CN101216451A - 一种dna生物传感器电极的制作方法及其应用 - Google Patents

一种dna生物传感器电极的制作方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种DNA生物传感器电极的制作方法及其应用，利用丝网印刷技术印刷薄片型电极，其步骤如下：a.底板选择和处理；b.印刷导电银层；c.印刷碳层；d.印刷绝缘层。采用电化学沉积的方法，实现了在ZrOCl2的KCl溶液中氧化锆薄膜对丝网印刷碳电极的表面修饰。传感器上的ssDNA与杂交液中能互补配对的ssDNA杂交反应，形成dsDNA。杂交前后的单/双链DNA与亚甲基蓝作用的不同，利用微分脉冲伏安法记录该传感器在亚甲基蓝溶液中的电化学信号，测量峰电流的变化即可对待测DNA进行定性和定量。该法可测定低至10－10M的DNA，是一种灵敏度高，选择性专一的技术。该法制备简单、特异性强、可批量生产，在医疗诊断、食品工业和环境保护领域均具有十分重要的意义。

Description

一种DNA生物传感器电极的制作方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物传感器电极的制作方法及其应用，涉及利用电化学的方法检测细菌DNA的生物传感器的制备。
背景技术
食品卫生质量问题一直以来备受广大人民的关注，大量食品中有害微生物的监测是食品安全检测的重要一环。目前，一般检测细菌的方法是通过测定细菌的生理、形态特征或通过测定细菌的基因组成来鉴定细菌。这些相关方法操作过程复杂，且需要花费很长的时间，它们已经远远不能满足当前对微生物检测的要求。近十年来，DNA生物传感器出现，其具有快速、灵敏、操作方便、无污染等优点，在临床基因诊断、环境分析和食品质量检测等方面具有广阔的应用前景。但是目前的DNA生物传感器大多数是基于传统的金电极，玻碳电极等，其成本高，处理较繁琐，且不能一次性使用，很难得到应用和推广。而基于丝网印刷电极研制的DNA生物传感器克服了传统方法耗时低效率的缺点，它是玻碳电极和碳糊电极的一种延伸，具有碳糊电极的电位窗口宽，背景电流低和廉价等优点，还具有能一次性使用，重复性好，可批量生产等特点。所以，利用丝网印刷电极制作一次性使用的DNA生物传感器将是未来生物传感器的一个主流，特别是在食品检测等方面将有很大的发展潜力，随着计算机技术、微制造技术和生物材料的不断发展，DNA生物传感器在食品检测等领域的应用将越来越广泛，它将取代现有的一些传统的检测方法，成为广泛普及的常规仪器。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，探针DNA在丝网印刷碳电极上的固定方法，在此基础上，设计了一种全新的丝网印刷碳电极，并在此种电极上通过电沉积的方法修饰了氧化锆薄膜，制备了一种一次性使用的DNA杂交生物传感器。
本发明涉及一种一次性使用的DNA生物传感器电极的制作方法，其步骤如下：
首先，利用丝网印刷方法获得具有导电层、碳层和绝缘层的碳电极，该碳电极经含Zr离子的电解液修饰后得到ZrO2/SPE电极；
然后，选择待测对象的特征DNA序列，设计其作为探针的互补ssDNA序列和完全不互补ssDNA序列，在探针ssDNA的5’端修饰磷酸基团，通过人工合成获得，将所得的ssDNA溶于pH值为6.0～9.0的缓冲溶液中，在-20℃下保存；按需求将ssDNA的缓冲溶液稀释到所需浓度，用微量吸管吸取少量的探针ssDNA到ZrO2/SPE电极上，利用ZrO2/SPE电极表面的氧化锆薄膜与探针ssDNA的5’端的磷酸基团特异性结合，从而把探针固定到ZrO2/SPE电极表面，即得ssDNA/ZrO2/SPE生物传感器。
所述碳电极的制备包括如下步骤：
a)底板的选择和处理：选用PVC或PP薄板作为电极的底板，先用有机溶剂擦洗底板表面，再用双蒸水冲洗待用；
b)导电层的印刷：利用丝网印刷机在待用底板的表面印刷一层导电银条，干燥后形成导电层；
c)碳层的印刷：利用丝网印刷机在b)的基础上再印刷一层碳层，干燥后待用；
d)绝缘层的印刷：利用丝网印刷机在c)的基础上再印刷一层绝缘层，干燥后最终形成丝网印刷碳电极；
e)丝网印刷碳电极的修饰：以上述丝网印刷碳电极作为工作电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以铂丝作为对电极，组成三电极系统；选用0.1M KCl，3～10mM ZrOCl2作为电解液，在-1.1V～+0.7V(vs.SCE)电压范围内，扫描速率为0.2～0.5mV/s，扫描时间为15min～30min，对三电极系统进行循环伏安扫描，得到氧化锆薄膜修饰的ZrO2/SPE电极。
所述碳层是圆形或方形。
所述DNA生物传感器电极的应用，其特征在于，使所述DNA生物传感器电极与一定浓度的待测对象的特征ssDNA的缓冲溶液进行杂交反应，形成dsDNA/ZrO2/SPE，杂交时间为数十分钟；同样使ssDNA/ZrO2/SPE与一定浓度的完全不互补的ssDNA的缓冲溶液进行反应，形成ncDNA/ZrO2/SPE；杂交前后的传感器浸入到含有20μM的亚甲基蓝指示剂的缓冲溶液中，溶液中具有氧化还原活性的亚甲基蓝将和DNA作用，且在传感器上发生电化学反应，于微分脉冲伏安图上0V～-0.5V区间呈一良好的还原峰，测量峰电流的变化，通过比较，根据峰电流变化大小来对待测DNA进行定性和定量。
所述峰电流变化接近时，溶液中无此DNA序列；反之，溶液中具有一定含量的DNA序列，并由此测出对象DNA的含量；
所述探针DNA序列是被测对象的特征DNA序列的完全互补链，且端上修饰了磷酸基团；
所述亚甲基蓝指示剂中含有20mM的NaCl、20mM的Tris-HCl及20mM的中性MB，或者含有20mM的NaCl、50mM的TE及20mM弱碱性MB。
使用该方法，可测定低至0.1ng/ml的DNA，是一种灵敏度高和选择性专一的DNA测定的新方法。
上述的DNA的缓冲溶液是20mM的NaCl、50mM TE、20μM MB(pH＝8.0)的缓冲溶液。NaCl用于控制离子强度，TE调节溶液pH值，从而使DNA更好地保存。
本发明的优点是：(1)利用丝网印刷技术制作了一次性使用的丝网印刷碳电极，此电极可根据实际需求调整其规格，很好地解决了当前固体电极预处理的繁琐操作，且此电极具有很好的同一性，完全可以批量生产，甚至实现商品化。(2)此DNA传感器制作简单，仅用简单的电化学技术就可在其表面修饰氧化物薄膜，解决了现常研究的DNA传感器层层自组装方法带来的各种不利因素。(3)解决了对细菌检测操作复杂，且需要花费时间长的问题，提供了一种容易制备且操作方便、灵敏度高、特异性强、可定性和定量检测细菌DNA浓度的一次性使用的生物传感器。实现了对副溶血性弧菌特征DNA的检测。本发明能对细菌DNA进行定性和定量检测，在医疗诊断、食品工业和环境保护领域均具有十分重要的意义。
附图说明
图1是本发明实施例的丝网印刷电极结构示意图；
图2是本发明实施例的细菌DNA传感器纪录的微分脉冲伏安曲线图，图中：
a)、ZrO2/SPE(氧化锆薄膜修饰的丝网印刷电极)在亚甲基兰溶液中的微分脉冲伏安曲线；
b)、dsDNA/ZrO2/SPE(单链DNA与完全互补的DNA杂交后的丝网印刷电极)在亚甲基兰溶液中的微分脉冲伏安曲线；
c)、ssDNA/ZrO2/SPE(单链DNA的丝网印刷电极)在亚甲基兰溶液中的微分脉冲伏安曲线；
d)、ncDNA/ZrO2/SPE(单链DNA与完全不互补的DNA杂交后的丝网印刷电极)在亚甲基兰溶液中的微分脉冲伏安曲线。
具体实施方式
通过以下实施例的说明将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1
利用本发明的DNA生物传感器检测致病性的副溶血孤菌的特征DNA
一：丝网印刷电极的制作
如附图1所示包括有：PVC底板1、导电银层2、碳层3或3’(分别代表圆形和方形)、绝缘层4、印刷后形成的一次性电极5。准备PVC底板1一张，先用乙醇溶液清洗表面污染物，再用双蒸水冲洗干净，干燥后备用；利用丝网印刷机在其上面印刷一层导电银层，在红外灯下干燥30～60min；再在其上面印刷一层碳层，主要为圆形和方形，规格大小可按实际需要设计后印刷，同样在红外等下干燥30～60min；再在其上面印刷一层绝缘层，干燥后；裁成大小相同的电极，即可作为工作电极使用。
二、DNA传感器的制备及其杂交
利用制作好的丝网印刷碳电极作为工作电极，及选用本发明之外的饱和甘汞电极作为参比电极，用铂丝作为对电极组成三电极系统，选用0.1M KCl，5mMZrOCl2作为电解液，在-1.1V～+0.7V(vs.SCE)电压范围内，扫描速率为0.5mV/s，10圈，对三电极系统进行循环伏安扫描，即得氧化锆薄膜修饰的丝网印刷电极(ZrO2/SPE)。选用致病性的副溶血孤菌的特征序列作为研究对象，副溶的耐热溶血毒素的编码基因的一段DNA，DNA序列如下：
细菌的特征序列：5’-GGT ACT AAA TGG CTG ACA TC-3’
完全互补的序列(探针)：5’-PO4-GAT GTC AGC CAT TTA GTA CC-3’
完全不互补的序列：5’-TCC TAA GCT CTA TGA CAT AT-3’
用微量吸管吸取3μl的1M的探针ssDNA到ZrO2/SPE电极上，利用电极表面的氧化锆薄膜与探针ssDNA的5’端的磷酸基团特异性结合，从而把探针固定到电极表面，即得ssDNA/ZrO2/SPE传感器；使传感器与一定浓度的细菌特征ssDNA的TE缓冲溶液(pH＝8.0)中进行杂交反应，形成dsDNA/ZrO2/SPE，杂交时间为数十分钟。同样使ssDNA/ZrO2/SPE与一定浓度的完全不互补的ssDNA的TE缓冲溶液(pH＝8.0)中进行反应，形成ncDNA/ZrO2/SPE。利用同样的条件，配制五种不同浓度的细菌特征序列DNA溶液与ssDNA/ZrO2/SPE杂交。3、记录微分脉冲伏安曲线(DPV)、绘制校正曲线
把制作好的各种电极浸入溶液为20mM的NaCl、50mM TE、20M的MB(pH＝8.0)的缓冲溶液中静止为15min，然后进行微分脉冲伏安法实验，得微分脉冲伏安法曲线，记录减去基线电流后的氧化峰电流值。
由图2可知，一、探针ssDNA在ZrO2/SPE上得到了有效固定；二、探针电极与互补ssDNA的杂交反应，能够使DPV氧化峰电流发生显著变化。因而该生物传感器电极可定性判断样品溶液中有无目标DNA序列。
ssDNA/ZrO2/SPE与五种不同浓度Cn(n＝1，2，3，4，5)的目标DNA杂交反应后分别测得氧化峰电流值In(n＝1，2，3，4，5)，拟合生成In-Cn间的函数方程，得到校正曲线。样品检测时，将该传感器电极在相同的杂交条件下与样品反应，测得氧化峰电流值Ix，然后根据校正曲线可得到样品中互补DNA的浓度值Cx。该传感器可实现对10-10～10-6M浓度范围内的互补DNA的定量检测。

Claims (7)

1.一种DNA生物传感器电极的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
首先，利用丝网印刷方法获得具有导电层、碳层和绝缘层的碳电极，该碳电极经含Zr离子的电解液修饰后得到ZrO2/SPE电极；
然后，选择待测对象的特征DNA序列，设计其作为探针的互补ssDNA序列和完全不互补ssDNA序列，在探针ssDNA的5’端修饰磷酸基团，通过人工合成获得，将所得的ssDNA溶于pH值为6.0～9.0的缓冲溶液中，在-20℃下保存；按需求将ssDNA的缓冲溶液稀释到所需浓度，用微量吸管吸取少量的探针ssDNA到ZrO2/SPE电极上，利用ZrO2/SPE电极表面的氧化锆薄膜与探针ssDNA的5’端的磷酸基团特异性结合，从而把探针固定到ZrO2/SPE电极表面，即得ssDNA/ZrO2/SPE生物传感器。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述碳电极的制备包括如下步骤：
a)底板的选择和处理：选用PVC或PP薄板作为电极的底板，先用有机溶剂擦洗底板表面，再用双蒸水冲洗待用；
b)导电层的印刷：利用丝网印刷机在待用底板的表面印刷一层导电银条，干燥后形成导电层；
c)碳层的印刷：利用丝网印刷机在b)的基础上再印刷一层碳层，干燥后待用；
d)绝缘层的印刷：利用丝网印刷机在c)的基础上再印刷一层绝缘层，干燥后最终形成丝网印刷碳电极；
e)丝网印刷碳电极的修饰：以上述丝网印刷碳电极作为工作电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，以铂丝作为对电极，组成三电极系统；选用0.1M KCl，3～10mM ZrOCl2作为电解液，在-1.1V～+0.7V(vs.SCE)电压范围内，扫描速率为0.2～0.5mV/s，扫描时间为15min～30min，对三电极系统进行循环伏安扫描，得到氧化锆薄膜修饰的ZrO2/SPE电极。
3.根据权利要求1或2所述的制作方法，其特征在于，所述碳层是圆形或方形。
4.权利要求1或2所述的DNA生物传感器电极的应用，其特征在于，使所述DNA生物传感器电极与一定浓度的待测对象的特征ssDNA的缓冲溶液进行杂交反应，形成dsDNA/ZrO2/SPE，杂交时间为数十分钟；同样使ssDNA/ZrO2/SPE与一定浓度的完全不互补的ssDNA的缓冲溶液进行反应，形成ncDNA/ZrO2/SPE；杂交前后的传感器浸入到含有20μM的亚甲基蓝指示剂的缓冲溶液中，溶液中具有氧化还原活性的亚甲基蓝将和DNA作用，且在传感器上发生电化学反应，于微分脉冲伏安图上0V～-0.5V区间呈一良好的还原峰，测量峰电流的变化，通过比较，根据峰电流变化大小来对待测DNA进行定性和定量。
5.根据权利4要求的所述的应用，其特征在于，所述峰电流变化接近时，溶液中无此DNA序列；反之，溶液中具有一定含量的DNA序列，并由此测出对象DNA的含量。
6.根据权利4要求的所述的应用，其特征在于，所述探针DNA序列是被测对象的特征DNA序列的完全互补链，且端上修饰了磷酸基团。
7.根据权利4要求的所述的应用，其特征在于，所述亚甲基蓝指示剂中含有20mM的NaCl、20mM的Tris-HCl及20mM的中性MB，或者含有20mM的NaCl、50mM的TE及20mM弱碱性MB。
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