CN103756936A - 一种双头菌及其生产l(+)-酒石酸或其盐的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种双头菌(Labryssp.BK-8)，该菌株的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7396，命名为：双头菌(Labryssp.)BK-8，保藏日：2013年4月1日。本发明提供的双头菌菌株，通过水解将顺式环氧琥珀酸或其盐生成L(+)-酒石酸或其盐。从而为获得L(+)-酒石酸或其盐提供了新的渠道。

Description

一种双头菌及其生产L(+)-酒石酸或其盐的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种双头菌及其在制备L(+)-酒石酸或其盐中的用途。
背景技术
酒石酸，又称2,3-二羟基丁二酸或2,3-二羟基琥珀酸，是一种α-羧酸。1769年瑞典化学家Carl Wilhelm Scheele最早在葡萄汁酿酒过程中发现了L(+)-酒石酸的存在。L(+)-酒石酸广泛存在于自然界中，特别是葡萄和罗望子果中，是最廉价的光活性酒石酸，被称为“天然酒石酸”，是重要的食品添加剂、医药拆分剂、印染防染剂、照相显影剂、金属离子屏蔽剂，广泛应用于医药化工及食品工业中。微生物转化法是目前L(+)-酒石酸生产的主流方法，即以顺酐为原料，通过水解和环氧化反应变为顺式环氧琥珀酸或其盐，然后加入含顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物，转化为L(+)-酒石酸或其盐。
目前已报道的产L(+)-酒石酸的菌种有：假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、棒杆菌属(Coryncbacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、红球菌属(Rhodococcus)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)。但未见利用双头菌(Labrys)生产L(+)-酒石酸的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种双头菌，具核苷酸如SEQ ID NO:1所示，所述双头菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.7396，命名为：双头菌(Labrys sp.)BK-8，保藏日：2013年4月1日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所（邮编：100101）。
本发明的另一个目的是提供所述双头菌在制备L(+)-酒石酸或其盐中的应用，通过以下步骤实现：
将保存于斜面培养基上的双头菌BK-8（CGMCC No.7396）接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养24h，得到所述双头菌菌株的种子液；然后取10ml种子液接种于装有200ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养24h，获得相应的双头菌细胞；接着8000rpm、30min离心收集双头菌细胞，将该双头菌细胞加入到200ml的浓度为1M的顺式环氧琥珀酸或其盐中，30℃振荡培养，反应72h，得到转化液；最后向转化液中加入过量的CaCl2，形成酒石酸钙沉淀，过滤得到沉淀并水洗，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴、阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干得到L(+)-酒石酸或其盐的成品。
顺式环氧琥珀酸盐选用顺式环氧琥珀酸钠或顺式环氧琥珀酸钾。
所用的斜面培养基组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，加水至1000ml，pH7.5。
种子培养基组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加水至1000ml，pH7.5。
产酶培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，顺式环氧琥珀酸钠17.6g，加水至1000ml，pH7.5。
本发明经过长期和深入的研究，从土壤中分离获得了一种新的微生物菌株，该新的菌株经鉴定为双头菌(Labrys)。本发明的双头菌菌株，通过水解将顺式环氧琥珀酸或其盐生成L(+)-酒石酸或其盐。从而为获得L(+)-酒石酸或其盐提供了新的渠道。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步的说明。
在以下实施例中，所用的各种培养基的组成如下：
(1)斜面培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，加水至1000ml，pH7.5。
(2)种子培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加水至1000ml，pH7.5。
(3)产酶培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，顺式环氧琥珀酸钠17.6g，加水至1000ml，pH7.5。
(4)筛选培养基：顺式环氧琥珀酸钠10g，酵母提取物1g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾2g，加水至1000ml，pH7.5。
实施例1：双头菌(Labryssp.)BK-8的筛选
称取1g田园土样品，置于装有25ml筛选培养基的250ml三角瓶中，30℃、250 rpm下振荡培养4天。取一环培养液，并在固体筛选培养基平板上划斜线，30℃倒置培养3天。挑取平板上的单菌落，接种于装有50ml产酶培养基的250ml三角瓶中，30℃、250rpm下振荡培养36h。8000rpm下离心30min，收集细胞，于4℃放置备用。将离心收集的细胞用10ml1MpH8.0顺式环氧琥珀酸钠悬浮，30℃振荡反应3天后，用偏钒酸铵显色法（刘叶青,严文康,周文龙,等.酒石酸的比色测定法.工业微生物,1983,13:32-37.）鉴定反应液中有无酒石酸产生。本发明田园土样品来源于杭州市。
本发明总共对875个菌株进行了筛选，得到了一株具有将顺式环氧琥珀酸或其盐水解为L(+)-酒石酸或其盐特性的菌株，经CGMCC证明存活。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏登记号为CGMCCNo.7396，命名为：双头菌(Labryssp.)BK-8，保藏日：2013年4月1日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所（邮编：100101）。
实施例2：双头菌(Labryssp.)BK-8的鉴定
步骤1：变性
在斜面培养基中挑取双头菌(Labrys sp.)BK-8CGMCC No.7396于10ul无菌水中，变性后离心取上清作为模板。变性条件为：99℃,10min。
步骤2：PCR扩增
使用细菌16S rDNA PCR鉴定试剂盒（购于TaKaRa公司，货号D310），进行PCR扩增双头菌BK-8CGMCC No.7396的16S rDNA片段。
其中，PCR反应体系为：步骤1所得的变性反应液1μl，PCR Premix25μl，Forwardprimer(20pmol/μl)0.5μl，Reverse primer(20pmol/μl)0.5μl，16S-free H2O23μl，总体积50μl。
PCR反应条件如下所示：
步骤3：PCR产物回收和测序
取10μl步骤2所得的PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购于TaKaRa公司，货号DV805A）切胶回收目的片段，并以16S Forward、16SInternal和16S Reverse为引物进行DNA测序（TaKaRa公司）。测序结果显示，双头菌BK-8CGMCC No.7396的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，即本发明的双头菌具有SEQ IDNO:1所示的16S rDNA序列。
将上述实施例1中得到的具有SEQ ID NO:1所示的16S rDNA核苷酸序列，用BLAST程序在NCBI数据库中进行比对分析，其比对结果如表1所示。比对结果显示，所测试的菌株属于双头菌属（Labrys）。
表1双头菌BK-8CGMCC No.7396的16S rDNA序列的BLAST比对结果
Figure BDA0000455232550000032
Figure BDA0000455232550000041
实施例3：利用顺式环氧琥珀酸钠和双头菌BK-8CGMCC No.7396生产L(+)-酒石酸
在本实施例中，所用的产酶培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，顺式环氧琥珀酸钠17.6g，加水至1000ml，pH7.5。
本实施例中，样品的红外光谱用Nicolet-Nexus670傅立叶转换式红外光谱仪检测；样品的核磁共振氢谱和碳谱用Bruker Avance DMX500核磁共振仪检测；样品的质谱用BrukerEsquire3000plus质谱仪检测；样品的旋光度用WZZ-2B旋光仪检测。
先将双头菌BK-8CGMCC No.7396的菌株保藏在斜面培养基上；然后将斜面培养基上的双头菌BK-8CGMCC No.7396接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养24h，得到双头菌BK-8CGMCC No.7396的种子液。吸取10ml上述双头菌BK-8CGMCCNo.7396的种子液接种于装有200ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养24h，以获得相应的双头菌细胞。8000rpm、30min离心收集双头菌细胞，将该双头菌细胞加入到200ml的浓度为1M的顺式环氧琥珀酸钠中，30℃振荡培养，反应72h，得到转化液。向转化液中加入过量的CaCl2，对产物进行过滤，将过滤得到的沉淀进行水洗得到48g酒石酸钙，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干得到28g固体产物。经红外光谱、紫外光谱、核磁共振谱、质谱检测，确定该固体产物为酒石酸。经旋光度检测，该固体产物的比旋光度为证明该固体产物为右旋型酒石酸，即L(+)-酒石酸，且纯度为99.9%。
实施例4：利用顺式环氧琥珀酸钾和双头菌BK-8CGMCC No.7396生产L(+)-酒石酸
本实施例中，产酶培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，顺式环氧琥珀酸钾20.8g，加水至1000ml，pH7.5。
本实施例中，样品的红外光谱用Nicolet-Nexus670傅立叶转换式红外光谱仪检测；样品的核磁共振氢谱和碳谱用Bruker Avance DMX500核磁共振仪检测；样品的质谱用BrukerEsquire3000plus质谱仪检测；样品的旋光度用WZZ-2B旋光仪检测。
先将双头菌BK-8CGMCC No.7396的菌株保藏在斜面培养基上；然后将斜面培养基上的双头菌BK-8CGMCC No.7396接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养24h，得到双头菌BK-8CGMCC No.7396的种子液。吸取10ml上述双头菌BK-8CGMCCNo.7396的种子液接种于装有200ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养24h，以获得相应的双头菌细胞。8000rpm、30min离心收集双头菌细胞，将该双头菌细胞加入到200ml的浓度为1M的顺式环氧琥珀酸钾中，30℃振荡培养，反应72h，得到转化液。向转化液中加入过量的CaCl2，对产物进行过滤，将过滤得到的沉淀进行水洗得到47g酒石酸钙，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴和阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干得到27.5g固体产物。经红外光谱、紫外光谱、核磁共振谱、质谱检测，确定该固体产物为酒石酸。经旋光度检测，该固体产物的比旋光度为
Figure BDA0000455232550000052
证明该固体产物为右旋型酒石酸，即L(+)-酒石酸，且纯度为99.9%。
综上可知，本发明的双头菌BK-8CGMCC No.7396具有将顺式环氧琥珀酸或其盐水解为L(+)-酒石酸或其盐的特性。
需要说明的是，本发明所述的顺式环氧琥珀酸盐可以是上述的顺式环氧琥珀酸钠或顺式环氧琥珀酸钾，还可以是顺式环氧琥珀酸钙等其他顺式环氧琥珀酸的盐。

Claims (7)

1.一种双头菌菌株，其特征在于: 所述双头菌菌株的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示, 所述双头菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.7396，命名为：双头菌(Labrys sp.)BK-8，保藏日：2013年4月1日。
2.根据权利要求1所述的一种双头菌菌株在制备L(+)-酒石酸或其盐中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：将保存于斜面培养基上的双头菌BK-8 CGMCC No.7396接种于装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养24h，得到所述双头菌菌株的种子液；然后取10ml上述双头菌的种子液接种于装有200ml产酶培养基的1000ml三角瓶中，30℃、200rpm振荡培养24h，获得相应的双头菌细胞；接着8000rpm、30min离心收集双头菌细胞，将该双头菌细胞加入到200ml的浓度为1M的顺式环氧琥珀酸或其盐中，30℃振荡培养，反应72 h，得到转化液；最后向转化液中加入过量的CaCl2，形成酒石酸钙沉淀，过滤得到沉淀并水洗，再对酒石酸钙依次进行硫酸酸解、阴、阳离子交换柱精制、浓缩、结晶、分离和烘干得到L(+)-酒石酸或其盐成品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所用的斜面培养基组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠 10g，琼脂粉15g，加水至1000ml，pH7.5；
种子培养基组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠 10g，加水至1000ml，pH7.5；
产酶培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠 10g，顺式环氧琥珀酸钠 17.6g，加水至1000ml，pH7.5。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，顺式环氧琥珀酸盐选用顺式环氧琥珀酸钠或顺式环氧琥珀酸钾。
6.根据权利要求1所述的一种双头菌菌株的制备方法，其特征在于，通过以下步骤获得：称取1 g田园土样品，置于装有25 ml筛选培养基的250 ml三角瓶中，30℃、250 rpm下振荡培养4天，取一环培养液，并在固体筛选培养基平板上划斜线，30℃倒置培养3天，挑取平板上的单菌落，接种于装有50 ml产酶培养基的250 ml三角瓶中，30℃、250 rpm下振荡培养36 h，8000 rpm下离心30 min，收集细胞，于4℃放置备用，将离心收集的细胞用10 ml 1 M pH8.0顺式环氧琥珀酸钠悬浮，30℃振荡反应3天后，用偏钒酸铵显色法鉴定反应液中有无酒石酸产生；其中产酶培养基的组成同权利要求4所述。
7.根据权利要求6所述的一种双头菌菌株的制备方法，其特征在于，筛选培养基为：顺式环氧琥珀酸钠 10g，酵母提取物1g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾 2g，加水至1000ml，pH7.5。
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