CN101194159A - 微观元素多参数分析设备和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种分析微观元素的设备(DA)，这种设备包括：第一，需分析的微观元素的测量空间(CM)；第二，至少一个提供在测量空间(CM)内联合在一起的射线的光源(S)，所述射线具有至少两个不同的分析波长，用来与测量空间(CM)内的微观元素交互作用，以形成交互作用射线；第三，在测量空间(CM)的上游用不同的码对射线进行编码的编码装置(M)；第四，对荧光和/或扩散的交互作用射线根据它们的波长进行选择性滤波的滤光装置(FO)；第五，将来自测量空间(CM)的交互作用射线的至少一部分变换成电信号的检测装置(DE，DF)；以及第六，包括对电信号进行解码的解码装置(DRE，DRE)的分析装置(MA)，用来确定表示所分析的微观元素的数据。

Description

微观元素多参数分析设备和方法

技术领域

本发明涉及微观元素分析领域，具体地说，涉及用光对微观元素进行表征和计数的设备。

在这里，“微观元素”是指任何外形尺寸极微小的元素，特别是生物微粒或细胞(原核细胞和真核细胞)。

背景技术

在活体外诊断领域(值得注意的是血液计数或流式血细胞计数)中，常规是使用基于光与各种构成样本的微观元素之间的交互作用的表征和计数设备，以便获得这些微观元素的定性和定量信息。

在广泛使用的技术中，可以特别提到的有包括透射、衍射、反射和折射的称为散射技术和包括发荧光和发磷光的称为光致发光的技术。它们可以获得特别是形状、体积、大小、颜色、密度、结构、生化性质和/或粒度分布的单独或组合信息。

然而，用流式血细胞计数这种普通的技术得到的生物元素特别是血球的表征基于有限的变量和细胞鉴别可能性。

每个测量原理是比较简易的物理方法，而同时进行多重测量导致可能干扰以后的测量的交互作用，使得以后的测量无法使用。因此，实现多个测量受到避免这些交互作用的能力的限制。

在市场上现有的血液分析器和流式血细胞计数器中，元素通常用称为Wallace Coulter方法的阻抗测量的电子方法或光学方法(散射、光致发光)检测。

例如，体积和折射率可以根据单个波长和两个不同的观测角度从散射分析结果推断。这种检测模式例如可参见TECHNICON仪器公司的专利US 4,735,504。在这个专利中所揭示的光学系统使用对在两个不同角度范围内衍射的光的测量，使各元素的体积和折射率可以通过将它们的光响应与在体积和折射率上标定的元素的光响应相比较分离出来。这些数据值的处理基于由Gustav MIE开发的球状颗粒光散射原理，在网址<http://en.wikipedia.org/wiki/Mie_scattering>处有值得注意的说明。

在流式细胞计中，普遍接受的是，对在接近光轴(FSC(“前向散射”)或轴上衍射)的角度范围内的衍射的测量可以得到所分析的微观元素的体积的指示。此外，与光轴正交散射(或“侧向散射”，或者是以90°散射)的光表示了元素的内部结构。这些特征与进行测量的角度和波长密切相关。

注意到发荧光是在可激励分子受到波长为它的特征波长之一的光能激励后返回到基态时所出现的现象。发射的荧光始终出现在比激励频率低的频率。荧光发射基本上是无方向性的。通常不在入射光的激励轴上进行测量，通过滤波器发送给检测器的只是所关心的光谱频带。

在荧光中所使用的分子探针(probe)可以是对特定类型的微粒有内在亲和力的活体或离体活体染料。可以特别提到的是核酸的添加染料，诸如橙噻唑、O槐黄、Y二苯氧芑胺之类，或者由附有染色标志(通常是单一或纵列荧光染料，或者有时是纳米晶体)的抗体组成的免疫探针。

这种通过实现免疫探针进行标记的模式对于细胞识别特别是按照上面所说明的流式细胞计技术进行细胞识别已经非常普遍。Ortho诊断公司的专利EP 0022670揭示了用流式细胞计识别各种细胞(通过它们的抗原决定基)的情况。这个专利中所揭示的技术打开了非常广泛地开发现在公认为有效、安全和可靠的细胞识别技术的免疫表现的大门。

然而，可以执行多参数细胞学分析而不使用抗原性识别。因此，在文献“采用荧光染料着色和流式仪器的复合血细胞计数和分类”(“Combined Blood Cell Counting Blood Cell Counting andClassification with Fluorochrome Stains and Flow Instrumentation”，J.of Histochem.Cytochem Vo 124.No.1，pp.396-411，1976)中，Howard M.Shapiro揭示了用执行吸收、衍射和荧光测量的多参数细胞计进行的对血细胞的一般分类，其中使这些元素与核酸和蛋白质的特定荧光染料的混合物接触。

同时，增加分析器内的荧光测量波长允许使用更多的标记，从而使用更多的抗体，如John A.Steinkamp在文献“流式细胞计多色荧光测量的模块化检测器”(“A Modular Detector for Flow CytometricMulticolor fluorescence”，1987，Cytometry 8：353-365)中所指出的那样，但是也大大增大了设备和实现它们的复杂性。

使用由单一波长激励的复合染料很快就呈现出一些由于它们的激励和/或它们的荧光发射的光谱重叠而引起的限制。

为了克服光谱重叠的这些问题，通常使用称为“补偿”的校正方法，这些方法都包括减小所分析的微观元素的与其他微观元素光谱重叠的部分的荧光信号，如在文献“流式细胞计的光谱补偿：显形膺象、局限性和注意事项”(“spectral compensation for FlowCytometry：Visualization Artifacts，Limitations and Caveats”，MarioRoederer 2001，Cytometry 45，pp.194-205)中所指出的那样。

补偿所引起的一个问题是以平均值来计算这些补偿，而且对于一组给定的荧光染料来说补偿值计算不能一劳永逸。确实，同属于一族的荧光染料的物理性质变化范围很宽，值得注意的是取决于供货源。同样的产品来自不同厂家的因此就会导致不同的补偿设置。这在诊断方面就特别成问题，因为供货源的失控会导致错误的因此可能是危险的测量结果。例如，为了接受如在值得注意的Carleton C·Steward和Sigrid J.Stewart的论文“四色补偿”(“Four color compensation”，Cytometry，Vol.38，pp.161-175，1999)中所说明的决定性的软件补偿，PE-TR转移的效率和所使用的抗体的特性都不够稳定。

使用几个激励波长可以更宽地选择需敞开的染料，并且可以更容易地使发射光谱分开。不同的激励波长在测量槽内经常是空间分开的，在这种情况下提供了进行几个独立测量的优点，如J.Steinkamp在论文“经改善的用于细胞和微粒分析和分类的多激光器/多参数流式细胞计”(“Improved multilaser/multiparameter flow cytometer foranalysis and sorting of cells and particles”，John A.Steinkamp，Robert C.Habbersett，and Richard D.Hiebert；Review of ScientificInstruments Vol 62(11)pp.2751-2764，November 1991)中所揭示的。这种方法的问题是，空间错位导致响应中的时间相移，而重新调整信息必须在下游通过以模拟方式延迟信息或者通过用软件措施重新调整测量结果来实现。

增加激励波长(特别是激光源)连同荧光和其他光参数的测量结果导致实现中工艺复杂和明显困难，例如在论文“使用3激光器流式细胞计的9色11参数免疫表现”(“Nine Color Eleven ParameterImmunophenotyping Using Three Laser Flow Cytometry”，MartinBigos 1999，Cytometry 36，pp.36-45)中所揭示的那样。

判读结果中出错的风险随着参数的增加而增加，而使用这些仪器需要非常专业的技术人员，而且要冒着得到会是不适当和错误的因而可能是危险的结果的风险。

补偿的一个限制是它的临界状况随着荧光染料的数目而增加，这与荧光测量结果中的噪声和用来校正原始测量结果的荧光测量结果的线性组合的传播和放大有关。

发明内容

由于还没有已知的分析设备是完全满意的，因此本发明的目的是改善这种情况。具体地说，本发明用来克服在现有技术中通常遇到的补偿的问题。

为此，本发明提供了一种分析微观元素的设备，这种设备包括：

·第一，用于需分析的微观元素的测量空间；

·第二，至少一个提供具有至少两个不同的分析波长、用来与测量空间内的微观元素交互作用以便形成交互作用辐射的辐射的光源；

·第三，负责将来自测量空间的交互作用辐射的至少一部分变换成电信号的检测装置；以及

·第四，负责分析电信号以确定表示所分析的微观元素的数据的分析装置。

在这里，“交互作用辐射”是指由于分析光束与需分析的微观元素之间的交互作用而引起的辐射。这种交互作用辐射值得注意的是可以是由于散射(折射、反射、衍射)和/或光致发光(荧光、磷光)而引起的辐射。

此外、在这里，“辐射”是表示波长在紫外到红外之间的范围内也就是说大约在100nm(0.1μm)到5000nm(5μm)之间的光束。

按照本发明，这种设备的特征是：

-它的编码辐射在测量空间内联合在一起；

-它包括i)负责在测量空间的上游以不同的码对辐射进行编码的编码装置，以及ii)负责在检测装置上游对荧光和/或散射交互作用辐射根据它的波长进行选择性滤波的滤光装置；以及

-它的分析装置包括负责对电信号进行解码的解码装置，以便根据它们原来的码进行分析。

在这里、“编码”是指在分析辐射光束(Ri)与微观元素相互作用前将码(ωi)施加到分析辐射光束(Ri)上的操作，以便产生本身包括这个原来的码的交互作用辐射。特别是，可以将码(ωi)选择成对每个分析辐射光束进行脉冲调制。

这些脉冲可以是同步的，也可以异步的。在同步脉冲的情况下，所有的波长同时与需分析的微观元素交互作用。在异步脉冲的情况下，这些波长相继与需分析的微观元素交互作用。滤光装置设计成使得对于给定的荧光染料组和给定的编码类型可以不用执行补偿。

按照本发明所设计的设备可以包括一些可以分别或以复合形式取得的辅助特征，值得注意的是：

·它的滤光装置可以负责对波长属于一些分别处在两个分析波长之间和超过最长的分析波长的荧光分析频带的荧光交互作用辐射进行选择性滤波；

·它的编码装置可以负责对分析的辐射在强度上进行周期性和/或正弦编码；

·它的编码装置的至少一部分可以在提供辐射的输出端的上游对光源进行操作，而这个部分可以集成在光源内；

·它的编码装置的至少一部分可以在源的下游对辐射进行操作，以形成分析辐射；

·它的编码装置可以对源所提供的辐射用例如声光调制器进行调制，以形成分析辐射；

·光源可以包括至少两个单色型的(如果需要的话)和/或至少一个发光二极管，它的分析辐射在测量空间内联合在一起。作为一种变型，光源也可以包括一个基本上连续的多色光光源，诸如多色激光器、白炽灯或弧光灯之类；

·光源可以按照连续模式和/或脉冲模式提供分析辐射；

·光源所提供的每个分析辐射光束的强度可以是可调的；

·它的检测装置可以包括多个专用于检测分析辐射作用于需分析的微观元素上所引起的交互作用辐射(表示散射和荧光过程)的光敏传感器。作为一个变型，检测装置可以包括多个专用于检测表示散射过程的交互作用辐射的光敏传感器，植入在由与分析辐射在测量空间内的总体传播方向相交的轴限定的位置，这个轴定向成相对总体方向成在从0°到360°的范围内的角度；

·它的分析装置可以根据从对表示散射过程的交互作用辐射的变换得到的信号推断一种所分析的微观元素的折射率。具体地说，在微观元素属于血液样本时，值得注意的是分析装置可以确定红血球内的血红蛋白含量或白血球的胞浆内蛋白含量；

·它的分析装置可以根据由于分析辐射与两种发光媒介(或荧光染料)之间的交互作用而产生的信号推断表示具有不同波长的两种发光媒介之间的能量转移的耦合度。

本发明还提供了一种分析微观元素的方法，这种方法包括：

·第一步骤，其中用在测量空间内联合在一起的具有至少两个不同的分析波长和按照不同的所选码编码的分析辐射照射放置在测量空间内的微观元素以便形成交互作用辐射；

·第二步骤，其中收集交互作用辐射的至少一部分，根据它的波长对它进行分离和滤波；

·第三步骤，其中检测经滤波的交互作用辐射，将它变换成电信号；以及

·第四步骤，其中对检测到的信号根据它们原来的码进行解码，以便确定表示所分析的微观元素的数据。

按照本发明所设计的方法可以包括一些可以分别或以组合形式得到的辅助特征，值得注意的是：

·在第一步骤，可以将分析辐射相继或同时加到需分析的微观元素上；

·在第一步骤，还可以对分析辐射的强度进行正弦调制；

·在第二步骤，可以对波长属于一些分别处在两个分析波长之间和超过最长的分析波长的荧光分析频带的荧光交互作用辐射进行选择性滤波；

·在第四步骤，可以根据从对表示散射过程的交互作用辐射的变换得到的信号推断一种所分析的微观元素的折射率。具体地说，在微观元素属于血液样本时，值得注意的是可以确定红血球内的血红蛋白含量或白血球的胞浆内蛋白含量；

·在第四步骤，可以根据由于分析辐射与两种发光媒介(荧光染料)之间的交互作用而产生的信号推算表示具有不同波长的两种发光媒介之间的能量转移的耦合度。

本发明特别适合(虽然是非限制性的)活体外诊断领域(特别要提到的是流式细胞计)和对液体中任何微观单元的分析。特别要提到的是它可适用于生物、生化、化学、微粒形态分析，具体地说，可适用于多参数流式细胞计、对液体或气态流体中带电粒子和粒子大小分布的分析。

附图说明

从以下结合附图所作的详细说明中可以清楚地看到本发明的其他一些特征和优点，在这些附图中：

图1A示意性地在功能上示出了按照本发明所设计的光学分析设备的第一示范性实施例，而图1B示意性地在功能上示出了按照本发明所设计的光学分析设备的第二示范性实施例，其中若干光源能产生可以在测量空间(CM)内联合在一起的辐射；

图2A示出了可以加到光辐射上同时照射的正弦编码的例子，图2B示出了相继二进制编码的例子，而图2C示出了周期性重复图2B中二进制编码的信号的形式；

图3为示出荧光染料的与三个分析波长(λ1至λ3)相应的三个吸收光谱(SA1至SA3)和这些荧光染料的三个荧光光谱(SF1至SF3)的示意图；

图4示意性地示出了分析设备的处在测量槽的上游的部分的示范性实施例，其中调制器是声光型的；

图5示意性地示出了分析设备的处在测量槽下游的用来检测和分析荧光的部分的示范性实施例；以及

图6为可以根据分析波长为488nm和976nm的散射截面Cext确定血球血红蛋白的体积和浓度的等体积和等浓度曲线的示意图。

这些附图不仅能用来实现本发明而且在必要情况下有助于清晰地理解本发明。

具体实施方式

首先参见图1A和1B，对按照本发明所设计的光分析设备DA的两个示范性的实施例进行说明。

以下，所考虑的是设备DA用于流式细胞计内对血样本内的微观元素进行表征和计数。然而，本发明并不局限于这种样本也不局限于流式细胞计。实际上它涉及任何类型的需通过荧光和/或光散射进行光学分析的微观元素，特别是液体或生物样本内的微粒。

如在图1A和1B中示意性地在功能上所示出的那样，按照本发明所设计的分析设备DA至少包括：

·测量空间CM，有时称为测量槽(或测量区域，甚至也称为测量窗)，需分析的样本的微观元素就放在(或通过)那里；

·一个(或几个)负责提供具有至少两个不同的分析波长λ1至λn在测量空间(CM)内联合在一起的辐射Ri的光源S，[在图1A的情况下，用单个光源来提供几个波长，而在图1B的情况下，用三个光源各按规定提供一个波长，在这里认为图1B中的不同的光源形成了辐射源的子部件]；

·至少负责对每个波长λi的辐射光束Ri用特定代码ωi编码(调制)的编码装置M(在这里i＝1至n，例如n＝2或3)，它可以由控制模块MC控制，编码例如是图2A至2C所示的那种，

·滤光装置FO，负责对来自测量空间CM在可能与微观元素交互作用后产生的交互作用辐射进行选择性滤波，优选的是，交互作用辐射的波长都属于一些分别处在两个分析波长λi与λi+l之间的荧光分析频带，除了最后一个(即最长的波长)，它处在超过最长的分析波长λn之外；

·包括光敏传感器(或光敏器件)的检测装置DF和/或DE，负责将来自测量空间的在可能与微观元素交互作用后产生的荧光和/或散射交互作用辐射的至少一部分变换成电信号，以及

·包括至少解码装置DRF和/或DRE的分析装置MA，负责对检测装置DF和/或DE发送给它的电信号进行解码，以便根据它们的码ωi分析它们，从而可以确定表示所分析的微观元素的数据。

重要的是注意到分析设备DA可以执行荧光和/或散射分析。因此，取决于不同情况，分析设备DA可以配置成：

·或者是，具有与带有所关联的解码装置DRF的专用于荧光DF的检测装置配合的滤光装置FO，而没有专用于散射DE的检测装置和所关联的解码装置DRE；

·或者是，具有与带有所关联的解码装置DRF的专用于荧光DF的检测装置配合的滤光装置FO和与专用于散射DE的检测装置和所关联的解码装置DRE配合的滤光装置FO；

·否则就是，具有专用于散射DE的检测装置和所关联的解码装置DRE，但没有滤光装置FO也没有用于荧光DF的检测装置和所关联的解码装置DRF。

在分析设备DA专用于流式细胞计或计数时，它的测量槽CM(或测量空间)可以为称为“带有通量耦合”的类型，诸如在专利文献FR2653885所说明的。

在图1A所示的例子中，光源S负责产生单个由n个波长分别为λ1至λn(n≥2)的辐射光束Ri叠加在一起组成的光束。在图1B所示的例子中，三个光源S各负责产生由一个波长为λi(λ1、λ2或λ3)的辐射光束Ri(R1、R2或R3)组成的单个光束。

每个光束的强度标为Ii，可以调整到预定值。这例如可以将一组荧光染料(或荧光化合物)在受到波长为λi、强度为Ii的分析辐射Ri激励时的荧光强度设置在一个预定级。量子荧光效率很高的荧光染料组(例如为对于某些诸如橙噻唑之类的分子探针的情况)还可以用低强度激励。相反，在具有相同的量子效率的荧光染料同时用来标记相同的细胞上受到不同表示的抗原时，各种荧光染料所发射的荧光强度可以通过调整它们各自的分析辐射光束的强度近似地加以补偿。

由于这可以控制微观元素的荧光强度，因此这种光源S也称为光“合成均衡器”。

还可以由编码装置对n个强度为Ii的辐射光束Ri中的每个辐射光束在强度上进行周期性和/或正弦编码。这种编码过程，例如为图2A至2C所示的类型，是确定性的，因为它允许通过解码装置DRE和/或DRE多路分离由于与所分析的微观元素的交互作用而引起的辐射(特别是由于发荧光和/或散射的机制引起的)。

在光源S包括诸如半导体激光器或发光二极管之类的激光器时可以通过对注入电流进行操作实现编码，于是调制器M就是能提供表示加到每个辐射光束上的码的电流的电流产生器。在编码为正弦编码时，值得注意的是这种编码就是确定调制频率ωi，下面将对这种情况的各种经验设想进行说明。

调制器M的输出端有n个可能选来在测量空间内联合在一起的波长为λi强度为Ii的辐射光束Ri。在正弦编码的情况下，光强度Ii(以W/m²表示)由附录中的式A1给出。

n个辐射Ri的光束由在测量(或计数)空间内的光学装置(未示出)聚焦，这些光束在测量空间内与先前按照熟悉该技术的人员所知的任何技术标记和/或染色的微观元素(在这里为生物细胞)交互作用。

图3示出了三种假设的与三个分析波长λ1至λ3相应的荧光染料的三个吸收光谱SA1至SA3以及荧光检测装置DF检测到的这三种荧光染料的三个荧光光谱SF1至SF3。B1至B3标示了滤光装置FO允许通过的三个波长带(频带)。

在这里类型不同的荧光染料限于三种，以便说明。然而，本发明并不局限于这个数字。实际上本发明可以应用于任何给定多种的荧光染料。

按照本发明，如从图3中可以看到的那样，与第一荧光染料的荧光光谱SF1的最大值相应的频带B1处在分析波长λ1与λ2之间，与第二荧光染料的荧光光谱SF2的最大值相应的频带B2处在分析波长λ2与λ3之间，而与第三荧光染料的荧光光谱SF3的最大值相应的频带B3处在超过分析波长λ3(是这三个波长中最长的波长)处。

优选的是，对于每个频带Bi，有一个相应的荧光检测器DFi。

对吸收光谱SAi和荧光光谱SFi的分析可以写出检测器(n＝3)所给出的(光电)信号与荧光染料量之间的矩阵方程：[PMo]＝I₁[C][Q]+I₂[D][Q]+I₃[B][Q]。

这里，[PMo]为荧光检测器DFi(n＝3)所给出的光电信号矩阵，下标o表示在没有能量转移的情况下的荧光信号。[C]、[D]和[B]为计算荧光光束的转移矩阵。[Q]为以摩尔数表示的(n＝3)荧光染料量Q1至Q3的矩阵。

转移矩阵[C]、[D]和[E]的系数c_ij、d_ij和e_ij分别由附录中式A2、A3和A4给出。

考察对矩阵[PMo]的分解和所关联的系数表明，不用将测量信号进行线性组合就可以确定各个克分子浓度Qi。采用前面提到的书写协定，克分子浓度Qi由附录中的式A5至A7给出。在这三个式A5至A7中，项PMi(ωi)表示代码ωi的特性。

这个特性例如可以是在由分析光脉冲的持续时间限定的时间间隔内的信号的峰值振幅或甚至均方根值，或者也可以是诸如荧光衰减时间之类的信号时间特性。不用将测量结果线性组合直接确定荧光染料的克分子浓度Qi提高了结果的精度，因此也就提高了诊断的准确性。

这样一来，为了确定给定荧光染料的克分子浓度就不用进行补偿(线性组合各个信号)。本发明的稳固性可以避免干涉效应，从而就不用补偿，因此比迄今所用的常规方法更为可靠和更为稳固。

本发明还可以确定与“授体”荧光染料与“受体”荧光染料之间的能量(荧光)转移相应的两种荧光染料(或荧光化合物)之间的耦合度。确定了两种荧光染料之间的耦合，就可以度量抗原决定基之间的距离或它们的物理关联。

考虑到上面所给定的书写协定，在有能量转移的情况下的各个荧光信号的表达式由附录中的式A8至A10给出。

下面将解析地说明前两种荧光染料之间的能量转移的情况。在这种情况下，由附录中的式A8至A10给出的各个光电信号的表达式可改写为附录中的式A11至A13的形式。这是由于只有系数κ₁₂和ρ₁₂需要考虑，而其他的系数κ_ij和ρ_ij都取为等于1。

考虑到式A2至A7，就可以从附录中的式A11和A12得出附录中的三个表达式A14至A16。然后，通过从式A14至A16中消去克分子浓度Q1至Q3，就可以确定前两种荧光染料之间的能量转移参数κ₁₂。这个能量转移参数κ₁₂的公式由附录中的式A17给出。

在前两种荧光染料之间有能量转移的情况下的克分子浓度Q1于是可以改用附录中的式A18所示的形式表示。在前两种荧光染料之间有能量转移的情况下的克分子浓度Q2和Q3于是由附录中的式A6和A7给出。

重要的是注意到上面和附录中所给出的这些公式可以扩展到也考虑第一与第三荧光染料之间和/或第二与第三荧光染料之间有能量转移的情况。

在图4中，示出了按照本发明所设计的分析设备DA的上游部分，其中光源S向调制器M提供宽带光(辐射)，而调制器M选择分析波长和在强度上对相应辐射进行编码。

这里，宽带光(或白光，或多色光)用脉冲激光器L得到，被注入微结构光纤OF。这种光源S例如为由本申请人在论文“用原来的多波长泵激系统在普通色散光纤内连续产生白色光”(“White-lightsupercontinuum generation in normally dispersive optical fiber usingoriginal multi wavelength pumping system”，Optics Express，vol.12，No.19，September 2004)中所揭示的。

用作微结构光纤OF的泵的激光器L可以例如用工作在反向置偏模式状态(例如脉冲重复频率为50MHz)的铷掺杂或镱掺杂的光纤激光器代替，后面接有能提供与以微结构光纤OF的非线性相互作用方式激励一致的通量的光放大器。

这种光源S所发出的多色光与白炽灯的不同，它的空间相干性极强(连续光谱的所有光子都以相同的空间模式发射)。

当然，也可以设想其他类型的光源S。因此，光源可以包括至少两个耦合激光器(可以是单色型的)和/或至少一个发光二极管。它也可以包括其他类型的基本上连续的多色光源，诸如白炽灯或弧光灯之类。

来自微结构光纤OF的光束通过聚焦光学系统O1用反射折射型组合(镜)调节成具有正确的色差或零色差。这个光束聚焦到调制器M上，调制器M呈现为声光单元的形式，优选的是它的角色差通过节距修改成以布拉格(Bragg)入射角衍射的衍射光栅的空间叠加得到校正。

通过叠加由振动单元维持的声波形成这些衍射光栅，振动单元是压电型的，由能支持n个调制信号m_i(t)＝M_icos2πω_it的电信号供电，这些调制信号包括在附录中给出受调强度I_i(t)的式A1内。

这样的声光调制器M例如是由A-A光电子公司销售的那种。

这里，声光调制器M由能同时产生(至少)3个音频(f1、f2、f3)的电子控制器SF控制，而电子控制器SF本身由控制模块MC(它可以形成为包括控制软件接口的计算机系统的一部分)控制。音频频带例如在80MHz到150MHz之间的范围内。这些频率选择成使得在光束的连续光谱内可以选择三个(在所说明的这个例子中)准单色辐射光束，例如波长等于488nm(蓝色)、570nm(黄色)和976nm(红外)。对这三个辐射光束的均衡通过调整声信号的强度实现。声强度越高，声光调制器M内的衍射效率也越高。也就是说，可以将光量从0衍射级调整到+1衍射级(通过调整声信号的强度)。

准单色辐射在这里是指所发射的光在光谱频带内在宽度上在1到50nm之间的范围内。

重要的是注意到光源S和调制器M的所有参数可以都是用控制模块MC(例如为计算机类型的)远程可调的。因此，光源S的所有参数，诸如各个分析波长和相应的分析辐射强度之类，都可以由操作员通过软件接口选择。

调制器M的输出端发出的分析辐射Ri例如由光学系统O2调节成在测量槽(或空间)CM内聚焦。

调制频率ωi根据诸如生物细胞通过测量空间CM的速度、稀释液、测量空间CM的光学窗的尺寸、分析设备DA的采集部件(滤光装置FO、检测器DE和/或DF)的带宽之类的各个参数选择。

例如，如果需分析的生物细胞以1m/s左右的速度通过具有半高度宽度为30μm左右的高斯外形的辐射的分析光束，将产生基本上为高斯形状的持续时间基本上等于30μs的交互作用辐射(荧光或散射(消光))脉冲。频谱于是为高斯形状的，它的半高度高度基本上等于0.3/30μs，或者说10kHz左右。为了避免电子串扰现象，优选的是选择两个相继的调制频率ωi和ωi+1之间至少相距100kHz。例如，可以选择ω1等于100kHz，ω2等于200kHz，而ω3等于300kHz。

如果液流通过的持续时间为5μs而不是30μs，每个交互作用辐射脉冲占据200kHz左右的频带，因此调制频率必须隔开至少这个特征频率：例如，ω1＝1MHz，而ω2＝1.5MHz。

应注意的是可以设想其他类型的调制器M。值得注意的是，调制器M可以至少部分可集成在光源S内，或者至少部分设置在光源S的下游。调制器M也可以至少部分设置在光源S的上游，例如用来控制对光源S供电的电流。

分析设备DA的上面结合图4所说明的处在测量槽CM上游的部分可以与图1A或1B中所例示的这种的下游部分耦合。在这种情况下，交互作用辐射中由于散射引起的部分到达检测器DE，在那里被变换成电信号，供分析模块MA处理。

在图1A中，检测器DE例示性地示为平均方向离分析辐射在测量空间CM内的总体传播方向45°左右。然而，这个平均方向的角度可以根据所需的信息类型取在0°到360°的范围内的任意给定值。

检测器DE将这些光电信号发送给分析模块MA的解码器(或解调器)DRE，以对它们解码。这个解调器DRE例如配置成一些滤波(解码)级，例如为模拟型的。作为一种变型，光电信号可以是经数字化的，而滤波(解码)操作可以以数字方式实时执行或者通过后处理(记录后再处理)执行。

解调器DRE的输出端上有三个散射信号SE(λ1＝488nm)、SE(λ2570nm)和SE(λ3＝976nm)。散射信号SE(488nm)和SE(976nm)的值可以用来确定散射截面C_ext(488nm)和C_ext(976nm)，这两个散射截面是确定红血球的折射率和体积所需要的。

将散射信号变换成截面是例如通过标定程序用在折射率和体积上经标定的微珠实现的。这些微珠可以例如由乳液构成或来自乳状液。

交互作用辐射的由荧光引起的部分通过信号调整光阵列后再到达滤光装置FO。交互作用辐射于是被过滤出一些波长，因此只保全了波长属于n(在这里n＝3)个检测频带Bi的交互作用辐射。

在图1A中，荧光检测装置DF全部在同一位置组合在一起。在这种情况下，滤光装置FO形成一个多频带滤波器。

如图5中所示，可以用分离装置LS将荧光交互作用辐射在频谱上分离成至少两个部分。为此，可以使用例如分光板LS，它可以是两色型的。因此，规定了(至少)两个荧光检测和分析信道，使得在第一信道上可以得到来自第一荧光染料的经滤波器FO1滤波的处在第一滤波频带B1内的荧光信号，而在第二信道上可以得到来自第二荧光染料的经滤波器FO2滤波的处在第二滤波频带B2内的荧光信号。

图5所示的设备例如可以用于计量核酸(RNA+DNA)和检测膜抗原。

在这里用波长λ1和λ2分别为488nm和560nm的两个分析辐射光束R1(ωl)和R2(ω2)来检测可以分别标记白血球的核酸和膜抗原的两种荧光染料(橙噻唑和PE)的荧光。这两个辐射光束R1(ω1)和R2(ω2)用上面结合图4说明的设备得到。

第一检测频带B1的中心波长为λ3(530nm)。具有例如为30nm的谱宽度，而第二检测频带B2的中心波长为λ4(670nm)，具有例如为40nm的谱宽度。按照本发明，λ3处在λ1与λ2之间，而λ4大于λ2。

经第一滤波器FO1滤波的交互作用辐射到达第一荧光检测器DF1，在那里由光电检测器变换成电信号发送给分析模块MA的第一荧光解码器(或解调器)DRF1，由它按照第一调制频率ω1解调，得出信号PM1(ω1)。

经第二滤波器FO2滤波的交互作用辐射到达第二荧光检测器DF2，在那里由光电检测器变换成电信号发送给分析模块MA的第二荧光解码器(或解调器)DRF2，由它按照第一和第二调制频率ω1和ω2解调，得出信号PM2(ω1)和信号PM2(ω2)。

荧光解调器DRF1和DRF2例如配置成由一些中心为调制频率的Butterworth带通型的滤波级组成的形式。

在前面所提到的激励条件下，荧光染料量(或克分子浓度)Q1和Q2可以用式A5和A6计算，系数c₁₁和d₂₂由A2和A3限定。

克分子浓度Q2可以由第二解调器DRF2用中心处在频率ω2的带通型滤波器从荧光信号PM2中提取。确实，如前面所指出的那样，由于荧光染料之间的光串扰，PM2包括两个频率分量：与经滤波的频率为ω2左右的电脉冲的均方根值或峰峰值相应的PM2(ω2)和与光串扰相应的PM2(ω1)。因此，PM2＝PM2(ω1)+PM2(ω2)。这两个由附录中的式A15和A16给出的频率分量PM2(ω1)和PM2(ω2)可以用一个简单的中心处在频率ω2的带通滤波器分开。

克分子浓度Q1可以直接从等于PM1(ω1)的荧光信号PM1中提取。

在不包括分离装置LS的配置中，情况与κ₁₂＝1的相应，单个荧光检测器PM得出的信号由式A19给出，它可以改写为附录中的式A20。由附录中的式A11和A12给出的信号PM(ω1)和PM(ω2)可以通过解调从信号PM中提取。

式A21可以用来计算Q2，将Q2代入式A22就可以确定Q1。

上面所说明的例子可以扩展到任意多种具有任意给定复杂程度的光串扰的荧光染料。

在第二个示范性应用中，按照本发明所设计的分析设备DA可以测量包含在需测量的全血样本内的细胞的折射率。在红血球菌株的情况下，认为这个折射率表示了血球血红蛋白的浓度。

确实，从光学上来看，红血球由厚度为7nm左右、折射率接近1.46的“双层类脂”膜组成。细胞内的内容含有一些水相分解的固体化合物，其中有血红蛋白(～34g/dl)、盐(～0.7g/dl)和少数有机化合物(～0.2g/dl)。

可以将折射率写成由式A23给出的形式。

浓度(以mmol/dl计)可以等于质量浓度(g/dl)，因为血红蛋白的摩尔量是已知的(M＝66 500g/mol)。在红血球内分解的血红蛋白为12pg。这导致平均浓度为33g/dl，或5mmol/l。

在全血的情况下，血红蛋白的测量结果必须用血球比率因子校正，血球比率因子对于男性约在40％到55％之间，而对于女性约在35％到45％之间。这个血球比率因子取为等于0.42(平均值)；例如，5mmol/l的血球血红蛋白的平均浓度对于根据全血得到的测量结果来说全血红蛋白的平均浓度就为2.1mmol/l。

考虑到上述情况和式A23，红血球的折射率可以写成：

对于分析波长为980nm的情况，n(980nm)＝1.34+0.0019*Hb(血球浓度g/dl)，以及

对于分析波长为488nm的情况，n(488nm)＝1.35+0.0016*Hb(血球浓度g/dl)。

这些公式的有效范围取为血球血红蛋白浓度(以g/dl计)从25到50g/dl。

分析波长等于980nm和488nm的折射率的虚部在数值上可以用下式确定：

κ(980nm)＝1.47*10^-5*Hb，以及

κ(488nm)＝3.7*10^-5*Hb。

血球的血红蛋白浓度可以用在两个波长处的衰减系数的测量结果确定。为此，可以使用A.G.Borovoi所开发的几何途径，它可以用来计算近似球状的红血球的散射截面C_ext，表示式由附录中的式A24给出。

可以构成图6所例示的这种等体积和等浓度曲线图，用来根据对于不同分析波长(在这里，为488nm和976nm)的散射截面C_ext确定血球的血红蛋白的浓度。在这个图中，对于每一对测量结果C_ext(488nm)和C_ext(976nm)相应有一个给出血红蛋白浓度和体积的球面。

得到血红蛋白含量和对它的监视可以是特别有用的。值得注意的是监视贫血和缺铁症的情况。在由于生长激素治疗(“r-Hu EPO治疗”)引起的高脊髓消耗期间，平均血球血红蛋白负荷对监视确实特别有用。在细胞治疗中监视网状红血球和它们的血红蛋白内容也可以是有用的，如Carlo Brugnara在文献“缺铁症和红血球生成：新的诊断法”(“Iron Deficiency and Erythropoiesis：New Diagnostic Approaches”，Clinical Chemistry 49：10，2003，pp.1573-1578)中所指出的那样。

由于有了本发明，现在能同时执行血红蛋白含量测量(通过散射测量)和其他测量(通过荧光测量)，而它们之间不会有干扰，从而减少了由于处理模式而引起差错的风险。

在这种情况下，血红蛋白内容可以有益地通过对红血球内的RNA的使早期的红血球或网状红血球可以与成熟的元素分离的荧光测量完成。可以同时用一个或多个荧光波长来进行附加标记，以作出其他可能的有用特定识别，诸如发现或测试：

·含有胎儿血红蛋白(HbF)的红血球，或

·寄生有疟疾寄生虫的红血球，或

·转铁蛋白(CD 71)受体，或

·glycophorine A(CD 235A)的表现，

如在Hans J.Tanke的论文“网状红血球和成熟红细胞”(“Reticulocytes and Mature Erythrocytes”，Flow Cytometry inHematology，ISBN 0-12-432940-3)中明显说明的那样。

本发明在有核细胞(白血球等)上和在红菌株或血小板元素(标记活化或血小板不成熟)上都有众多应用。

此外，本发明不仅可用于元素存在于血液内或骨髓内的情况，而且还可以适用于任意生物细胞悬浮液，无论它是真核的还是原核的。

在上面的说明中，主要是以分析设备的形式对本发明进行说明的。然而，本发明还可以呈现为可以由所说明的分析设备及其变形实现的分析方法。

这种方法除了流式细胞计外还可以用于活体内或活体外的应用。例如，这种方法可以适用于对细胞表层区(值得注意的是，涂片测试和组织切片)或细胞悬浮液进行扫描的设备。

本发明不局限于上面所说明的光学分析设备和方法的实施例，这些实施例只是例示性的。本发明应包括熟悉该技术的人员在下面所列的权项的范围内可以设想到的所有变形。

附录

$*I_i\left(t\right)=\frac{I_{i0}(1+M_i\cos \left(2\mathrm{\&pi;}{\mathrm{\&omega;}}_{i}t\right)}{2}---\left(A1\right)$

其中，i＝1至n，I_i0为辐射Ri的最大强度，Mi为调制深度(或振幅)(通常在0到1之间的范围内)，ωi为加到辐射Ri上的调制的频率，而t为时间。

^*c₁₁＝α₁₁η₁₁F₁₁    c₁₂＝0              c₁₃＝0    (A2)

c₂₁＝α₁₁η₁₁F₁₂     c₂₂＝α₂₁η₂₁F₂₂    c₂₃＝0

c₃₁＝α₁₁η₁₁F₁₃     c₃₂＝α₂₁η₂₁F₃₂    c₃₃＝α₃₁η₃₁I₃F₃₃

d₁₁＝0 d₁₂＝0           d₁₃＝0    (A3)

d₂₁＝0 d₂₂＝α₂₂η₂₂F₂₂  d₂₃＝0

d₃₁＝0 d₃₂＝α₂₂η₂₂F₃₂  d₃₃＝α₃₂η₃₂F₃₃

e₁₁＝0 e₁₂＝0 e₁₃＝0                (A4)

e₂₁＝0 e₂₂＝0 e₂₃＝0

e₃₁＝0 e₃₂＝0 e₃₃＝α₃₃η₃₃F₃₃

其中，α_ij为分量i在波长λj处的摩尔吸收系数，η_ij为分量i在检测频带Bj内的荧光效率，Fij为与分量i的荧光光谱处在检测频带Bj内的部分有关的在0到1之间的范围内的加权因子，

^*Q₁＝c₁₁ PM1(ω₁)    (A5)

Q₂＝d₂₂ PM2(ω₂)     (A6)

Q₃＝e₃₃PM3(ω₃)      (A7)

^*PM1＝κ₁₂*κ₁₃*PM₁₀                                (A8)

PM2＝κ₂₃*PM₂₀+ρ₁₂(1-κ₁₂)κ₁₃PM₁₀                 (A9)

PM3＝PM₃₀+ρ₁₃(1-κ₁₃)κ₁₃ PM₁₀+ρ₂₃(1-κ₂₃)PM₁₀    (A10)

其中，κ_ij为在0到1之间的范围内的从荧光染料i向荧光染料j的能量转移的恒定现象耦合系数，而ρ_ij为荧光染料j将从荧光染料i转移来的光变换成荧光的量子效率的系数。

^*PM1＝κ₁₂*PM₁₀                   (A11)

PM2＝PM₂₀+ρ₁₂(1-κ₁₂)PM₁₀        (A12)

PM3＝PM₃₀                         (A13)

^*PM1(ω1)＝κ₁₂α₁₁η₁₁I₁F₁₁Q₁    (A14)

PM2(ω2)＝α₂₂η₂₂I₂F₂₂Q₂         (A15)

PM2(ω1)＝α₂1η₂₁I₁F₂₂Q₂+α₁₁η₁₁I₁F₁₂Q₁+ρ₁₂(1-κ₁₂)α₁₁η₁₁I₁F₁₁Q₁(A16)

$*{\mathrm{\&kappa;}}_{12}=\frac{\mathrm{PM}1\left(\mathrm{\&omega;}1\right)[{\mathrm{\&rho;}}_{12}+\frac{F_{12}}{F_{11}}]}{\mathrm{PM}2\left(\mathrm{\&omega;}1\right)+\frac{{\mathrm{\&alpha;}}_{21}{\mathrm{\&eta;}}_{21}{I}_1}{{\mathrm{\&alpha;}}_{22}{\mathrm{\&eta;}}_{22}{I}_2}\mathrm{PM}2\left(\mathrm{\&omega;}2\right)+{\mathrm{\&rho;}}_{12}\mathrm{PM}1\left(\mathrm{\&omega;}1\right)}---\left(A17\right)$

^*Q₁＝(1/κ₁₂c₁₁I₁)PM1(ω1)    (A18)

$*\mathrm{PM}=\{\frac{1}{a_{11}}-\left(\frac{a_{21}}{a_{12}{a}_{22}}\right)\}{\mathrm{PM}}_{01}+\left(\frac{1}{a_{22}}\right){\mathrm{PM}}_{02}---\left(A19\right)$

^*PM＝(a₁₁+a₂₁)Q₁+a₂₂Q₂        (A20)

^*PM(ω₂)＝α₂₂η₂₂I₂F₂₂Q₂     (A21)

^*PM(ω₁)＝α₂₁η₂₁I₁F₂₂Q₂+α₁₁η₁₁I₁(F₁₁+F₁₂)Q₁    (A22)

^*m(Hb，λ)＝n(Hb，λ)-i κ(Hb，λ)    (A23)

其中，n(Hb，λ)＝n₀(λ)+α(λ)*Hb为折射率的实部，n₀(λ)为纯溶剂的折射率，是波长的函数，α(λ)为血红蛋白的折射率特性，是波长的函数，κ(Hb，λ)＝β(λ)*Hb为折射率的虚部，而β(λ)为摩尔吸收系数。

^*C_ext＝πa²Q_ext(A24)

有

$Q_{\mathrm{ext}}=2-4e^{-\mathrm{\&rho;}\tan \mathrm{\&beta;}}\frac{\cos \mathrm{\&beta;}}{\mathrm{\&rho;}}\sin (\mathrm{\&rho;}-\mathrm{\&beta;})-4e^{-\mathrm{\&rho;}\tan \mathrm{\&beta;}}{\left(\frac{\cos \mathrm{\&beta;}}{\mathrm{\&rho;}}\right)}^2\cos (\mathrm{\&rho;}-2\mathrm{\&beta;})+4\left(\frac{\cos \mathrm{\&beta;}}{\mathrm{\&rho;}}\right)\cos \left(2\mathrm{\&beta;}\right),$

m＝n-ik，红血球的折射率，

ρ＝2x(n-1)，给出相位差的参数，

x＝2πa/λ，

a，球的半径，以及

tanβ＝κ/(n-1)。

Claims (27)

1.一种用于分析微观元素的设备(DA)，包括需分析的微观元素的测量空间(CM)；至少一个能提供辐射的光源(S)，所述辐射具有至少两个不同的分析波长，用来与在所述测量空间(CM)内的所述微观元素交互作用以便形成交互作用辐射；用来将来自所述测量空间(CM)的交互作用辐射的至少一部分变换成电信号的检测装置(DE，DF)；以及用来分析所述电信号以确定表示所分析的微观元素的数据的分析装置(MA)；其特征是：

-所述经编码的辐射在所述测量空间(CM)内联合在一起；

-所述设备(DA)包括i)用来在所述测量空间(CM)的上游以不同的码(ωi)对所述辐射进行编码的编码装置(M)，以及ii)用来在所述检测装置(DE，DF)的上游对所述荧光和/或散射交互作用辐射根据它的波长进行选择性滤波的滤光装置(FO，LS)；以及

-所述分析装置(MA)包括用来对所述电信号进行解码的解码装置(DRE，DRF)，以便根据它们原来的代码进行分析。

2.如权利要求1所述的设备，其特征是所述光源(S)所提供的所述分析辐射(Ri)相继加到需分析的微观元素上。

3.如权利要求1所述的设备，其特征是所述光源(S)所提供的所述分析辐射(Ri)同时加到需分析的微观元素上。

4.如权利要求1至3中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述滤光装置(FO，LS)用来对波长属于一些分别处在两个分析波长之间和超过最长的分析波长的荧光分析频带的所述荧光交互作用辐射进行选择性滤波。

5.如权利要求1至4中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述光源(S)包括至少两个能向所述测量空间(CM)提供联合在一起的辐射的激光器。

6.如权利要求5所述的设备，其特征是所述激光器是单色型的。

7.如权利要求1至6中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述光源(S)包括至少一个发光二极管。

8.如权利要求1至4中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述光源(S)包括多色辐射源。

9.如权利要求8所述的设备，其特征是所述多色辐射源(S)从包括至少一个具有基本上连续光谱的多色激光器、白炽灯和弧光灯的组中选出。

10.如权利要求1至9中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述光源(S)用来按照连续模式和/或脉冲模式提供所述分析辐射。

11.如权利要求1至10中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述光源(S)所提供的每个分析辐射光束(Ri)的强度(Ii)是可调的。

12.如权利要求1至11中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述编码装置(M)用来对所述分析辐射进行强度调制。

13.如权利要求1至12中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述编码装置(M)的至少一部分用来在所述光源(S)的下游对辐射进行操作，以形成所述分析辐射。

14.如权利要求1至13中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述编码装置(M)的至少一部分用来在提供分析辐射的输出端的上游对所述光源(S)进行操作。

15.如权利要求14所述的设备，其特征是所述编码装置(M)的所述部分集成在所述光源(S)内。

16.如权利要求1至15中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述编码装置(M)包括能对所述光源(S)提供的所述辐射进行调制以形成所述分析辐射的声光调制器。

17.如权利要求1至16中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述检测装置(DE，DF)包括多个用来检测交互作用辐射的光敏传感器。

18.如权利要求1至16中任一个权利要求所述的设备，其特征是所述检测装置(DE，DF)包括多个用来检测交互作用辐射的光敏传感器，植入在由与分析辐射在约束通路处的总体传播方向相交的轴限定的位置，这个轴定向成相对总体方向成在从0°到360°的范围内的角度。

19.如上述任一个权利要求所述的设备，其特征是所述设备包括具有控制软件接口的计算机系统(MC)。

20.一种分析微观元素的方法，其特征是所述方法包括：

i)第一步骤，其中用在测量空间(CM)内联合在一起的具有至少两个不同的分析波长和按照不同的所选码编码的分析辐射照射所述测量空间(CM)内的微观元素，以便形成交互作用辐射；

ii)第二步骤，其中收集所述交互作用辐射的至少一部分，根据它的波长对它进行分离和滤波；

iii)第三步骤，其中检测经滤波的交互作用辐射，将它变换成电信号；以及

iv)第四步骤，其中对所述检测到的信号根据它们原来的码进行解码，以便确定表示所分析的微观元素的数据。

21.如权利要求20所述的方法，其特征是，在第一步骤，所述分析辐射(Ri)相继加到所述需分析的微观元素上。

22.如权利要求20所述的方法，其特征是，在第一步骤，所述分析辐射(Ri)同时加到所述需分析的微观元素上。

23.如权利要求20至22中任一个权利要求所述的方法，其特征是，在第二步骤，对波长属于一些分别处在两个分析波长之间和超过最长的分析波长的荧光分析频带的所述荧光交互作用辐射进行选择性滤波。

24.如权利要求20至23中任一个权利要求所述的方法，其特征是，在第四步骤，根据从对表示散射过程的交互作用辐射的变换得到的信号推算一种所分析的微观元素的折射率。

25.如权利要求20至24中的任一个权利要求所述的方法，其特征是，在第四步骤，在样本是全血的情况下，根据所述折射率确定红血球菌株的细胞的血球血红蛋白浓度。

26.如权利要求20至25中任一个权利要求所述的方法，其特征是，在第四步骤，根据由于所述分析辐射与两种不同的、空间上很接近的荧光染料之间的交互作用而产生的信号，推算表示所述荧光染料之间的能量转移的耦合度。

27.在从包括生物、生化、化学、微粒、形态分析的组中所选择的领域中，特别是在多参数流式细胞计、对液体或气态流体中的带电粒子和粒子大小分布的分析中，使用如上述任一个权利要求所述的分析设备和方法。

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