CN101229340A - 保妇康栓在制备治疗宫颈癌的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种保妇康栓在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。表明保妇康栓可以杀伤细胞，细胞生长稀疏，崩解破碎，证实药物对两种细胞系增殖有抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及中药保妇康栓的新医药用途，具体来说是在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。
背景技术
宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，世界上每年确诊宫颈癌新发病例470000例，其中80％以上发生在发展中国家，这些国家每年死于宫颈癌的妇女接近200000人，使这些妇女面临着因宫颈癌造成的很高的疾病负担。
目前已经明确高危型人乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌和癌前病变的主要危险因素。目前已经确定的HPV亚型大约有100多种，其中约有35种亚型可感染生殖道，约30种型别在子宫颈癌中被发现。根据HPV亚型与宫颈癌的相关性可将HPV分为高危型和低危型。根据不同HPV亚型与宫颈癌发生的危险程度，已认定其中16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68等亚型主要与宫颈癌和宫颈上皮内瘤变(CIN)有关，为高危型。临床和流行病学的资料明确表明HPV16亚型比其它型别更容易引起宫颈上皮内瘤变，此外，与HPV相关的宫颈癌以外的其它恶性肿瘤中HPV16阳性的比例高于子宫颈癌，HPV16、18亚型阳性的CIN患者较其它亚型易在更短时间内进展。与宫颈癌有关的高危HPV亚型的治疗目前尚无特效药物，HPV疫苗接种的真正预防效果将为大幅降低HPV感染率和宫颈癌的发病风险提供绝好的机会，但是在未来几十年里我们仍然要进行规范的筛查和防治。
目前治疗HPV感染的药物无确切疗效，疫苗大规模投入临床使用尚需时日，研制开发抗HPV药物对于宫颈癌的防治具有重大意义。
保妇康栓由莪术油和冰片两味中药组成，具有行气破瘀、生肌止痛的功效。目前用于湿热瘀滞所致的带下病，症见带下量多、色黄、时有阴部瘙痒；霉菌性阴道炎、老年性阴道炎、宫颈糜烂见上述证侯者。临床研究表明，采用保妇康栓阴道上药联合物理方法治疗宫颈糜烂效果显著，另外，保妇康栓还具有体外抗病原微生物的活性。
发明内容
本发明提供保妇康栓在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。
本发明提供保妇康栓在制备治疗HPV引起的宫颈癌的药物中的应用。
本发明提供保妇康栓在制备治疗HPV16亚型引起的宫颈癌的药物中的应用。
保妇康栓及其主要成分莪术油可抑制宫颈癌细胞系SiHa、CaSki以及宫颈永生化细胞系H8增殖。
附图说明
图1.保妇康栓作用下CaSki细胞生长曲线。
图2.保妇康栓作用下H8细胞生长曲线。
图3.冰片加莪术油对CaSki细胞的生长抑制作用。
具体实施方式
下面结合附图和具体实验对本发明作进一步说明。
材料与方法
一、材料来源
1细胞系：
CaSki细胞系，HPV16阳性的人宫颈癌细胞株，由中国医学科学院基础医学研究所生物物理室提供；
H8细胞系，人宫颈鳞状上皮永生化细胞系，HPV16阳性细胞株，由中国医学科学院基础医学研究所生物物理室提供；
SiHa细胞系，HPV16阳性的人宫颈癌细胞株，由日本旭川医科大学山下刚博士惠赠。
2.主要试剂：
保妇康栓，海南碧凯药业有限公司生产，每粒重1.74g，其中含莪术油88mg，冰片75mg，其余成分为基质；
莪术油、冰片及保妇康栓基质均由海南碧凯药业有限公司提供；
工具酶：Taq DNA聚合酶(Promega)；
逆转录酶(M-MLV Reverse Transcriptase)(Promega)；
分子标志物：pBR322 DNA/Hae III Markers(600，500，400，300，200，100bp)(华美生物工程公司)；
培养基和血清：Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基(GIBCO BRL)；胎牛血清(天津市川页生化制品有限公司)；
3.引物：
由上海生工生物工程技术服务有限公司，应用美国PE公司391型DNA自动合成仪合成，纯化方式：PAGE。
二、实验方法
1.细胞培养：CaSki、SiHa细胞在含5％胎牛血清的DMEM培养基中，H8细胞在含2％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，在5％CO2恒温箱内培养。CaSki、SiHa、H8细胞接种密度均为：100ml培养瓶，10.0×104/10ml；6孔培养板，3.0×104/3ml；24孔培养板，1.0×104/lml；96孔培养板0.2×104/200μl。
2.药物浓度选择：
1)保妇康栓药物浓度选择：
将1枚保妇康栓(水溶性)溶解于44ml无血清的DMEM培养基中，其所含保妇康栓浓度为3.95×104mg/L，待溶液澄清后，用孔径为0.22μm的滤器过滤除菌，分装后4℃避光保存备用。根据预试验结果，实验组最终加入的保妇康栓浓度分别为19.77mg/L(莪术油1mg/L，冰片0.85mg/L，基质17.97mg/L)，39.55mg/L(莪术油2mg/L，冰片1.7mg/L，基质35.94mg/L)，79.09mg/L(莪术油4mg/L，冰片3.4g/ml，基质71.88g/ml)，对照组则加入等量的培养基。参照保妇康栓中基质(0，10mg/L，20mg/L，40mg/L，80mg/L，100mg/L)和冰片浓度(0，1.4mg/L，2.8mg/L，5.6mg/L，11.2mg/L，22mg/L)，测定加药后CaSki细胞增殖力。
4.细胞形态观察：
1)活细胞照相：将对数生长期的细胞接种于6孔板培养板，每孔3×104个细胞，在各实验组的6孔培养板中每孔放置一片盖玻片，形成附有细胞的盖片，第二天细胞贴壁后更换为含药培养基，培养三天后，在倒置显微镜下观察细胞形态并照相。观察不同浓度保妇康栓作用下CaSki、H8细胞系形态学变化。
2)Giemsa染色观察：SiHa、CaSki、H8细胞系三种细胞实验均分2组：①对照组，等量乙醇；②药物处理组，莪术油浓度分别为15mg/L，25mg/L，35mg/L。固定方法稍作改变，其它步骤按常规进行。在各实验组的6孔培养板中每孔放置一片盖玻片，接种3×105个对数生长期细胞。培养3d后用三氯醋酸(TCA)固定，每孔加预冷的50％TCA液600μl(TCA最终浓度为10％)固定，加TCA时轻轻地加在培养液表面(使死亡或凋亡的细胞被固定在原位)，静置5分钟后再将平板移至4℃放置1小时。取出盖玻片，用去离子水洗3遍，再用PBS冲洗2遍，甩干。用现配的Giemsa染色液(Giemsa染液贮存液：pH7.0 PBS＝1：染色15min，用自来水冲去玻片上多余的染料，空气干燥，二甲苯透明，光学树脂胶封固。在光学显微镜下分别用低、高倍镜观察细胞。
5.四甲基偶氮唑蓝比色法检测不同浓度的保妇康栓对细胞生长抑制情况：
将CaSki、H8细胞接种于六板96孔细胞培养板，每孔3000个细胞，第二天更换为含药培养基，所含保妇康栓浓度分别为19.77mg/L，39.55mg/L，79.09mg/L，并设正常对照，每个浓度平行5孔。37℃，5％CO2培养24小时后每孔加入5mg/ml四甲基偶氮唑蓝(MTT)20μl，继续培养4小时，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜150μl，37℃放置20分钟，震荡使蓝紫色结晶完全溶解后，酶标仪测定OD值，波长492nm，连续6天，作生长曲线。
同法将SiHa、CaSki、H8细胞接种于96孔细胞培养板，每孔3000个细胞，第二天更换为含药培养基，所含莪术油浓度分别为15mg/L，25mg/L，35mmg/L，并设空白对照组。连续6天做生长曲线，结果见表1-4，及图1-4。
表1保妇康栓对CaSki细胞的生长抑制作用(OD，
n＝5)
| control | 19.77mg/L | 39.55mg/L | 79.07mg/L | F值 | P值 | |
| 1天2天3天4天5天6天 | 0.170±0.0080.245±0.0160.312±0.0090.398±0.0270.456±0.0190.652±0.038 | 0.141±0.0060.214±0.0080.275±0.0040.365±0.0200.412±0.0340.512±0.019 | 0.138±0.0110.197±0.0090.278±0.0090.289±0.0100.346±0.0080.463±0.024 | 0.122±0.0050.168±0.0080.199±0.0060.221±0.0120.298±0.0060.312±0.021 | 30.90177.6932.016255.131130.7785.15 | P＜0.01P＜0.01P＜0.01P＜0.01P＜0.01P＜0.01 |
表2保妇康栓对H8细胞的生长抑制作用(OD，
n＝5)
| control | 19.77mg/L | 39.55mg/L | 79.07mg/L | F值 | P值 | |
| 1天2天3天4天5天6天 | 0.170±0.0080.254±0.0160.389±0.0090.422±0.0270.568±0.0190.71±0.038 | 0.141±0.0060.198±0.0080.365±0.0040.422±0.0200.520±0.0340.566±0.019 | 0.138±0.0110.165±0.0090.286±0.0090.355±0.0100.421±0.0080.466±0.024 | 0.122±0.0050.135±0.0080.199±0.0060.256±0.0120.298±0.0060.356±0.021 | 30.90177.6932.016255.131130.7785.15 | P＜0.01P＜0.01P＜0.01P＜0.01P＜0.01P＜0.01 |
表3冰片加莪术油对CaSki细胞的生长作用
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | P值 | |
| control1.4mg/L2.8mg/L5.6mg/L11mg/L22mg/L | 0.3680.3590.3540.3780.3610.326 | 0.3620.3690.360.3710.3330.305 | 0.3260.3650.3710.3440.2940.315 | 0.3160.340.3610.320.3130.321 | 0.3320.4440.3650.3190.3290.324 | 0.7880.7560.36.40.75860.78480.7654 | -0.130.080.740.370.07 |
表4基质对CaSki细胞生长的作用
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | P值 | |
| control10mg/L20mg/L40mg/L80mg/L100mg/L | 0.7750.7740.7660.7690.8030.738 | 0.7670.7430.7750.7580.7910.803 | 0.8050.7740.7660.7890.790.773 | 0.8070.7760.7540.7720.7580.751 | 0.7860.7660.7860.7620.7820.762 | 0.7880.76660.76940.770.78480.7654 | -0.070.090.100.780.14 |
与对照组比较，P＞0.05
结果：由图1至图3及表1至表4可以看出，MTT检测发现不同浓度保妇康栓对宫颈癌细胞CaSki以及宫颈永生化细胞H8均有生长抑制作用，随着作用时间以及药物浓度增加作用越明显(见图1，3)。
分别用不同浓度的保妇康栓成分--冰片和基质处理CaSki细胞，第五天MTT值与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。不同浓度冰片加莪术油处理CaSki细胞第五天，MTT值与单加莪术油组相比无显著性差异(P＞0.05)。
6.细胞周期检测
CaSki、H8细胞两种细胞接种在六孔板，每孔3×105个对数生长期细胞，分两组：①对照组，等量乙醇；②药物处理组，所含保妇康栓浓度分别为19.77mg/L，39.55mg/L，79.09mg/L；
同法将SiHa、CaSki、H8细胞接种于六孔板，实验均分2组：①对照组，等量乙醇；②药物处理组，莪术油浓度分别为15mg/L，25mg/L，35mg/L。
具体步骤：
(1)消化细胞，计数。
(2)将5×104对数生长期细胞接种于6孔板中，每组设三个平行孔。
(3)5％CO2孵箱37℃培养三天后，收取细胞和上清。先取出6孔板中的细胞上清，置于20ml离心管中，再消化细胞，吹打置于同一离心管管中，1200rpm离心7min，弃上清，加5mlPBS洗，1200rpm离心7mn，弃上清，加1ml生理盐水，将细胞转移至1.5ml离心管中，1200rpm离心7min，弃上清，加500μl 75％冷乙醇固定，吹打混匀。
(4)置于4℃冰箱保存，作流式细胞术。
经0.01％RNA酶处理胞浆RNA、50mg/L碘化丙锭(propidium iodide，PI)DNA染色30min后，经300目细胞筛过滤除去成团细胞，用流式细胞仪检测细胞周期中不同时相的细胞百分比和细胞凋亡率。每份标本测定5000个细胞。根据DNA含量区分细胞所处细胞周期时相，结果见表5-6。
表5保妇康栓作用下CaSki细胞周期分布和细胞凋亡率
| Cell cycle(％) | apoptosis(％) | |||
| G1 | G2 | S | ||
| control39.55mg/L79.09mg/L | 79.9±0.7175.5±1.5674.9±1.13* | 10.25±0.2111.1±0.7112.15±0.21 | 9.8±0.4212.55±0.6413.4±0.85* | 0.94±0.0031.18±0.0013.09±0.001* |
注：P＜0.05compared with control
表6保妇康栓作用下H8细胞周期分布和细胞凋亡率
| Cell cycle(％) | apoptosis(％) | |||
| G1 | G2 | S | ||
| control39.55mg/L79.09mg/L | 74.2±1.8472.8±2.6976.75±2.62 | 12±1.0212.4±0.859.75±0.07 | 13.75±1.7715±1.5613.55±2.76 | 0.68±0.0020.69±0.0022.33±0.005 |
注：P＞0.05 compared with control
结果：由表5和6可以看出，保妇康栓作用于H8细胞，G1期减少，但是均无统计学差异(P＞0.05)。保妇康栓作用于CaSki细胞，G1期细胞减少(P＜0.05)，S期细胞增加(P＜0.05)，使细胞阻滞于S期。保妇康栓作用于H8细胞，加药组凋亡率略增加，但无统计学差异(P＞0.05)。保妇康栓作用于CaSki细胞，加药组凋亡率略增加，有统计学差异(P＜0.05)。
7.半定量RT-PCR方法检测HPV16E6E7mRNA表达水平：
(1)总RNA提取
1)收集107细胞，PBS洗2遍，充分振荡；
2)向样品管中加入1000μl 4N异硫氰酸胍、20mM NaAc(pH5.2)、0.1M β巯基乙醇、0.5％十二烷基肌氨酸钠混合液，充分振荡，使沉淀完全溶解；
3)室温，12000rpm离心5min；
4)取上清，加200μl氯仿充分混匀，12000rpm离心5min；
5)小心吸取上层水相，加入等体积的(约450μl)酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)温和混匀，12000rpm离心3min；重复该步骤一遍；
6)吸取上清(约450μl)，加入1/10体积的3M NaAc、一倍体积的异丙醇，-20℃ 30min以上；
7)12000rpm离心10min，弃上清；
8)加入1ml 75％乙醇，振荡混匀，12000rpm离心5min，弃上清；重复该步骤一遍；
9)敞开试管盖室温晾干约10min；
10)加入25μl DEPC处理水，即为所提总RNA，样品-80℃保存。
(2)RT(逆转录)反应：
①取约5μg总RNA于一支0.5ml离心管中，65℃保温10min，离心数秒，放置冰浴中；
②在上面离心管中加入随机引物1μl、10nM dNTP 1μl、5×RT缓冲液4μl、酶混合液(含逆转录酶M-MLV 20u、RNA酶抑制剂20u)1μl，用DEPC-ddH20补足至20μl；③室温放置10min，37℃保温30min；④95℃(5min，4℃5min，迅速放入-20℃冻存。
(3)PCR反应：
①取0.5ml离心管，依次加入10×PCR缓冲液4.5μl、10mM dNTP 1μl、25mM MgCl24μl、上、下游引物各1μl(50pmol)(阳性内参照加通用引物β-actin 50ng/μl上、下游引物1μl)、2u/μl Taq酶1μl、RT反应产物(eDNA第一链)5μl，用DEPC-ddH20补足至50μl；
②离心数秒，上PCR仪扩增，扩增参数为：94℃预变性5min；94℃变性45s，50℃复性45s，72℃延伸1min，扩增30个循环；72℃延伸加时5min；PCR产物4℃保存；
③1.2％琼脂糖凝胶电泳观察结果。
2％琼脂糖凝胶电泳观察结果，电压40V。
结果：CaSki和H8细胞用保妇康栓药物处理后，可见细胞生长稀疏，部分细胞固缩。
(4)半定量分析
应用Scion Image 4.0(NIH)软件进行电泳条带图像灰度值的半定量分析。待测基因电泳条带灰度比值＝待测条带灰度值/同一份标本内参照β-actin条带灰度值。每个加药样本至少检测三次，结果见表7。
表7保妇康栓作用下RT-PCR产物电泳条带灰度值
| HPV16E6E7/β-actinControl | HPV16E6E7/β-actin(39.55mg/L) | HPV16E6E7/β-actin(79.09mg/L) | |
| CaSkiH8 | 0.8916±0.0270.697±0.016 | 0.8013±0.02590.627±0.0223 | 0.6689±0.04090.4538±0.025 |
*P＜0.05 compared with control
结果：本实验中在保妇康栓作用下，CaSKi和H8两种细胞HPV16E6E7基因片段mRNA表达均明显低于对照组(P＜0.01)，并呈剂量依赖关系(P＜0.01)。
8统计学处理
用SPSS 13.0统计软件，进行单因素方差分析(ANOVA)、t检验等。
结论：
一、保妇康栓以及莪术油对于CaSki和H8细胞增殖的作用
MTT检测结果表明，保妇康栓可以抑制CaSki和H8细胞的增殖，随着药物浓度的增加，抑制作用增强。活细胞照相提示保妇康栓可以杀伤细胞，细胞生长稀疏，崩解破碎，证实药物对两种细胞系增殖有抑制作用。
MTT法检测结果显示莪术油对于SiHa、CaSki和H8细胞的具有生长抑制作用，随着药物浓度的增加，抑制作用增强。呈现剂量-效应关系。活细胞照相和Gimsa染色结果均提示提示莪术油可以杀伤细胞，细胞生长稀疏，崩解破碎，证实药物对三种细胞增殖有抑制作用。
二、保妇康栓对于细胞周期的影响
本试验流式细胞术结果显示，在不同浓度的保妇康栓作用下，CaSki细胞凋亡率高于对照组。加药组CaSki细胞G1期减少，G2、S期增加，细胞阻滞于S期。结果表明妇康栓可以阻断DNA的合成和复制，有效的抑制肿瘤细胞的增殖。故推测保妇康栓通过促进P16表达，改变细胞周期进程，同时抑制P53表达，阻止细胞分裂，抑制细胞的增殖。
三、保妇康栓对于HPV16E6E7基因mRNA表达的影响
高危型HPV感染是宫颈癌发生的必要条件。高危型HPV产生两种癌蛋白：E6和E7蛋白，癌蛋白可与宿主细胞的细胞周期调节蛋白(抑癌蛋白如p53、Rb等)相结合(E6蛋白与p53结合，E7蛋白和Rb、cyclin A结合)，导致细胞周期控制失常，发生癌变并促进肿瘤进展。本实验中在保妇康栓作用下，两种细胞系HPV16E6E7基因片段mRNA表达均明显低于对照组，且存在剂量依赖关系。保妇康栓可能通过抑制肿瘤细胞HPV16E6E7表达，激活P53和Rb通路促进细胞衰老和凋亡。
四、保妇康栓及其主要成分莪术油可抑制宫颈癌细胞系SiHa、CaSki以及宫颈永生化细胞系H8增殖，其机制可能与抑制HPV 16E6E7表达有关。
Claims (3)
1.保妇康栓在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的保妇康栓在制备治疗宫颈癌的药物中的应用，其特征在于所述的治疗宫颈癌的药物是指治疗HPV引起的宫颈癌的药物。
3.如权利要求2所述的保妇康栓在制备治疗宫颈癌的药物中的应用，其特征在于所述的治疗宫颈癌的药物是指治疗HPV16亚型引起的宫颈癌的药物。
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| WO2010012131A1 (zh) * | 2008-07-28 | 2010-02-04 | Chen Rong | 含有莪术油的药物组合物的制药用途 |
| CN102836148A (zh) * | 2012-09-19 | 2012-12-26 | 海南碧凯药业有限公司 | 一种治疗宫颈疾病的药物组合物 |
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