，混合物冰却到室温状态23～25℃，然后用500～600毫升的甲苯稀释并浓缩到200～250毫升，此过程重复2～3次，最后产物浓缩到90％～95％的干状态，此时混合物转移到过滤器中过滤，并以50～60毫升甲苯洗涤，最后抽真空4～5小时得92～100克的4-氯吡啶-2-碳酰氯为白底固体；

第二步：4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺合成

在0℃和氩气充盈的条件下进行，取7～10克盐酸化4-氯吡啶-2-碳酰氯加入到溶解在100～200毫升四氢呋喃和20～30毫升甲醇的2～3摩尔浓度甲胺反应，反应混合物在3～8℃条件下搅拌4～5小时，浓缩到90％～95％的干状态，然后溶解在100～150毫升醋酸醋酯有机相化合物，用100～150毫升饱和的食盐水洗涤2～3次，再用硫酸钠使其有机相化合物干燥，并浓缩得4.95～5.95克4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺，得率为88～90％，此化合物为黄色晶体固体状化合物，熔点为37～40℃。

第三步：4-[(4-氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺合成：

将9.6～15克1-硫基-4-氨基苯溶解在150～200毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入10.29～15克叔丁醇钾，，红褐色反应混合物在室温23～25℃搅拌2～3小时，然后将加入15～18克4-氯-(2-吡)-N-甲基羧酸胺和65～75克碳酸钾，然后在氩气中加热到80～100℃，反应6～8小时，反应混合物冷却到室温状态23～25℃，再倒入到500～600毫升醋酸醋酯和500～600毫升饱和的食盐水中抽提分层，水相化合物再用300～400毫升醋酸醋酯抽提一次，合并其有机相化合物，用1000～1500毫升饱和的食盐水洗涤3～5次，用硫酸钠来干燥其有机相化合物，并浓缩得18.62～23克4-[(4-氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺，得率为87～90％，浓缩条件为35～40℃条件下抽真空3～4小时。

第四步：N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺的合成：

在150～200毫升二氯甲烷中加入67～75克4-[(氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酰胺，然后在0℃和充盈氩气中，滴加溶解在150～200毫升二氯甲烷中的62.08～70克4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯，反应混合物在室温23～25℃下搅拌，15～20分钟后产生黄色沉淀固体物，混合物搅拌16～18小时后过滤，固体物用50～80毫升二氯甲烷洗涤2～3次，在35～40℃条件下抽真空干燥4～5小时，然后可得118.19～115克N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-({4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基}氨基)-羧酰胺，得率为92～95％，黄白色固体，熔点为210～220℃。

本发明有益效果为：本发明产出一种全新的化合物实体物质，即N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺，其能有效地抑制Raf和VEGFR蛋白激酶的活性，并且能广泛抑制多种类型的人肿瘤细胞系生长，并进一步诱导肿瘤细胞凋亡，在人肿瘤异种移植模型研究中，N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺被证明是一种有效的抗肿瘤剂，能强烈抑制人肝癌，肺癌和肾细胞癌细胞在体内生长，N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺有被开发成为新的抗肝癌药物的巨大潜能。

附图说明：

图1为本发明和对照组治疗皮下接种的人肝癌(HepG3B)肿瘤细胞的肿瘤体积与种植后天数曲线图

图2为本发明和对照组治疗皮下接种的人肺癌(NCI-H23)肿瘤细胞的肿瘤体积与种植后天数曲线图

图3为本发明和对照组治疗皮下接种的人结肠癌(HCT-116)肿瘤细胞的肿瘤体积与种植后天数曲线图

具体实施方式：

实施例1

一种抗癌药物化合物，化合物N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺，其化学结构式为：

核磁共振氢谱(H NMR)分析结果(300MHz，DMSO-d₆)：δ2.77(d，J＝4.8，3H，-NHCH₃)；7.16(m，3H，芳香簇环)；7.37(d，J＝2.5Hz，1H，芳香簇环)；7.62(m，4H，芳香簇环)；8.11(d，J＝2.5Hz，1H，芳香簇环)；8.49(d，J＝5.5Hz，1H，芳香簇环)；8.77(brd，1H，-NHCH₃)；8.89(s，1H，-NHCO-)；9.12(s，1H，-NHCO-)；化学电离质谱和高分辨质谱确认(C₂₁H₁₆N₄ClF₃SO₂)的分子量是434.5。

一种抗癌药物化合物的合成方法，合成步骤如下：

第一步：4-氯吡啶-2-碳酰氯的制备

在温度为50℃和充有氩气的条件下，在180毫升二氯亚砜中缓慢加入6毫升N，N，-二甲基甲酰胺，搅拌10分钟，然后在30分钟内缓慢加入460克2-吡啶羧酸(487.37毫摩尔)，刚开始为绿色后来变橙色最后变为紫色，将反应溶液加热到72℃并产生大量二氧化硫，反应16小时后产生黄色固体物沉淀，混合物冰却到室温状态23℃，然后用500毫升的甲苯稀释并浓缩到200毫升，此过程重复2次，最后产物浓缩到90％的干状态，此时混合物转移到过滤器中过滤，并以50毫升甲苯洗涤，最后抽真空4小时得92克(433.03毫摩尔)的4-氯吡啶-2-碳酰氯为白底固体；

第二步：4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺合成

在0℃和氩气充盈的条件下进行，取7克盐酸化4-氯吡啶-2-碳酰氯(32.95毫摩尔)加入到溶解在100毫升四氢呋喃和20毫升甲醇的2摩尔浓度甲胺反应，反应混合物在3℃条件下搅拌4小时，浓缩到95％的干状态，然后溶解在100毫升醋酸醋酯有机相化合物，用100毫升饱和的食盐水洗涤2次，再用硫酸钠使其有机相化合物干燥，并浓缩得4.95克4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺(29.02毫摩尔)，得率为88％，此化合物为黄色晶体固体状化合物，熔点为37℃。

第三步：4-[(4-氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺合成：

将9.6克1-硫基-4-氨基苯(87.98毫摩尔)溶解在150毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入10.29克叔丁醇钾，红褐色反应混合物在室温23℃搅拌2小时，然后将加入15克4-氯-(2-吡)-N-甲基羧酸胺(87.92毫摩尔)和65克碳酸钾(47.03毫摩尔)，然后在氩气中加热到80℃，反应6小时，反应混合物冷却到室温状态23℃，再倒入到500毫升醋酸醋酯和500毫升饱和的食盐水中抽提分层，水相化合物再用300毫升醋酸醋酯抽提一次，合并其有机相化合物，用1000毫升饱和的食盐水洗涤3次，用硫酸钠来干燥其有机相化合物，并浓缩得18.62克4-[(4-氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺，得率为90％，浓缩条件为35℃条件下抽真空3小时。

第四步：N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺的合成：

在150毫升二氯甲烷中加入67克4-[(氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酰胺(275.43毫摩尔)，然后在0℃和充盈氩气中，滴加溶解在150毫升二氯甲烷中的62.08克4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯(280.19毫摩尔)，反应混合物在室温23℃下搅拌，15分钟后产生黄色沉淀固体物，混合物搅拌16小时后过滤，固体物用50毫升二氯甲烷洗涤2次，在35℃条件下抽真空干燥4小时，然后可得118.19克N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-({4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基}氨基)-羧酰胺(254.27毫摩尔)，得率为92％，黄白色固体，熔点为210℃。

实施例2

一种抗癌药物化合物的合成方法，合成步骤如下：

第一步：4-氯吡啶-2-碳酰氯的制备

在温度为50℃和充有氩气的条件下，在200毫升二氯亚砜中缓慢加入8毫升N，N，-二甲基甲酰胺，搅拌20分钟，然后在40分钟内缓慢加入480克2-吡啶羧酸，刚开始为绿色后来变橙色最后变为紫色，将反应溶液加热到85℃并产生大量二氧化硫，反应18小时后产生黄色固体物沉淀，混合物冰却到室温状态25℃，然后用600毫升的甲苯稀释并浓缩到250毫升，此过程重复3次，最后产物浓缩到95％的干状态，此时混合物转移到过滤器中过滤，并以60毫升甲苯洗涤，最后抽真空5小时得100克的4-氯吡啶-2-碳酰氯为白底固体；

第二步：4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺合成

在0℃和氩气充盈的条件下进行，取10克盐酸化4-氯吡啶-2-碳酰氯加入到溶解在200毫升四氢呋喃和30毫升甲醇的3摩尔浓度甲胺反应，反应混合物在8℃条件下搅拌5小时，浓缩到95％的干状态，然后溶解在150毫升醋酸醋酯有机相化合物，用150毫升饱和的食盐水洗涤3次，再用硫酸钠使其有机相化合物干燥，并浓缩得5.95克4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺，得率为90％，此化合物为黄色晶体固体状化合物，熔点为40℃。

第三步：4-[(4-氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺合成：

将9.6克1-硫基-4-氨基苯(87.98毫摩尔)溶解在150毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入10.29克叔丁醇钾，红褐色反应混合物在室温25℃搅拌2～3小时，然后将加入18克4-氯-(2-吡)-N-甲基羧酸胺和75克碳酸钾，然后在氩气中加热到100℃，反应8小时，反应混合物冷却到室温状态25℃，再倒入到600毫升醋酸醋酯和600毫升饱和的食盐水中抽提分层，水相化合物再用400毫升醋酸醋酯抽提一次，合并其有机相化合物，用1500毫升饱和的食盐水洗涤5次，用硫酸钠来干燥其有机相化合物，并浓缩得23克4-[(4-氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺，得率为90％，浓缩条件为35℃条件下抽真空4小时。

第四步：N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺的合成：

在200毫升二氯甲烷中加入75克4-[(氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酰胺(275.43毫摩尔)，然后在0℃和充盈氩气中，滴加溶解在200毫升二氯甲烷中的70克4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯，反应混合物在室温25℃下搅拌，20分钟后产生黄色沉淀固体物，混合物搅拌18小时后过滤，固体物用80毫升二氯甲烷洗涤3次，在40℃条件下抽真空干燥5小时，然后可得115克N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-({4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基}氨基)-羧酰胺，得率为95％，黄白色固体，熔点为220℃。

为证明本发明抗癌药物化合物的药用效果，可以用以下方法来验证：

实验方法

Raf和VEGFR蛋白激酶活性测定：

Raf是一种原癌基因产物，它的活化受细胞外生长因子刺激所调节的，一旦RAF被活化则能磷酸化MEK使其活化，并进一步将活化信号传递给ERK，从而促进肿瘤细胞生长。本试验利用检测细胞内被磷酸化的MEK多少来衡量细胞内Raf蛋白激酶活性的高低。MDA-MB-321是一种人性乳腺癌细胞系并富含大量的Raf蛋白。我们用MDA-MB-321细胞来检测N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺是否能抑制Raf蛋白激酶活性。MDA-MB-321细胞在37℃、5％CO₂的条件下，在含10％小牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL)中贴壁生长。以不同浓度N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺(0、10、100、500ng/ml，1、10μg/ml)处理细胞，于处理后1小时收集细胞蛋白，Bradford′s法测定蛋白浓度后以western blot测定被磷酸化的MEK水平。

免疫印迹实验

用聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白(上样量为60μg总蛋白)，将蛋白电转到PVDF上，封闭后加鼠抗人抗磷酸化MEK抗体(1∶1000稀释)(购买于美国波士顿信号传递公司)、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IG抗体(1∶5000稀释)(购买于美国波士顿信号传递公司)，用化学发光试剂增强反应，X光片压片曝光，凝胶成像系统分析结果。洗膜后以未磷酸化MEK抗体检测以校正结果。VEGFR是血管内皮细胞生长因子受体，调节血管内皮细胞生长，迁移和分化。它决定肿瘤血管新生重要开关。当血管内皮细胞生长因子刺激VEGFR后，VEGFR形成二具体并活化其激酶并使其自身磷酸化。根据VEGFR自身磷酸化的强弱来检测VEGFR蛋白激酶活性的高低。本试验我们用人微血管内皮细胞(HUMEC)来检测N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺是否能抑制VEGFR蛋白激酶活性。HUMEC细胞在37℃、5％CO₂的条件下，在含10％小牛血清的DMEM培养基(GIBCO-BRL)中贴壁生长。以不同浓度N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺(0、10、100、500ng/ml，1、10μg/ml)处理细胞，于处理后1小时收集细胞蛋白，Bradford′s法测定蛋白浓度后以western blot测定被磷酸化的VEGFR水平。

实验结果：

本发明抗癌药物化合物抑制Raf和VEGFR蛋白激酶活性：

为了研究本发明抗癌药物化合物抑制Raf和VEGFR蛋白激酶活性，用不同浓度的本发明抗癌药物化合物分别处理MDA-MB-321细胞和HUMEC细胞1小时，采用western blot测定被磷酸化的MEK和VEGFR水平改变。结果本发明抗癌药物化合物抑制Raf和VEGFR蛋白激酶活性的半数抑制浓度(IC50)分别50nM和20nM浓度。

细胞毒性分析：

应用人肿瘤细胞株分析N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺(溶解于DMSO)的细胞毒性。人肿瘤细胞株购自ATCC和NCI，在10％FBS的DMEM培养液中，置于5％CO₂的37℃孵箱中培养。细胞生长汇合后作毒性分析，胰蛋白酶消化细胞后用培养液洗涤，然后计数。96孔板每孔传3000～6000个细胞孵育16～24小时，再加入不同浓度的N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺。培养72小时后，应用MTT分析药物处理后的细胞和对照细胞。

实验结果：

在含有不同本发明抗癌药物化合物的正常培养基中培养31种肿瘤细胞株，3天后应用MTT法测定细胞存活情况。结果见表1，显示大多数人体肿瘤细胞对本发明抗癌药物化合物比较敏感。有些肿瘤细胞对本发明抗癌药物化合物的EC50低于1μm。然而对人微血管内皮细胞最敏感的细胞则是但是人微血管内皮细胞，说明本发明抗癌药物化合物是一种极强的肿瘤血管抑制剂。另外正常人乳腺上皮细胞(MCF10A)和正常小鼠成纤维细(MEF)对本发明抗癌药物化合物不敏感，即便这两种化合物的浓度高达30μm，这些细胞仍然生长良好。

表1本发明抗癌药物化合物体外抑制人肿瘤细胞生长

人肿瘤细胞株	细胞类型		本发明抗癌药物化合物
				LnCAP	前列腺		0.91
D145	前列腺		1.5
				PC3	前列腺		1.2
HCT-116	结肠		0.89
				Widr	结肠		0.93
HT29	结肠		1.1
				LoVo	结肠		1.3
CCL-225	结肠		1.9
				CCL-247	结肠		2.4
NCI-H23	肺		0.85
				A549	肺		1.2
MDA-MB-231	乳腺		1.15
				MDA-MB-435	乳腺		1.36
AU-565	乳腺		1.86
				BT-549	乳腺		1.1
MCF-7	乳腺		2.15
				Caki-1	肾		1.1
ACHN	肾		1.5
				786-0	肾		1.7
SN12C	肾		3.1
				SKOV3	卵巢		1.16
IGROV1	卵巢		0.91
				Mid PaCa-2	胰腺		1.2
U-251	恶性胶质瘤		3.58
				SK-MEL-5	皮肤(黑色素瘤)		1.92
G-361	皮肤(黑色素瘤)		1.8
				MCF-10a	正常乳腺上皮细胞		＞30
SGC-7901	胃		1.2

EC109	食管		1.5
				CNE-2Z	鼻咽		1.98
HepG3B	肝		1.67
				HUMEC	人微血管内皮细胞		0.03
MEF	正常小鼠成纤维		＞30

本发明抗癌药物化合物在小鼠体内的药代动力学实验：

取4只8周龄BlebC小鼠(2只雄性和2只雌性)，单次剂量100mg/kg给予本发明抗癌药物化合物(用15％Captsol或载体配制)。分别于给药后0.5、1、3、6、12、24、48、72小时，经眼静脉取血并制得血浆，以测定给予本发明抗癌药物化合物的血浆浓度。

实验结果：

口饲给药的本发明抗癌药物化合物在4个小鼠体内的药代动力学参数总结如下(表2)：

表2.本发明抗癌药物化合物在小鼠体内的药代动力学参数

药代动力学参数	均数+/-标准差
		T1/2(hour)	4+/-0.25
Tmax(min)	60+/-8
		Cmax(uM)	50+/-6

给药后本发明抗癌药物化合物对小鼠的急性毒性研究：

取两组8周龄的BlabC小鼠，每组10只(5只雄性和5只雌性)，分别以单次剂量500mg/kg和多次剂量100mg/kg(QDX15)给予本发明抗癌药物化合物(5％Captsol或载体配制))，然后分别观察1周和4周，每两天称体重。试验结束后，将受试小鼠处死，进行病理分析。

实验结果

结果显示，以单次剂量500mg/Kg和多次剂量100mg/kg(QDX15)给予本发明抗癌药物化合物，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。因此给予本发明化合物是具有很大开发前景的广普抗肿瘤新药，本本发明抗癌药物化合物可作为抗肿瘤药物的原料药，优先作为抗恶性实体瘤药物的原料药，本发明抗癌药物化合物也可与可药用载体或赋形剂制成不同剂型的抗肿瘤药物，包括片剂，冲剂，胶囊，滴丸，口服液以及注射液。所述可药用载体或赋形剂例如谷物油，羧甲基纤维素钠等。

本发明抗癌药物化合物一般口服推荐剂量为每平方米体表面积1000mg/天，连续三周，休息一周为一疗程。本发明抗癌药物化合物每天总剂量一次于早餐后半小时口服，具体病例可由医师根据病情调整。

人肿瘤转移模型：

T细胞缺陷裸小鼠(nu/nu)，6周龄，购自Charles River实验室，按照大学动物饲养和使用委员会条例，在无菌环境中饲养、处理。48只鼠肋腹部分别皮下接种5×106个悬浮于0.2ml HBSS/基质胶(50∶50，V/V)中的人肝癌细胞HepG3B、人肺癌细胞NCI-H23和人结肠癌细胞HCT-116。当肿瘤平均直径长至7～8mm，肿瘤体积约在100～200mm³大小时，24只鼠被分成治疗组(16只/2组)，按30mg/kg和60mg/kg本发明抗癌药物化合物(溶解在15％Captisol)给药，对照组(8只)只接受赋形剂(15％Captisol)。

为保证试验本发明抗癌药物化合物治疗组和对照组在处理开始时肿瘤大小的分布基本相同，小鼠被分成三类：小体积肿瘤(肿瘤平均直径＜4mm)、中等体积肿瘤(肿瘤平均直径4～8mm)和大体积肿瘤(肿瘤平均直径＞8mm)。将每一类中相同数目的小鼠分别分在对照组和本发明抗癌药物化合物治疗组中。

肿瘤移植裸鼠的本发明抗癌药物化合物给药方案：口服给药，本发明抗癌药物化合物溶解在15％Captisol。每日在两组实验组中分别给予200μl含0.75mg和1.5mg本发明抗癌药物化合物(15％Captisol)的药液，每周5天，连续3周，在对照组中每日给予200μl安慰剂(15％captisol)，每周5天，连续3周。两组动物分开饲养，自由进食。

抗肿瘤效果的评价：每3或4天测量肿瘤大小，采用下面的公式计算肿瘤体积：

V＝(a×b)/2

其中a代表宽(较小的直径)，b代表长(较长的直径)。每个瘤体的相对肿瘤体积(RTV)指给定时间的体积与治疗开始时的体积的比率。每个治疗组计算平均RTV和SE。应用下面的公式计算肿瘤生长抑制值确定抗肿瘤活性：

TGI(％)＝T/C×100

其中T代表实验结束点(4周)处理组肿瘤的平均RTV，C代表对照组的平均RTV。采用国立癌症研究所制定的抗肿瘤活性最低水平(T/C 42％)标准。实验结束后切除瘤体，用甲醇固定。

实验结果：

在试验中本发明抗癌药物化合物有效抑制多种肿瘤细胞和人微血管内皮细胞体外增殖的基础上，应用人肿瘤移植裸鼠(皮下接种)评价本发明抗癌药物化合物的抗肿瘤作用，受试的肿瘤细胞包括人肝癌细胞HepG3B、人肺癌细胞NCI-H23和人结肠癌细胞HCT-116。结果见附图1-3，显示本发明抗癌药物化合物强烈抑制这三种肿瘤生长，60mg/kg本发明抗癌药物化合物给药其TGI值分别为0.5％，10％，15％。30mg/kg本发明抗癌药物化合物给药其TGI值分别为10.5％，26％，30％。同时未发现化本发明抗癌药物化合物具有明显的副作用，包括体重的变化。这些数据显示，本发明抗癌药物化合物是开发新的抗肿瘤药物的一个很好的候选化合物。

Claims (2)

1.一种抗癌药物化合物，其特征在于：化合物N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺，其化学结构式为：

其中，核磁共振氢谱(H MR)分析结果(300MHz，DMSO-d₆)：δ2.77(d，J＝4.8，3H，-NHCH₃)；7.16(m，3H，芳香簇环)；7.37(d，J＝2.5Hz，1H，芳香簇环)；7.62(m，4H，芳香簇环)；8.11(d，J＝2.5Hz，1H，芳香簇环)；8.49(d，J＝5.5Hz，1H，芳香簇环)；8.77(brd，1H，-NHCH₃)；8.89(s，1H，-NHCO-)；9.12(s，1H，-NHCO-)；化学电离质谱和高分辨质谱确认(C₂₁H₁₆N₄ClF₃SO₂)的分子量是434.5。

2.一种抗癌药物化合物的合成方法，其特征在于：合成步骤如下：

第一步：4-氯吡啶-2-碳酰氯的制备

在温度为40～50℃和充有氩气的条件下，在180～200毫升二氯亚砜中缓慢加入6～8毫升N，N，-二甲基甲酰胺，搅拌10～20分钟，然后在30～40分钟内缓慢加入460～480克2-吡啶羧酸，刚开始为绿色后来变橙色最后变为紫色，将反应溶液加热到72～85℃并产生大量二氧化硫，反应16～18小时后产生黄色固体物沉淀，混合物冰却到室温状态23～25℃，然后用500～600毫升的甲苯稀释并浓缩到200～250毫升，此过程重复2～3次，最后产物浓缩到90％～95％干状态，此时混合物转移到过滤器中过滤，并以50～60毫升甲苯洗涤，最后抽真空4～5小时得92～100克的4-氯吡啶-2-碳酰氯为白底固体；

第二步：4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺合成

在0℃和氩气充盈的条件下进行，取7～10克盐酸化4-氯吡啶-2-碳酰氯加入到溶解在100～200毫升四氢呋喃和20～30毫升甲醇的2～3摩尔浓度甲胺反应，反应混合物在3～8℃条件下搅拌4～5小时，浓缩到90％～95％干状态，然后溶解在100～150毫升醋酸醋酯有机相化合物，用100～150毫升饱和的食盐水洗涤2～3次，再用硫酸钠使其有机相化合物干燥，并浓缩得4.95～5.95克4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺，得率为88～90％，此化合物为黄色晶体固体状化合物，熔点为37～40℃；

第三步：4-[(4-氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺合成：

将9.6～15克1-硫基-4-氨基苯溶解在150～200毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入10.29～15克叔丁醇钾，红褐色反应混合物在室温23～25℃搅拌2～3小时，然后将加入15～18克4-氯-(2-吡)-N-甲基羧酸胺和65～75克碳酸钾，然后在氩气中加热到80～100℃，反应6～8小时，反应混合物冷却到室温状态23～25℃，再倒入到500～600毫升醋酸醋酯和500～600毫升饱和的食盐水中抽提分层，水相化合物再用300～400毫升醋酸醋酯抽提一次，合并其有机相化合物，用1000～1500毫升饱和的食盐水洗涤3～5次，用硫酸钠来干燥其有机相化合物，并浓缩得18.62～23克4-[(4-氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺，得率为87～90％，浓缩条件为35～40℃条件下抽真空3～4小时；

第四步：N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-{[4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基]氨基}-羧酰胺的合成：

在150～200毫升二氯甲烷中加入67～75克4-[(氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酰胺，然后在0℃和充盈氩气中，滴加溶解在150～200毫升二氯甲烷中的62.08～70克4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯，反应混合物在室温23～25℃下搅拌，15～20分钟后产生黄色沉淀固体物，混合物搅拌16～18小时后过滤，固体物用50～80毫升二氯甲烷洗涤2～3次，在35～40℃条件下抽真空干燥4～5小时，然后可得118.19～115克N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-({4-(N-甲基-甲氨酰)(4-吡啶硫基)苯基}氨基)-羧酰胺，得率为92～95％，黄白色固体，熔点为210～220℃。

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