具体实施方式:
本发明针对肠易激综合症主要发病机理,研究了芍甘提取物对胃肠运动功能异常动物模型(患病动物)以及对不同介质引起的小肠平滑肌运动所产生的影响,研究结果证明,芍甘提取物对胃肠平滑肌运动功能的紊乱有明显的调节作用,可以用于治疗IBS。
本发明中所用芍甘提取物,采用ZL 02156681.X的方法制备得到。
以下通过与治疗IBS病症相关的专属性实验说明芍甘提取物对胃肠运动机能的影响。
实验中用到的营养性半固体糊的制备:取10g羧甲基纤维素钠,溶于250ml蒸馏水中,非别加入16g奶粉、8g糖、8g淀粉和2g活性碳末,搅拌均匀。配制成300ml约300g的黑色半固体糊。
1.对新斯的明所致小鼠胃排空和小肠推进兴奋的影响
清洁级ICR小鼠40只,体重20-22g,随机分为5组:芍苷提取物高中低剂量组(药物组,400、200、100mg/kg ig给药10ml/kg),模型对照组(ig给予蒸馏水10ml/kg)和空白对照组(每日正常进食),药物组和模型对照组除每日正常进食外,每日一次灌胃药物或蒸馏水,连续5d。5d后,禁食供水18h后,药物组和模型对照组再次灌胃药物或蒸馏水,45min后,空白对照组腹腔注射生理盐水,药物组和模型对照组灌胃给予甲基硫酸新斯的明2mg/kg。15min后各组均灌胃给予营养性半固体糊0.8ml/只,20min后处死动物。打开腹腔,结扎胃喷门和幽门,取胃,用滤纸擦干后称全重,然后沿胃大弯剪开胃体,洗去胃内容物后擦干,称净重。以胃全重和胃净重之差计算胃残留物重量,计算胃内残留物占所灌半固体糊的重量百分比为胃内残留率。同时取出小肠,分离肠系膜,剪取上端至幽门,下端至回盲部的肠管,置于托盘上。轻轻将小肠拉成直线,测量肠管长度作为“小肠总长度”。从幽门至黑色固体糊前沿的距离作为“肠内推进距离”。
小肠推进率(%)=肠内推进距离(cm)/小肠全长(cm)*100%
实验结果参见表1,显示:模型组小鼠的肠内推进距离、小肠推进率,均非常显著性的升高并与空白组相比有非常显著性差异(P<0.01);同时模型组的胃全重和胃残留率与空白组相比有非常显著性的降低,并且有非常显著性的差异(P<0.01)。表明模型组的动物在给予新斯的明后肠蠕动加快,胃排空功能增强,胃肠运动机能处于兴奋的病理模型状态,造模成功。
以400、200mg/kg剂量的芍甘提取物灌胃给予5d后,与模型组比较,小鼠的肠内推进距离和小肠推进率,均显著性的下降,并且有显著性差异(P<0.05)。同时以400、200mg/kg的剂量灌胃给予小鼠芍苷5d后,其胃全重和胃残留率,与模型组比较,均显著性的升高,并且有显著性差异(P<0.05)。提示芍苷在400、200mg/kg剂量时,可以拮抗由新斯的明引起的肠运动和胃排空的兴奋作用,具有明显的舒缓胃和小肠推进作用,使胃肠排空明显降低。
表1芍苷对新斯的明所致小鼠胃排空和小肠推进兴奋的影响
组别 |
剂量(mg/kg) |
肠内推进距离(cm) |
小肠推进率(%) |
胃全重(g) |
胃残留率(%) |
高剂量 |
400 |
36.54±5.86△ |
78.97±9.54△ |
0.6±0.07△△ |
48.61±8.42△△ |
中剂量 |
200 |
3588±4.07△ |
80.59±7.63△ |
0.49±0.12 |
48.55±11.51△ |
低剂量 |
100 |
42.99±1.43 |
87.67±3.51 |
0.5±0.12 |
41.88±12.03 |
模型组 |
--- |
40.91±4.91** |
90.33±7.41** |
0.44±0.06** |
37.90±3.89** |
空白组 |
--- |
25±1.67 |
57.95±5.53 |
0.74±015 |
62.22±8.26 |
注:与空白组相比*P<0.05 **P<0.01.与模型组相比△P<0.05△△P<0.01.
2、对阿托品所致小鼠胃排空和小肠推进抑制的影响:
清洁级ICR小鼠40只,体重20-22g,随机分为5组:芍苷提取物高中低剂量组(药物组,400、200、100mg/kg ig给药10ml/kg),模型对照组(ig给予蒸馏水10ml/kg)和空白对照组(每日正常进食),药物组和模型对照组除每日正常进食外,每日一次灌胃药物或蒸馏水,连续5d。5d后,禁食供水18h后,药物组和模型对照组再次灌胃药物或蒸馏水,45min后,空白对照组腹腔注射生理盐水,药物组和模型对照组腹腔均注射硫酸阿托品0.3mg/kg。15min后各组均灌胃给予营养性半固体糊0.8ml/只,20min后处死动物,打开腹腔,结扎胃喷门和幽门,取胃,用滤纸擦干后称全重,然后沿胃大弯剪开胃体,洗去胃内容物后擦干,称净重。以胃全重和胃净重之差胃残留物重量,计算胃内残留物占所灌半固体糊的重量百分比为胃内残留率。同时取出小肠,分离肠系膜,剪取上端至幽门,下端至回盲部的肠管,置于托盘上。轻轻将小肠拉成直线,测量肠管长度作为“小肠总长度”。从幽门至黑色固体糊前沿的距离作为“肠内推进距离”。
小肠推进率(%)=肠内推进距离(cm)/小肠全长(cm)*100%
实验结果参见表2,显示:与空白组比较,模型组的肠内推进距离、小肠推进率,均非常显著性的降低并与空白组相比有非常显著性差异(P<0.01);同时模型组的胃全重和胃残留率与空白组相比有非常显著性的升高,并且有非常显著性的差异(P<0.01)。表明模型组的动物在给予阿托品后肠蠕动减缓,胃排空功能减弱,胃肠运动机能处于抑制的病理模型状态,造模成功。
与小鼠灌胃给药芍苷提取物5d后的结果相比,模型组小肠推进率有升高作用趋势,但无统计学显著性差异(P>0.05)。表明芍苷提取物对阿托品引起的肠运动和胃排空抑制作用不显著,但具有一定的改善作用。
表2芍苷对阿托品所致小鼠胃排空和小肠推进抑制的影响
组别 |
剂量(mg/kg) |
肠内推进距离(cm) |
小肠推进率(%) |
胃全重(g) |
胃残留率(%) |
高剂量 |
400 |
19.57±5.38 |
42.12±2.63 |
1.21±0.18 |
80.22±2.79 |
中剂量 |
200 |
16.66±4.52 |
39.33±5.01 |
1.14±0.14 |
77.12±4.31 |
低剂量 |
100 |
14.98±4.28 |
38.55±9.12 |
1.24±0.33 |
78.74±5.32 |
模型组 |
--- |
13.85±4.22** |
32.23±5.25** |
1.51±0.35** |
82.13±5.36** |
空白组 |
--- |
26.11±4.35 |
58.88±6.22 |
0.74±0.15 |
62.22±8.26 |
注:与空白组相比*P<0.05**P<0.01. 与模型组相比△P<0.05△△P<0.01.
3.对大鼠离体小肠运动的影响
该实验中保养液的制备:NaCl 5.54g、KCl 0.35g、CaCl20.28g、葡萄糖2.1g、KH2PO40.16g、MgSO4.7H2O 0.29g、NaHCO32.1g,加蒸馏水定容至1L。
标本的制备:大鼠禁食12h后,麻醉后打开腹腔取出肠段后,祛除系膜和脂肪,放在37℃的保养液中,洗去内容物后,制成1~2cm的肠组织标本。
运动曲线的记录:描记时将组织标本放于充氧的含有保养液的浴槽中,然后将组织的一端固定于支持杠上,另一端连线于张力换能器上(压力传感器)。给予1~1.5g的拉力后,通过记录仪观察其运动曲线。待其运动曲线平稳后加入芍苷提取物药液、激动剂或空白溶媒观察其运动曲线的变化,记录给药前后运动频率和幅度的变化。
1)对组胺(His)致肠平滑肌痉挛的拮抗作用
大鼠随机分为4组,空白溶媒组和芍苷提取物高中低剂量组(药物组,加入浴槽后使芍苷提取物终浓度0.5、0.125、0.03mg/ml)。
按上述方法取各组正常大鼠离体肠取材部位,制成肠组织标本。肠段稳定后,分别描记一段正常收缩曲线,然后分别给予1×10-11mol/L His溶液0.2ml,此时肠平滑肌随即出现强直收缩,曲线上升。继续描记一段加入激动剂His溶液后的曲线,然后药物组分别给予芍甘提取物三个剂量。记录给药前后运动频率和幅度的变化。
实验结果表明:
a)对His致肠平滑肌痉挛的运动频率的影响作用(参见表3)
在肠样本运动曲线平稳后加入His后,其离体小肠的运动频率与给药前相比无显著性差异(P>0.05),说明His的加入对离体小肠的运动频率无显著性的影响作用。同时芍苷提取物的三个剂量对离体小肠的运动频率与加入His后相比均无显著性差异(P>0.05),说明芍苷提取物在终浓度为0.5、0.125、0.03mg/ml 1时,对离体小肠的运动频率无显著性的影响作用。
表3芍苷对加入His后离体小肠收缩频率变化的影响(
n=7)
分组 |
剂量(mg/ml) |
给药前 |
加入His |
给药后 |
高剂量组 |
0.5 |
26.14±2.27 |
27±2.45 |
26.57±2.7 |
中剂量组 |
0.125 |
27±2.45 |
26.14±2.27 |
26.14±2.27 |
低剂量组 |
0.03 |
26.57±2.7 |
26.57±2.07 |
26.14±2.27 |
空白组 |
- |
26.57±2.7 |
27.00±2.45 |
26.57±2.7 |
b)对His致肠平滑肌痉挛的运动幅度的影响作用(参见表4)
离体小肠在其运动曲线平稳后加入1×10-11mol/L His溶液0.2ml,4个实验组的离体小肠收缩幅度与给药前比较均有显著性差异(P<0.05),提示His溶液的加入使得离体小肠的收缩显著加强,并与给药前比较有显著性差异(P<0.05)。而加入芍苷提取物后,在终浓度为0.125和0.5mg/ml剂量时,与加入His后的收缩幅度比较,其离体小肠的收缩幅度显著性的降低,并有显著性的差异(P<0.05)。其对His致肠平滑肌痉挛的运动幅度的抑制率分别达到了42.62%和32.63%,提示芍苷提取物对His致肠平滑肌痉挛在终浓度为0.125~0.5mg/ml剂量范围内有明显的拮抗作用,并且量效关系明显。
表4芍苷对加入His后离体小肠收缩幅度变化的影响(
n=7)
分组 |
剂量(mg/ml) |
给药前(2mm) |
加入His(2mm) |
给药后(2mm) |
抑制率(%) |
高剂量组 |
0.5 |
10.89±3.12 |
18.63±3.84* |
11.63±2.83△△ |
42.62 |
中剂量组 |
0.125 |
11.20±2.28 |
17.34±4.00** |
11.59±2.97△ |
32.63 |
低剂量组 |
0.03 |
7.87±2.71 |
11.67±2.9** |
9.00±3.22 |
23.17 |
空白组 |
- |
9.91±3.55 |
18.37±7.98* |
16.07±7.4 |
12.84 |
注:与给药前相比*P<0.05 **P<0.01.与加入His相比△P<0.05 △△P<0.01.
2)对5-HT致肠平滑肌痉挛的拮抗作用
大鼠随机分为4组,空白组和芍苷提取物高中低剂量组(药物组,加入浴槽后使芍苷提取物终浓度0.5、0.125、0.03mg/ml)。
按上述方法取各组正常大鼠离体肠取材部位,制成肠组织标本。肠段稳定后,描记一段正常收缩曲线,然后分别给予1×10-7mol/L 5-HT溶液0.2ml,肠平滑肌随即出现强直收缩,曲线上升。继续描记一段加入激动剂5-HT溶液后的曲线,药物组分别给予芍甘提取物三个剂量。记录给药前后运动频率和幅度的变化。
实验结果表明:
a)对运动频率的影响作用(参见表5):
在肠样本运动曲线平稳后加入5-HT后,其离体小肠的运动频率与给药前相比无显著性差异(P>0.05),说明5-HT的加入对离体小肠的运动频率无显著性的影响作用。同时芍苷提取物的三个剂量对离体小肠的运动频率与加入5-HT后相比均无显著性差异(P>0.05),说明芍苷提取物在终浓度为0.5、0.125、0.03mg/ml 1时,对离体小肠的运动频率无显著性的影响作用。
表5对加入5-HT后离体小肠收缩频率变化的影响(
n=7)
分组 |
剂量(mg/ml) |
给药前 |
加入5-HT |
给药后 |
高剂量组 |
0.5 |
27±2.45 |
26.14±2.27 |
27±2.45 |
中剂量组 |
0.125 |
27±2.45 |
27±2.45 |
26.57±2.07 |
低剂量组 |
0.03 |
27.43±2.07 |
27.43±2.7 |
27±2.45 |
空白组 |
- |
8.86±0.9 |
9±0.82 |
8.86±0.9 |
b)对运动幅度的影响作用(参见表6):
离体小肠在其运动曲线平稳后加入1×10-7mol/L 5-HT溶液0.2ml,实验结果参见表6。
表6芍苷对5-HT引起离体小肠收缩幅度的影响(
n=7)
分组 |
剂量(mg/ml) |
给药前(2mm) |
加入5-HT(2mm) |
给药后(2mm) |
抑制率(%) |
高剂量组 |
0.5 |
10.73±2.89 |
17.91±6.56* |
8.89±3.09△ |
49.03 |
中剂量组 |
0.125 |
10.54±4.58 |
17.64±6.88* |
9.27±4.15△ |
46.89 |
低剂量组 |
0.03 |
8.84±2.29 |
13.33±4.27* |
11.16±5.66 |
16.73 |
空白组 |
- |
9.91±3.55 |
18.37±7.98* |
16.07±7.4 |
12.84 |
注:与给药前相比*P<0.05 **P<0.01.与加入5-HT相比△P<0.05 △△P<0.01.
表6数据显示,四个实验组的离体小肠收缩幅度与给药前比较均有显著性差异(P<0.05),提示5-HT溶液的加入使得离体小肠的收缩显著加强,并与给药前比较有显著性差异(P<0.05)。而加入芍苷提取物后,在终浓度为0.125和0.5mg/ml剂量时,与加入5-HT后的收缩幅度比较,其离体小肠的收缩幅度显著性的降低,并有显著性的差异(P<0.05)。其对His致肠平滑肌痉挛的运动幅度的抑制率分别达到了49.03%和46.89%,提示芍苷提取物对5-HT致肠平滑肌痉挛在终浓度为0.125~0.5mg/ml剂量范围内有明显的拮抗作用。
上述通过体内、体外研究试验综合表明,芍苷提取物对肠道运动的异常兴奋有显著的拮抗作用,对于肠道运动被异常抑制显示一定的作用趋势,具有一定的改善作用,对于介质5-羟色胺5-HT、组胺(His)引起的平滑肌痉挛显示明显的拮抗作用。以上结果提示,芍苷提取物可以可以调节肠道功能的紊乱,对多种因素引起的内脏平滑肌运动紊乱有良好的的调节作用。说明芍药甘草提取物可以作为治疗IBS的药物。
依据上述动物实验推算,本发明芍药甘草提取物作为治疗IBS的药物的有效剂量可以在1~5g/天·人的范围内。
以本发明芍药甘草提取物为药用活性成分制成的治疗IBS的药物或组合药物也属于对本发明的应用,以该药物有效剂量用于对哺乳动物优选人的IBS治疗,药物有效剂量包括对所述疾病提供缓解或治疗作用的剂量,也属于对本发明的应用。
本发明芍药甘草提取物或其组合物可用口服方法或其他方法用药。口服用药可以是片剂、丸剂、粉末混合物、颗粒剂、胶囊剂、包衣剂、溶液、乳剂、分散剂,也可以用注射剂、栓剂或其它适宜的形式。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备的。如制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的助剂,例如淀粉,明胶,阿拉伯胶,硅石,聚乙二醇,液体剂型所用的溶剂例如水,乙醇,丙二醇,植物油类如玉米油,花生油,橄榄油等。含有本发明芍药甘草提取物的制剂中还可有其它助剂,例如表面活性剂,润滑剂,崩解剂,防腐剂,矫味剂,色素等。毫无疑问,制备这些可能的制剂也属于对本发明的应用。