CN101219152B

CN101219152B - 免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法

Info

Publication number: CN101219152B
Application number: CN2008100503645A
Authority: CN
Inventors: 刘景圣
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2008-02-01
Filing date: 2008-02-01
Publication date: 2010-08-04
Anticipated expiration: 2028-02-01
Also published as: CN101219152A

Abstract

本发明涉及一种免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法。其是将双歧杆菌以1～10％接种量接种于经超高压灭菌的脱脂免疫牛初乳中，培养4～24h，获得双歧杆菌发酵免疫牛初乳；添加冻干保护剂，真空冷冻干燥，获得免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉；将母芯与复合冻干粉按质量比为1∶4～14以空气悬浮造粒法制成免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉颗粒，然后以浓度为5～50％的肠溶型欧巴代包衣液为包埋剂在空气悬浮造粒机中进行肠溶包膜制得复合微胶丸。所得复合微胶丸能够克服胃酸的杀伤，有效保持免疫与微生态双活性，降低制品在生产、使用过程中免疫牛初乳与双歧杆菌的活性、数量及效价的损失，增强制品对人体的保健功能。

Description

免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种利用双歧杆菌发酵免疫牛初乳后通过真空冷冻干燥、悬浮造粒和肠溶包膜制备具有良好的免疫与微生态调节双重活性复合微胶丸的方法。

背景技术

19世纪末，人类开始认识双歧杆菌和免疫乳。经过1个多世纪的研究与实践，人类已经了解并掌握了二者的基本特性，并已开发出多种产品。

双歧杆菌是人类肠道内主要的有益菌群，可以抑制有害菌群的生长繁殖，促进机体新陈代谢，增强机体抵抗能力，调节人体内微生态平衡，已应用于医疗保健药品和食品。双歧杆菌产品在日本和欧美等国家非常盛行，目前国外已开始采用高密度培养、真空冷冻干燥、肠溶微胶囊等技术生产各种双歧杆菌微生态制剂，如益生菌(Probiotics)制剂、益生元(Prebiotics)制剂、合生素(Synbiotics)制剂等。我国双歧杆菌乳制品的发展起步较晚，90年代才开始对双歧杆菌酸奶进行研究，主要是双歧杆菌系列酸“益生菌”酸奶，以及丽珠肠乐、回春生、菲康、金双歧、“法国合生元益生菌”等微生态制剂。虽然在这些制剂中，双歧杆菌的活菌数达到10⁸cfu/g，但制剂生产过程中没有经过包埋和缓释技术处理，因此制剂在保藏过程中会出现活菌数与稳定性降低，服用过程中胃肠通过率极低等现象，严重影响了产品的保健功能。

对于免疫乳的研究国外起步较早，从20世纪50年代开始，科学家就着手研究通过免疫乳来防治人类的疾病。如Mainer、Sheridan等人研制抗轮状病毒的免疫乳，Biokema、Mietns等人研制抗大肠杆菌的免疫乳，Tacket等人研制抗福氏志贺氏菌的免疫乳，以及抗其它肠道病原菌及非肠道疾病的免疫乳，并取得了相当好的临床结果。另外，国外的学者对免疫球蛋白的特性进行了大量的研究，如Mainer、David、Tyler等人研究发现当温度超过65℃，乳中免疫球蛋白的活性被破坏；Hipert通过免疫电泳表明，免疫球蛋白经过胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，仍可保持一定的活性；胃酸对免疫球蛋白的破坏作用较大。目前国外已采用超滤、超高压、微胶囊技术对各种免疫乳制品进行研究，得到的产品稳定性较好，胃肠通过率较高。但国内开发出的免疫乳类产品种类较少，主要是以普通牛初乳为原料生产出的牛初乳类干粉产品，特异性免疫球蛋白的产品还未见有生产，而且这些产品在生产过程中主要应用热杀菌、喷雾干燥等技术，产品中免疫球蛋白的免疫活性损失较大，保藏稳定性较低，胃肠通过率低于10％。

本发明专利是以高活性免疫牛初乳和高密度培养的双歧杆菌为原料，采用高密度培养、超高压、真空冷冻干燥、悬浮造粒和肠溶包膜技术制备免疫与微生态调节双重活性的复合肠溶微胶丸。该制剂不仅有效保持高免疫和微生态调节双重活性，而且具有较强的耐酸和抗消化酶特性，肠道内释放效果良好。

发明内容

本发明提供一种利用双歧杆菌发酵免疫牛初乳后通过真空冷冻干燥、悬浮造粒和肠溶包膜制备复合微胶丸的方法，旨在解决在生产、使用过程中免疫牛初乳与双歧杆菌的活性、数量及效价显著降低的问题。

本发明采取的技术方案是：

1、双歧杆菌发酵免疫牛初乳的制备：

选取距离预产期6～8周的健康预产奶牛作为免疫对象，进行人体肠道内有害菌(如致病性大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等)免疫，收集该母牛分娩后1～3d的乳汁即为免疫牛初乳；所得免疫牛初乳经离心脱脂、超高压杀菌后接种双歧杆菌，离心脱脂条件为3000～5000rpm，5～15min，使脱脂后免疫牛初乳中脂肪质量含量为0.8～1.2％，超高压杀菌条件为300～800MPa，保压2～20min，接种量为1～10％体积浓度，培养4～24h，使双歧杆菌活菌数量达到10⁹cfu/mL以上，免疫球蛋白效价≥2¹⁰，获得双歧杆菌发酵免疫牛初乳；

2、免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉的制备：

在双歧杆菌发酵免疫牛初乳中添加0.1～10％质量浓度的蔗糖和0.4～40％质量浓度的甘露醇(蔗糖和甘露醇作为冻干保护剂使用)，控制料液的厚度处于5～20mm范围内，先在-80～-20℃温度范围内预冻1～10h，使料液中心达到预冻温度；然后进行冻干，冻干过程中采用搁板导热的加热方式，冻干压力为1～50Pa，搁板温度控制在0～30℃以下，冻干时间6～16h；所制得的免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉，其中活菌数量达到10¹⁰cfu/g干粉以上，免疫球蛋白效价≥2⁹；

3、免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备：

以淀粉和砂糖粉制作母芯，母芯中淀粉的质量百分含量为10～50％，母芯经造粒后干燥；

在100mL质量浓度为0.4～40％海藻糖的水溶液中添加经浓缩后的酪蛋白水解液5～50mL(酪蛋白含量为20％质量浓度)，并添加0.2～20％体积的Span80作为乳化剂，制成复合保护液；

以复合冻干粉1～2倍质量的复合保护液为润湿剂，在25～45℃温度范围内，采用空气悬浮造粒法将免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉包被在母芯上，母芯与复合冻干粉的质量比为1∶4～14，从而制备免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉颗粒；

再以质量浓度为5～50％的肠溶型欧巴代包衣液为包埋剂，同样采用空气悬浮造粒法进行肠溶包膜，从而制得具有良好免疫与微生态调节双重活性的复合微胶丸。

上述方法步骤1中所述的双歧杆菌经高密度培养后进行接种，高密度培养后的活菌数量达到10⁹cfu/mL以上。

上述方法步骤3中所述的母芯造粒机的工艺参数为：主机调速：50～120rpm，喷浆调速：80～150rpm，鼓风温度：20～60℃；在干燥室内鼓风干燥，干燥温度37～40℃，空气相对湿度≤20％，干燥时间2～10h。

上述方法步骤3中所述的空气悬浮造粒机的工艺参数为：进风量：100～300m³/h；进气温度：20～60℃；排气温度：20～60℃；物料温度：10～60℃；喷浆速度：1～10rpm；造粒机内鼓风干燥，进风量：100～300m³/h，干燥温度37～40℃，干燥时间2～10h。

经以上工艺制备的免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸，呈淡绿色、圆形颗粒状，不粘连，流动性好，粒径大小基本均匀，90％以上的微粒直径均处于0.9～1.5mm范围内，活菌数量达到10⁸cfu/g以上，免疫球蛋白效价≥2⁸。

所得复合微胶丸能够有效克服胃液对免疫牛初乳与双歧杆菌活性的杀灭作用，有效保持免疫与微生态双活性，可在人工胃液中2～4h不崩解，而在人工肠液中1h内崩解，释放出活菌及免疫球蛋白，达到免疫牛初乳与双歧杆菌联合起效的保健功能。

本发明的有益效果是针对具有免疫活性与微生态调节双重活性功能性乳制品的开发与应用。本发明专利是以高活性免疫牛初乳和高密度培养的双歧杆菌为原料，采用高密度培养、超高压、真空冷冻干燥、悬浮造粒和肠溶包膜技术制备免疫与微生态调节双重活性的复合肠溶微胶丸。该制剂不仅有效保持高免疫和微生态调节双重活性，而且具有较强的耐酸和抗消化酶特性，肠道内释放效果良好。本发明解决了该类制品在生产、使用过程中免疫牛初乳与双歧杆菌的活性、数量及效价损失严重的问题，为进一步开发双歧杆菌与免疫牛初乳制品提供了坚实的技术支撑，为更好的开发新型功能性食品开辟了新的研究领域和空间。

附图说明

图1：双歧杆菌在免疫牛初乳中的生长曲线图；

图2：免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸状态图；

图3：标尺下的免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸。

图1所示，双歧杆菌接种到免疫牛初乳中，初始活菌数为6.8×10⁶cfu/mL，0～1.5h为菌体生长的延滞期，1.5～6.5h为对数生长期，6.5～11h为稳定期。6.5h活菌数达到最大值3.61×10⁹cfu/mL。

具体实施方式

实施例1：双歧杆菌发酵免疫牛初乳的制备

一、免疫牛初乳的制备

1、抗原制备

将福氏志贺氏菌(Shigella flexneri，从吉林大学第一临床医院微生物研究室购进，常规菌种)增菌培养，摇床温度37℃，转速200rpm，培养18～20h；收集培养液，添加0.4％体积浓度的甲醛，37℃灭活24h，杂检。如无活菌存在，用麦氏比浊管测定菌体浓度。用无菌生理盐水调整菌体浓度为1.0×10¹¹cfu/mL，制成水剂苗，并在水剂苗中加入等体积的10号白油，搅拌乳化，制成油佐剂苗；水剂苗、油佐剂苗均4℃保存备用。同时用小白鼠做安全检查。

2、抗原免疫接种

随机选择健康、距离预产期6～8周的预产奶牛肌肉注射水苗，两周后皮下注射油佐剂苗，以后每隔一周交替注射水剂苗和油佐剂苗，直至奶牛分娩。在接种过程中，定期采血，监测牛分泌抗体的水平，要求血清抗体凝集价≥2⁵。

3、免疫牛初乳的收集、脱脂与效价测定

收集母牛分娩后1～3d的牛初乳即为免疫牛初乳。将免疫牛初乳在4000rpm，10min条件下离心脱脂，所得脱脂免疫牛初乳中脂肪质量含量为0.96％。同时测定脱脂免疫牛初乳的抗体含量和效价，抗体含量为35.6mg/mL，免疫球蛋白效价为2¹¹。

二、双歧杆菌的高密度培养

1、双歧杆菌液体培养基

胰胨5g 酵母浸粉10g 大豆蛋白胨5g

葡萄糖10g 温-80 1ml 半胱氨酸·HCl 0.5g

盐溶液40ml 蒸馏水1L

盐溶液的成分和制备：

无水CaCl₂ 0.2g KH₂PO₄ 1.0g MgSO₄·7H₂O 0.48g

NaHCO₃ 10g K₂HPO₄ 1.0g NaCl 2.0g

蒸馏水1L

2、双歧杆菌高密度培养

在10L发酵罐中通入氮气保持压力，压力为0.1MPa，接种量2.5％体积浓度，37℃搅拌培养，转速80rpm。培养基初始pH值7.0，培养6h后发酵液pH值降至5.76，采用恒流补碱的方法从发酵罐补料口滴加1mol/L浓氨水保持pH值在6.0±0.3；葡萄糖浓度12h降至4g/L，此时开始补糖，补充10％质量浓度的灭菌葡萄糖10mL，使糖浓度保持在4～6g/L。6～20h为菌体生长的对数期，在对数生长期末期放罐，此时活菌数为4.62×10⁹cfu/mL。

三、双歧杆菌发酵免疫牛初乳的制备

1、免疫牛初乳超高压杀菌

将脱脂后的免疫牛初乳密封于聚乙烯塑料袋中，置于压力容器内，以最大程度的提高杀菌效率和保护免疫乳中免疫球蛋白的活性为目标，确定超高压杀菌工艺为：杀菌压力为600MPa、保压时间10min，孢子的杀菌率达到99.58％。

2、双歧杆菌发酵免疫牛初乳

将实施例1步骤二得到的双歧杆菌以2.5％体积浓度的接种量接种于经超高压杀菌的免疫牛初乳中，在37℃条件下培养6.5h，使活菌数达到3.61×10⁹cfu/mL，双歧杆菌在免疫牛初乳中的生长曲线如图1所示。双歧杆菌发酵免疫牛初乳中免疫球蛋白效价为2¹⁰。

实施例2：免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉的制备

在双歧杆菌发酵免疫牛初乳中添加1％质量浓度的蔗糖和4％质量浓度的甘露醇作为冻干保护剂。冷阱温度为-45℃，料液的装液厚度10mm，先在-30℃条件下预冻2h；然后进行冻干，冻干过程中采用搁板导热的加热方式，压力为15Pa，搁板温度控制在20℃以下，冻干时间10h。复合冻干粉中活菌数量为1.24×10¹⁰cfu/g干粉，免疫球蛋白效价为2⁹。

实施例3：免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备

1、母芯的制作

以质量比为7∶3的蔗糖粉和可溶性淀粉为原料制作母芯，母芯造粒机的工作参数为：主机调速：80rpm，喷浆调速：110rpm，鼓风温度：27.1℃。

2、母芯的干燥

将母芯初步定型干燥后，去除不合格的母粒，在干燥室内鼓风干燥，干燥温度40℃，空气相对湿度≤20％，干燥时间4h。母芯平均重量为0.226mg，直径0.3～0.5mm。

3、免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉颗粒的制备

采用空气悬浮造粒法将免疫牛初乳于双歧杆菌复合冻干粉包被在母芯上，母芯与复合冻干粉的质量比为1∶10，制得双歧杆菌与免疫牛初乳复合冻干粉颗粒。制备过程中以复合保护剂为润湿剂，复合冻干粉与复合保护液的质量比为1∶1.5，保护剂配方为：在100mL质量浓度为4％的海藻糖溶液中加入25mL浓缩后的酪蛋白水解液(酪蛋白含量为20％质量浓度)，并加入2mL Span80作为乳化剂。

空气悬浮造粒法工艺参数为：进风量：200m³/h，进气温度44.8℃，排气温度：36.2℃，物料温度：37℃，喷浆速度：6rpm。

4、免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉颗粒的干燥

造粒机内鼓风干燥，进风量：200m³/h，干燥温度37℃，干燥时间4h。

5、免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备

(1)肠溶型欧巴代包衣液的配制

在合适的配液容器中加入计算好的88％质量浓度的乙醇溶液作为溶剂，加入粉末状肠溶型欧巴代包衣剂配成15％质量浓度的肠溶型欧巴代包衣液，即免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉颗粒增重为15％。

配制时将粉末状肠溶型欧巴代包衣剂以平稳的速度加入到连续搅拌的酒精溶液中，不能使粉末漂浮在液面上。随着包衣液的粘度不断增大，提高搅拌速度，以保持原有的漩涡。加料完毕后可降低搅拌速度，并继续搅拌45min，即可完成肠溶型欧巴代包衣液的配制。

(2)空气悬浮造粒

采用空气悬浮造粒机进行肠溶包膜，工艺参数为：进风量：200m³/h，进气温度44.8℃，排气温度：36.2℃，物料温度：37℃，喷浆速度：6rpm。

6、免疫球蛋白与双歧杆菌复合微胶丸产品质量评价

制得的双歧杆菌与免疫球蛋白复合微胶丸如图2所示，呈淡绿色圆形颗粒状、不粘连、流动性好，粒径大小基本均匀，90％以上的微粒直径均处于0.9～1.5mm范围内，见图3。

微胶丸中的活菌数为6.3×10⁸cfu/g，免疫球蛋白效价为2⁸。以肠溶型欧巴代作为肠溶包膜的完整微胶丸在人工胃液中2h不崩解，而在人工肠液中40min内崩解完全，将双歧杆菌及免疫球蛋白释放出来。

Claims

1.免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法，其步骤如下：

(1)双歧杆菌发酵免疫牛初乳的制备

选取距离预产期6～8周的健康预产奶牛作为免疫对象，进行人体肠道内有害菌免疫，收集该母牛分娩后1～3d的乳汁即为免疫牛初乳；所得免疫牛初乳经离心脱脂、超高压杀菌后接种双歧杆菌，获得双歧杆菌发酵免疫牛初乳；

(2)免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉的制备

在双歧杆菌发酵免疫牛初乳中添加冻干保护剂，控制料液的厚度处于5～20mm范围内，先在-80～-20℃温度范围内预冻1～10h，使料液中心达到预冻温度；然后进行冻干，冻干过程中采用搁板导热的加热方式，冻干压力为1～50Pa，搁板温度控制在0～30℃以下，冻干时间6～16h，制得活菌数量达到10¹⁰cfu/g以上，免疫球蛋白效价≥2⁹免疫牛初乳与双歧杆菌复合冻干粉；

(3)免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备

再以质量浓度为5～50％的肠溶型欧巴代包衣液为包埋剂，同样采用空气悬浮造粒法进行肠溶包膜，从而制得具有良好免疫与微生态调节双重活性的复合微胶丸；

前面所述的复合保护液是在100mL质量浓度为0.4～40％海藻糖的水溶液中添加经浓缩后的酪蛋白水解液5～50mL，酪蛋白水解液中酪蛋白含量为20％质量浓度，并添加0.2～20％体积的司盘80作为乳化剂制备得到。

2.如权利要求1所述的免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法，其特征在于：有害菌为大肠杆菌、沙门氏菌或志贺氏菌。

3.如权利要求2所述的免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法，其特征在于：有害菌为福氏志贺氏菌。

4.如权利要求1所述的免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法，其特征在于：双歧杆菌经高密度培养后进行接种，高密度培养后的活菌数量达到10⁹cfu/mL以上。

5.如权利要求1所述的免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法，其特征在于：离心脱脂条件为3000～5000rpm，5～15min，使脱脂后免疫牛初乳中脂肪的含量在0.8～1.2％范围内。

6.如权利要求1所述的免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法，其特征在于：超高压杀菌条件为300～800MPa，保压2～20min。

7.如权利要求1所述的免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法，其特征在于：接种量为1～10％体积浓度，培养4～24h，双歧杆菌活菌数量达到10⁹cfu/mL以上，免疫球蛋白效价≥2¹⁰。

8.如权利要求1所述的免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法，其特征在于：冻干保护剂为蔗糖和甘露醇，蔗糖用量为0.1～10％质量浓度，甘露醇的用量0.4～40％质量浓度。

9.如权利要求1所述的免疫牛初乳与双歧杆菌复合微胶丸的制备方法，其特征在于：空气悬浮造粒的工艺参数为进风量200m³/h，进气温度20～60℃，排气温度20～60℃，物料温度10～60℃，喷浆速度1～10rpm。