KR20080007473A - 미시적 요소들의 다중매개변수 분석을 위한 기기 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미시적 요소들을 분석하기 위한 기기(DA)에 관련하며, 이 기기는, 첫째로, 분석하려는 미시적 요소들을 위한 측정공간(CM), 둘째로, 적어도 2개의 다른 분석파장들을 가지고 상호작용 방사선을 형성하기 위하여 측정공간(CM) 내에서 미시적 요소들과 상호작용하도록 고안된 방사선을 전달하는 적어도 하나의 소스(S), 셋째로, 측정공간(CM) 하류의 방사선들을 서로 다른 코드들로 부호화하는 부호화수단(M), 넷째로, 형광 및/또는 확산의 방사선들을 그것들의 파장들에 따라 선택적으로 필터링하는 광학적 필터링 수단(FO), 다섯째로, 측정공간(CM)으로부터의 상호작용 방사선의 적어도 일부를 전기신호들로 변환하는 검출수단(DE, DF), 그리고, 여섯째로, 분석된 미시적 요소들을 나타내는 데이터가 결정되도록 하기 위해 전기신호들을 복호화하는 복호화수단(DRE, DRF)을 구비한 분석수단(MA)을 포함한다.
Description
본 발명은 미시적 요소들(microscopic elements)의 분석 분야에 관한 것이며, 더 상세하게는 빛을 이용한 미시적 요소들의 특성화 및 카운팅에 전용인 기기들에 관한 것이다.
여기서, "미시적 요소들"은 현미경 치수의 어느 요소 그리고 그 중에서도 생체 미립자들 또는 세포들(원핵생물들 및 진핵생물들)을 의미하는 것으로서 이해된다.
체외 진단(그 중에서도 혈액학적 카운팅 또는 유동 세포 분석법) 분야에서는, 이 미시적 요소들에 대한 정성적 및 정량적 정보를 얻기 위하여, 빛과 시료를 구성하는 각종 미시적 요소들 사이의 상호작용에 기초하여 특성화 및 카운팅 기기들을 이용하는 것이 일반적이다.
널리 사용되는 기법들 중에는 투과, 회절, 반사 및 굴절을 포함하여 산란 기법들로서 알려진 것들과, 형광 및 인광을 포함하여 광발광(포토루미네센스)으로서 알려진 것들이 있다. 그것들은 개별적으로 또는 조합하여 형상, 체적, 크기, 색상, 밀도, 구조, 생화학적 성질 또는 미립자 크기 분포에 관한 정보가 명백히 얻어지게 한다.
유동 세포 분석법(flow cytometry)의 공통적인 기법들로 얻어진 생체 요소들의, 그리고 주로 혈액 세포들의 특성화 정보는 그럼에도 불구하고 제한된 수의 변수들 및 셀 구별 가능성들에 기초하고 있다.
각각의 측정 원리는 비교적 간단한 물리적 방법이지만 이 측정량들의 동시 체배(multiplication)는 그것들을 사용할 수 없게 한다고 해도 좋을 정도까지 측정량들과 간섭할 수 있는 상호작용들을 유발한다. 그래서, 다중 측정의 구현은 이러한 상호작용들을 피하는 능력에 의해 제한된다.
시장에 나와 있는 혈액 분석기들 및 유동 세포 분석기들에서, 미시적 요소들은 월리스 콜터(Wallace Coulter) 법으로 알려진 임피던스 측정 방법에 의해 또는 광학적 방법(산란, 포토루미네센스)에 의해 일반적으로 전자적으로 검출된다.
예를 들면, 체적 및 굴절률이 단일 파장 및 2개의 다른 관측각도들에 기초한 산란 분석의 결과들로부터 추론될 수 있다. 이 검출 방식은 예를 들면 TECHNICON Instruments Corp.사의 미국특허공보 제4,735,504호에 기재되어 있다. 이 특허에 기재된 광학계는 2개의 다른 각도 범위들로 회절되는 빛의 측정들을 이용하고, 그것은 미시적 요소들의 광학적 반응들과 체적 및 굴절률이 교정된 미시적 요소들의 광학적 반응들과의 비교에 의해 미시적 요소들의 체적 및 굴절률 값들이 분리될 수 있게 한다. 이 데이터 값들의 처리는 구스타프(Gustav) MIE에 의해 개발된 구모양 입자에 의한 특히 인터넷 주소 <http://en.wikipedia.org/wiki/Me_scattering>에서 기재되어 있는 광 산란 이론에 기초하고 있다.
유동 세포 분석법에서, 광학적 축에 가까운 범위의 각도들 하의 회절(FSC ("forward scatter"의 경우) 또는 축상(on-axis) 회절의 측정은 분석되는 미시적 요소들의 체적의 표시가 된다. 게다가, 광학 축에 대해 직교하게 산란된 빛(또는 "측면 산란기" 또는 다시 90도 산란함)은 미시적 요소들의 내부 구조를 나타내는 것으로서 설명된다. 이 특성들은 측정들이 행하여지는 각도들 및 파장들에 긴밀하게 연결된다.
형광은 들뜰 수 있는 분자가 그것의 특성 파장들 중의 하나에서 빛 에너지에 의한 들뜸(여기) 후에 바닥 상태로 되돌아갈 때 유도되는 현상이다. 형광 빛의 방출은 들뜸 주파수보다 낮은 주파수에서 발생한다. 형광 방출은 실질적으로 등방성이다. 측정은 입사광의 들뜸 축으로부터 떨어져서 그리고 관심 있는 스펙트럼대역만을 검출기에 전송하는 광학적 필터를 통해 일반적으로 행해진다.
형광에서 사용되는 분자 탐촉자들은 특정 유형의 분자들에 대해 고유 친화도를 가지는 생체 또는 초생체 색소들일 수 있다. 오렌지 티아졸, O-아우라민, Y-피로닌 등과 같은 핵산들을 위한 인터칼레티잉 색소들(intercalating dyes)이 거론될 수 있거나, 또는 색소 표시자(dye marker), 일반적으로 단일 또는 탠덤(tandem) 형광색소 또는 때때로 나노결정이 부착되는 항체로 구성된 면역학적 탐촉자들이 거론될 수 있다.
면역학적 탐촉자들의 구현에 의한 이 표시 방식은 세포학적 식별을 위해 그리고 특히 앞서 기재된 유동 세포 분석 기법들에 따라 널리 퍼지게 되었다. Ortho Diagnostics Inc.사의 유럽특허 EP 0 022 670은 유동 세포 분석법을 이용한 각종 세포들의 항원 결정자들에 의한 상기 각종 세포들의 식별을 기재하고 있다. 이 특허에 기재된 기법은 효율적이며, 안전하고 신뢰할 수 있는 셀 식별 기법으로서 지금 인식되고 있는 면역형태학적 검사(immunophenotyping)의 매우 광범위한 발전에 문을 열었다.
다중매개변수 세포학적 분석은 그럼에도 불구하고 항원 식별을 이용하는 일 없이 수행될 수 있다. 그래서, "Combined Blood Cell Counting and Classification with Fluorochrome Stains and Flow Instrumentation" J. of Histochem. & Cytochem Vol24. No.1, pp. 396-411, 1976, Howard M. Shapiro라는 문서에서, 흡수, 회절 및 형광 측정들을 수행하는 다중매개변수 세포분석기에 의한 혈액세포들의 일반 분류를 기재하고 있는데, 거기서 요소들은 핵산들 및 단백질들로 된 특정 형광색소들의 혼합물과 접촉하게 된다.
병행하여, 분석기들에서 형광측정 파장들의 체배는, John A. Steinkamp의 "A molecular Detector for Flow Cytometric Multicolor Fluorescence Measurements", 1987, Cytometry 8: pp. 353-365라는 문서에서 나타낸 바와 같이, 표시자들의 성장 수의 사용을 허용하였고 그래서 항체들의 사용을 허용하였지만, 기기들 및 그것들의 구현의 복잡도를 매우 심각하게 증가시켰다.
단일 파장에 의해 들뜨게 된 색소들의 결합 사용은 그것들의 들뜸 및/또는 그것들의 형광 방출의 특수한 중첩의 영역들 때문에 신속히 한계를 나타낸다.
이러한 특수한 중첩의 문제를 극복하기 위해, "Spectral Compensation for Flow Cytometry: Visualization Artifacts, Limitations and Caveats", Mario Roederer 2001, Cytometry 45, pp. 194-205라는 문서에서 나타낸 바와 같이, 다른 미시적 요소들의 특수한 중첩의 비례부분에 의해 분석된 미시적 요소의 형광신호를 전역적으로 감소시키는 "보상"이라 불리는 정정 방법이 일반적으로 사용되고 있다.
보상에 의해 유발되는 하나의 문제는 보상이 평균값으로 계산되고 주어진 족의 형광색소들에 대해 보상의 값을 단호하게 고정하는 것이 가능하지 않다는 것이다. 참으로, 동일한 족의 형광색소들의 물리적 성질들에는 특히 공급원에 따라 달라지는 폭 넓은 변동들이 존재한다. 다른 제조자들로부터 나오는 동일한 생성물은 그래서 다른 집합들의 보상들에 이르게 할 수 있다. 이것은 비 제어형 공급원들이 오류가 있게 하고 그러므로 잠재적으로 위험한 측정에 이르게 하기 때문에 특히 진단 분야에서 문제를 안고 있다. 예를 들면, PE-TR 전송의 효율 및 채용된 항체들의 성질은 Carleton C. Steward 및 Sigrid J. Stewart에 논문인 "Four color compensation", Cytometry, Vol.38, pp. 161-175, 1999에서 특히 설명되고 있다.
몇몇 들뜸 파장들의 사용은 색소들의 폭넓은 선택이 열리게 하고 방출 스펙트럼이 더 쉽게 분리될 수 있게 한다. 각종 들뜸 파장들은 J. Steinkamp의 "Improved multilaser/multiparameter flow cytometer for analysis and sorting of cells and particles" John A. Steinkamp, Robert C. Habbersett, and Richard D. Hiebert; Review of Scientific Instruments Vol 62(11) pp. 2751-2764, November 1991라는 논문에서 기재된 바와 같이 측정 탱크에서 빈번하게 공간적으로 분리되어 이 경우에 몇몇 독립적인 측정들의 이점을 제공하게 된다. 이 방법이 가지는 문제는 공간적 변위가 응답들에서의 시간적 위상 편이를 유발한다는 것과 정 보의 재조정이 하류에서 정보를 아날로그 형태로 지연하는 것에 의해 또는 소프트웨어 수단에 의해 측정들을 재조정하는 것에 의해 행해져야 한다는 것이다.
들뜸 파장들의(특히 레이저원들의) 체배는, 형광의 측정 및 다른 광학적 매개변수들의 측정과 함께, 예를 들면 "Nine Color Eleven Parameter Immunophenotyping Using Three Laser Flow Cytometry", Martin Bigos 1999, Cytometry 36, pp.36-45라는 논문에 기재된 바와 같이 기술적으로 복잡하게 하고 구현에 상당한 어려움이 있게 한다.
결과들의 해석에서의 오류의 위험 수준은 매개변수들의 수와 함께 증가하고, 부적절하고 잘못되며 그러므로 잠재적으로 위험한 결과들을 얻을 위험을 무릅쓰고 매우 전문화된 기술자들에 대해 장비들의 사용이 유지된다.
임계 레벨이 형광색소들의 수와 함께 증가하는 보상들의 하나의 제한은, 형광 측정들에서의 잡음 및 그대로의 측정들(raw measurements)을 수정하는데 사용되는 그것들의 선형 조합들의 전파 및 증폭에 관계가 있다.
알려진 분석 기기가 완전히 만족스럽지 않으므로, 본 발명의 목적은 그 상황을 개선하는 것이다. 특히, 본 발명은 종래기술에서 일반적으로 직면하는 보상의 문제들을 극복하도록 설계된다.
이를 위해, 본 발명은 미시적 요소들을 분석하기 위한 기기를 제공하는데, 이 기기는 다음을 포함한다:
● 첫째로, 분석하려는 미시적 요소들을 위한 측정공간,
● 둘째로, 적어도 2개의 다른 분석파장들을 가지고 상호작용 방사선을 형성하기 위하여 측정공간 내에서 미시적 요소들과 상호작용하도록 고안된 방사선을 전달하는 적어도 하나의 소스,
● 셋째로, 측정공간으로부터 유래하는 상호작용 방사선의 적어도 일부를 전기신호들로 변환하는 검출수단,
● 넷째로, 분석된 미시적 요소들을 나타내는 데이터가 결정되도록 하기 위해 전기신호들을 분석하는 분석수단.
여기서, "상호작용 방사선"은 분석 빔 및 분석되는 미시적 요소들 사이의 상호작용으로 나오는 방사선을 말한다. 이 상호작용 방사선은 특히 산란(굴절, 반사, 회절) 및/또는 광발광(형광, 인광)으로부터의 방사선일 수 있다.
게다가, 여기서, "방사선"은 자외선 및 적외선 사이의 범위, 바꾸어 말하면 약 100nm(0.1㎛) 및 약 5000nm(5㎛) 사이에 있는 파장의 광빔을 의미한다고 이해된다.
본 발명에 따른 기기는,
- 그것의 부호화된 방사선이 상기 측정공간(CM) 내에서 결합(conjugation) 된다는 것과,
- 상기 기기는 i) 측정공간 상류의 방사선을 다른 코드들로써 부호화하는 부호화수단(M), 및 ii) 검출수단 상류에 있고, 형광을 선택적으로 필터링하고 및/또는 상호작용 방사선을 그것의 파장의 함수로서 산란하는 광학적 필터링 수단(FO, LS)을 포함한다는 것, 그리고
- 분석수단은 전기신호들이 그것들의 원본 코드의 함수로서 분석되도록 전기신호들을 복호화하는 복호화수단을 포함한다는 것을 특징으로 한다.
여기서, "부호화"는, 원본 코드를 자체에 포함하는 상호작용 방사선을 발생할 목적으로, 분석 방사선 빔이 미시적 요소들과 상호작용하기 전에 분석 방사선 빔(Ri)에 코드(ωi)를 적용하는 행위를 말하다. 특히, 코드들(ωi)은 펄스형 변조를 각각의 분석 방사선 빔에 인가하도록 하는 방식으로 선택될 수 있다.
이 펄스들은 동기적이거나 비동기적일 수 있다. 동기적 펄스들의 경우에, 모든 파장들은 분석되는 미시적 요소들과 동시에 상호작용한다. 비동기적 펄스들의 경우에, 파장들은 분석하려는 미시적 요소들과 순차적으로 상호작용한다. 광학적 필터링 수단은 주어진 족의 형광색소들에 대해 그리고 주어진 유형의 부호화에 대해 보상이 수행되는 것을 피하도록 하는 방식으로 설계된다.
본 발명에 따른 기기는 개별적으로 또는 조합하여 취해질 수 있는 상보적인 특성들을 포함할 수 있는데, 특히,
● 그것의 광학적 필터링 수단은 2개의 분석 파장들 사이에 각각 삽입된 형광분석 대역들 및 최장 분석 파장 너머에 위치된 형광분석 대역에 속하는 파장들을 가지는 상기 형광 상호작용 방사선을 선택적으로 필터링할 수 있으며;
● 그것의 부호화수단은 방사선을 주기적으로 및/또는 사인곡선적으로 세기를 분석할 수 있으며;
● 그것의 부호화수단의 적어도 일부는 방사선을 위해 분배 출력 하류의 소스에 대해 작용할 수 있고, 상기 일부는 소스에 일체로 될 수 있으며;
● 그것의 부호화수단의 적어도 일부는 분석 방사선을 형성하기 위하여 소스 하류의 방사선에 대해 작용할 수 있으며;
● 그것의 부호화수단은, 분석 방사선을 형성하기 위하여, 소스에 의해 예를 들면 음향 광 변조기에 의해 전달된 방사선을 세기 변조할 수 있으며;
● 소스는 원한다면 단색 유형의 적어도 2개의 커플링된 레이저들 및/또는 적어도 하나의 발광다이오드를 포함할 수 있는데, 그것의 분석 방사선은 측정공간 내에서 결합 된다. 변형예로서, 소스는 예를 들면 다색 레이저, 백열등 또는 아크등과 같은 실질적으로 연속하는 다색 광의 소스를 포함할 수 있으며;
● 소스는 연속 모드 및/또는 펄스 모드에 따라 분석 방사선을 전달할 수 있으며;
● 소스에 의해 전달되는 각 분석 방사선 빔의 세기는 조정될 수 있으며;
● 그것의 검출수단은 분석하려는 미시적 요소들에 대한 분석 방사선에 의해 유도되는 상호작용 방사선(산란을 그리고 형광 처리(들)를 나타냄)의 검출 전용인 다수의 광감성 센서들을 포함할 수 있다. 변형예로서, 검출수단은 산란 처리(들)를 나타내는 상호작용 방사선의 검출 전용이고 측정공간 내의 분석 방사선의 전반적인 전파 방향을 가로채는 축에 의해 정해진 위치에 삽입된 다수의 감광성 센서들을 포함하며, 이 축은 전반적인 전파 방향에 대하여 0도 내지 360도의 범위에 있는 각도로 배향되어 있으며;
● 그것의 분석수단은 분석되는 한 유형의 미시적 요소들의 굴절률이 산란 처리를 나타내는 상호작용 방사선의 변환으로 생겨난 신호들로부터 추론될 수 있게 한다. 특히, 미시적 요소들이 혈액 시료에 속할 때, 분석수단은 특히 적혈구내 헤모글로빈 함량 또는 백혈구들의 세포질내 단백질 함량이 결정될 수 있게 한다.
● 그것의 분석수단은 다른 파장들을 가지는 2개의 발광 작용제들(또는 형광색소들) 사이의 에너지 전달을 나타내는 커플링 정도가 분석 방사선 및 2개의 발광 작용제들 사이의 상호작용으로 생겨난 신호들로부터 추론될 수 있게 한다.
본 발명은 또한 미시적 요소들을 분석하기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은,
● 측정공간 내에 위치된 미시적 요소들이, 측정공간 내에서 결합되고 적어도 2개의 다른 분석파장들을 가지는 분석 방사선에 의해 조명되고, 다른 선택된 코드들에 따라 상호작용 방사선을 형성하도록 하는 방식으로 부호화되는 제1단계;
● 상호작용 방사선의 적어도 일부가 수집되고, 그 다음 그것의 파장의 함수로서 분리되고 필터링되는 제2단계;
● 필터링된 상호작용 방사선은 검출되고, 그 다음 전기신호들로 변환되는 제3단계; 및
● 검출된 신호들은 그것들의 원본 코드의 함수로서 분석된 미시적 요소들을 나타내는 데이터가 결정되는 것을 허용하는 방식으로 복호화되는 제4단계를 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 개별적으로 취해지거나 조합될 수 있는 상보 특성들을 포함할 수 있고, 특히,
● 제1단계에서, 분석 방사선은 분석하려는 미시적 요소들에 순차적으로 또는 동시에 인가될 수 있으며;
● 제1단계에서, 분석 방사선은 분석하려는 상기 미시적 요소들에 동시에 인가될 수도 있으며;
● 제2단계에서, 2개의 분석 파장들 사이에 각각 삽입된 및 최장 분석 파장 너머에 위치된 형광분석 대역들에 속하는 파장들을 가지는 형광 상호작용 방사선은 선택적으로 필터링될 수 있으며;
● 제4단계에서, 분석되는 하나의 유형의 미시적 요소들의 굴절률은 산란 처리를 나타내는 상호작용 방사선의 변환으로 생겨난 신호들로부터 추론될 수 있다. 특히, 미시적 요소들이 혈액 시료에 속할 때, 적혈구내 헤모글로빈 함량 또는 백혈구들의 세포질내 단백질 함량이 결정될 수 있으며;
● 제4단계에서, 형광색소들 사이의 에너지 전달을 나타내는 커플링 정도는 분석 방사선 및 2개의 발광 작용제들 사이의 상호작용으로 생겨난 신호들로부터 추론될 수 있다.
본 발명은, 비록 비제한적인 방식이지만, 생체 외 진단 (특히 유동 세포 분석) 분야에, 그리고 유체에서 어떠한 미시적 요소의 분석에도 특히 매우 적합하다. 그것은 생물학적, 생화학적, 화학적, 미립자, 형태학적 분석, 그리고 특히 다중매개변수 유동 세포 분석, 액상 또는 기상 유체의 대전 입자들의 분석, 및 입자크기 분배(particle size distribution)에 특히 적용가능하다.
본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 아래의 상세한 설명과 첨부 도면들을 검 토함에 의거하여 명확하게 될 것인데, 도면들 중에서,
도 1a는 본 발명에 따른 광학적 분석 기기의 제1 예시적 실시예를 개략적으로 및 기능적으로 도시하고, 도 1b는 본 발명에 따른 광학적 분석 기기의 제2 예시적 실시예를 개략적으로 및 기능적으로 도시하는데 이 도면에서는 수 개의 소스들이 측정공간(CM) 내에서 결합되는 것이 의도되고 있는 방사선을 발생할 수 있으며;
도 2a는 광 방사에 적용될 수 있는 동시 조명을 이용한 사인곡선적 부호화의 예를 도시하며, 도 2b는 순차 이진 부호화의 예를 도시하고, 도 2c는 도 2b의 이진 부호화가 주기적으로 반복된 신호들의 형태들을 보이고 있으며,
도 3은 3개의 분석 파장들(λ1 내지 λ3)에 상응하는 형광색소들의 흡수 스펙트럼들(SA1 내지 SA3) 및 동일한 형광색소들의 3개의 형광 스펙트럼들(SF1 내지 SF3)을 도시하는 다이어그램이며,
도 4는 측정 탱크의 하류에 있는 분석 기기의 부분의 예시적인 실시예를 개략적으로 도시하는데, 거기서 변조기는 음향 광 유형으로 되어 있으며,
도 5는, 측정 탱크 하류에 있고 형광의 검출 및 분석 전용인 분석 기기의 부분의 예시적인 실시예를 개략적으로 도시하며, 그리고
도 6은 미립자 헤모글로빈의 체적 및 농도가 488nm 및 976nm에 동등한 분석파장들에서 산란 단면적들(Cext)의 함수로서 결정될 수 있게 하는 등체적 및 등농도의 다이어그램이다.
첨부된 도면들은 발명을 완전하게 하는데 뿐만 아니라 필요한 경우 그것의 정의(또는 한정)에 기여하는데 이용될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 광학적 분석 기기(DA)의 2개의 예시적인 실시예들을 설명하기 위하여 무엇보다도 먼저 도 1a 및 1b에 대해 참조한다.
다음에서, 기기(DA)가 혈액 시료에 있는 미시적 요소들의 유동 세포 분석에서의 특성화 및 카운팅에 전용된다고 간주된다. 그러나, 본 발명은 이 유형의 시료 또는 유동 세포 분석에 한정되지는 않는다. 그것은 실제로는 형광 및/또는 광 산란에 의해 광적으로 분석하려는 미시적 요소들을 포함하는 어떤 유형의 시료에라도 그리고 특히 유체 또는 생물학적 시료들 내에 있는 입자들에 관계가 있다.
도 1a 및 1b에서 개략적이고 기능적으로 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 분석 기기(DA)는, 적어도, 다음을 포함한다:
● 때때로 측정 탱크라고(또는 측정 영역이라고, 또는 측정 윈도우라고도) 불리며 그 속에는 분석하려는 시료의 미시적 요소들이 위치되는(또는 통과하고 있는) 하나의 측정공간(CM),
● 측정공간(CM) 내에서 결합된 적어도 2개의 다른 분석파장들(λ1 내지 λn)을 가지는 방사선(Ri)을 전달하기 위한 하나(또는 몇 개의 ) 소스(들)(S)[도 1a의 경우에, 단일 소스(S)가 몇 개의 파장들을 전달하는데 이용되는 반면, 도 1b의 경우에, 3개의 소스들(S)이 각각 하나의 파장을 전달하는데 사용되며 - 정의에 의해, 여기서는 도 1b의 다른 소스들이 방사선 소스의 하위부분들을 형성한다고 간주된다],
● 파장 λi의 각각의 광 방사선 빔(Ri)을 특화 코드(ωi)(여기서 i=1 내지 n이며, 예를 들면 n = 2 또는 3)로써 최소한 부호화(변조)하고, 어쩌면 제어모듈(MC)에 의해 제어되는 부호화수단(M)으로서, 부호화는 예를 들면 도 2a 내지 2c에 보인 것의 유형인, 부호화수단,
● 미시적 요소들과 잠재적으로 상호작용한 후, 측정공간(CM)으로부터 나오는 상호작용 방사선을 선택적으로 필터링하기 위한 광학적 필터링 수단(FO)으로서, 가장 긴 분석파장(λn) 너머에 위치된 마지막의 것(최장 파장을 가짐)을 제외하고는, 상호작용 방사선의 파장들이 바람직하게는 2개의 분석파장들(λi 및 λi+1) 사이에 각각 삽입된 형광 분석 대역들(Bi)에 속하는, 광학적 필터링수단,
● 미시적 요소들과는 잠재적으로 상호작용한 후 측정공간으로부터 나오는 형광 및/또는 산란 상호작용 방사선의 적어도 일부를 전기신호들로 변환하는 감광성 센서들(또는 포토센서들)을 포함하는 검출수단(DF 및/또는 DE), 및
● 분석되는 미시적 요소들을 나타내는 데이터가 결정되는 것을 허용하도록 하는 방식으로 전기신호들을 그것들의 부호(ωi)의 함수로서 분석하도록 하기 위해, 검출수단(DF 및/또는 DE)에 의해 전송되어 온 전기신호들을 복호화하는 적어도 복호화수단(DRF 및/또는 DRE)을 포함하는 분석수단(MA).
분석 기기(DA)가 형광 및/또는 산란 분석들을 이행할 수 있다는 것을 유의하는 것이 중요하다. 결과적으로, 변형예에 따라서는, 분석 기기는,
● 광학적 필터 수단(FO)과 형광 전용인 연관된 검출수단(DF) 및 연관된 연관된 복호화 수단(DRF)을 가지나, 산란 전용인 검출수단(DE) 및 연관된 복호화수 단(DRE)은 가지지 않으며,
● 또는 광학적 필터 수단(FO)과 형광 전용인 연관된 검출수단(DF) 및 연관된 복호화 수단(DRF), 그리고 광학적 필터 수단(FO)과 산란 전용인 검출수단(DE) 및 연관된 복호화 수단(DRE)을 가지며,
● 또는 산란 전용인 검출수단(DE) 및 연관된 복호화 수단(DRE)을 가지나 광학적 필터 수단(FO)과 형광 전용인 연관된 검출수단(DF) 및 연관된 연관된 복호화 수단(DRF)은 가지지 않는다.
분석 기기(DA)가 유동 세포 분석에 또는 카운팅에 전용될 때, 그것의 측정 탱크(CM)(또는 측정공간)는 특허문서 FR 2653885에 기재된 것과 같은 "플럭스 커플링"이라고 하는 유형으로 될 수 있다.
도 1a의 예에서, 소스(S)는 개별 파장들(λ1 내지 λn)로 되며 n≥2인 n개의 방사선 빔들(Ri)의 중첩으로 구성된 단일 광 빔을 발생할 수 있다. 도 1b의 예에서, 3개의 광원들(S)의 각각은 파장(λi)(λ1, λ2, λ3)의 하나의 방사선 빔(Ri)(R1, R2 또는 R3)으로 구성된 단일 광 빔을 발생할 수 있다.
Ii로 표시된 각각의 빔의 세기는 미리 결정된 값으로 조정될 수 있다. 이것은 예를 들면 족(family)을 이루는 형광색소들(또는 형광 화합물들)의 형광 세기가 파장 λi 및 세기 Ii의 분석 방사선(Ri)에 의해 들뜨게 된 때에 미리 결정된 레벨에 놓이는 것을 허용한다. 양자(quantum) 형광 효율이 매우 높은 족의 형광색소들(이것은 예를 들면 오렌지 티아졸과 같은 일정한 분자 탐촉자들의 경우이다)은 낮은 세기로 들뜨게 될 수 있다. 반면에, 동일한 양자 효율들을 가지는 형광색소들이 동일한 세포에 대해 다르게 표현되는 항원들을 만들기 위해 동시에 이용될 때, 각종 형광색소들에 의해 방출된 형광 레벨들은 형광색소들의 개별 분석 방사선 빔들의 세기들에 대한 작용에 의하여 근사적으로 동등하게 될 수 있다.
미시적 요소들의 형광 레벨들을 제어하기 위한 이 가능성 덕분에, 소스(S)는 광학적 "합성기-등화기"라고 불릴 수도 있다.
세기 Ii의 n개의 방사선 빔들(Ri)의 각각은 아래에서 논의되는 부호화 수단에 의해 세기가 주기적으로 및/또는 사인곡선적으로 부호화될 수 있다. 예를 들면 도 2a 내지 2c에 도시된 유형의 것으로 되는 이 부호화 처리는, 그것이 복호화 수단(DRF 및/또는 DRE) 덕택에, 분석되는 미시적 요소들과의 상호작용으로부터(특히 형광 및/또는 산란의 메커니즘들에 의해) 생겨난 방사선의 역다중화를 허용하기 때문에, 결정자(determinent)이다.
소스(S)가 예를 들면 반도체 레이저, 발광다이오드와 같은 레이저를 포함할 때, 부호화는 주입 전류에 대한 작용에 의해 달성될 수 있으며, 그때 변조기(M)는 방사선 빔들의 각각에 적용된 코드들의 이미지 전기전류들을 전달할 수 있는 발전기이다. 부호화가 사인곡선 형태일 때, 이 부호화는 특히 아래에서 설명될 각종 실험적 고려사항들의 함수들인 변조 주파수들(ωi)을 고정할 때에 존재한다.
변조기(M)의 출력에는, 선택된 파장(λ) 및 잠재적으로 선택된 세기(Ii)로 되며 측정공간에서 결합되는 n개의 방사선 빔들(Ri)이 있다. 사인곡선 부호화의 경 우에, 광 세기(Ii)를 위한 표현(W/㎡)은 부록에서 수학식 A1에 의해 주어진다.
n개 방사선(Ri)의 빔 또는 빔들은 측정(또는 카운팅)공간 내부의 미도시된 광학적 수단에 의해 집속되고, 측정공간에서 방사선 빔들은 이 기술분야의 숙련된 자들에게 알려진 어느 기법에 따라 이전에 표시된 및/또는 염색된 미시적 요소(여기서는 생물학적 세포)와 상호작용한다.
도 3에서는 3개의 분석파장들(λ1 내지 λ3)에 상응하는 3개의 가상 형광색소들의 3개의 흡수스펙트럼들(SA1 내지 SA3), 및 형광검출수단(DF)에 의해 검출되는 동일한 3개의 형광색소들의 3개의 형광스펙트럼들(SF1 내지 SF3)이 보이고 있다. 참조기호 B1 내지 B3은 광학적 필터링 수단(FO)이 통과시키는 3개의 파장대역들을 나타낸다.
다른 유형들의 형광색소들의 수는 설명을 용이하게 하기 위해 여기서 3개로 제한된다. 그러나, 본 발명은 이 수로 제한되지 않는다. 그것은 어떠한 주어진 수의 형광색소들에도 실제로 적용할 수 있다.
본 발명에 따르면 그리고 도 3에서 관측될 수 있는 바와 같이, 제1형광색소의 형광 스펙트럼(SF1)의 최대에 상응하는 대역(B1)은 분석파장들(λ1 및 λ2) 사이에 삽입되며, 제2형광색소의 형광 스펙트럼(SF2)의 최대에 상응하는 대역(B2)은 분석파장들(λ2 및 λ3) 사이에 삽입되고, 제3형광색소의 형광 스펙트럼(SF3)의 최대에 상응하는 대역(B3)은 분석파장(λ3)(3개중 가장 긴 것임) 너머에 위치된다.
바람직하게는, 각각의 대역(Bi)에 대하여, 형광 검출기(DFi)가 상응한다.
흡수(SAi) 및 형광(SFi) 스펙트럼들의 분석은 매트릭스 식이 (n=3)개의 검출기들에 의해 전달된 (광전)신호들 및 형광색소들의 양들 사이에서 다음과 기록될 수 있게 한다: [PMo] = I1[C][Q] + I2[D][Q] + I3[E][Q].
여기서, [PMo]는 (n=3)개의 형광 검출기들(DFi)에 의해 전달된 (광전)신호들의 매트릭스이며, 지수 o는 에너지 전달이 없을 때의 형광신호를 나타낸다. [C], [D] 및 [E]는 여기서 형광 광 빔들이 계산될 수 있도록 하는 전송 매트릭스들이다. [Q]는 여기서 몰 수로 표현되는 (n=3)개의 형광색소들의 양들(Q1 내지 Q3)의 매트릭스이다.
전송 매트릭스들([C], [D] 및 [E])의 계수들(Cij, dij 및 eij)은 부록의 수학식들(A2, A3 및 A4)에 의해 개별적으로 주어진다.
매트릭스 [PMo] 및 연관된 계수들의 분해의 검토는 측정 신호들의 선형 결합 없이 각 몰 농도(Qi)를 결정하는 것이 가능함을 보이고 있다. 전술한 기록 규약으로, 몰 농도들(Qi)은 부록의 수학식들(A5 내지 A7)에 의해 주어진다. 이 3개의 수학식들(A5 내지 A7)에서, 항 PMi(ωi)는 코드 ωi의 특성을 나타낸다.
이 특성은 예를 들면 분석 광 펄스의 지속기간에 의해 제한된 시간간격 하의 신호의 피크 진폭 또는 r.m.s. 값, 또는 대신에, 형광 광의 페이드 시간과 같은 신호의 시간적 특성일 수 있다. 측정들의 선형 결합을 이용하지 않은 형광색소들의 몰 농도(Qi)의 직접 결정은 결과들의 정확도를 높이고 그러므로 진단의 정확도를 높인다.
그러므로 (각종 신호들의 선형 조합의) 보상의 사용은 주어진 형광색소의 몰 농도를 결정하기 위해 회피될 수 있다. 본 발명의 견고성(robustness)은 간섭 효과, 그래서 보상이 회피되는 것을 허용하고, 그러므로 지금까지 사용된 기존의 방법들보다 신뢰성 있고 더 견고하다.
본 발명은 결정하려는 2개의 형광색소들(또는 형광 화합물들) 사이의 커플링 정도가 "주개(donor)" 형광색소 및 "받개(receiver)" 형광색소 사이의 (형광에 의한) 에너지 전달에 상응하는 것을 허용할 수도 있다. 2개의 형광색소들 사이의 커플링의 이러한 결정은 예를 들면 황원결정인자(에피토프)들 사이의 거리 또는 그것들의 그 밖의 물리적 연관이 측정되는 것을 허용한다.
위에서 주어진 기록 규약에 비추어, 에너지 전달의 존재 하에 각종 형광신호들을 위한 표현들이 부록에서 수학식 A8 내지 A10에 의해 주어진다.
제1의 2개의 형광색소들 사이의 에너지 전달의 경우는 이하에서 분석적으로 기술될 것이다. 이 경우에, 부록에서 수학식 A8 내지 A10에 의해 주어진 각종 광전 신호들을 위한 표현들은 부록의 수학식 A11 내지 A13 형태로 재기록될 수 있다. 이것은 계수들(κ12 및 ρ12)만이 고려될 필요가 있고, 다른 계수들(κij 및 ρij)은 1과 같도록 한다는 사실에 기인한다.
수학식 A2 내지 A7을 위한 표현들을 감안하여, 부록의 수학식 A11 및 A12로부터, 부록의 수학식 A14 내지 A16이 추출될 수 있다. 그러면, 수학식 A14 내지 A16으로부터 몰 농도들(Q1 내지 Q3)을 제거하는 것에 의해, 제1의 2개의 형광색소 들 사이의 에너지 전달 매개변수(κ12)는 결정될 수 있다. 이 에너지 전달 매개변수(κ12)를 위한 공식은 부록에서 수학식 A17에 의해 주어진다.
그러면 제1의 2개의 형광색소들 사이의 에너지 전달의 존재 하의 몰 농도(Q1)는 부록의 수학식 A18에 의해 표시된 바와 같이 재공식화될 수 있다. 제1의 2개의 형광색소들 사이의 에너지 전달의 존재 하의 몰 농도들(Q2 및 Q3)은 부록에서 수학식 A6 및 A7에 의해 주어진다.
위에서 주어지고 부록에 있는 수학식들은 제1 및 제3 형광색소들 사이 및/또는 제2 및 제3 형광색소들 사이의 에너지 전달이 고려될 경우에 확장될 수 있다는 것에 유의하는 것이 중요하다.
도 4에서, 본 발명에 따른 분석 기기(DA)의 상류 부분이 보이고 있는데, 거기서 소스(S)는 광대역 광(방사선)을, 분석파장들의 선택과 상응하는 복사선의 세기 부호화 둘 다를 제공하는 변조기(M)에 공급한다.
여기서, 광대역 광(또는 백색광, 또는 다색광)은 미시구조의 광섬유(OF)에 주입되는 펄스형 레이저(L)에 의하여 얻어진다. 이 유형의 소스(S)는 예를 들면 "White-light supercontinuum generation in normally dispersive optical fiber using original multi-wavelength pumping system", Optics Express, vol. 12, No. 19, September 2004라는 본 출원인에 의한 논문에 기재되어 있다.
미시구조의 광섬유(OF)를 위한 펌프로서 소용되는 레이저(L)는 예를 들면 역바이어스 모드들(예를 들면 50MHz의 펄스 반복율을 가짐)의 체제에서 동작하는 네 오디뮴 도핑 또는 이터븀 도핑 섬유 광학 레이저와, 이것을 뒤따르며 미시구조의 광섬유(FO)의 비선형 상호작용 체제에서의 들뜸과 양립할 수 있는 플럭스를 전달할 수 있는 광 증폭기에 의해 대체될 수 있다.
이 유형의 소스(S)에 의해 전달되는 다색광은 그것의 공간적 가간섭성이 극히 높다(연속체의 모든 광자들이 동일한 공간적 방식으로 방출됨)는 사실에서 백열등에 의해 전달되는 다색광과는 다르다.
물론, 다른 유형들의 소스들(S)이 생각될 수 있다. 그래서, 소스는 어쩌면 단색 형의 적어도 2개의 결합된 레이저들, 및/또는 적어도 하나의 발광다이오드를 포함할 수 있다. 그것은 실질적으로 연속하는 다색광 광원, 예를 들면 백열들 또는 아크등을 포함할 수도 있다.
미시구조 광섬유(OF)로부터 나오는 광 빔은, 예를 들면, 반사굴절형(거울들)의 광학적 조합에 대해 수정된 색차(chromatism) 또는 제로 색차 탱크들을 가지는 집속광학계(O1)에 의해 조정된다. 이 광 빔은 변조기(M)에 초점 맺히고, 변조기는 브래그(Bragg) 입사각에서 회절에 적용된 피치의 회절격자들의 공간 중첩에 의해 그것의 각도 색차(angular chromatism)가 바람직하게 수정되는 음향 광 셀의 형상을 취한다.
이 회절격자들은 변조된 세기(Ii(t))를 주는 부록의 수학식 A1에 관련된 n개 변조신호들인 mi(t) = Micos2πωit를 유지할 수 있는 전기신호에 의해 전력 공급되는 압전형의 진동소자에 의해 유지되는 음파들의 중첩에 의해 만들어진다.
그러한 음향 광 변조기(M)는 예를 들면 A-A 옵토-일렉트로닉이란 회사에서 판매하는 것이 있다.
여기서, 음향 광 변조기(M)는 (적어도) 3가지 음향주파수들(f1, f2, f3)을 동시에 생성할 수 있는 제어 전자기기(SF)에 의해 제어되며 제어 전자기기 자체는 제어모듈(MC)(이것은 제어 소프트웨어 인터페이스를 포함하는 컴퓨터 시스템의 부분을 형성할 수 있음)에 의해 제어된다. 음향 주파수들의 대역은 예를 들면 80MHz 및 150MHz 사이의 범위에 있다. 주파수들은 예를 들면 파장들이 488nm(청색), 570nm(노랑색) 및 976nm(적외선)인 3가지(기재된 예에서) 준 단색 방사선 빔들 중에서 빔의 광 연속성 내에서의 선택을 허용하도록 하는 방식으로 선택된다. 3가지 방사선 빔들의 등화는 음향신호의 세기에 대한 작용에 의하여 얻어진다. 음향 세기가 높아질수록, 음향 광 변조기(M) 내의 회절 효율이 높아진다. 바꾸어 말하면, 0 회절차수부터 +1 회절차수까지 갈 수 있는 광의 양은 조절될 수 있다(음향신호의 세기에 대한 작용에 의함).
준 단색 방사선은 여기서 1과 50nm 폭 사이의 범위에 있는 스펙트럼 대역에서 방출된 빛을 의미한다고 이해된다.
소스(S) 및 변조기(M)의 매개변수들의 모두는 제어 모듈(예를 들면 컴퓨터 형)에 의해 원격 조절가능할 수 있다는 것의 유의하는 것이 중요하다. 그래서, 소프트웨어 인터페이스에 의해, 소스(S)의 모든 매개변수들, 이를테면 분석 방사선의 개별 세기들 및 분석파장 등은 조작자에 의해 선택될 수 있다.
변조기(M)의 출력에서 전달되는 분석 방사선(Ri)은 예를 들면 측정탱크(또는 공간)(CM) 내의 초점 맞추려는 광학계(O2)에 의해 조절된다.
변조 주파수들(ωi)은, 예를 들면, 측정공간(CM)을 통과하는 생물학적 세포의 통과 속력, 희석도, 측정공간(CM)의 광학적 창의 크기, 분석 기기(DA)의 획득부분(광학적 필터링 수단(FO), 검출기들(DE 및/또는 DF)의 대역폭과 같은 각종 매개변수들의 함수로서 선택된다.
예를 들면, 만일 분석하려는 생물학적 세포가 약 30μm의 절반 높이의 폭의 가우스 프로파일을 가지는 분석 방사선 빔을 약 1m/s의 속력으로 통과하면, 그것은 실질적으로 가우스 형상이고 실질적으로 30μs인 지속기간의 상호작용 방사선(형광 또는 산란(들뜸))의 펄스를 발생할 것이다. 그러면 주파수 스펙트럼은 가우스 형상이고 그것의 높이의 절반 높이는 실질적으로 0.3/30μs, 또는 약 10KHz이다. 전자 크로스토크 현상을 피하기 위해, 2개의 연속하는 변조주파수들(ωi 및 ωi+1) 사이에 100KHz의 최소 분리를 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들면, ω1은 100KHz와 동일하게 선택될 수 있으며, ω2는 200KHz 그리고 ω3은 300KHz와 동일하게 선택될 수 있다.
만일 유통(flow-through) 지속기간이 30μs 대신 약 5μs 이면, 각각의 상호작용 방사선 펄스는 약 200KHz의 주파수대역을 점유하고 그러므로 변조 주파수들은 적어도 이 특성 주파수에 의해 분리되어야 하며, 예를 들면, ω1 = 1MHz이고 ω2 = 1.5MHz가 되어야 한다.
변조기(M)의 다른 유형들이 생각되어질 수 있다는 것에 유의하는 것이 중요하다. 특히, 변조기(M)는, 적어도 부분적으로는, 소스(S)에 일체화되어야 하거나 또는 적어도 부분적으로는 소스(S) 하류에 있어야 한다. 변조기(M)는 적어도 부분적으로는, 소스(S)의 상류에 그것의 전력공급 전류를 제어할 수 있도록 하는 방식으로 놓일 수도 있다.
측정탱크(CM) 상류에 놓이고 도 4에 관련하여 위에서 설명된 분석 기기(DA)의 부분은 도 1a 또는 1b에 도시된 유형의 것의 하류 부분에 결합될 수 있다. 이 경우에, 산란으로부터 생겨난 상호작용 방사선의 일부는 검출기(DE)에 도착하고 검출기에서 분석모듈(MA)에 의해 처리되는 전기신호들로 변환된다.
도 1a에서, 검출기(DE)는, 예로써, 측정공간(CM) 내의 분석 방사선의 전반적인 전파 방향에 대해 약 45도의 중간 방향을 지향하고 있다. 그러나, 이 중간 방향의 각도는 소망하는 정보 유형에 따라서는 0도부터 360도까지의 범위 내에서 어떤 주어진 값이라도 취할 수 있다.
검출기(DE)는 이 광전 신호들을 분석모듈(MA)의 복호기(또는 복조기)(DRE)에 복호기가 광전 신호들을 복호화하도록 하기 위해 전송한다. 이 복조기(DRE)는 예를 들면 아날로그 형의 필터링(복호화) 스테이지들 형태로 구성된다. 변형예로서, 광전 신호들은 디지털화되고 필터링(복호화) 동작은 디지털적으로 실시간으로 또는 (기록 후) 후처리에 의해 수행될 수 있다.
복조기(DRE)의 출력에는, 3개의 산란 신호들인 SE(λ1 = 488nm), SE(λ2 = 570nm) 및 SE(λ3 = 976nm)가 있다. 산란 신호들의 값들인 SE(488nm) 및 SE(976nm)는 산란 단면적들인 Cext(488nm) 및 Cext(976nm)가 적색 혈액세포들의 체적들 및 굴절 률들의 결정에 필요한 것인지가 결정되게 한다.
산란 신호들의 단면적들로의 전환은 예를 들면 굴절률 및 체적을 교정하는 마이크로비드들을 사용한 교정(calibration)에 의해 달성된다. 이 마이크비드들은 예를 들면 라텍스로 만들어질 수 있거나 또는 에멀션으로부터 유래할 수 있다.
형광으로부터 생겨난 상호작용 방사선의 부분은 광학적 필터링 수단(FO)에 도달하기 전에 신호 조정 광학 어레이를 통과한다. 그 다음 상호작용 방사선은 n(여기서 n=3)개의 검출대역들(Bi)에 속하는 파장들을 가지는 것만이 보존되도록 파장들로 필터링된다.
도 1a에서, 형광 검출 수단(DF)은 모두 동일한 위치에서 그룹화된다. 이 경우에, 광학적 필터링 수단(FO)은 다중대역 필터를 형성한다.
도 5에 도시된 바와 같이, 분리수단(LS)이 형광 상호작용 방사선을 적어도 2개의 부분들로 스펙트럼으로 분리하기 위해 사용될 수 있다. 이를 위해, 어쩌면 이색성(dichroic) 유형의 분리판(LS)이 예를 들면 사용될 수 있다. 그래서, (적어도) 2개의 형광 검출 및 분석 채널들이 정의되어, 제1 형광성 유형의 형광색소들로부터의 형광 신호들이 광 필터(FO1)의 제1 광학적 필터링 대역(B1)에서 하나의 채널에 대해 얻어지는 것을 허용하고, 제2의 채널에 대해서는, 제2 형광성 유형의 형광색소들로부터의 형광 신호들이 광 필터(FO2)의 제2 광학적 필터링 대역(B2)에서 얻어지는 것을 허용한다.
도 5의 기기는 예를 들면 핵산들(RNA+DNA)의 정량화 및 막항원(membrane antigen)의 검출을 위해 이용될 수 있다.
여기서, 백혈구들의 막항원 및 핵산들이 개별적으로 표시되는 것을 허용하는 2개의 형광색소들(오렌지 티아졸 및 PE)의 형광들을 검출하기 위하여 각각 488nm 및 560nm에 등가인 파장들(λ1 및 λ2)을 가지는 2개의 분석 방사선 빔들(R1(ω1) 및 R2(ω2))이 이용된다. 2개의 방사선 빔들(R1(ω1) 및 R2(ω2))은 도 4에 관련하여 앞서 기술된 기기에 의해 얻어진다.
제1검출대역(B1)은 λ3(530nm)가 가운데이고 예를 들면 30nm의 스펙트럼 폭을 가지는 반면, 제2검출대역(B2)은 λ4(670nm)가 가운데이고 예를 들면 40nm의 스펙트럼 폭을 가진다. 본 발명에 따라서, λ3는 λ1 및 λ2 사이의 범위에 있고, λ4는 λ2보다 크다.
제1 광 필터(FO1)에 의해 필터링된 상호작용 방사선은 제1형광검출기(DF1)에 도착하고 제1형광검출기의 광검출기들에 의해 전기신호들로 변환되어 분석모듈(MA)의 제1 형광복호기(또는 복조기)(DRF1)에 전송되고 제1 형광복호기는 신호 PM1(ω1)을 전달하기 위해 제1변조주파수(ω1)에 따라 전기신호들을 복조한다.
제2 광 필터(FO2)에 의해 필터링된 상호작용 방사선은 제2형광검출기(DF2)에 도착하고 제2형광검출기의 광검출기들에 의해 전기신호들로 변환되어 분석모듈(MA)의 제2 형광복호기(또는 복조기)(DRF2)에 전송되고 제2 형광복호기는 신호 PM2(ω1) 및 신호 PM2(ω2)를 전달하기 위해 제1 및 제2 변조주파수들(ω1 및 ω2)에 따라 전기신호들을 복조한다.
형광 복조기들(DRF1 및 DRF2)은 예를 들면 변조 주파수들이 중앙이 되는 버터워스(Butterworth) 대역통과 형의 아날로그 필터링 스테이지들 형태로 구성된다.
전술한 들뜸 조건들 하에서, 형광색소들(또는 몰 농도)(Q1 및 Q2)의 양들은 계수들(c11 및 d22)이 A2 및 A3에 의해 정의되는 수학식 A5 및 A6을 이용하여 계산될 수 있다.
몰 농도(Q2)는 제2형광검출기(DF2)에 의해 전달된 형광신호(PM2)로부터 주파수 ω2에 중심을 둔 대역통과형의 필터를 이용하여 제2복조기(DRF2)에 의해 추출될 수 있다. 실지로, 앞서 나타낸 바와 같이, 형광색소들 사이의 광학적 크로스토크 때문에, PM2는 2개의 주파수성분들, 즉, 주파수 ω2 주위에서 필터링된 전기펄스의 r.m.s.값 또는 피크 대 피크 값에 상응하는 PM2(ω2), 및 광학적 크로스토크에 상응하는 PM2(ω1)을 포함한다. 그러므로, PM2 = PM2(ω1) + PM2(ω2)이다. 이 주파수성분들(PM2(ω1) 및 PM2(ω2))은 부록에서 수학식 A15 및 A16에 의해 정의되어 있는 것으로, 주파수 ω2를 중심에 둔 간단한 대역통과필터에 의해 분리될 수 있다.
몰 농도(Q1)는 PM1(ω1)과 동일한 형광신호(PM1)로부터 직접 추출될 수 있다.
분리수단(LS)을 포함하지 않고 κ12 = 1인 상황에 상응하는 구성에서, 형광검출기(PM)에 의해서만 전달되는 신호들은 부록에서 수학식 A20 형태로 재공식화될 수 있는 수학식 A19에 의해 주어진다. 신호들(PM(ω1) 및 PM(ω2))은 부록에서 수학식 A21 및 A22에 의해 주어진 것으로, 신호(PM)로부터 복조에 의해 추출될 수 있다.
수학식 A21은 Q2가 계산될 수 있게 하고, Q2를 수학식 A22에 삽입하는 것은 Q1이 결정되는 것을 허용한다.
위에서 설명된 예는 어떠한 주어진 복잡도의 광학적 크로스토크 레벨을 가지는 어떤 수의 형광색소들에 대해서도 확장될 수 있다.
제2의 예시적인 응용에서, 분석 기기(DA)는 본 발명에 따르면 전체 혈액 시료에 들어 있는 세포들의 굴절률이 측정되는 것을 허용한다. 적혈구내 스트레인(erythrocytic strain)의 세포들의 경우에, 이 굴절률은 미립자 헤모글로빈의 농도를 나타내는 것으로서 인식된다.
실지로, 광학적 관점에서, 적색 혈액 세포는 두께 약 7nm의 1.46에 가까운 굴절률의 "지질 이중층(lipid bilayer)" 막으로 구성된다. 세포내 내용물은 수상(aqueous phase)으로 용해된 몇몇 고체 화합물들을 함유하는데, 그것들 중에는 헤모글로빈(~34g/dl), 염(~0.7g/dl) 및 미량의 유기화합물(~0.2g/dl)이 있다.
굴절률은 수학식 23에 의해 주어진 형태로 기록될 수 있다.
헤모글로빈의 몰 질량이 알려져 있으므로(M = 66 500g/mol) 몰 농도(mmol/dl)는 질량농도(g/dl)로 수식화될 수 있다. 적색 혈액 세포에 용해된 헤모글로빈의 평균 질량은 12pg이다. 이것은 33g/dl, 또는 5mmol/l의 평균 농도가 되게 한다.
전체 혈액에 대해, 헤모글로빈 측정은 남자의 경우 약 40% 및 55% 사이이고 여자의 경우 약 35% 및 45% 사이에 있는 적혈구용적률 계수(hematocrit factor)에 의해 수정되어야 한다. 이 적혈구용적률 계수는 0.42(평균값)가 되도록 취해지며, 예를 들면, 5mmol/l의 미립자 헤모글로빈의 평균 농도는 전체 혈액에 대해 행해진 측정에 대해 2.1mmol/l의 전체 헤모글로빈의 평균 농도가 된다.
위를 그리고 수학식 23을 감안하여, 적색 혈액세포의 굴절률은 다음과 같이 기록될 수 있다: 980nm의 분석파장의 경우, n(980nm) = 1.34 + 0.0019 * Hb(미립자 농도 g/dl), 그리고
488nm의 분석파장의 경우, n(488nm) = 1.35 + 0.0016 * Hb(미립자 농도 g/dl).
이 공식들의 유효성 범위는 25부터 50g/dl의 미립자 헤모글로빈 농도(g/dl)로 취해질 것이다.
980nm 및 488nm에 동등한 분석파장들에서의 굴절률의 허수부는 다음 수학식에 의해 수치적으로 결정될 수 있다:
κ(980nm) = 1.47*10-5*Hb, 그리고
κ(980nm) = 3.7.10-5*Hb.
미립자 헤모글로빈 농도는 2개의 파장들에서의 소거계수(extinction coefficient)의 측정을 이용하여 결정될 수 있다. 이를 위해, A.G. Borovoi에 의해 개발된 기하학적 접근법이 이용될 수 있는데, 그것은 구모양으로 근사화된 적색 혈액 세포의 산란 단면적(Cext)이 계산될 수 있게 하며, 그 산란 단면적의 표현은 부록의 수학식 A24에 의해 주어진다.
미립자 헤모글로빈의 농도 및 체적이 분석파장(여기서는, 488nm 및 976nm)에 서 산란단면적들(Cext)의 함수로서 결정되는 것을 허용하는 도 6에 도시된 유형의 등체적 및 등농도 곡선들의 다이어그램이 만들어질 수 있다. 이 다이어그램에서, 측정들인 Cext(488nm) 및 Cext(976nm)의 각 쌍에 대해서는 주어진 헤모글로빈 농도 및 체적의 대응하는 단일 구모양이 있다.
헤모글로빈 함량을 얻는 것과 및 그것의 감시는 특히 유용하다고 밝혀질 수 있다. 이것은 특히 빈혈증 및 철분 부족을 감시하기 위한 경우이다. 평균 미립자 헤모글로빈 로드는 실지로는 성장 호르몬 요법("r-Hu EPO 요법")에 의해 유발되는 요구를 높은 수질(medullary) 동안에 감시하는데 특히 유용하다. 망상적혈구들 및 그것들의 세포 치료(cellular therapy)에서의 헤모글로빈 함량을 감시하는 것은 Carlo Brugnara의 "Iron Deficiency and Erythropoiesis: New Diagnositic Approaches", Clinical Chemistry: 49: 10, 2003, pp. 1573-1578)라는 문서에 나타낸 바와 같이 유용하다고 판명될 수도 있다.
본 발명 덕택에, 헤모글로빈 함량 측정(산란 측정을 통함) 및 다른 측정(형광 측정을 통함)을, 그것들 사이의 간섭 없이 그리고 처리 모드 때문인 오류의 위험이 줄어든 상태로, 동시에 행하는 것이 이제 가능하다.
이 경우에, 헤모글로빈 함량은 젊은 적혈구들, 또는 망상적혈구들이 완전히 발달한 요소들로부터 고립되는 것을 허용하는 적혈구내 RNA의 형광 측정에 의해 유익하게 완료될 수 있다. 하나 이상의 형광파장이 다른 잠재적인 유용한 구체적 식별, 이를테면 다음을 위한 테스팅의 식별을 가능하게 하는 부가적인 마킹들을 위해 동시에 이용될 수 있는데:
● 태아 헤모글로빈(HbF)을 함유한 적색 혈액 세포들, 또는
● 말라리아 원충이 만연한 적색 혈액 세포들, 또는
● 트랜스페린(CD71) 수용체들, 또는
● 글리코포린 A(CD234a)의 표현,
이것은 특히 Hans J. Tanke의 "Reticulocytes and Mature Erythrocytes", Flow Cytometry in Hematology, ISBN 0-12-432940-3이란 논문에 기재되어 있다.
본 발명의 응용들은 유핵 세포들(nucleated cells)(백혈구들 등) 및 적혈구계 스트레인 또는 혈소판 요소들(활성화 또는 혈소판 미숙을 마킹함) 모두에 대해 수없이 많다.
게다가, 본 발명은 혈액 속에 또는 골수 속에 존재하는 요소들의 경우에 유용할뿐만 아니라 진핵생물이든지 또는 원핵생물이든지 간에 어떠한 생물학적 세포 서스펜션에라도 적용될 수도 있다.
위의 설명에서, 본 발명은 분석 기기 형태로 원리적으로 설명되었다. 그러나, 본 발명은 설명된 분석 기기에 의해 그리고 그것의 변형예들에 의해 이행될 수 있는 분석 방법 형태로 생각될 수도 있다.
이 방법의 응용들은, 유동 세포 분석법 외에, 생체내, 또는 생체외 사용들에 대해서 생각해 볼 수 있다. 예를 들면, 이 방법은 세포 표면 영역의 스캐닝(특히, 스미어 테스트 및 조직 섹셔닝, 또는 세포 서스펜션의 스캐닝에 영향을 주는 기기에 적용될 수 있다.
본 발명은 예로써만 위에서 설명된 광학적 분석 기기 및 방법 실시예들에 한정되지 않고, 아래에 열거된 청구항들의 범위 내에서 이 기술분야의 숙련된 자들에 의해 생각될 수 있는 모든 변형들도 포함한다.
부 록
* 
(A1)
여기서 i = 1 내지 n이며, Iio는 방사선(Ri)의 최대 세기이며, Mi는 변조 깊이(또는 진폭)(일반적으로 0과 1 사이의 범위에 있음)이며, ωi는 방사선(Ri)에 적용된 변조의 주파수이고, t는 시간이다.
* 
(A2)
여기서 αij는 파장 λj에서 화합물(i)의 몰 흡수 계수이며, ηij는 검출대역(Bj)에 서 화합물(i)의 형광효율이며, Fij는 화합물(i)의 형광스펙트럼의 일부만이 검출대역(Bj) 내에서 필터링된다는 사실에 관련한 0과 1 사이의 범위에 있는 가중계수이다.
* 
(A5)
* 
(A8)
여기서 κij는 0과 1 사이의 범위에 있는 일정한 현상학적 커플링 계수이며 형광색소(i)부터 형광색소(j)까지의 에너지 전달을 나타내고, ρij는 형광색소(i)로부터 나오는 전송된 빛이 형광색소(j)에 의해 형광 빛으로 바뀌게 하는 양자효율을 나타내는 계수이다.
* 
(A11)
* 
(A14)
* 
(A17)
* 
(A18)
* 
(A19)
* (A20)
* 
(A21)
* 
(A22)
* 
(A23)
여기서 
는 굴절률의 실수부이며, 
는 순수 용매의 굴절률이고 파장의 함수이며, 
는 헤모글로빈의 굴절률 특성의 증분 계수이고 파장의 함수이며, 
는 굴절률의 허수부이고, 
는 몰 흡수계수이다.
* 
(A24)
여기서 
,
m = n-ik: 적색 혈액 세포의 복소수 굴절률,
ρ = 2x(n-1): 위상차를 주는 매개변수,
x = 2πa/λ,
a: 구의 반경, 그리고
tanβ = κ/(n-1)이다.
Claims (27)
- 미시적 요소들을 분석하기 위한 기기(DA)에 있어서, 분석하려는 미시적 요소들을 위한 측정공간(CM), 적어도 2개의 다른 분석 파장들을 가지며 상호작용 방사선을 형성하기 위해 상기 측정공간(CM) 내의 상기 미시적 요소들과 상호작용하도록 고안된 방사선을 전달할 수 있는 적어도 하나의 소스(S), 상기 측정공간(CM)으로부터 나오는 상호작용 방사선의 적어도 일부를 전기신호들로 변환하도록 설계된 검출수단(DE, DF), 및 분석된 미시적 요소들을 나타내는 데이터가 결정되는 것을 허용하는 방식으로 상기 전기신호들을 분석하도록 설계된 분석수단(MA)을 포함하며, 상기 기기는,부호화된 방사선이 상기 측정공간(CM) 내에서 결합 된다는 것과,상기 기기는 i) 상기 측정공간(CM) 상류의 상기 방사선을 다른 코드들(ωi)로써 부호화하도록 설계된 부호화수단(M), 및 ii) 상기 검출수단(DE, DF) 상류에 있고, 상기 형광을 선택적으로 필터링하고 및/또는 상호작용 방사선을 그것의 파장의 함수로서 산란하게끔 설계된 광학적 필터링 수단(FO, LS)을 포함한다는 것, 그리고상기 분석수단(MA)은 상기 전기신호들이 그것들의 원본 코드의 함수로서 분석되도록 상기 전기신호들을 복호화하게끔 설계된 복호화수단(DRE, DRF)을 포함한다는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항에 있어서, 상기 소스(S)에 의해 전달된 상기 분석 방사선(Ri)은 분석하려는 상기 미시적 요소들에 순차적으로 인가되는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항에 있어서, 상기 소스(S)에 의해 전달된 상기 분석 방사선(Ri)은 분석하려는 상기 미시적 요소들에 동시에 인가되는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광학적 필터링 수단(FO, LS)은 2개의 분석 파장들 사이에 각각 삽입된 및 최장 분석 파장 너머에 위치된 형광분석 대역들에 속하는 파장들을 가지는 상기 형광 상호작용 방사선을 선택적으로 필터링하도록 설계되는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소스(S)는 결합된 방사선을 상기 측정공간(CM)에 전달할 수 있는 적어도 2개의 레이저들을 포함하는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제5항에 있어서, 상기 레이저들은 단색형인 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소스(S)는 적어도 하나의 발광다이오드를 포함하는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소스(S)는 다색 방사선 소스를 포함하는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제8에 있어서, 상기 다색 방사선 소스(S)는 실질적으로 연속하는 스펙트럼을 가지는 적어도 하나의 다색 레이저, 백열등 및 아크등을 포함하는 군 내에서 선택되는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소스(S)는 연속 모드 및/또는 펄스 모드에 따라 상기 분석 방사선을 전달하도록 설계된 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소스(S)에 의해 전달되는 각각의 분석 방사선 빔(Ri)의 세기(Ii)는 조정 가능한 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부호화수단(M)은 상기 분석 방사선을 세기로 변조하도록 설계되는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부호화수단(M)의 적어도 일부는 상기 분석 방사선을 형성하도록 하는 방식으로 상기 소스(S) 하류의 방사선에 대해 작용하도록 설계되는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부호화수단(M)의 적어도 일부는 분석 방사선을 위해 분배출력 하류의 상기 소스(S)에 대해 작용하도록 설계되는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제14항에 있어서, 부호화수단(M)의 상기 일부는 상기 소스(S)에 일체화되어 있는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부호화수단(M)은 상기 소스(S)에 의해 전달되는 상기 방사선을 상기 분석 방사선을 형성하도록 하는 방식으로 변조할 수 있는 음향 광 변조기를 포함하는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출수단(DE, DF)은 상호작용 방사선의 검출을 위해 설계된 다수의 광감성 센서들을 포함하는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출수단(DE, DF)은, 상호작용 방사선의 검출을 위해 설계되고 절대적(obligatory) 통로에서 분석 방사선의 전반적인 전파 방향을 가로채는 축에 의해 정해진 위치에 삽입된 다수의 감광성 센서들을 포함하며, 상기 축은 전반적인 전파 방향에 대하여 0도 내지 360도의 범위 에 있는 각도로 배향되어 있는 것을 특징으로 하는 기기.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기기는 제어 소프트웨어 인터페이스를 포함하는 컴퓨터 시스템(MC)을 포함하는 것을 특징으로 하는 기기.
- 미시적 요소들을 분석하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은,i) 측정공간(CM) 내의 미시적 요소들이, 상기 측정공간(CM) 내에서 결합되고 적어도 2개의 다른 분석파장들을 가지는 분석 방사선에 의해 조명되고, 다른 선택된 코드들에 따라 상호작용 방사선을 형성하도록 하는 방식으로 부호화되는 제1단계;ii) 상기 상호작용 방사선의 적어도 일부가 수집되고, 그 다음 그것의 파장의 함수로서 분리되고 필터링되는 제2단계;iii) 상기 필터링된 상호작용 방사선은 검출되고, 그 다음 전기신호들로 변환되는 제3단계; 및iv) 상기 검출된 신호들은 그것들의 원본 코드의 함수로서 상기 분석된 미시적 요소들을 나타내는 데이터가 결정되는 것을 허용하는 방식으로 복호화되는 제4단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20항에 있어서, 제1단계에서, 상기 분석 방사선(Ri)은 분석하려는 상기 미시적 요소들에 순차적으로 인가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20항에 있어서, 제1단계에서, 상기 분석 방사선(Ri)은 분석하려는 상기 미시적 요소들에 동시에 인가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제2단계에서, 2개의 분석 파장들 사이에 각각 삽입된 및 최장 분석 파장 너머에 위치된 형광분석 대역들에 속하는 파장들을 가지는 상기 형광 상호작용 방사선은 선택적으로 필터링되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제4단계에서, 분석되는 하나의 유형의 미시적 요소들의 굴절률은 산란 처리를 나타내는 상호작용 방사선의 변환으로 생겨난 신호들로부터 추론되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제4단계에서, 전체 혈액의 시료가 존재할 때, 적혈구내 스트레인(erythrocytic strain)의 세포들의 미립자 헤모글로빈 농도는 상기 굴절률로부터 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제4단계에서, 형광색소들 사이의 에너지 전달을 나타내는 커플링 정도는 상기 분석 방사선 및 2개의 다르나 공간적으론 가까운 형광색소들 사이의 상호작용으로 생겨난 신호들로부터 추론되는 것 을 특징으로 하는 방법.
- 생물학적, 생화학적, 화학적, 미립자, 형태학적 분석, 그리고 특히 다중매개변수 유동 세포 분석, 액상 또는 기상 유체의 대전 입자들의 분석, 및 입자크기 분배를 포함하는 군 내에서 선택된 분야에서의 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 분석 기기 및 방법을 사용하는 방법.
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