CN101200766B - 检测乳腺癌易感基因突变的多重pcr试剂盒及其制备方法 - Google Patents

检测乳腺癌易感基因突变的多重pcr试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测乳腺癌易感基因第11外显子突变的多重PCR试剂盒及其制备方法。该试剂盒PCR扩增引物由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所组成的引物对1以及SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所组成的引物对2所组成。本发明多重PCR试剂盒结合SSCP技术以及DNA银染可以同时筛查BRCA1基因的第11外显子和BRCA2的第11外显子的突变情况，具有敏感性强，准确率高等优点，且方法简便、快速，对于乳腺癌的早期发现或预测有重要意义。

Description

检测乳腺癌易感基因突变的多重PCR试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种检测乳腺癌易感基因(BRCA1和BRCA2)的第11外显子突变的多重PCR试剂盒，本发明还涉及该多重PCR试剂盒的制备方法及检测方法，属于医学分子生物学领域。
背景技术
乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于肺癌而位居第二位，且发病率呈直线上升趋势。在我国沿海经济较发达地区，尤其在京、津、沪三大城市的部分地区中，乳腺癌发病率已居于女性恶性肿瘤的首位；西欧和北美经济发达地区的妇女中，乳腺癌是一种主要的死亡原因。
乳腺癌的自然病程以临床前期最长，约占疾病全程的2/3。早期癌中多数尚未出现明显包块或肿块较小，此时治疗效果较好。有研究表明，乳腺癌原发灶越小，预后越好。T4、T3、T2、T1期乳腺癌的10年生存率分别为19.7％、46.0％、62.6％、87.8％直径小于1cm的微小癌，其10年总体生存率在90％～99％。由此可见，早期诊断和早期治疗是降低乳腺癌死亡率的关键。因此，对乳腺癌发病率的早期评估，早期诊断及早期治疗等方面的研究应引起医护人员的高度重视。
遗传性乳癌发病前的危险度诊断评估：当知道家系中存在BRCA1、BRCA2的基因变异时，可通过调查家系成员是否继承变异基因，而可在发病前对乳癌危险度进行诊断评估，基因检查的结果，如果确定了继承变异基因，则可以通过多次检查，早期发现、治疗乳癌，检查结果如为阴性，则可将病人从患遗传性乳癌的精神紧张状态中解放出来。
乳腺癌和卵巢癌易感基因(breast and ovarian cancer susceptibility gene，BRCA)变异与乳癌密切相关，现在认为，遗传性乳癌的40％-70％是由BRCA1或BRCA2的基因变异引起，推测伴卵巢癌的乳癌家系约有80％是由BRCA1的异常引起，而几乎所有伴男性乳癌的乳癌家系都是由BRCA2的异常引起。
BRCA1基因(breast and ovarian cancer susceptibility gene)1990年定位于17q21，1994年克隆成功，并被确认为乳腺癌和卵巢易感基因，全长估计100kb，编码22个外显子，其完整的cDNA全长7.8kb，基因产物为含1863个氨基酸，有一锌指结构的蛋白，BRCA2基因定位于13q12-13，由10254个核苷酸组成，包含26个外显子，半数编码序列包含在第11外显子，编码蛋白含3418个氨基酸，Gayther等发现BRCA2基因第11外显子3.3kb区域发生突变的家庭成员乳腺癌患病率高，因此，此区域被成为乳腺癌聚集区，尽管BRCA1、BRCA2在结构上有某些相似之处，但目前没有证据表明二者有同源性。
BRCA1是迄今发现与乳腺癌发生最重要的易感基因之一，在调节细胞周期进程。DNA损伤修复，细胞生长与凋亡及转录活化与抑制等多种生物学途径都起重要作用，BRCA1还是某些特异靶基因的转录调控子，BRCA1突变会导致细胞基因组不稳定，对环境变化的敏感性增加，近年来，国内对乳腺癌BRCA1基因进行了一些研究。
在BRCA1基因中，第11个外显子长3.4kb，BRCA1编码的全部1863个氨基酸中，第11外显子编码了61％的氨基酸，所以外显子11的研究文献众多。BRCA1突变主要位于第11外显子，占全基因突变率2/3。
BRCA2是继BRCA1之后发现的另1个遗传性乳腺癌/卵巢癌易感基因，Wooster等1995年将其定位于人类染色体13q12-13，BRCA2基因全长70kb，mRNA长11385bp，有27个外显子，属于抑癌基因，正常BRCA2基因参与DNA双链损伤修复，维持DNA的完整性，促进DNA损伤细胞的凋亡，抑制细胞癌变，BRCA2基因的突变会导致所编码的蛋白质截断，使BRCA2蛋白失去修复损伤DNA的能力，DNA损伤后难以修复，则可积累引起细胞癌变，BRCA2突变基因携带者一生患乳腺癌的风险高达70％-90％。
目前，BBCA2基因的突变类型已检测出100多种，其中最常见的突变区域在第11外显子，Tobias等对92例患卵巢癌的犹太人进行的BRCA2基因突变研究显示，BRCA2基因6的11外显子的突变占30％。
聚合酶链反应(PCR)—单链构象多态性(SSCP)DNA银染分析方法，可用来检测DNA中的微小碱基变化，多重PCR可同时检测出多段基因。PCR-SSCP方法能快速、灵敏地检测基因突变和多态性，通过对遗传性乳腺癌组织进行BRCA1基因第11外显子和BRCA2基因第11外显子的多重PCR扩增，可更全面准确的评估患乳腺癌的发病风险。
发明内容
本发明针对目前乳腺癌的高发病率及乳腺癌越早诊断治愈率越高的现状，提供一种新的多重PCR试剂盒，该多重PCR试剂盒能够准确、快速的检测出乳腺癌易感基因是否产生突变，进而根据检测结果能够推测或评估检测者可能患上乳腺癌的风险程度，为预防或治疗提供依据。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种检测乳腺癌易感基因是否产生突变的多重PCR试剂盒，包括：25mMMgCl2，2mM dNTPs，PCR反应缓冲液，耐热DNA聚合酶，多重PCR扩增引物和双蒸水；其中所述的多重PCR扩增引物
由引物对1和引物对2组成；其中，引物对1由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所组成，引物对2由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所组成。
优选的，本发明多重PCR检测试剂盒的组分还可包括阳性对照和阴性对照；其中，所述的阳性对照是指BRCA1第11外显子和BRCA2第11外显子阳性对照；所述的阴性对照是指BRCA1第11外显子和BRCA2第11外显子阴性对照。
所述的试剂盒中，上述各种组分的最低包装量是进行一次多重PCR反应的最低用量，该最低用量可参考以下用量：25mM MgCl2 2μl；2mM dNTPs 2.5μl；反应缓冲液2μl；3U/μl耐热DNA聚合酶0.3μl；50pmol引物对1 0.5μl；50pmol引物对2 0.5μl；ddH2O 17.2μl。
在此用量的基础上，本领域的技术人员可根据实际需要，将各组分的包装量相应的增多，例如：PCR反应缓冲液的包装量可以是：PCR反应缓冲液0.002-10ml，dNTPs 0.025-10ml，25mmol/L的MgCl2 0.002ml-10ml；耐热DNA聚合酶0.3μL-1500μL；引物对0.5μL-1500μL；引物对2 0.5μL-1500μL，双蒸水20μL-100mL；BRCA1第11外显子阳性对照15μl-5mL，BRCA2第11外显子阳性对照15μl-5mL，BRCA1第11外显子阴性对照15μl-5mL，BRCA2第11外显子阴性对照15μl-5mL。
本发明多重RT-PCR检测试剂盒中的各种组分都可从商业途径购买得到，所用到的引物都可采用自动DNA合成仪合成得到。
本发明多重PCR检测试剂盒的应用方法如下：按照常规方法提取待检测样品的DNA模板；进行多重PCR扩增反应；将PCR扩增产物经2％琼脂糖电泳鉴定；其中，BRCA1第11外显子为981bp、BRCA2第11外显子为97bp；将PCR扩增产物通过SSCP和DNA银染分析、鉴定BRCA1和BRCA2的基因是否发生了突变，其基本过程是：将用本发明试剂盒扩增得到的特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；用适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后通过银染显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。
其中，所述的多重PCR扩增反应条件优选如下：
(1)反应体系：样品模板1μl，25mM MgCl2 2μl，2mM dNTPs 2.5μl，反应缓冲液2μl，3U/μl耐热DNA聚合酶0.3μl，50pmol引物对1 0.5μl，50pmol引物对2 0.5μl，用双蒸馏水补至25μl；
(2)PCR扩增条件：95℃变性5min，后进入主循环94℃变性1min，55℃复温1min，72℃延伸1min，共40个循环，然后72℃延伸7min，4℃保存。
运用本发明多重PCR检测试剂盒可以准确、快速的检测出乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2是否产生突变，具有敏感性强，准确率高等优点，且方法简便、快速，避免了复杂的手续，对于乳腺癌的早期发现有重要意义。
附图说明
图1  PCR扩增产物经2％琼脂糖电泳结果；
图2  BRCA1第11外显子SSCP检测结果(左起第二泳道可见到异常条带)。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
实施例1、本发明多重PCR试剂盒的制备和组装
一、引物对1和引物对2的设计及配制
引物对1：BRCA1 F：5-TAC CCAGTT GGT TGATTT CC-3(SEQ ID NO：1)
         R：5-CTC ACACAG GGGATC AGC ATT C-3(SEQ ID NO：2)
引物对2：BRCA2 F：5-GGG AAG CTT CAT AAG TCA GTC-3(SEQ ID NO：3)
         R：5-TTT GTAATG AAG CAT CTG ATA CC-3(SEQ ID NO：4)
采用自动DNA合成仪合成，稀释为50pmol/μl。
二、试剂盒的组装
10×PCR反应缓冲液0.002-10ml，dNTPs 0.025-10ml，25mmol/L的MgCl20.002ml-10ml；耐热DNA聚合酶0.3μL-1500μL；引物对0.5μL-1500μL；引物对20.5μL-1500μL，双蒸水20μL-100mL；BRCA1第11外显子阳性对照15μl-5mL，BRCA2第11外显子阳性对照15μl-5mL，BRCA1第11外显子阴性对照15μl-5mL，BRCA2第11外显子阴性对照15μl-5mL。
其中，10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTPs，耐热DNA聚合酶均购于Takara公司；阳性对照和阴性对照购于中国药品生物制品检定所。
试验例1  本发明多重PCR试剂盒的临床应用试验
(一)、检测标本：
所检测的标本均为哈尔滨肿瘤医院病理科存档蜡块，其中遗传性乳腺癌210例患者。(所检测的210例标本均为哈尔滨肿瘤医院病理科存档蜡块，其中遗传性乳腺癌患者102例。)
(二)、检测方法：
1、DNA抽提：
用上海生工生物有限公司生产的DNA抽提试剂盒(SK201)提取样品基因组DNA；将每份蜡块包埋标本切成厚10μm的薄片5片，置115ml的离心管中，经二甲苯脱蜡，无水乙醇除去残存的二甲苯，真空抽干。用上海生工生物有限公司生产的DNA抽提试剂盒(SK201)提取基因组DNA，用紫外分光光度计测定DNA含量后，4℃保存备用。
2、PCR扩增：
(1)一次PCR扩增反应的反应体系如下：
待检样品cDNA 1μl；25mM MgCl2 2μl；2mM dNTPs 2.5μl；反应缓冲液2μl；3U/μl耐热DNA聚合酶0.3μl；50pmol引物对1 0.5μl；50pmol引物对2 0.5μl；用ddH2O补至25μl。
(2)PCR反应条件：置PCR扩增仪中，95℃变性5min，后进入主循环94℃变性1min，55℃复温1min，72℃延伸1min，共40个循，然后72℃延伸7min，4℃保存。
3、PCR扩增产物经2％琼脂糖电泳鉴定，结果见图1，其中电泳后扩增片段的特异性条带分别为BRCA1第11外显子981bp、BRCA2第11外显子97bp。
4、SSCP及DNA银染：
取PCR产物10μl，加甲酰胺变性上样液10μl(含0.2ml乙二胺四乙酸0.5ml；0.1％溴酚蓝10mg；0.1％二甲苯青10mg；去离子甲酰胺10ml)，吹打混均，置98℃水浴10min后，立即置于0℃水中，使双链DNA变性为单链DNA，并保持在单链状态。采用15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将20μl样品全部上样，70V恒压电泳24h。采用常规方法银染，固定、银染、显色后照相，分析结果。
(三)、检测结果：多重PCR试剂盒对BRCA1第11外显子和BRCA2第11外显子的检测结果。试验结果见图1和图2。
BRCA1第11外显子出现突变14例，突变率6.67％，BRCA2第11外显子出现突变35例，突变率16.67％。
同时，对所有样品PCR产物胶回收、测序。测序结果为BRCA1第11外显子出现突变14例，突变率6.67％，BRCA2第11外显子出现突变37例，突变率17.6％。测序结果与多重PCR试剂盒检测结果比对，多重PCR试剂盒对BRCA1第11外显子的检测符合率100％，BRCA2第11外显子的检测符合率94.5％。
美康序列表
序列表
<110>美康生物技术研究所
<120>检测乳腺癌易感基因突变的多重PCR试剂盒及其制备方法
<130>KLP0866
<160>4
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
tacccagttg gttgatttcc       20
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
ctcacacagg ggatcagcat tc    22
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>3
gggaagcttc ataagtcagt c    21
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>4
tttgtaatga agcatctgat acc  23

Claims (2)

1.一种检测乳腺癌易感基因BRCA1第11外显子和BRCA2第11外显子突变的多重PCR试剂盒，该多重PCR试剂盒包括：25mM MgCl2，2mM dNTPs，PCR反应缓冲液，耐热DNA聚合酶，多重PCR扩增引物和双蒸水；其特征在于：所述的多重PCR扩增引物由引物对1和引物对2组成，其中，引物对1由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所组成，引物对2由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所组成。
2.按照权利要求1的多重PCR试剂盒，其特征在于：各种组分的最低包装量是至少进行一次多重PCR反应的最低用量；所述的各组分的最低用量是：25mMMgCl2 2μl，2mM dNTPs 2.5μl，PCR反应缓冲液2μl，3U/μl耐热DNA聚合酶0.3μl，50pmol引物对10.5μl，50pmol引物对2 0.5μl，用双蒸馏水补至25μl。
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Patentee before: Beijing Compulife Biotech Research Center

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20080618

Assignee: NANJING MOKOBIO BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.

Assignor: BEIJING MOKOBIO BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER CO., LTD.

Contract record no.: 2014990000876

Denomination of invention: Multiple PCR reagent kit detecting breast cancer susceptibility gene mutation and preparation method thereof

Granted publication date: 20120606

License type: Exclusive License

Record date: 20141121

LICC Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model
C56 Change in the name or address of the patentee
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 100070, Beijing, Fengtai District, No. 188 South Fourth Ring Road headquarters base, No. 15, zone 5, building 8

Patentee after: BEIJING MOKOBIO LIFE SCIENCE CO., LTD.

Address before: 100070, Beijing, Fengtai District, No. 188 South Fourth Ring Road headquarters base, No. 15, zone 5, building 8

Patentee before: BEIJING MOKOBIO BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER CO., LTD.