CN101215530A

CN101215530A - 生产l(+)-酒石酸及其盐的方法以及该方法中所用的微生物菌株

Info

Publication number: CN101215530A
Application number: CNA2007100021559A
Authority: CN
Inventors: 张建国
Original assignee: HANGZHOU BIOKING BIOCHEMICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Bioking Biochemical Engineering Co ltd; Hangzhou crystal biological Polytron Technologies Inc.
Priority date: 2007-01-04
Filing date: 2007-01-04
Publication date: 2008-07-09
Anticipated expiration: 2027-01-04
Also published as: CN100584939C

Abstract

本发明涉及能将顺式环氧琥珀酸或其盐转化为L(+)－酒石酸的微生物。本发明还涉及利用微生物生产L(+)－酒石酸或其盐的方法。进一步地，本发明还涉及所述微生物在生产L(+)－酒石酸或其盐中的用途。

Description

生产L(+)-酒石酸及其盐的方法以及该方法中所用的微生物菌株

技术领域

本发明涉及一种新的生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，以及该方法中所用的能将顺式环氧琥珀酸或其盐转化为L(+)-酒石酸或其盐的微生物。具体地，本发明涉及利用所述微生物生产L(+)-酒石酸或其盐的方法。进一步地，本发明还涉及所述微生物在生产L(+)-酒石酸或其盐中的用途。

背景技术

酒石酸可以用于诸如以下行业：在食品行业可作为诸如食品添加剂、增味剂以及食用色素成分之一；在医药行业诸如用于抗结核药乙胺丁醇的生产，作为不可替代的光学异构体拆分剂，用来拆分其中间体2-氨基丁醇；在化学工业及其它工业，诸如用于印染的防染剂、照相显影剂、金属离子隐蔽剂、电镀、制革及制镜行业。目前酒石酸的需求正在逐年递增，因此迫切需要扩大酒石酸生产规模，提高产品质量，以满足国内、国际市场需求。

L(+)-酒石酸[(2R，3R)-2，3-二羟丁烷-1，4-二羧酸]是一种天然结构的有机酸，在某些植物果实如葡萄、罗望子果等中有较高的含量。过去，生产L(+)-酒石酸的主要方法是利用葡萄酒的副产物酒石或罗望子果为原料经加工制得，或者从酒石中提取，或者以葡萄糖为主要原料通过一步发酵法提取。而采用具有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物生产L(+)-酒石酸是目前L(+)-酒石酸生产的发展方向，其原理如下：

顺丁烯二酸酐-→顺丁烯二酸-→顺式环氧琥珀酸-→L(+)-酒石酸

以顺丁烯二酸酐为原料经加水得到顺丁烯二酸溶液，再以钨酸或钨酸盐为催化剂使顺丁烯二酸与过氧化氢反应制得顺式环氧琥珀酸，最后利用微生物顺式环氧琥珀酸水解酶将顺式环氧琥珀酸水解为L(+)-酒石酸。

具有L(+)-酒石酸合成酶的微生物主要是细菌，目前报道的有：无色杆菌属(Achromobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Λgrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)和棒杆菌属(Coryncbacterium)。采用红球菌属微生物制取L(+)-酒石酸有见报道，如US4,010,072采用Rhodococcus ruber DSM44319菌种、US.6,379,938采用Rhodococcus rhodochrous菌株等。但未见采用本发明所述的微生物菌株Rhodococcus sp.USA-AN012生产L(+)-酒石酸的报道。

本发明所采用的微生物菌株是发明者从土壤中分离获得的一个新菌株，该菌株能将顺式环氧琥珀酸或其盐转化为L(+)-酒石酸或其盐，满足了国内、国际市场不断增长的L(+)-酒石酸或其盐的需求。

发明内容

本发明人经过长期和深入细致的研究，从土壤中分离获得了一种新的微生物菌株，它能够将顺式环氧琥珀酸或其盐转化为L(+)-酒石酸或其盐。该微生物菌株被确认为是红球菌USA-AN012的又一个新种命名为红球菌USA AN-012BK-98(Rhodococcus sp.USA-AN012BK-98)。该菌株已经于2006年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.1756。

本发明的目的之一是提供一种能将顺式环氧琥珀酸或其盐转化为L(+)-酒石酸或其盐的微生物；

本发明的另一目的是提供一种具有与SEQ ID NO：1序列一致的16SrDNA序列的微生物。

本发明提供的微生物优选为红球菌USA-AN012BK-98。

本发明提供的微生物优选是具有保藏号为CGMCC No.1756的红球菌。

本发明还提供具有SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

本发明还提供与SEQ ID NO：1-4具有同源性的序列，同源性优选为至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选为至少90％，优选至少95％，更优选至少99％的同源性。

本发明还提供一种核苷酸序列，其包括选自SEQ ID NO：1-4中的序列。

本发明还提供具有选自SEQ ID NO：1-4中的序列，其中一个或多个，优选1-15个，优选1-10，优选1-5个核苷酸被取代、删除和/或添加而得到的经修饰的序列。

进一步地，本发明还涉及本发明所述微生物在生产L(+)-酒石酸或其盐中的用途。

本发明还涉及所述的微生物的突变体或变种及其生物学培养物，所述的微生物突变体或变种及其生物学培养物能将顺式环氧琥珀酸或其盐转化为L(+)-酒石酸或其盐。

本发明还涉及一种生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，该方法包括将上面所述的微生物，微生物的突变体或变种或生物学培养物与顺式环氧琥珀酸或其盐接触。所述的顺式环氧琥珀酸或其盐可以从市场上购得，也可以根据本领域已知的技术制备。诸如我们可以由顺丁烯二酸和碳酸钙以及双氧水反应制得顺式环氧琥珀酸钙，再经酶反应获得酒石酸钙，酸解后得到酒石酸溶液，离子交换除去杂质后获得精制的酒石酸溶液，再经诸如浓缩，结晶，烘干包装成成品。所述的顺丁烯二酸可由市场购得，亦可以由本领域常规的方法制得，诸如由顺丁烯二酸酐制得。本发明所述的原料物质均可以从市场购得或由本领域常规的方法制得。

本发明所述的顺式环氧琥珀酸盐优选为顺式环氧琥珀酸二钠，或顺式环氧琥珀酸钙。

本发明的其它目的见于本发明的详细描述之中。

本发明所利用的培养基可以是本领域常规的培养基。所述的培养可以在本领域的常规或已知的条件下进行。例如，可以在实验室或者工业发酵罐中，在适当的培养基中以及适当的条件下，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、补料-分批的、或者固态发酵)来培养细胞。在包含碳源和氮源以及无机盐的适当营养培养基中以本领域已知的方法进行培养。

本发明所用的培养基的成分及其含量诸如下述：

液体种子培养基：

葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，NaCl1％，pH7.5。121℃灭菌20分钟。

产酶培养基：

葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，顺式环氧琥珀酸二钠1.0％pH7.5，121℃灭菌20分钟。

合适的培养基可以从供应商处获得，或者可以用本领域已知的方法制备。适用于本发明的培养基并不限于上面所述的那些。在细菌培养箱中的培养时间和温度亦可以按本领域常规的培养时间和温度进行。

对于菌种鉴定的方法，这是本领域技术人员所熟知的。诸如经典的分类鉴定法，化学分类法，遗传学分类法等等。本发明所采用的菌种鉴定法，采用的是近年来发展起来的16srDNA序列分析法，其鉴定技术路线包括：(1)菌基因组抽提；(2)引物设计合成；(3)PCR扩增；(4)PCR产物纯化；(5)测序；(6)在线BLAST分析。

测序的原理为本领域所熟知(参见附图1)：双脱氧核糖核酸在PCR扩增过程中的随机终止，会产生不同长度的3’荧光标记片断，在电泳中它们因位移率不同而分开。因而，可基于此原理进行序列测序。

本发明所述的生产酒石酸及其盐的方法，可以利用本发明所述微生物采用常规的步骤、装置和条件进行。

本发明应用本领域常用的鉴定菌株的细菌学特征的方法来鉴定菌株CGMCC No.1756，其细菌学特征优选为下述的一种或多种：革兰氏染色阳性；菌体在生长过程中，其形态经历由培养初期呈杆状到短小杆状，后期呈球状的多形态变化；无芽孢。

定义

本发明中所用的术语为本领域常用的术语，具有本领域技术人员通常所理解的含义。

1.摩尔收率

摩尔是物质的量的单位，符号为mol，是国际单位制7个基本单位之一。摩尔是一系统物质的量，该系统中所包含的基本微粒数与12g¹²C的原子数目相等。使用摩尔时基本微粒应予指明，可以是原子、分子、离子及其他粒子，或这些粒子的特定组合体。

以摩尔为单位的物质的收率称为摩尔收率。

2.比旋光度

能使透过物质的偏振光的振动面旋转一定的角度，称为旋光度，以α表示。能使偏振光的振动面按顺时针方向旋转，为右旋光性物质，旋光度为正值。能使偏振光的振动面按逆时针方向旋转，为左旋光性物质，旋光度为负值。量度旋光度的仪器为旋光仪。同一种旋光性物质在不同条件下测定α值时，所得的结果也不一样。但如固定实验条件，则测得的物质的旋光度即为常数，它能反映该旋光性物质的本性，叫做比旋光度，以[α]表示。

附图简述

附图1：显示的是测序的原理；

附图2：DNA Marker 3％Agrose电泳图；

附图3：网上BLAST分析的结果；

附图4：显示CGMCC No.1756的16s rDNA测序图；

附图5：CGMCC No.1756测序结果序列比对的结果；

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明。下面的实施例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。

实施例1微生物CGMCC No.1756的16s rDNA的测序

一.基因组DNA抽提

所用的试剂盒为购自VIOGENE的Blood&Tissue Genomic DNA ExtractionKit。具体抽提步骤如下：

1.收集达到10⁹对数生长期的细菌(或者达到3ml培养物)，在7,500rpm(5,000xg)离心10分钟收集沉淀；

2.将沉淀重新悬浮在200微升溶菌酶反应溶液(20mM Tris-HCl，pH8.0；2mM EDTA；20mg/ml溶菌酶)中；

3.在37℃温育30分钟；

4.添加20微升蛋白酶K和200微升EX Buffer到样品中；通过涡旋20秒将其立即混匀；

5.在60℃温育30分钟以裂解细菌细胞，温育期间每5分钟通过涡旋或倒置来混合样品；

6.同时，在70℃预热10mM Tris-HCl(pH9.0)，ddH₂O，或TE缓冲液以用于DNA洗脱。

7.添加210微升无水乙醇(absolute ethanol)或异丙醇到步骤4中获得的样品中，并涡旋混匀。

8.将B/T基因组DNA微型柱(Genomic DNA Mini Column)置于收集管(Collcction Tube)上，将所有的混合物(包括所有的沉淀)在不接触边缘(rim)下移液到柱中。在8,000rpm(6,000xg)下离心2分钟。将柱置于新的收集管中。

9.用0.5ml WS Buffer通过在8,000rpm(6,000xg)下离心2分钟洗涤柱两次。离心后弃去flow-through。

10.再将柱全速离心2分钟以除去乙醇残留物。

11.将柱置于新的1.5-ml管。用200微升预热的洗脱液洗脱DNA。

12.将柱直立1-5分钟，并离心1-2分钟以洗脱DNA。

13.将洗脱的DNA于4℃或-20℃储藏。若经常使用，则可在4℃储存DNA。

二.PCR扩增

PCR扩增中所使用的引物：

10F：5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’(SEQ ID NO：2)；

1500R：5’GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3’(SEQ ID NO：3)；

反应体系如下：

DNA	10Xbuffer	MgCl₂(25mM)	DNTP(2.5mM)	F-引物(20UM)	R-引物(20UM)	Ex-taq(5U/μl)	H₂O	体积
DNA	10Xbuffer	MgCl₂(25mM)	DNTP(2.5mM)	F-引物(20UM)	R-引物(20UM)	Ex-taq(5U/μl)	H₂O	体积	1μl	2.5μl	1μl	1μl	0.5μl	0.5μl	0.25μl	18.25μl	25μl

反应条件：

将经过上述程序所得的PCR产物按照如下程序进行鉴定。

三.PCR产物鉴定、割胶纯化

所用的标记物是DNA Marker DL2000，Code D501A，Lot CD3401，得自TaKaRa公司。

割胶所用的试剂盒是北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的小量胶回收试剂盒。

1.割下含DNA的琼脂糖块，使它尽可能小。放入1.5ml离心管中。

2.按每100mg琼脂糖加入300微升溶胶液的比例加入溶胶液，置50℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化。每2分钟颠倒混匀一次。

3.将溶化后的Agarose液移入吸附柱，离心30秒。倒掉收集管中液体，再将吸附柱放入收集管。

4.在吸附柱中加入500微升漂洗液，离心15秒。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管。

5.在吸附柱中加入500微升漂洗液，静置1分钟后，离心15秒。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管。

6.高速离心1分钟。

7.将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30微升洗脱液，静置1分钟后，离心1分钟。将1.5ml离心管(DNA)贮存于-4℃。

四.测序

1.测序所用引物：

10F：5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’(SEQ ID NO：2)

1500R：5’GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3’(SEQ ID NO：3)

16SFW1：5’TAA CTG TTC AGG TAT TGA CG 3’(SEQ ID NO：4)

共3个测序反应。

2.测序反应步骤：

(1)按照样品板(sample sheet)将需要进行反应的样品和引物排列好；

(2)取8联PCR反应管，在96孔板上排列好。为避免将反应管弄混，在排列时请注意将96孔板的缺角置于右上方，同时8联管也可以根据管壁上标明的数字使其全部按照相同的方向排列；

(3)加入模板DNA 1～3微升到PCR反应管底部。所有的样品加完后，可以仔细检查反应管的底部，确定所有样品都已加好后，再进行下面的步骤。PCR产物模板的使用量由琼脂糖电泳看到的条带亮度确定；

(4)5％甘油水溶液补充体积到12微升；

(5)加入4微升3.2pM测序引物；

(6)加入4微升BigDye terminator；

(7)上PCR仪，通用引物循环条件如下

(8)将产物进行酒精二次沉淀纯化：

1.每一反应管中加入25微升NaAc/酒精溶液(3N NaAC 2.5ml+EOH37.5ml)，混匀后在台式离心机(SORVALLR RT 7)上4℃以4000rmp离心30min；倒置96孔板，垫干净吸水纸，离心不大于800rmp时停机；

II.再在每管中加入70％冻酒精(-20℃保存)50或100微升，4000rmp离心15min；倒置96孔板，垫干净吸水纸，离心不大于800rmp时停机；

III.重复第2步1次；

IV.将沉淀好的DNA产物加入25微升的去离子甲酰胺(来自ABi公司)。

(9)上3700DNA分析仪跑电泳，进行序列分析：

其中所用仪器：

GeneAmpR PCR System 9700(PE Applied Biosystems)

SORVALLR RT 7(酒精沉淀时冷冻离心)

3700DNA Analysis System (PE Applied Biosystems)

3.BLAST分析

(1)登陆网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/选择BLASTn。

(2)在弹出窗口的文本框中输入拼接后的菌种序列，点击BLAST按钮。

(3)在随后出现的页面中点击Format按钮。

(4)在BLAST结果网页中分析鉴定菌种。

对本发明获得的微生物菌株的基因组进行如上所述的DNA抽提、PCR扩增16S rDNA、PCR产物纯化、测序(运用ABI 3700测序仪)，并与数据库Blast比对，结果表明该菌株16S rDNA序列与红球菌USA-AN012(Rhodococcus sp.USA-AN012)DNA序列一致，但本发明分离获得的红球菌具有将顺式环氧琥珀酸及其盐水解为L(+)-酒石酸及其盐的特性，因此，该微生物菌株被确认为是红球菌USA-AN012的又一个新种命名为红球菌USA AN-012 BK-98(Rhodococcus sp.USA-AN012 BK-98)。该菌株已经于2006年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.1756。

实施例2利用顺式环氧琥珀酸二钠和本发明所述的CGMCC No.1756菌株生产L(+)-酒石酸

将培养24小时的上述红球菌CGMCC No.1756的斜面接种于装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养24小时，吸取10ml上述种子液接种于装有200ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30℃振荡培养24小时，逐渐向三角瓶中加入顺式环氧琥珀酸二钠35克，经72小时振荡培养和反应后，加入CaCl₂水溶液，过滤和水洗沉淀得46克酒石酸钙，再经硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干得到L(+)-酒石酸25克，摩尔收率为84.76％。经分析该L(+)-酒石酸的比旋光度为

含量为99.75％。

实施例3利用顺式环氧琥珀酸钙和本发明所述的CGMCC No.1756菌株生产L(+)-酒石酸

将培养24小时的上述红球菌CGMCC No.1756的斜面接种于装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养24小时，吸取10ml上述种子液接种于装有200ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30℃振荡培养24小时，向三角瓶中加入顺式环氧琥珀酸钙35克，经100小时振荡培养及反应后，过滤水洗得35克酒石酸钙，再经硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干得到L(+)-酒石酸16克。摩尔收率为80.5％。经分析该L(+)-酒石酸的比旋光度为

含量为99.78％。

实施例4利用顺式环氧琥珀酸二钠和由κ-卡拉胶包埋的本发明所述的CGMCC No.1756菌株细胞生产L(+)-酒石酸

将培养24小时的上述红球菌CGMCC No.1756的斜面接种于装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养24小时，吸取10ml上述种子液接种于装有200ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30℃振荡培养24小时。离心收集菌体，用κ-卡拉胶包埋得到固定化红球菌CGMCCNo.1756生物催化剂100克。将此100克固定化红球菌CGMCC No.1756生物催化剂放入1000ml 1.0M的顺式环氧琥珀酸二钠的溶液中，37℃反应40小时后，过滤回收生物催化剂。过滤液中加入CaCl₂水溶液，经搅拌后过滤洗涤沉淀，得225克L(+)-酒石酸钙。将该酒石酸钙加硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干得到L(+)-酒石酸120克，摩尔收率为80％。经分析该L(+)-酒石酸的比旋光度为

含量为99.6％。

将回收的固定化生物催化剂再放入1000ml 1.0M的顺式环氧琥珀酸二钠的溶液中，37℃反应40小时后，过滤回收生物催化剂。过滤液中加入CaCl₂水溶液，经搅拌后，过滤洗涤沉淀得235克酒石酸钙。将该酒石酸钙加硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干得到L(+)-酒石酸125克，摩尔收率为83.33％。经分析该L(+)-酒石酸的比旋光度为

含量为99.80％。

该固定化生物催化剂可以反复使用。

综上可知，本发明分离获得的红球菌具有将顺式环氧琥珀酸及其盐水解为L(+)-酒石酸及其盐的特性。

生物材料保藏

依据布达佩斯条约的条款，下述的生物材料已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，100080)，给出了下述的保藏号：

保藏物(Deposit)	保藏登记号	保藏日期
保藏物(Deposit)	保藏登记号	保藏日期	红球菌USA AN-012 BK-98(Rhodococcus sp.USA -AN012BK-98)	CGMCC No.1756	2006年7月13日

可以理解的是，上面的描述仅是本发明的示例，因而本发明权利要求所保护的范围并不仅仅以此处公开的特定实施方案来限定。任何等同的实施方案将被认为在本发明的范围之内。事实上，根据前面的描述，对本发明进行有关的修改和变化对于本领域技术人员来讲都将是可能的，因而，这种修改和变化也将落在本发明所附的权利要求的范围之内。

序列表

<110>杭州宝晶生物化工有限公司

<120>生产L(+)-酒石酸及其盐的方法以及该方法中所用的微生物菌株

<130>C06P0107

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1422

<212>DNA

<213>红球菌菌种USA-AN012

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>2

agagtttgat cctggctcag 20

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>3

ggttaccttg ttacgactt 19

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>4

taactgttca ggtattgacg 20

Claims

1.一种微生物，其特征在于具有将顺式环氧琥珀酸或其盐转化为L(+)-酒石酸或其盐的能力，并且该微生物的特征还在于其具有选自下述的一个或多个特征：革兰氏染色阳性；菌体在生长过程中，其形态经历由培养初期呈杆状到短小杆状，后期呈球状的多形态变化；无芽孢。

2.权利要求1的微生物，以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3为引物，PCR扩增16S rDNA，运用ABI 3700测序仪测序，测序引物为SEQ ID NO：4，并与数据库Blast比对，其16S rDNA的序列具有SEQ ID NO：1所示的序列。

3.权利要求1或2中所述的微生物菌株，其为红球菌。

4.权利要求1-3中任一项所述的微生物菌株，其为具有保藏号CGMCC No.1756的红球菌。

5.一种生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，该方法包括将权利要求1-4中任一项所述的微生物菌株与顺式环氧琥珀酸或其盐接触。

6.权利要求5所述的方法，其中所述的顺式环氧琥珀酸盐为顺式环氧琥珀酸二钠或顺式环氧琥珀酸钙。

7.权利要求1-4任一项所述的微生物在生产L(+)-酒石酸或其盐中的用途。

8.权利要求1-4中任一项所述的微生物的突变体及其生物培养物，其能将顺式环氧琥珀酸或其盐转化为L(+)-酒石酸或其盐。

9.一种生物催化剂，其包括权利要求1-4中任一项所述的微生物。