CN101184503A - 含全细胞百日咳抗原的组合疫苗 - Google Patents

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Abstract

已经研究了包含(a)D－T－Pw－HepB－Hib抗原和(b)一种或多种脑膜炎球菌偶联物抗原的疫苗。已经公开了关于这些疫苗的许多改进和变化。可通过将以下两种组分混合在一起来临时制备疫苗：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含Hib偶联物和一种或多种脑膜炎球菌偶联物的第二组分。

Description

含全细胞百日咳抗原的组合疫苗
本文所引用的所有文献都已完整纳入本文作为参考。
技术领域
本发明属于组合疫苗领域，所述组合疫苗是含有来自一种以上病原体的免疫原混合物的疫苗，因此，给予这种疫苗可使对象同时获得对一种以上病原体的免疫力。
背景技术
组合疫苗对患者的益处在于能减少注射次数，从而带来顺应性提高的临床优势(例如参见参考文献1的第29章)。具体涉及的(尤其是在儿童中)六种病原体是白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(造成白喉)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)(造成破伤风/牙关紧闭症)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)(百日咳)、乙肝病毒(‘HepB’，病毒性肝炎)、b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(‘Hib’，造成细菌性脑膜炎和肺炎)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(脑膜炎球菌性脑膜炎和败血病)。
抵抗这些病原体中每一种的疫苗是已知的，包含‘D’、‘T’、‘P’、‘HepB’和‘Hib’组分的所有五种以同时组合给药的五价疫苗由GlaxoSmithKline销售，其商品名为TRITANRIX-HepB/Hib。这种五价疫苗中的‘P’组分基于全细胞百日咳(‘Pw’)抗原。该疫苗中的DTP和HepB组分是装在药瓶中的混合溶液(这种四价DTPw-HepB组合物作为‘TRITANRIX-HepB’产品单独销售)，但Hib组分被冻干并装在单独的药瓶中。DTPw-HepB溶液被用来在使用时重建Hib组分，从而在药瓶中临时形成五价疫苗。
TRITANRIX-HepB/Hib不能抵抗脑膜炎球菌感染。
参考文献2的实施例3公开了人临床试验的结果，其中将四价TRITANRIX-HepB产品与来自Hib和来自脑膜炎球菌血清组A和C(‘MenA’和‘MenC’)的偶联的荚膜糖临时混合。作者称这种七价混合物诱导了抗每种抗原的良好免疫应答并被婴儿良好耐受。未给出关于Hib、MenA和MenC组分的全部细节。
参考文献3和4也报道了类似的信息。
本发明的一个目的是提供进一步的并改进的组合疫苗以抵抗所有六种白喉棒状杆菌、破伤风梭菌、百日咳博德特氏菌、乙肝病毒、b型流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟氏球菌。
发明概述
本发明基于对包含D-T-Pw-HepB-Hib抗原(TRITANRIX-HepB/Hib产品也含有该抗原)且同时包含一种或多种脑膜炎球菌偶联物抗原的疫苗的研究。已经公开了关于这些疫苗的许多改进和变化，这些是本发明的主题。
本发明的疫苗包含：
(i)白喉类毒素‘D’；
(ii)破伤风类毒素‘T’；
(iii)细胞百日咳抗原‘wP’；
(iv)乙肝病毒表面抗原‘HBsAg’；
(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖；
(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。
所述脑膜炎球菌糖类可来自血清组A、C、W135和Y中的一种或多种。这四种血清组通常被称为‘MenA’、‘MenC’、‘MenW135’和‘MenY’。偶联抗原在文中通常被称为‘MenA-X’等，其中‘X’表示偶联物的载体蛋白。含有特定载体蛋白的偶联物则被称为‘MenA-CRM’或‘MenC-D’等。
优选的疫苗含有至少血清组C的，优选同时含有血清组A和C的脑膜炎球菌偶联物。因此，优选的疫苗是六价的(D-T-Pw-HBsAg-Hib-MenC)或七价的(D-T-Pw-HBsAg-Hib-MenA-MenC)。
除了上述抗原(i)-(vi)，也可存在其它抗原以产生例如8价、9价、10价等疫苗。
本发明的疫苗在制造时可被制成液体形式(即所有抗原都含在水性溶液或悬浮液中)，或者可在使用时将以下两种组分混合在一起而临时制备：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含Hib和脑膜炎球菌偶联物的第二组分。这两种组分优选装在分开的容器中(例如药瓶和/或注射器)，本发明提供了包含组分(a)和(b)的试剂盒。第一容器的内容物优选为水性的，第二容器的内容物优选为冻干的，从而可通过用水性D-T-wP-HBsAg组分重建冻干组分来制备本发明的疫苗。
(1)Hib偶联物的重量比
Hib偶联物是熟知的，但它们可以有各种形式。例如，参考文献1的表14-7给出了四种不同Hib偶联物的特性。该表称，糖∶载体的重量比在‘PRP-D’的1.4∶1(糖过量)和‘PRP-OMP’的0.06∶1(蛋白质过量)之间变化。所有这些偶联物都曾用于组合疫苗，但本发明的一个方面选择特定的重量比范围用于含有脑膜炎球菌偶联物的组合疫苗。
曾报道Hib偶联物中载体蛋白与糖类的重量比在组合疫苗的功效中具有重要作用。根据参考文献5，在载体蛋白也作为抗原的组合疫苗(例如，如本发明中一样，破伤风类毒素被同时用作载体和抗原)中，Hib偶联物应当具有1∶0.3和1∶2之间的糖∶载体重量比。
相反，根据本发明，糖与载体的重量比可超过该范围，并在1∶2和1∶4之间。在组合儿科疫苗中，该范围内的Hib偶联物当与脑膜炎球菌偶联物组合时显示出极好的免疫原性且不会造成任何免疫干扰，即便该载体蛋白还以游离抗原存在(例如，当载体蛋白是破伤风类毒素或白喉类毒素时)。实际上，过量的载体蛋白有助于提供对例如破伤风或白喉的免疫力。
因此，本发明提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其特征在于，上述流感嗜血杆菌偶联物具有超过糖重量的载体，且其中载体与糖的重量比在2∶1和4∶1之间。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的组合疫苗的方法：(i)白喉类毒素(‘D’)，(ii)破伤风类毒素(‘T’)，(iii)细胞百日咳抗原(‘Pw’)，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合以得到四价D-T-Pw-HBsAg组分；(b)将流感嗜血杆菌偶联物与脑膜炎奈瑟氏球菌偶联物组合以得到混合的偶联物组分，其中，所述流感嗜血杆菌偶联物具有超过糖重量的载体，且载体与糖的重量比在2∶1和4∶1之间；和(c)将D-T-Pw-HBsAg组分与偶联物组分混合以得到组合疫苗。
Hib偶联物具有重量过量的载体蛋白。其重量比在2∶1和4∶1之间，且优选在2.5∶1和3.5∶1之间。可采用2.8∶1和3.2∶1之间的重量比，优选重量比约为3∶1。因此在典型的10μg(以糖测量)剂量中，本发明的组合物将含有20-40μg载体，优选约30μg。这种比例与参考文献5的教导完全相反。
Hib偶联物的载体蛋白优选为破伤风类毒素，因此对于10μg Hib糖类而言，该组合物可包含20-40μg来自Hib偶联物的破伤风类毒素再加上作为‘T’抗原的破伤风类毒素，以抵抗破伤风梭菌感染。
优选的组合物和方法采用来自血清组C的脑膜炎球菌偶联物。更优选的组合物和方法采用来自血清组A和C的不同的脑膜炎球菌偶联物。它们优选偶联到流感嗜血杆菌D蛋白载体，但它们也可偶联到破伤风类毒素载体、白喉类毒素载体或CRM197载体。
(2)Hib偶联物中的载体/糖连接
如参考文献1的表14-7所示，采用了各种不同的连接化学性质来制造Hib偶联物。一些偶联物是通过活化糖类形成的，一些是通过活化载体形成的，而一些是通过活化这两者形成的。对于糖类活化，在‘HbOC’产品中使用高碘酸盐(periodiate)和氰基硼酸盐(cyanoborohydrate)，在‘TRP-T’产品中使用ADH、CNB和盐酸碳二亚胺。所有这些偶联物都已被用于组合疫苗，但本发明的一个方面选择特定类型的连接用于含有脑膜炎球菌偶联物的组合疫苗。
根据本发明，多糖可首先用溴化氰活化，然后偶联到己二酸接头上，然后使这种接头-糖部分与载体蛋白、尤其是与破伤风类毒素载体蛋白反应。
第一个步骤涉及Hib糖类上的游离-OH基团的氰化，如下所示：
Figure S200680014588XD00041
该反应是用溴化氰(CNBr)完成的。简言之，使CNBr在酸性条件(通常为pH10-12)下与糖反应。在这种高pH下，形成了带有糖的羟基的氰酸酯。这种高pH使羟基电离从而对氰酸根离子上的羟基离子发动亲核攻击。由于这种高pH，可发生各种副反应，但只有氰酸酯形成是本发明的目的。
使氰酸酯与双官能试剂(异双官能试剂或者优选同双官能试剂)反应以提供连接载体的间隔物。根据本发明，可采用己二酸酰肼间隔物。这通常可用己二酸二酰肼(AADH)实现：
Figure S200680014588XD00051
AADH与氰酸酯的反应(形成亚氨氨基甲酸酯(imidocarbamate)连接)的机制如下所示：
Figure S200680014588XD00052
活化的糖然后在存在EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)时与破伤风类毒素载体反应：
Figure S200680014588XD00053
EDAC通常以其盐酸盐的形式使用：
(CH3)2N(CH2)3-N＝C＝N-CH2CH3·HCl
EDAC使己二酸接头游离端的羧基与载体蛋白(通常是氨基酸侧链上的游离-SH、-NH2或-OH)反应形成如下所示的偶联物，其中-X-是源于载体的-S-、-O-或-NH-：
Figure S200680014588XD00054
在含水条件下，C＝NH可转化成C＝O以得到氨基甲酸酯：
Figure S200680014588XD00055
因此，本发明提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其特征在于，流感嗜血杆菌偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)用溴化氰活化b型流感嗜血杆菌荚膜糖以得到氰酸酯；(b)在氰酸酯中加入己二酸酰肼间隔物以得到活化的糖；和(c)通过碳二亚胺缩合将活化的糖偶联到载体蛋白。
本发明还提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其特征在于，(v)的流感嗜血杆菌偶联物包含具有以下两种结构之一的接头：
其中，-X-选自-O-、-S-或-NH-。优选氨基甲酸酯。Hib偶联物的载体蛋白优选为破伤风类毒素。
优选的组合物和方法采用来自血清组C的脑膜炎球菌偶联物，更优选的组合物和方法采用来自血清组A和C的不同的脑膜炎球菌偶联物。它们优选偶联到流感嗜血杆菌D蛋白载体。Hib、MenA和MenC偶联物的混合物可与其它疫苗混合使用或者将其本身作为疫苗使用。因此，本发明还提供了一种偶联物混合物，其中包含：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，所示流感嗜血杆菌偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)用溴化氰活化b型流感嗜血杆菌荚膜糖以得到氰酸酯；(b)在氰酸酯中加入己二酸酰肼间隔物以得到活化的糖；和(c)通过碳二亚胺缩合将活化的糖偶联到载体蛋白。
本发明还提供了一种偶联物混合物，其中包含：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，(i)的流感嗜血杆菌偶联物包含具有以下两种结构之一的接头：
其中，-X-选自-O-、-S-或-NH-。优选氨基甲酸酯。
(3)脑膜炎球菌偶联物中直接的载体-糖连接
上述Hib偶联物通过间隔物连接到载体蛋白。相反，在脑膜炎球菌偶联物中优选采用直接连接。已发现直接连接特别适合于脑膜炎球菌偶联物，尤其是将D蛋白用作载体且Hib偶联物不采用直接连接时(以避免接头越过其可能产生免疫原性的任何可能极限)。
在直接连接情况中，脑膜炎球菌糖类中的-OH基团首先被氰化(例如，如上所述)以得到氰酸酯。-OCN基团然后被用来直接连接到载体中的侧链，如游离的-NH2基团、游离-SH基团或游离的-OH基团。优选连接赖氨酸侧链中的游离-NH2。
直接连接的机制可如下所示：
Figure S200680014588XD00072
这种反应的偶联产物可如下所示：
在含水条件下，C＝NH可被转化成C＝O以得到氨基甲酸酯：
Figure S200680014588XD00074
除了使用溴化氰作为氰化剂，氰化反应优选使用有机氰化试剂如1-氰基-4-(二甲基氨基)-吡啶试剂(‘CDAP’)进行。有机氰化试剂可选自以下：1-氰基-4-(二甲基氨基)-吡啶四氟硼酸盐、对-硝基苯基氰酸盐(‘pNPC’)和N-氰基三乙基-铵四氟硼酸盐(‘CTEA’)。使用这些试剂意味着活化反应可在中性pH下进行，这有助于保持多糖的稳定性和完整性。具体地说，这有助于保留-Oac基团(见下文)。在优选的方法中，所述氰化试剂在pH6-8时在非亲核缓冲液如盐水、HEPES、磷酸盐、水和一些有机溶剂中使用[6]。CDAP可溶于乙腈并加入糖的水溶液中。偶联后，可加入甘氨酸终止反应，甘氨酸能封闭任何未反应的氰酸根。
就脑膜炎球菌血清组A偶联物而言，本发明提供了一种组合疫苗，其中包含：
(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，其特征在于，血清组A偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组A的荚膜糖以得到氰酸酯；和(b)将氰酸酯直接偶联到蛋白质载体。该疫苗还可包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的偶联物混合物的方法：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，血清组A偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组A的荚膜糖以得到氰酸酯；和(b)将氰酸酯直接偶联到载体蛋白。
就脑膜炎球菌血清组C偶联物而言，本发明提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，血清组C偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组C的荚膜糖以得到氰酸酯；和(b)将氰酸酯直接偶联到载体蛋白。该疫苗还可包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的偶联物混合物的方法：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，血清组C偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组C的荚膜糖以得到氰酸酯；和(b)将氰酸酯直接偶联到载体蛋白。
本发明还提供了疫苗和方法，其中，血清组A和血清组C的偶联物都是用这种方法制备的，然后将它们混合。也可加入Hib偶联物以得到含有Hib、MenA和MenC中所有三种的偶联物混合物。
(4)血清组C偶联物的O-乙酰化
脑膜炎球菌血清组C的荚膜糖是一种α2→9-连接的唾液酸(N-乙酰神经氨酸)的均聚物，其在C-7或C-8残基上通常具有O-乙酰(OAc)基：
Figure S200680014588XD00091
                                        R＝-H或-COCH3
→9)-NeupNAc 7/8 OAc-(α2→
一些MenC菌株(约占侵袭性分离物的12％)产生缺乏这种Oac基团的多糖。Oac基团的存在或不存在产生独特表位，且抗体结合糖类的特异性可影响其抗O-乙酰化(OAc-)和脱-O-乙酰化(OAc+)菌株的杀菌活性[7-9]。批准的MenC偶联物疫苗包含OAc-(NeisVac-CTM)和OAc+(MenjugateTM和MeningitecTM)糖类。
根据本发明，可使用OAc+或OAc-菌株。
因此，本发明提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，(vi)的血清组C的荚膜糖中至少50％的唾液酸残基在C-7或C-8位被O-乙酰化。
本发明还提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，血清组C的荚膜糖来自OAc+菌株。
本发明还提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，(vii)的血清组C的荚膜糖中的唾液酸残基未被O-乙酰化。
本发明还提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，血清组C的荚膜糖来自OAc-菌株。这些疫苗还可包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的组合疫苗的方法：(i)白喉类毒素(‘D’)，(ii)破伤风类毒素(‘T’)，(iii)细胞百日咳抗原(Tw’)，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合以得到四价D-T-Pw-HBsAg组分；(b)将流感嗜血杆菌偶联物和脑膜炎奈瑟氏球菌偶联物组合以得到混合的偶联物组分，其中，(vii)的血清组C的荚膜糖中至少50％的唾液酸残基在C-7或C-8位被O-乙酰化。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的组合疫苗的方法：(i)白喉类毒素(‘D’)，(ii)破伤风类毒素(‘T’)，(iii)细胞百日咳抗原(Tw’)，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合以得到四价D-T-Pw-HBsAg组分；(b)将流感嗜血杆菌偶联物与脑膜炎奈瑟氏球菌偶联物组合以得到混合的偶联物组分，其中，(vii)的血清组C的荚膜糖中的唾液酸残基未被O-乙酰化。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的组合疫苗的方法：(i)白喉类毒素(‘D’)，(ii)破伤风类毒素(‘T’)，(iii)细胞百日咳抗原(‘Pw’)，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合以得到四价D-T-Pw-HBsAg组分；(b)将流感嗜血杆菌偶联物与脑膜炎奈瑟氏球菌偶联物组合以得到混合的偶联物组分，其中，血清组C的荚膜糖来自OAc-菌株。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的组合疫苗的方法：(i)白喉类毒素(‘D’)，(ii)破伤风类毒素(‘T’)，(iii)细胞百日咳抗原(‘Pw’)，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合以得到四价D-T-Pw-HBsAg组分；(b)将流感嗜血杆菌偶联物与脑膜炎奈瑟氏球菌偶联物组合以得到混合的偶联物组分，其中，血清组C的荚膜糖来自OAc+菌株。
用这些方法制备的疫苗还可包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖。
本发明还提供了一种偶联物混合物，其中包含：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，MenC偶联物中的唾液酸残基未被O-乙酰化。
本发明还提供了一种偶联物混合物，其中包含：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，MenC荚膜糖来自OAc-菌株。
本发明还提供了一种偶联物混合物，其中包含：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，MenC偶联物中至少50％的唾液酸残基在C-7或C-8位被O-乙酰化。
本发明还提供了一种偶联物混合物，其中包含：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，MenC荚膜糖来自OAc+菌株。
其中，血清组C偶联物中至少50％的唾液酸残基被O-乙酰化，该最低百分比可以较高，例如为60％、70％、80％、90％或更高。
优选的制造血清组C偶联物的菌株是OAc+菌株，优选血清型16，优选血清亚型P1.7a，1。因此优选C：16：P1.7a，1 OAc+菌株。
(5)血清组A偶联物的O-乙酰化
脑膜炎球菌血清组A的荚膜糖是α1→6连接的N-乙酰-甘露糖胺-磷酸的均聚物，其在C-3和C-4位被部分O-乙酰化：
Figure S200680014588XD00121
                              R＝-H或-COCH3
C-3位的乙酰化可高达70-95％。用来纯化糖的条件可导致脱-O-乙酰化(例如，在碱性条件下)，但本发明试图保留OAc。
因此，本发明提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，其特征在于，血清组A的荚膜糖中至少50％的甘露糖胺残基在C-3位被O-乙酰化。该疫苗还可包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的组合疫苗的方法：(i)白喉类毒素(‘D’)，(ii)破伤风类毒素(‘T’)，(iii)细胞百日咳抗原(‘Pw’)，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合以得到四价D-T-Pw-HBsAg组分；(b)将流感嗜血杆菌偶联物与脑膜炎奈瑟氏球菌偶联物组合以得到混合的偶联物组分，其中，血清组A的荚膜糖中至少50％的甘露糖胺残基在C-3位被O-乙酰化。
通过该方法制造的疫苗还可包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖。
本发明还提供了一种偶联物混合物，其中包含：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，血清组A的荚膜糖中至少50％的甘露糖胺残基在C-3位被O-乙酰化。
其中，血清组A偶联物中至少50％的甘露糖胺残基被O-乙酰化，该最低百分比可以较高，例如为60％、70％、80％、90％或更高。
(6)偶联物剂量
Hib-偶联抗原的制造并不便宜，已经开发了各种节省其用量的策略[10-12]。一种方法是以低于标准10μg/剂的剂量给予两剂偶联物(通常的比例为，例如，、、等)[10，12]。例如，在参考文献12中，以5μg/剂或3.33μg/剂，即正常剂量的或，给予Hib-偶联物。
相同的方法已用于DTP-Hib疫苗中的Hib-偶联物。例如，参考文献13比较了与DTwP疫苗组合使用全剂量、半剂量和三分之一剂量的Hib-偶联物，尽管与单独给予DTP和Hib相比，接受组合DTP-Hib疫苗的患者中抗-PRP抗体的几何平均浓度降低，但在所有病例中都观察到可接受的保护性抗-Hib免疫应答。参考文献14使用了通过用10剂量瓶DTwP重建单剂Hib得到的稀释10倍的Hib-偶联物剂量。参考文献2披露了用TRITANREKTM DTwP-HbsAg疫苗重建全剂量、半剂量或四分之一剂量的冻干Hib-偶联物。
未报道对组合疫苗中的脑膜炎球菌偶联物进行过类似的剂量研究。对于本发明的组合疫苗，选择的Hib和脑膜炎球菌偶联物的量为8-12μg(以糖测量)。该量可存在于单一单位剂量中，或者可存在于每毫升疫苗中。
因此，本发明提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其特征在于，该疫苗含有8-12μg/ml b型流感嗜血杆菌荚膜糖。优选的同时包含血清组A和C的脑膜炎球菌偶联物。
本发明还提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，其特征在于，该疫苗含有8-12μg/ml脑膜炎球菌血清组A的荚膜糖。该疫苗优选还包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖。
本发明还提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，该疫苗含有8-12μg/ml脑膜炎球菌血清组C的荚膜糖。该疫苗优选还包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖。
本发明提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其特征在于，该疫苗含有8-12μg b型流感嗜血杆菌荚膜糖/单位剂量。优选同时包含血清组A和C的脑膜炎球菌偶联物。
本发明还提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，其特征在于，该疫苗含有8-12μg脑膜炎球菌血清组A的荚膜糖/单位剂量。该疫苗优选还包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖。
本发明还提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，该疫苗含有8-12μg脑膜炎球菌血清组C的荚膜糖/单位剂量。该疫苗优选还包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖。
对所有三种Hib、MenA和MenC偶联物而言，优选疫苗的糖剂量为8-12μg(每毫升或每单位剂量)。
(7)制备本发明的疫苗的临时方法
如上所述，本发明的疫苗可在使用时将以下两种组分混合在一起而临时制备：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含Hib偶联物和至少一种脑膜炎球菌偶联物的第二组分。这两种组分宜单独包装，因此，通常本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒中装有：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含Hib偶联物和至少一种脑膜炎球菌偶联物的第二组分。该方法避免了在含水储存条件下可能发生的偶联物的解聚，而解聚是Hib和MenA偶联物的特殊问题，尤其是当其组合时。
(a)和(b)两种组分被单独包装在例如分开的药瓶中。第一个药瓶(装有D-T-wP-HBsAg)的内容物优选为水性的，而第二个药瓶(装有偶联物)的内容物优选是冻干的，从而可通过用水性组分重建冻干组分来制备本发明的疫苗。因此，本发明提供了一种制备本发明的疫苗组合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)以含水形式提供包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；(b)以冻干形式提供包含Hib和脑膜炎球菌偶联物的第二组分；和(c)将第一和第二组分混合以得到疫苗。混合步骤通常在使用时发生。
本发明还提供了一种制备本发明的试剂盒的方法，其包括以下步骤：(a)获得或制备包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；(b)获得或制备包含Hib和脑膜炎球菌偶联物的第二组分；和(c)将这两种组分组合成试剂盒的形式。
更具体地说，本发明提供了：
-一种试剂盒，其中装有：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的第二组分，其特征在于，流感嗜血杆菌偶联物具有超过糖重量的载体，且载体与糖的重量比在2∶1和4∶1之间。
-一种制备本发明的试剂盒的方法，其包括以下步骤：(a)制备包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；(b)制备包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的第二组分，其特征在于，流感嗜血杆菌偶联物具有超过糖重量的载体，且载体蛋白与糖的重量比在2∶1和4∶1之间；和(c)将这两种组分组合成试剂盒的形式。
-一种试剂盒，其中装有：(i)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(ii)包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的第二组分，其特征在于，流感嗜血杆菌偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)用溴化氰活化b型流感嗜血杆菌荚膜糖以得到氰酸酯；(b)在氰酸酯中加入已二酸酰肼间隔物以得到活化的糖；和(c)通过碳二亚胺缩合将活化的糖偶联到载体蛋白。
-一种试剂盒，其中装有：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的第二组分，其特征在于，流感嗜血杆菌偶联物包含具有以下两种结构之一的接头：
Figure S200680014588XD00161
其中，-X-选自-O-、-S-或-NH-。
-一种制备本发明的试剂盒的方法，其包括以下步骤：(i)制备包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；(ii)制备包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的第二组分；和(iii)将这两种组分组合成试剂盒的形式，其特征在于，流感嗜血杆菌偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)用溴化氰活化b型流感嗜血杆菌荚膜糖以得到氰酸酯；(b)在氰酸酯中加入己二酸酰肼间隔物以得到活化的糖；和(c)通过碳二亚胺缩合将活化的糖偶联到载体蛋白。一种制备本发明的试剂盒的方法，其包括以下步骤：(a)制备包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；(b)制备包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的第二组分；和(c)将这两种组分组合成试剂盒的形式，其特征在于，流感嗜血杆菌偶联物包含具有以下两种结构之一的接头：
Figure S200680014588XD00162
  其中，-X-选自-O-、-S-或-NH-。
  -一种制备本发明的试剂盒的方法，其包括以下步骤：(i)制备包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；(ii)制备包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的第二组分，其特征在于，脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组A的荚膜糖以得到氰酸酯；和(b)将氰酸酯直接偶联到载体蛋白。
-一种制备本发明的试剂盒的方法，其包括以下步骤：(a)制备包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；(b)制备包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖的第二组分，其特征在于，脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组C的荚膜糖以得到氰酸酯；和(b)将氰酸酯直接偶联到载体蛋白。
-一种制备本发明的试剂盒的方法，其包括以下步骤：(i)制备包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；(ii)制备包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖的第二组分，其特征在于，脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组A的荚膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯与双官能接头反应以得到活化的糖；和(c)将活化的糖偶联到载体蛋白。
-一种制备本发明的试剂盒的方法，其包括以下步骤：(i)制备包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；(ii)制备包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖的第二组分，其特征在于，脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组C的荚膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯与双官能接头反应以得到活化的糖；和(c)将活化的糖偶联到蛋白质载体。
-一种试剂盒，其中装有：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖的第二组分，其特征在于，脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C偶联物中至少50％的唾液酸残基在C-7或C-8位被O-乙酰化。
-一种试剂盒，其中装有：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖的第二组分，其特征在于，脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C偶联物中的唾液酸残基未被O-乙酰化。
-一种试剂盒，其中装有：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖的第二组分，其特征在于，脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖来自OAc+菌株。
-一种试剂盒，其中装有：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖的第二组分，其特征在于，脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖来自OAc-菌株。
-一种试剂盒，其中装有：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖的第二组分，其特征在于，血清组A的荚膜糖中至少50％的甘露糖胺残基在C-3位被O-乙酰化。
-一种制备本发明的试剂盒的方法，其包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合以得到第一试剂盒组分；和(b)将偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖、偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖和偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖组合以得到第二试剂盒组分。
优选通过混合DTPw组分和HBsAg组分来制造试剂盒的第一组分。试剂盒的第二组分优选为包含以下组分的三价偶联物组分：(1)偶联到载体蛋白的流感嗜血杆菌的荚膜糖；(2)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖；和(3)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖。
(8)制备本发明的疫苗的方法
优选的本发明七价疫苗包含以下七种抗原性组分：D、T、Pw、HbsAg、Hib-X、MenA-X和MenC-X。尽管原则上可以任何顺序将它们混合，但如上所述，特别优选的是制备第一组分(含D、T、Pw和HBsAg抗原)和第二组分(含Hib、MenA和MenC偶联物)并在使用时合并这两种组分。
此外，优选将D-T-Pw组分与HBsAg组分混合以制备D-T-Pw-HBsAg组分。已经发现这种混合顺序(即在已有的DTPw混合物中加入HBsAg，而不是在加入D、T或Pw抗原之前加入HBsAg)对于制造组合疫苗尤其是疫苗的各组分被吸附到铝盐上的疫苗特别有用。这不同于参考文献15所披露的先制备D-T-HbsAg混合物然后再加入Pw原液的混合顺序。这也不同于参考文献16所披露的将Pw-HbsAg混合物与D-T混合物合并的混合顺序。
因此，本发明提供了一种制备包含以下组分的组合疫苗的方法：(i)白喉类毒素(‘D’)，(ii)破伤风类毒素(‘T’)，(iii)细胞百日咳抗原(‘Pw’)，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖(‘Hib-X’)，(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖(‘MenA-X’)，和(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖(‘MenC-X’)，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合以得到四价D-T-Pw-HBsAg组分；(b)将Hib偶联物与至少一种脑膜炎球菌偶联物组合以得到混合的偶联物组分；和(c)将四价D-T-Pw-HBsAg组分与混合的偶联物组分混合以得到组合疫苗。
所述三价D-T-Pw组分优选包含磷酸铝佐剂和/或氢氧化铝佐剂。更优选地，其同时包含磷酸铝佐剂和氢氧化铝佐剂。
所述单价HBsAg组分优选被吸附到磷酸铝佐剂[17]。D和T类毒素优选被吸附到氢氧化铝佐剂。
所述混合的偶联物组分优选包含来自Hib和Men A、Hib和MenC或者Hib与MenA及MenC的偶联物。
与诸如INFANRIX HEXATM的疫苗不同，该疫苗优选不将偶联物组分中三种偶联物中的任何一种吸附到铝盐[2]，且更优选偶联物组分不含铝盐。最优选的偶联物组分未经佐剂处理。然而，它们可含有糖，如乳糖和/或蔗糖。
所述四价D-T-Pw-HBsAg组分优选为水性形式，所述三价偶联物组分优选为冻干形式，以便在步骤(c)中用水性D-T-Pw-HBsAg组分重建。为制造四价D-T-Pw-HBsAg组分，所述D-T-Pw和HBsAg组分在混合时优选为水性形式。
为制备三价偶联物组分，可以任何顺序混合三种偶联物，例如，一起加入所有三种偶联物或者先混合两种(例如，MenA+MenC、MenA+Hib、MenC+Hib)然后再加入第三种。
(9)铝佐剂
除了包含抗原，本发明的疫苗通常包含至少一种铝盐佐剂。所述疫苗可同时包含氢氧化铝和磷酸铝佐剂。
本发明提供了一种试剂盒，其中装有：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原并包含氢氧化铝和磷酸铝佐剂的第一组分；和(b)包含(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和(ii)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖的第二组分。
在第一组分中，HbsAg优选被吸附到磷酸铝佐剂。D和T类毒素优选被吸附到氢氧化铝佐剂。优选通过混合DTPw组分与HBsAg组分来制造第一组分。DTPw组分优选同时包含氢氧化铝和磷酸铝。HBsAg组分优选含有磷酸铝。
在第二组分中，优选没有偶联物被吸附到铝盐，更优选第二组分不含铝盐。最优选的第二组分是未经佐剂处理的。然而，它们可含有糖，如乳糖或者优选蔗糖。第一组分优选为水性形式，第二组分优选为冻干形式。因此，第一组分可用来重建第二组分以得到本发明的疫苗。
(10)脑膜炎球菌偶联物中使用间隔物的载体-糖连接
上述Hib偶联物通过间隔物连接到载体蛋白。间隔物也可用于脑膜炎球菌偶联物，但优选直接连接(见上文)。当与氰化反应组合使用间隔物时，一般方案是如上所述制备氰酸酯。然后与双官能接头(优选同双官能接头)中的一个官能团反应以活化该酯，而保留其他官能团以连接载体。
因此，本发明提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，其特征在于，(vi)的血清组A偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组A的荚膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯与双官能接头反应以得到活化的糖；和(c)将活化的糖偶联到载体蛋白。该疫苗还可包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的偶联物混合物的方法：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，血清组A偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组A的荚膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯与双官能接头反应以得到活化的糖；和(c)将活化的糖偶联到载体蛋白。
本发明提供了一种组合疫苗，其中包含：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，和(vi)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，(vii)的血清组C偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组C的荚膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯与双官能接头反应以得到活化的糖；和(c)将活化的糖偶联到载体蛋白。该疫苗还可包含(vii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的偶联物混合物的方法：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，(iii)的血清组C偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)氰化血清组C的荚膜糖以得到氰酸酯；(b)使氰酸酯与双官能接头反应以得到活化的糖；和(c)将活化的糖偶联到载体蛋白。
本发明还提供了疫苗和方法，其中，血清组A和血清组C偶联物都用这种方式制备，然后合并。
可使用任何合适的双官能接头，只要其中的一个官能团能共价结合氰化脑膜炎球菌糖类而另一个官能团能连接载体即可。这两个官能团可以是相同的(即同双官能接头)或者它们可以是不同的(即异双官能接头)，这取决于需要连接的基团。
(11)加入防腐剂的方法
疫苗通常含有防腐剂以防止有害微生物生长。在通过混合各种组分形成的组合疫苗中，熟练的技术人员必须选择何时在何处加入防腐剂。根据本发明，不同的组分含有不同的防腐剂。
因此，本发明提供了一种制备包含以下组分的组合疫苗的方法：(i)白喉类毒素(‘D’)，(ii)破伤风类毒素(‘T’)，(iii)细胞百日咳抗原(‘Tw’)，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，和(vii)汞防腐剂，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合以得到四价D-T-Pw-HBsAg组分，其中，所述D-T-Pw组分还含有防腐剂；(b)将流感嗜血杆菌偶联物与脑膜炎奈瑟氏球菌偶联物组合以得到混合的偶联物组分；和(c)将D-T-Pw-HBsAg组分与混合的偶联物组分混合以得到组合疫苗。
本发明提供了一种制备本发明的试剂盒的方法，其包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合，其中，所述D-T-Pw组分含有汞防腐剂以得到第一试剂盒组分；和(b)将偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖与至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖组合以得到第二试剂盒组分。
这些方法中的步骤(a)也可以是，可通过混合(i)三价D-T-Pw组分、(ii)HbsAg和(iii)单独的防腐剂以制备第一试剂盒组分，其中，(ii)中不含(iii)的防腐剂。
所述汞防腐剂可以是乙基汞硫代水杨酸钠(也称为硫汞柳酸钠或硫柳汞)或timerfonate。混合的偶联物组分(以及第二试剂盒组分)可以含或不含防腐剂。优选不含防腐剂。单价HBsAg组分可以含或不含防腐剂。如果已经使用了汞防腐剂，则在用纯化的HbsAg制造组合疫苗之前可进行透析(例如用半胱氨酸)[18]。
混合的偶联物组分优选含有Hib偶联物、MenA偶联物和MenC偶联物。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的组合疫苗的方法：(i)白喉类毒素(‘D’)，(ü)破伤风类毒素(‘T’)，(in)细胞百日咳抗原(‘Pw’)，(iv)乙肝病毒表面抗原(‘HBsAg’)，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，和(vii)2-苯氧乙醇防腐剂，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合以得到四价D-T-Pw-HBsAg组分，其中，所述D-T-Pw组分不含2-苯氧乙醇；(b)将流感嗜血杆菌偶联物与脑膜炎奈瑟氏球菌偶联物组合以得到混合的偶联物组分；和(c)将D-T-Pw-HBsAg组分与混合的偶联物组分混合以得到组合疫苗。
本发明提供了一种制备本发明的试剂盒的方法，其包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合，其中，所述D-T-Pw组分不含2-苯氧乙醇防腐剂以得到第一试剂盒组分；和(b)将偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖与至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖组合以得到第二试剂盒组分。
这些方法中的步骤(a)也可以是，可通过混合(i)三价D-T-Pw组分、(ii)HbsAg和(iii)单独的2-苯氧乙醇防腐剂以制备第一试剂盒组分，其中，(i)中不含(iii)的防腐剂。
混合的偶联物组分(以及第二试剂盒组分)可以含或不含2-苯氧乙醇防腐剂。优选不含防腐剂。单价HBsAg组分可以含或不含2-苯氧乙醇防腐剂。
(12)除去偶联物中的杂质
偶联化学不总是精确或化学计量的，可以产生最终疫苗产品不需要的副产品。本发明提供了当制备混合的偶联物组分时测定或除去这些副产品的方法。该组分可用来制造本发明的疫苗或作为本发明试剂盒的组分。
本发明提供了一种制备包含以下组分的偶联物混合物的方法：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)用EDAC将Hib荚膜糖偶联到破伤风类毒素，然后除去EDU；(b)用CDAP试剂将MenA荚膜糖偶联到蛋白质载体，然后除去DMAP；(c)用CDAP试剂将MenC荚膜糖偶联到蛋白质载体，然后除去DMAP；和(d)混合步骤(a)的Hib偶联物、步骤(b)的MenA偶联物和步骤(c)的MenC偶联物以得到偶联物混合物。
在混合步骤之后，偶联物混合物可被冻干例如以得到用于本发明的试剂盒的组分。在冻干之前，三价组分的pH可被降至例如6.0±0.5的范围内或约6.1。
‘EDAC’是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，这是一种水溶性碳二亚胺，曾被用来交联含有羧酸和伯胺的生物物质(见上文)。它通常以盐酸盐使用。
‘EDU’是N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)脲，它是EDAC偶联的可溶性反应产物：
Figure S200680014588XD00231
偶联反应之后可用稀酸或水洗涤以除去EDU和过量的EDAC[19]。
‘CDAP’试剂包含1-氰基-4-(二甲基氨基)-吡啶基团并被用作氰化试剂。它们优选以四氟硼酸盐的形式使用：
Figure S200680014588XD00232
‘DMAP’是4-二甲基氨基-吡啶，是CDAP氰化反应的一种反应产物：
Figure S200680014588XD00233
DMAP可通过凝胶过滤、凝胶渗透层析等方法除去。凝胶渗透层析柱可用来在一次运行中分离偶联物、未反应的载体、未反应的糖、未反应的CDAP、未反应的甘氨酸和DMAP，从而得到纯化的偶联物。
偶联反应可使用接头等，如上所述(例如，使用己二酸酰肼间隔物以制备Hib-T)。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的偶联物混合物的方法：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)用EDAC将Hib荚膜糖偶联到载体蛋白；(b)用CDAP试剂将MenA荚膜糖偶联到蛋白质载体；(c)用CDAP试剂将MenC荚膜糖偶联到蛋白质载体；(d)混合步骤(a)的Hib偶联物、步骤(b)的MenA偶联物和步骤(c)的MenC偶联物以得到偶联物混合物；和(e)除去偶联物混合物中的EDU和/或DMAP。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的偶联物混合物的方法：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)用EDAC将Hib荚膜糖偶联到破伤风类毒素，然后检测EDU；(b)用CDAP试剂将MenA荚膜糖偶联到蛋白质载体，然后测定DMAP；和(c)用CDAP试剂将MenC荚膜糖偶联到蛋白质载体，然后测定DMAP。
该方法通常还包括以下步骤：(d)混合步骤(a)的Hib偶联物、步骤(b)的MenA偶联物和步骤(c)的MenC偶联物以得到偶联物混合物。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的偶联物混合物的方法：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)用EDAC将Hib荚膜糖偶联到破伤风类毒素；(b)用CDAP试剂将MenA荚膜糖偶联到蛋白质载体；和(c)用CDAP试剂将MenC荚膜糖偶联到蛋白质载体；(d)混合步骤(a)的Hib偶联物、步骤(b)的MenA偶联物和步骤(c)的MenC偶联物以得到偶联物混合物；和(e)测定偶联物混合物中的EDU和/或DMAP。
本发明还提供了一种制备包含以下组分的偶联物混合物的方法：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(ii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A的荚膜糖，和(iii)偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的荚膜糖，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)用EDAC将Hib荚膜糖偶联到载体蛋白；(b)用EDAC将MenA荚膜糖偶联到蛋白质载体；(c)用EDAC将MenC荚膜糖偶联到蛋白质载体；(d)混合步骤(a)的Hib偶联物、步骤(b)的MenA偶联物和步骤(c)的MenC偶联物以得到偶联物混合物；和(e)除去偶联物混合物中的EDU。
EDAC/EDU法特别适合以破伤风类毒素作为载体蛋白的情况。CDAP/DMAP法特别适合以D蛋白作为载体蛋白的情况。
(13)特性性特征的组合
上面的章节(1)-(12)包括了本发明的各种特征性特征：
特征性特征
(1) Hib偶联物中糖与载体的重量比在1∶2.5和1∶3.5之间
(2) 用CNBr活化Hib，然后与己二酸接头偶联
(3) 氰化脑膜炎球菌荚膜糖以得到氰酸酯，然后将氰酸酯直接偶联到蛋白质载体
(4) 血清组C脑膜炎球菌的O-乙酰化状态
(5) 血清组A脑膜炎球菌的O-乙酰化状态
(6) 偶联物剂量为8-12μg
(7) 疫苗的临时制备及试剂盒
(8) 将D-T-Pw与HbsAg混合，然后将D-T-Pw-HbsAg与MenA-MenC-Hib混合进行制备
(9) D、T、wP和HbsAg是试剂盒组分，并含有氢氧化铝和磷酸铝佐剂
(10) 用双官能接头将脑膜炎球菌荚膜糖偶联到载体
(11) 在HbsAg组分中加入防腐剂
(12) 使用EDAC和/或DMAP之后除去和/或测定EDU和/或DMAP
尽管这12种特征性特征是相互独立的，但它们也可相互组合。因此，本发明提供了特征(1)-(12)的所有可能的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种和11种组合以及所有12种特征的组合。
特别优选的组合包括：
a.(1)和(2)
b.(1)和(2)和(6)
c.(1)和(2)和(12)
d.(1)和(2)和(6)和(12)
e.(3)和(4)
f.(3)和(5)
g.(3)和(4)和(5)
h.(3)和(4)和(6)
i.(3)和(5)和(6)
j.(3)和(4)和(5)和(6)
k.(8)和(9)
l.(8)和(11)
m.a.至1.中的任何一种与(12)组合
n.a.至m.中的任何一种与(7)组合
o.a.至n.中的任何一种与(8)组合
p.a.至o.中的任何一种与(9)组合
q.a.至p.中的任何一种与(11)组合
组合e.和f.(然后是g.、h.、i.和j.)是有利的，这是因为当使用CDAP时脑膜炎球菌糖类上脆弱的乙酰基可被保留。组合k.是有利的，这是因为混合佐剂和抗原的正确顺序对于吸附是关键性的，从而对于功效和长期储存稳定性也是关键性的。组合1.是有利是，这是因为它能最小化制造过程中的多个阶段加入防腐剂的需求。
(14)白喉类毒素
白喉是由白喉棒状杆菌造成的，这是一种革兰氏阳性非芽孢需氧菌。这种细菌表达原噬菌体编码的ADP-核糖化外毒素(‘白喉毒素’)，可处理这种外毒素(例如采用福尔马林或甲醛)以得到不再具有毒性但保留抗原性并能够在注射后刺激产生特异性抗-毒素抗体的类毒素。白喉类毒素在参考文献1的第13章中有更加详细的描述。优选的白喉类毒素是通过甲醛处理制备的。可使白喉棒状杆菌在可添加有牛提取物的生长培养基(例如，Fenton培养基或者Linggoud和Fenton培养基)中生长，然后进行甲醛处理、超滤和沉淀以得到白喉类毒素。然后用包括无菌过滤和/或渗析的方法处理类毒素化的材料。
白喉类毒素优选被吸附到氢氧化铝佐剂上。
优选地，白喉类毒素组分基本上不含任何汞防腐剂。
白喉类毒素的量可表达为国际单位(IU)。例如，NIBSC提供的‘吸附的白喉类毒素的第三国际标准1999’(Diphtheria Toxoid Adsorbed Third International Standard1999)[20，21]含有160IU/安瓿。除了IU系统，‘Lf’单位(“絮凝化单位”或“临界絮凝化剂量”)被定义为与1国际单位抗毒素混合产生最佳絮凝化混合物的类毒素的量[22]。例如，NIBSC提供的‘简易白喉类毒素’(Diphtheria Toxoid，Plain)[23]，其含有300LF/安瓿，并还提供了‘用于絮凝试验的白喉类毒素的第一国际参考试剂’(The1st International Reference Reagent For Diphtheria Toxoid For Flocculation Test)[24]，其含有900LF/安瓿。
当采用牛材料培养白喉棒状杆菌时，这些材料应获自未患牛海绵状脑病(BSE)或其它遗传性海绵状脑病(TSE)的来源。
本发明的疫苗中白喉类毒素与破伤风类毒素的比例通常在2∶1和3∶1之间(以Lf单位测量)，优选在2.4∶1和2.6∶1之间，更优选2.5∶1。
本发明的疫苗中白喉类毒素的量通常为至少30IU/剂。
(15)破伤风类毒素
破伤风是由破伤风梭菌造成的，这是一种革兰氏阳性产芽孢菌。这种菌表达一种内肽酶(‘破伤风毒素’)，可对其进行处理以得到不再具有毒性但保留抗原性并能够在注射后刺激产生特异性抗-毒素抗体的类毒素。破伤风类毒素在参考文献1的第27章中有更加详细的描述。优选的破伤风类毒素是通过甲醛处理制备的。可使破伤风梭菌在生长培养基(例如，衍生自牛酪蛋白的Latham培养基)中生长，然后进行甲醛处理、超滤和沉淀以得到破伤风类毒素。然后可用包括无菌过滤和/或渗析的方法处理该材料。
破伤风类毒素可被吸附到氢氧化铝佐剂上，但这不是必须的(例如，可以使用总破伤风类毒素中0-10％的吸附)。
优选地，破伤风类毒素组分基本上不含任何汞防腐剂。
破伤风类毒素的量可表达为国际单位(IU)。例如，NIBSC提供的‘吸附的破伤风类毒素的第三国际标准2000’(Tetanus Toxoid Adsorbed Third International Standard2000)[25，26]含有469IU/安瓿。除了IU系统，‘Lf’单位(“絮凝化单位”或“临界絮凝化剂量”)被定义为与1国际单位抗毒素混合产生最佳絮凝化混合物的类毒素的量[22]。例如，NIBSC提供了‘用于絮凝试验的破伤风类毒素的第一国际参考试剂’(The1st International Reference Reagent for Tetanux Toxoid For Flocculation Test)[24]，其含有1000LF/安瓿。
当采用牛材料培养破伤风梭菌时，这些材料应获自未患牛海绵状脑病(BSE)或其它遗传性海绵状脑病(TSE)的来源。
本发明的疫苗中破伤风类毒素与白喉类毒素的比例通常在1∶2和1∶3之间(以Lf单位测量)，优选在1∶2.4和1∶2.6之间，更优选1∶2.5。
本发明的疫苗中破伤风类毒素的量通常为至少60IU/剂。
(16)细胞百日咳抗原
疫苗中的百日咳抗原是细胞(全细胞)或非细胞的。本发明采用细胞百日咳抗原，其形式为灭活的百日咳博德特氏菌细胞。细胞百日咳抗原的制备已经充分论述[例如参见参考文献1的第21章]。例如，可通过热灭活百日咳博德特氏菌的I期培养物来获得。
细胞百日咳抗原可被吸附到磷酸铝佐剂上或与该佐剂混合。
wP抗原的量可表达为国际单位(IU)。例如，NIBSC提供了‘百日咳疫苗的第三国际标准’(Third International Standard For Pertussis Vaccine)[28]，其含有46 IU/安瓿。各安瓿含有2.0ml等分水溶液的冻干残余物，该水溶液含有10升用8升M/15Sorensen缓冲液pH7.0稀释的细菌悬浮液(根据美国不透明度标准等于180不透明单位)。除了IU系统，还可使用‘OU’单位(“不透明单位”)(例如，4OU约为1IU)。
本发明的疫苗中wP抗原的量通常为至少4IU/剂。
(17)乙肝表面抗原
乙肝病毒(HBV)是一种已知的造成病毒性肝炎的物质。HBV病毒粒子由被外部蛋白质外壳或衣壳包裹的内部核心构成。病毒核心含有病毒DNA基因组。衣壳的主要成份是一种蛋白质，被称为HBV表面抗原，或者更通常称为‘HBsAg’，这是一种分子量约为24kDa的由226个氨基酸构成的蛋白质。所有现有乙肝疫苗含HBsAg，当这种抗原被给予接种者时它能刺激产生抗-HbsAg抗体从而抵抗HBV感染。
为制造疫苗，可用两种方法制备HBsAg。第一种方法涉及从慢性乙肝携带者的血浆中纯化特定形式的抗原，这是因为慢性乙肝携带者的肝脏中会合成大量HbsAg并在HBV感染期间释放到血流中。第二种方法涉及通过重组DNA法表达蛋白质。可用任何一种方法制备用于本发明方法的HBsAg，但优选采用通过重组表达制备的HbsAg。具体地说，优选HbsAg是通过在酵母如酵母属(如酿酒酵母(S.cerevisiae))或汉森酵母属(如多形汉森酵母(H.polymorpha))中表达制备的。
酵母表达的HbsAg将通常是非糖基化的。
HbsAg通常为基本球形颗粒(平均直径约20nm)的形式，其中含有包含磷脂的脂质基质。酵母表达的HbsAg颗粒可含有在天然HBV病毒粒子中未发现的磷脂酰肌醇。该颗粒也可含有非毒性量的LPS以刺激免疫系统[29]。
HBsAg优选来自HBV亚型adw2。
尽管在最终疫苗中HbsAg可被吸附到氢氧化铝佐剂上(如在熟知的ENGERIX-BTM产品中那样)，但它也可保持未吸附，而通常在用于本发明的方法之前吸附到磷酸铝佐剂上[17]。
HbsAg的量通常以微克表示。
每剂疫苗中HbsAg的典型含量为10μg。
(18)Hib偶联物
用于本发明疫苗的b型流感嗜血杆菌抗原含有Hib荚膜糖抗原。来自b型流感嗜血杆菌的糖类抗原是熟知的[例如，参考文献1的第14章]。Hib糖类被偶联到载体蛋白上以增强其免疫原性，尤其是在儿童中。Hib荚膜糖的制备已经充分论述[例如，参考文献30-39]。
如参考文献1的表14-7所示，各种不同的连接载体蛋白已被用于Hib偶联物。PRP-D产品采用白喉类毒素载体蛋白，这种载体也可用于本发明。HbOC产品采用CRM197载体蛋白，这种载体也可用于本发明。PRP-OMP产品采用血清组B脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物作为载体，这种载体也可用于本发明。PRP-T产品采用破伤风类毒素载体蛋白，这种载体也可用于本发明。流感嗜血杆菌D蛋白(见下文)也可用作Hib偶联物的载体。
优选的用于本发明的Hib偶联物采用破伤风类毒素作为载体蛋白以得到通常称为‘PRP-T’的产品。这是HIBERIXTM产品中的偶联物。
Hib偶联物中的载体蛋白优选不同于脑膜炎球菌偶联物中的载体蛋白，但在一些实施方案中也可使用相同的载体。
从Hib菌制备时偶联物的糖部分可含有全长磷酸多核糖基核糖醇(PRP)，和/或可含有全长PRP的片段。
可采用的偶联物中糖∶蛋白质的比例(w/w)在1∶5(即蛋白质过量)和5∶1(即糖类过量)之间，例如，比例在1∶2和5∶1之间以及比例在1∶1.25和1∶2.5之间。然而，在优选的疫苗中，糖与载体蛋白的重量比在1∶2.5和1∶3.5之间。
在破伤风类毒素同时作为抗原和载体蛋白的疫苗中，偶联物中糖与载体蛋白的重量比可在1∶0.3和1∶2之间[5]。
不考虑所含作为抗原的破伤风类毒素，未偶联的载体优选不超过整体组合物中载体蛋白总量的5％，更优选小于2％重量。
给予Hib抗原优选导致抗-PRP抗体浓度≥0.15μg/ml，更优选≥1μg/ml。这些是标准的可接受反应阀值。
Hib偶联物的量通常以糖类的质量表示(即偶联物整体(载体+糖类)的剂量高于标示剂量)以避免由于载体的选择造成的差异。每剂疫苗中Hib糖类的典型含量为10μg。
按照本发明，Hib偶联物在其使用前可被冻干。在冻干操作之前也可加入其它组分，例如作为稳定剂。可加入的优选稳定剂是乳糖、蔗糖和甘露醇，以及它们的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。因此，最终的疫苗可含有乳糖和/或蔗糖。采用蔗糖/甘露醇混合物能加速干燥过程。
(19)脑膜炎球菌偶联物
用于本发明疫苗的脑膜炎球菌抗原含有与载体蛋白偶联的荚膜糖抗原。来自脑膜炎奈瑟氏球菌的糖类抗原是熟知的：多年前便已知道二价疫苗MENCEVAXACTM和四价疫苗MENCEVAX ACWYTM[40，41]。此外，抗血清组C的偶联疫苗已被批准用于人类，其中包括MENJUGATETM [42]、MENINGITECTM和NEISVAC-CTM。已知来自血清组A+C的偶联物的混合物[43，44]，还已经报道了来自血清组A+C+W135+Y的偶联物的混合物[45-48]。
用于本发明的产品和方法的脑膜炎球菌糖类可来自血清组A、C、W135和Y中的一种或多种，例如，A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y。优选至少采用血清组C的糖类，且优选采用同时来自血清组A和C的糖类。
本发明可采用具有任何合适的连接化学和任何合适的间隔物(除非给出具体细节)的任何合适的脑膜炎球菌偶联物。
MENJUGATETM和MENINGITECTM产品采用CRM197载体蛋白，这种载体也可用于本发明。NEISV AC-CTM产品采用破伤风类毒素载体蛋白，这种载体也可用于本发明。特别优选的脑膜炎球菌偶联物的载体蛋白是来自流感嗜血杆菌的D蛋白，它不存在于任何现有被批准的偶联物疫苗中。这种蛋白质详细描述于参考文献49和50，将其用作偶联物中的载体蛋白描述于参考文献51。术语“D蛋白”包括天然的全长蛋白质的片段，如参考文献51所述，还包括含有全长D蛋白或这些片段的融合蛋白(例如，流感病毒NS1蛋白的片段和D蛋白的片段的融合物)。当这些片段与T-非依赖性糖类抗原偶联时保留了将其转变成T-依赖性抗原的能力。典型的片段至少将包括D蛋白N-端的1/3。该蛋白质可在大肠杆菌中方便地表达[50]，且这种重组材料优选用于本发明[51]。
当使用D蛋白载体时，偶联物被称为‘MenA-D’和‘MenC-D’。
优选单独的脑膜炎球菌偶联物应采用单独的载体蛋白(参见参考文献52)，但优选这些单独的载体应相互相同，例如组合物中的所有脑膜炎球菌偶联物应采用破伤风类毒素载体，或者组合物中的所有脑膜炎球菌偶联物应采用D蛋白载体，等等。
脑膜炎球菌偶联物中的载体蛋白优选不同于Hib偶联物中的载体蛋白，但在一些实施方案中可采用相同的载体。
当从脑膜炎球菌制备时偶联物的糖部分可含有全长糖类，和/或可含有全长糖类的片段。
可采用的脑膜炎球菌偶联物中糖∶蛋白质的比例(w/w)在1∶10(即蛋白质过量)和10∶1(即糖类过量)之间，例如，比例在1∶5和5∶1之间、在1∶2.5和2.5∶1之间、或在1∶1.25和1.25∶1之间。
给予脑膜炎球菌偶联物优选导致相关血清组的血清杀菌测定(SBA)效价提高至少4倍，优选至少8倍。SBA效价可用幼兔补体或人补体测量[53]。
脑膜炎球菌偶联物的浓度通常以糖类的质量表示(即偶联物整体(载体+糖类)的剂量高于标示剂量)以避免由于载体的选择而造成的差异。每剂疫苗中每种脑膜炎球菌糖类的典型含量约为5μg或10μg。
根据本发明，脑膜炎球菌偶联物在其使用前可被冻干。在冻干操作之前也可加入其它组分，例如作为稳定剂。可加入的优选稳定剂是乳糖和/或蔗糖。因此，最终的疫苗可含有乳糖和/或蔗糖。
(20)偶联物混合物
本发明提供了偶联物混合物及其制备方法。其中通常包含(i)Hib偶联物、(ii)MenA偶联物和(iii)MenC偶联物的混合物。偶联物混合物可用作疫苗本身，也可用作与其它抗原混合的组分以制造组合疫苗。
偶联物混合物可含有三种以上的偶联物，但优选为三价偶联物混合物。也可制备还含有来自脑膜炎球菌血清组W135和Y的偶联的荚膜糖的五价偶联物混合物。
偶联物混合物优选为冻干形式。
偶联物混合物优选不含以下抗原：白喉类毒素；百日咳博德特氏菌抗原；脊髓灰质炎病毒抗原；HbsAg。
优选地，没有一种偶联物被吸附到铝盐上[2]，且更优选不包含铝盐。最优选的混合的偶联物组分未经佐剂处理。然而它们可含有糖，例如乳糖或者优选蔗糖。
(21)佐剂
除了抗原性组分，本发明的疫苗通常会含有至少一种铝盐佐剂。如上所述，所述疫苗可同时含有氢氧化铝和磷酸铝佐剂。当同时含有时，这两种佐剂的重量比约为1∶1，例如，氢氧化铝∶磷酸铝的比例约为1.58∶1.6。
尽管铝佐剂通常被称为“氢氧化铝”或“磷酸铝”佐剂，但这些只是为方便起见而取的名字，它们都没有准确描述所存在的实际化合物[例如参见参考文献54的第9章]。本发明可采用通常用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。
被称为“氢氧化铝”的佐剂通常为铝的羟基氧化物盐类，其通常至少部分为晶体状的。铝的羟基氧化物可表示为AlO(OH)，通过红外(IR)光谱可将其与其它的铝化合物如氢氧化铝Al(OH)3区别开，尤其是通过1070cm-1出现的吸收带和3090-3100cm-1出现的强肩峰[参考文献54的第9章]。
被称为“磷酸铝”的佐剂通常为铝的羟基磷酸盐，经常还含有小量硫酸盐(即铝的羟基磷酸盐的硫酸盐)。它们可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度会影响磷酸根对盐中羟基的取代程度。羟基磷酸盐中PO4/Al的摩尔比通常在0.3和1.2之间。羟基磷酸盐因存在羟基而不同于严格的AlPO4。例如，3164cm-1处的IR光谱条带(例如当加热至200℃时)证明存在结构性羟基[参考文献54的第9章]。
佐剂可采取任何合适形式(例如，凝胶、晶体、无定形等)。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比通常为0.3-1.2，优选0.8-1.2，更优选0.95±0.1。佐剂一般为无定形羟基磷酸铝，其中PO4/Al摩尔比为0.84-0.92，包含0.6mg Al3+/ml。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。磷酸铝通常是颗粒。抗原吸附后其颗粒的直径一般为0.5-20μm(如约5-10μm)。
磷酸铝的PZC与用磷酸根取代羟基的程度成反比，这种取代程度可随着用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而改变。也可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝更酸性的PZC)或通过加入缓冲液如组氨酸缓冲液(使PZC的碱性更强)来改变PZC。用于本发明的磷酸铝的PZC通常为5.0-7.0，更优选5.5-6.0，如约5.7。
优选以加入抗原的水性溶液形式使用磷酸铝(注：一般将磷酸铝水溶液称为“溶液”，但是从严格的物理化学观点来看，该盐不可溶，形成的是悬液)。优选将磷酸铝稀释到所需浓度，以保证在加入抗原性组分之前是均一溶液。
在加入抗原之前Al3+的浓度通常为0-10mg/ml。优选浓度为2-6mg/ml。
用于制备本发明疫苗的磷酸铝溶液可(但不必须)含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸缓冲液)。磷酸铝溶液优选无菌和无热原。磷酸铝溶液可包含游离(如以浓度为1.0-20mM，优选为5-15mM，更优选约为10mM存在的)的水性磷酸根离子。磷酸铝溶液也可包含氯化钠。氯化钠浓度优选为0.1-100mg/ml(如0.5-50mg/ml，1-20mg/ml，2-10mg/ml)，更优选约为3±1mg/ml。存在NaCl有助于在吸附抗原之前正确测定pH。
当将抗原描述为被“吸附”到佐剂时，优选至少50％(以重量计)的抗原被吸附，例如50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或更多。在一些实施方式中，白喉类毒素和破伤风类毒素都被全部吸附，即在上清液中不可检测。也优选将HbsAg全部吸附。
(22)疫苗的其它组分
除了含有抗原和佐剂等，本发明的组合疫苗可含有其它组分。这些组分可具有各种来源。例如，它们可存在于一种在本发明的加工过程中混合的抗原性组分中或者可在加工过程中与抗原性组分分别加入。
为控制最终疫苗产品的张力，优选的含有生理盐，如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其在最终疫苗产品中的含量可为1-20mg/ml。
由于抗原的吸附特性，最终的疫苗产品可以是具有絮状外观的悬浮液。这种外观意味着微生物污染不容易被发现，因此疫苗中优选含有抗微生物剂。当用多剂量容器包装疫苗时这尤其重要。优选含有的抗微生物剂是2-苯氧乙醇和硫柳汞。然而优选在本发明的加工过程中不使用汞防腐剂(例如，硫柳汞)。然而，如果加工期间使用的抗原(例如，HBsAg)已经用这种防腐剂处理过则不可避免地会存在痕量防腐剂。然而为安全起见，优选最终的疫苗产品含有的汞少于约25ng/ml。更优选地，最终的疫苗产品含有的硫柳汞不可检测。这通常是通过在将抗原制品用于本发明方法之前除去其中的汞防腐剂或者通过在制备单独的抗原性组分期间避免使用硫柳汞实现的。
除了硫柳汞之类的物质，通过本发明方法制造的最终疫苗中也可存在痕量来自各抗原的其它残余成份。例如，如果采用甲醛来制备白喉、破伤风和百日咳的类毒素，则最终的疫苗产品可含有痕量甲醛(例如，少于10μg/ml，优选＜5μg/ml)。游离氨基酸(例如，丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和/或胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸和/或羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸)、维生素(例如胆碱、抗坏血酸等)、磷酸二钠、磷酸二氢钾、钙、葡萄糖、硫酸腺嘌呤、酚红、乙酸钠、氯化钾等也可存在于最终的疫苗中，每种物质的浓度≤100μg/ml(例如，≤50μg/ml、≤10μg/ml)。最终疫苗中其它可能的组分来源于抗原制备中未充分纯化抗原。因此可能存在小量百日咳博德特氏菌、白喉棒状杆菌、破伤风梭菌和酿酒酵母蛋白和/或基因组DNA。为最小化这些残余组分的量，优选对抗原制品进行处理以除去它们，然后再将抗原用于本发明的方法。
当最终的疫苗中存在铝盐时，铝的总量(以Al3+表示)优选＜2mg/ml(例如，1.2-1.5mg/ml，或约1.4mg/ml；或0.4-0.8mg/ml，或约0.6mg/ml)。
在本发明的加工期间，稀释组分以得到所需最终浓度将通常由WFI(注射用水)完成。
为防止抗原、尤其是偶联抗原之间的干扰，可以包含聚阴离子聚合物，如聚-L-谷氨酸[55]。
(23)组合疫苗的包装
在典型的应用中，本发明的方法将用于提供适合包装、然后适合分配和给药的散装组合疫苗。上述浓度通常是最终包装疫苗中的浓度，因此散装疫苗中的浓度可能较高(例如，需要通过稀释以降至最终浓度)。
因此，本发明的方法可包括将疫苗包装在容器中以供使用的其它步骤。合适的容器包括药瓶和一次性针筒(优选无菌针筒)。
当将疫苗包装入药瓶时，优选这些药瓶是用玻璃或塑料材料制成的。药瓶在加入疫苗之前优选被灭菌。为避免对乳胶敏感患者造成问题，可用不含乳胶的塞子密封药瓶。药瓶中可装有单剂量疫苗或者可装有一剂以上疫苗(‘多剂量’药瓶)，例如，10剂。当采用多剂量药瓶时，各剂量应在严格无菌条件下用无菌针头和针筒取出，同时要小心避免污染药瓶的内容物。优选的药瓶由无色玻璃制成。
当疫苗被包装入针筒时，针筒上通常未附加针头，但可与针筒一起提供单独的针头以供装配和使用。优选安全针头。通常为1英寸23号、1英寸25号和5/8英寸25号针头。可在针筒上提供可剥离的印有内容物批号和有效期的标签以方便保存。针筒内的柱塞优选有制动器以防止柱塞在抽吸过程中意外被拉出。针筒可具有乳胶橡皮帽和/或柱塞。一次性针筒装有单剂量疫苗。针筒通常会具有针帽以在附加针头之前密封针尖，且该针帽优选由丁基橡胶制成。如果针筒和针头是独立包装的，则优选为针头配备丁基橡胶护罩。优选灰色丁基橡胶。优选的针筒是以商品名“Tip-Lok”TM销售的针筒。
当采用玻璃容器(例如，针筒或药瓶)时，优选采用由硼硅玻璃而非钠钙玻璃制成的容器。
当单独包装时，偶联抗原将通常被冷冻干燥(冻干)在单独的容器内，从而包装的疫苗将含有至少两个分开的容器。在施用于患者之前，将用另一容器内的液体重建和稀释这种冻干材料。因此，偶联物容器将通常为药瓶，而另一容器将含有装在药瓶或预装针筒内的液体。第二容器中的液体内容物将被转移到装有冻干的偶联抗原粉末的药瓶内，从而重建偶联抗原以便给予患者。
装冻干偶联物的容器优选为具有适配盖子的药瓶(例如，Luer锁紧套口)，从而可将预装针筒插入该盖，将针筒的内容物排入药瓶内以重建其中的冻干材料，并可将药瓶的内容物重新吸回针筒。从药瓶上取下针筒之后，然后可加上针头并可将疫苗施用于患者。所述盖优选位于封口或覆盖物内侧，从而在接触盖子之前封口或覆盖物已被除去。
本发明的组合疫苗优选以0.5ml的剂量给予患者。因此，本发明的方法可包括从散装疫苗中取出0.5ml样品并将其包装入容器的步骤。对于多剂量情况，将取出多剂用量并一起包装入单个容器。当疫苗为包含冻干组分的试剂盒时，则重建后的最终剂量优选为0.5ml。这里提及的0.5ml剂量应理解为平均0.5ml±0.05ml。
装疫苗的容器然后将通常被装入盒子中以供分配，例如装入纸板盒，盒子上还将标示疫苗的细节，例如其商品名、疫苗中抗原的组成(例如，‘白喉、破伤风、灭活的全细胞百日咳和乙肝重组体，吸附疫苗’等)、容器规格(例如，‘一次性预装Tip-Lok针筒’或‘10×0.5ml单剂量药瓶’)、其剂量(例如，‘各含一个0.5ml剂量’)、警告(例如，‘仅供儿科使用’)、有效期等。每个盒子可含有一个以上包装的疫苗，例如5个或10个包装的疫苗(尤其对于药瓶而言)。如果疫苗是含在针筒内的，则包装上应显示针筒的图片。
疫苗可包装在一起(例如装入同一盒子)并夹入包含疫苗细节的单页，如给药说明、疫苗内抗原的细节等。说明还可包括警告，例如将肾上腺素溶液放在方便获得的地方以应对接种后发生的过敏反应等。
包装的疫苗材料优选是无菌的。
包装的疫苗材料优选是无热原的，例如含有＜1EU(内毒素单位，标准量度)/剂，优选＜0.1EU/剂。
包装的疫苗材料优选不含谷蛋白。
任何水性包装疫苗材料的pH优选为6-8，例如6.5-7.5。因此，本发明的方法可包括在包装之前调节散装疫苗的pH的步骤。
包装疫苗内的任何水性材料优选为混浊的白色悬浮液。
包装的疫苗优选储存于2-8℃。不应冷冻。
(24)疫苗的施用
最终的本发明的组合疫苗适合给予人类，尤其是儿童。疫苗的典型剂量方案或者为达到完整功效将包括在初步免疫接种方案中给予一次以上的剂量。典型的初步方案将包括三次剂量，间隔约6-8周给予，其中第一次剂量在儿童6-9周时给予。优选在6、10和14周时接种的3剂初步方案，并可在第18个月时给予第四次剂量。
该疫苗也可用来完成不同疫苗的初步免疫接种方案。
本发明提供了一种在患者中引起免疫应答的方法，所述方法包括给予患者本发明的组合物。
本发明还提供了一种本发明的组合物，该组合物用于药物。
本发明还提供了以下物质在制造用于免疫患者的药物中的应用：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。
本发明还提供了以下物质在制造用于免疫患者的药物中的应用：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，其中，所述药物用来重建偶联物混合物。
本发明还提供了以下物质在制造用于免疫患者的药物中的应用：(i)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖和(ii)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，其中，所述药物被冻干并在用含有至少一种其它抗原的水性疫苗重建之后施用。
上面给出了各种药物的其它具体特征。优选的药物是疫苗。
药物将通常直接给予患者。直接给药可通过胃肠道外注射(如静脉注射、皮下注射、腹腔注射、肌肉注射或注射到组织间隙)、或通过直肠给药、口服、阴道内给药、局部给药、透皮给药、鼻内给药、眼内给药、耳内给药、肺内吸入或其他粘膜给药途径来完成。然而通常通过肌内注射给药。优选的注射部位是大腿前外侧或上臂的三角肌。
这些应用、方法和药物优选用于对上述病原体产生免疫力。所述患者优选是人，并且可以是儿童(例如学步童或婴儿)、青少年或成年人，但通常是儿童。优选的患者年龄为0-36个月，例如0-24个月、0-12个月或0-6个月。
检测单独抗原功效的方法是本领域已知的。
本发明的疫苗可与口服脊髓灰质炎疫苗(如例如含有1型脊髓灰质炎病毒、2型脊髓灰质炎病毒和3型脊髓灰质炎病毒的三价口服脊髓灰质炎疫苗)基本同时给予。第一次接受本发明的疫苗的儿童之前可接受过口服脊髓灰质炎疫苗和/或卡介苗(BCG)。
因此，优选的接受免疫接种的患者组包括但不限于：(a)之前接受过口服脊髓灰质炎疫苗的儿童；(b)之前接受过卡介苗的儿童；(c)之前接受过口服脊髓灰质炎疫苗和BCG的儿童；(d)之前未接受过D、T、Pw、HbsAg、Hib偶联物和至少一种脑膜炎球菌偶联物中的任何一种的组(a)、(b)或(c)中的儿童；和(e)之前接受过口服脊髓灰质炎疫苗、BCG、D、T、Pw、HbsAg、Hib偶联物和至少一种脑膜炎球菌偶联物的儿童。这些儿童的年龄可以在任何一个上文特别指出的年龄组中，如0-36、0-24、0-12或0-6个月。
因此，本发明提供了以下物质在制造用于免疫所述(a)-(e)组之一中的患者的药物中的应用：(i)白喉类毒素，(ii)破伤风类毒素，(iii)细胞百日咳抗原，(iv)乙肝病毒表面抗原，(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌荚膜糖，(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖。
如果本发明的疫苗含有铝基佐剂，则在储存过程中可能发生组分沉淀。因此在将疫苗给予患者之前应振荡。经过振荡的疫苗为混浊的白色悬浮液。
概述
术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它的物质，例如X+Y。
术语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。“基本上”可视需要从本发明定义中省去。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。
偶联技术的一般信息可在参考文献39中找到。
附图简述
图1显示了组合物中HBsAg稳定性的western印迹结果。在图1A中，各泳道为：(1)Laemmli加样缓冲液(LSB)；(2)MW标记；(3-5)1μg三种单独的对照HbsAg制品；(6-8)三种单独的五价组合物的上清液；(9-10)LSB。在图1B中，各泳道为：(1)MW标记；(2-4)1μg三种单独的对照HbsAg制品；(5-7)在2-8℃储存2周的三种单独的五价组合物的上清液；(8-10)在36-38℃储存2周的三种单独的五价组合物的上清液。
图2显示了五价组合物的pH随时间的变化情况。
图3显示了八价组合物中HBsAg稳定性的western印迹结果。在图3A和3B中：泳道1含MW标记；泳道2含浓度为1μg/ml的HBsAg对照；泳道3含八价组合物的上清液。在图3B中：泳道4含LSB；泳道5含与泳道2相同的对照；泳道6含DOC/TCA提取物。
实施本发明的方式
八价D-T-Pw-HBsAg-Hib-MenC-Men W135-Men Y疫苗
在铝盐佐剂悬浮液中加入酵母表达的HbsAg、白喉类毒素、破伤风类毒素和全细胞百日咳抗原。调节混合物的pH，然后加入Hib-CRM197偶联物，从而它不会被吸附到铝佐剂上。该方法得到的五价疫苗具有以下组成：
组分 浓度
白喉类毒素 15Lf/ml
破伤风类毒素 6.5Lf/ml
全细胞百日咳抗原 60OU/ml
HBsAg 20μg/ml
CRM-Hib 20μg/ml(以糖类计)
Al3+ 0.6mg/ml
NaCl 9mg/ml
在进一步的工作中，在加入CRM-Hib组分之后加入来自血清组C、W135和Y中每一种的单独的脑膜炎球菌-CRM197偶联物以得到八价疫苗：
组分  浓度
白喉类毒素  15Lf/ml
破伤风类毒素  6.5Lf/ml
全细胞百日咳抗原  30OU/ml
HBsAg  20μg/ml
CRM-Hib  20μg/ml
CRM-MenC  20μg/ml
CRM-MenW135  20μg/ml
CRM-MenY  20μg/ml
Al3+  0.6mg/ml
NaCl  9mg/ml
表示疫苗稳定性和功效的一个重要参数是Hib偶联物的水解百分比，临床极限为25％游离糖类(参考文献56称，20％不会影响临床免疫原性)。通过HPAEC-PAD对五价疫苗测量了该参数，HPAEC-PAD能够以最小量的分离和纯化(with minimalseparation and clean-up)直接量化皮摩尔水平的未偶联糖类。分析针对于游离糖类的量。
测定了糖的：
(a)总量，以μg/ml表示
(b)上清液中的量(即未吸附的量)，以μg/ml表示
(c)游离量(CRM197-Hib偶联物水解得到)，以μg/ml表示
(c)值表达为(d)(b)的百分比或表达为(e)理论上总糖浓度(20μg/ml)的百分比。结果如下：
  批号   时间     (a)     (b)     (c)     (d)     (e)
1   0     23.47     21.30     1.26     5.3％     6.3％
  2周，2-8℃     18.39     19.12     1.04     5.7％     5.2％
  2周，36-38℃     19.84     17.18     1.36     6.8％     6.8％
  4周，2-8℃     22.51     20.57     1.49     6.5％     7.3％
  4周，36-38℃     21.30     18.15     2.47     11.6％     12.3％
2   0     23.23     22.26     0.70     3.0％     3.5％
  2周，2-8℃     21.06     19.36     0.65     3.1％     3.3％
  2周，36-38℃     21.54     16.70     1.19     5.5％     5.9％
  4周，2-8℃     23.72     19.84     0.87     3.7％     4.4％
  4周，36-38℃     23.72     18.63     1.91     8.1％     9.6％
3   0     24.20     23.23     0.80     3.3％     4.0％
  2周，2-8℃     20.09     17.67     0.80     4.0％     4.0％
  2周，36-38℃     18.15     17.18     1.14     6.3％     5.7％
  4周，2-8℃     22.99     23.23     0.94     4.1％     4.7％
  4周，36-38℃     22.26     18.39     1.94     8.7％     9.7％
最多25％的游离糖是临床上可接受的。所有的值都低于该范围，在2-8℃储存最多达4周时低于6.5％。在热应激条件下(36-38℃储存4周)观察到较高水平，但仍旧低于25％的值，其中对第1批观察到最大值，为11.6％。对多价Hib疫苗进行的早期工作显示，相比在2-8℃储存2年，在36-38℃储存1个月使更多的CRM-Hib水解。因此可以预计，在正常储存条件下储存至少两年仍有可接受的水解。
还在于2-8℃储存6个月之后对游离糖类进行了HPAEC-PAD。数据如下：
    批号     (c)     (d)     (e)
    1     1.65     9.8％     8.3％
    2     1.09     5.8％     5.5％
    3     1.16     6.6％     5.8％
因此，与储存4周相比，储存6个月后游离糖的百分比仅少量增加，其值仍旧远低于25％的值。因此CRM197-Hib在这三种剂型中非常稳定。
图2A显示了三批五价疫苗在2-8℃储存6个月期间pH的变化。图2B显示了三批产品在36-38℃储存4周期间pH的变化。在2-8℃储存6个月后pH是稳定的，而在热应激条件下，直到2周后pH才略微下降0.1个单位，而直到4周后才进一步略微下降。即便如此，所有的pH值都保持在6.0-7.0的可接受范围内。
三批五价疫苗的渗量为312-315 mOsm/Kg，位于可注射疫苗渗量为240-360mOsm/Kg的可接受范围中央。
为获得组合疫苗的功效，评价抗原的功效和免疫原性是重要的。评价了五价疫苗中白喉、破伤风和百日咳抗原的功效并检测了CRM-Hib和HbsAg的免疫原性。进行ELISA分析以评价免疫接种后特定抗体的水平。用小鼠模型和不同于测定HBV功效的免疫接种方案测量HbsAg的免疫原性。
DTP功效值如下：
    D     T     P
    第1批     41     161     4
    第2批     39     138     5
    第3批     39     143     6
对这三批抗原中的每一批，功效检测结果都明显高于可接受的下限，这些结果显示这三批抗原有良好的功效。
为评价HBsAg免疫原性，在第0天和第14天通过皮下注射给一组10只CD1小鼠接种五价疫苗(0.5ml，1∶4稀释于盐水)。在第21天采集小鼠血液并用(a)“Enzygnost抗-HB II”检验(Dade Behring)或(b)“Ausab EIA”检验(Abbott)通过ELISA评价HbsAg特异性抗体。这些ELISA检验具有不同模式和不同的HBsAg灵敏度。因此无法比较两种检测之间的几何平均效价值。然而，在各检测中，血清的GMT值是最佳的。结果如下：
    Enzygnost     Ausab EIA
    GMT   应答者的百分比     GMT   应答者的百分比
    第1批     1008   100     192   100
    第2批     1518   100     194   100
    第3批     461   90     127   100
    仅佐剂     2   0     2   0
进行这种类型的小鼠免疫原性试验获得的所有GMT值都高于文献中报道的值。两种抗原的应答者的百分比始终较高，处于约100％的最佳水平。
为评价Hib免疫原性，在第0天、第10天和第20天通过皮下注射给一组8只CD1小鼠接种五价疫苗(0.5ml，1∶4稀释于盐水)。在第34天采集小鼠血液并通过ELISA评价Hib特异性抗体。结果如下：
  应答者的百分比
    第1批   100
    第2批   100
    第3批   100
    仅佐剂   0
HbsAg在铝佐剂上是吸附是疫苗免疫原性的重要因素，该参数是通过免疫印迹测量的。免疫印迹过程基本如下：用DOC/TCA沉淀1ml疫苗悬浮液，用LSB使其变性，然后加载到12％丙烯酰胺SDS-PAGE上；加入1μg各批次HbsAg作为对照；羊抗-HbsAg抗体制品被用作第一抗体(1∶1000稀释)并将抗-羊POD偶联物(1∶2500稀释)用作第二抗体。
五价疫苗的结果示于图1。图1A的泳道6-8显示，在0时间点组合物中没有可检测的可溶性HBsAg，图1B和1C的泳道5-10证实，在2-8℃或36-38℃储存2周和4周后亦是如此。在三个不同批次中，在这些不同条件下约99％的HbsAg保持吸附在佐剂上。
在2-8℃储存6个月后再进行一次稳定性试验(图1D)。三批疫苗中每一批的吸附仍约为99％。
图1所用的阳性对照含有1μg HbsAg。观察到与S肽(24kDa)对应的单个条带以及聚合体的特征性条带(约45kDa)。未见Pre-S2。
还用类似的方法检测了八价疫苗的HbsAg吸附。将1ml样品3500rpm离心10分钟。将上清液转移到新的试管中并用DOC/TCA沉淀。将沉淀重悬于200μl提取缓冲液，煮沸5分钟并1300rpm离心10分钟。将20μl该提取物和经DOC/TCA沉淀的上清液加载到12％SDS-PAGE上进行Western印迹。
图3A显示了0时点的八价疫苗，图3B显示了在2-8℃储存8个月后的该疫苗。图3B的泳道3和6不存在任何明显染色(明显少于在对照泳道2和5中用1μgHBsAg观察到的染色)说明，在该储存期之后HbsAg吸附仍旧是稳定的。
七价D-T-Pw-HBsAg-Hib-MenA-MenC疫苗
如下收集5种抗原性组分：
-三价D-T-Pw组分：制备的D-T-Pw组分包括吸附到氢氧化铝佐剂上的白喉类毒素、同样吸附到氢氧化铝佐剂上的破伤风类毒素和以磷酸铝作为佐剂的全细胞百日咳抗原。该组分含有硫柳汞但不含2-苯氧乙醇。
-HBsAg组分：从重组酿酒酵母表达并纯化HBsAg。将纯化的蛋白质吸附到磷酸铝抗原[17]。
-Hib偶联物组分：Hib多糖从Hib菌株20752制备，用溴化氰活化并用己二酸酰肼间隔物衍生化后通过碳二亚胺缩合共价偶联于破伤风类毒素，糖∶载体的重量比约为1∶3。在涉及EDAC的反应之后测量EDU水平。
-MenA偶联物组分：纯化来自血清组A脑膜炎球菌的荚膜糖并用CDAP技术共价偶联于流感嗜血杆菌D蛋白。在涉及CDAP的反应之后测量残余的DMAP含量，证实C-3的Oac基团得以保留。同样通过CDAP偶联还用破伤风类毒素载体制备了偶联物。
-MenC偶联物组分：纯化来自OAc+血清组C脑膜炎球菌的荚膜糖并用CDAP技术共价偶联于流感嗜血杆菌D蛋白。在涉及CDAP的反应之后测量残余的DMAP含量。还从OAc-菌株制备了偶联物。同样通过CDAP偶联还用破伤风类毒素载体制备了偶联物。
将D-T-Pw组分与HBsAg组分混合，并将该水性形式的四价混合物包装入有塞的药瓶。HbsAg水平为10μg/剂。
将三种偶联物混合并按参考文献2的描述冻干。将冻干的粉末包装入有塞的药瓶。每种偶联物的水平为5μg/剂。还制备了含有双倍各偶联物剂量的混合物。该偶联物混合物是不含佐剂的。
将两个药瓶包装在一个盒子中。
为对患者给药，将水性D-T-Pw-HbsAg材料吸入针筒，并注入装有冻干偶联物的药瓶。在冻干材料重活化之后将其吸回针筒，这样便可给患者给药了。
对于婴儿第6、10和14周时通过肌内注射给予给予一次3剂初次免疫接种。为进行比较，140名婴儿接受GSK的TRITANRIX-HepB/Hib疫苗。该疫苗显示出极好的免疫原性。
在随访试验中，婴儿在第6、10和14周时接受七价疫苗。对照患者接受TRITANRIX-HepB/Hib或TRITANRIX-HepB/Hib加MENINGITEC疫苗。在该初次免疫接种过程之前和之后1个月时测量血清抗体水平。每次疫苗接种后记录8天内随访(solicited)的局部和全身不良反应和30天内的一般不良反应(unsolicited adverseevents)。初次过程之后，与TRITANRIX-HepB/Hib对照组中的100％相比，99-100％接受该七价疫苗的对象的抗-PRP水平≥0.15μg/m。99-100％接受该七价疫苗的对象的SBA-MenC效价≥1∶8(而接受Meningitec的对象为100％)。至少97.7％接受该七价疫苗的对象的SBA-MenA效价≥1∶8(而接受Meningitec的对象为＜10％)。该七价疫苗诱导的抗白喉、破伤风和乙肝抗原以及抗-百日咳博德特氏菌类毒素浓缩物的血清保护水平较高并类似于对照疫苗。临床相关的随访/一般不良反应的发病率较低，并在所有组中分布相同。未报道与疫苗接种有关的严重不良反应。该七价疫苗显示出极好的免疫原性和良好的安全性特征，说明它是对生活在MenA和MenC流行区的婴儿进行初次免疫接种的合适的组合疫苗。
在进一步的研究中，评价了在10个月大的婴儿中对疫苗中Hib、MenA和MenC组分的免疫记忆力和抗体持久性。在用七价疫苗初免的婴儿中，对Hib、MenA和MenC的抗体持久性和免疫记忆力极好：10μg各种偶联物引起高水平的相应抗体，证明用偶联物疫苗初免是足够的，因为其产生的反应高于未初免幼儿中的反应(就MenA和MenC而言)并类似于HiberixTM(就Hib而言)。
应当理解的是，本发明只是用实施例的方式进行描述，只要不偏离本发明范围和精神，可以对本发明作出修改。
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Claims (38)

1.一种疫苗组合物，所述组合物包含：
(i)白喉类毒素‘D’；
(ii)破伤风类毒素‘T’；
(iii)细胞百日咳抗原‘wP’；
(iv)乙肝病毒表面抗原‘HBsAg’；
(v)偶联到载体蛋白的b型流感嗜血杆菌(‘Hib’)荚膜糖；和
(vi)至少一种偶联到载体蛋白的脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖，
其中，所述b型流感嗜血杆菌荚膜糖和脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜糖各自偶联到破伤风类毒素载体蛋白上。
2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述组分(vi)包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A和C的糖类。
3.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述组分(iv)的偶联物具有重量过量的载体，且糖类与载体的重量比在1∶2和1∶4之间。
4.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述组分(iv)的偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)用溴化氰活化b型流感嗜血杆菌荚膜糖以得到氰酸酯；(b)在氰酸酯中加入己二酸酰肼间隔物以得到活化的糖；和(c)通过碳二亚胺缩合将活化的糖偶联到载体蛋白。
5.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述组分(iv)的偶联物包含具有以下结构的接头：
Figure S200680014588XC00011
6.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述组分(vi)的偶联物是通过包括以下步骤的方法获得的：(a)将脑膜炎球菌荚膜糖氰化以得到氰酸酯；和(b)将氰酸酯直接偶联到蛋白质载体。
7.如权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述脑膜炎球菌荚膜糖来自血清组A。
8.如权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述脑膜炎球菌荚膜糖来自血清组C。
9.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述组分(vi)的偶联物包含OAc+脑膜炎球菌血清组C的荚膜糖。
10.如权利要求1-8中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述组分(vi)的偶联物包含OAc-脑膜炎球菌血清组C的荚膜糖。
11.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述组分(vi)的偶联物包含脑膜炎球菌血清组A的荚膜糖，该糖中至少80％的甘露糖胺残基在C-3位被O-乙酰化。
12.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含8-12μg/ml组分(iv)的偶联物。
13.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的单位剂量包含8-12μg组分(iv)的偶联物。
14.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含8-12μg/ml组分(vi)的偶联物。
15.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的单位剂量包含8-12μg组分(vi)的偶联物。
16.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗同时包含磷酸铝佐剂和氢氧化铝佐剂。
17.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述HbsAg被吸附到磷酸铝佐剂上。
18.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述白喉类毒素被吸附到氢氧化铝佐剂上。
19.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述破伤风类毒素被吸附到氢氧化铝佐剂上。
20.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含汞防腐剂和2-苯氧乙醇防腐剂。
21.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述白喉类毒素与破伤风类毒素的比例在2∶1和3∶1之间，以Lf单位测量。
22.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述HbsAg是非糖基化的并为颗粒形式，所述颗粒包括含有磷脂和磷脂酰肌醇的脂质基质。
23.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述HbsAg来自HBV亚型adw2。
24.如上述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗以0.5ml的剂量给予患者。
25.一种制备如上述权利要求中任一项所述的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将三价D-T-Pw组分与单价HBsAg组分组合以得到四价D-T-Pw-HBsAg组分；(b)将Hib偶联物与至少一种脑膜炎球菌偶联物组合以得到混合的偶联物组分；和(c)将四价D-T-Pw-HBsAg组分与混合的偶联物组分混合以得到疫苗。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述三价D-T-Pw组分同时包含氢氧化铝和磷酸铝佐剂。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述三价D-T-Pw组分中的D和T组分被吸附到氢氧化铝佐剂上。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述单价HBsAg组分被吸附到磷酸铝佐剂上。
29.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述混合的偶联物组分未经佐剂处理。
30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述三价D-T-Pw组分含有汞防腐剂。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述汞防腐剂是乙基汞硫代水杨酸钠。
32.如权利要求25-31中任一项所述的方法，其特征在于，所述混合的偶联物组分不含汞防腐剂。
33.如权利要求25-32中任一项所述的方法，其特征在于，所述疫苗包含2-苯氧乙醇防腐剂，但三价D-T-Pw组分不含2-苯氧乙醇防腐剂。
34.如权利要求25-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述Hib偶联物通过以下方法制备：用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺将Hib糖类偶联到破伤风类毒素载体；然后除去N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)脲。
35.如权利要求25-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌偶联物通过以下方法制备：用1-氰基-4-(二甲基氨基)-吡啶将脑膜炎球菌糖类偶联到破伤风类毒素载体；然后除去4-二甲基氨基-吡啶。
36.一种用于制备如权利要求1-24中任一项所述的疫苗组合物的试剂盒，该试剂盒中装有：(a)包含D、T、wP和HBsAg抗原的第一组分；和(b)包含Hib和脑膜炎球菌偶联物的第二组分，其中，所述两种组分在分开的容器中。
37.如权利要求36所述的试剂盒，其特征在于，所述第二组分中的偶联物是冻干的。
38.如权利要求36所述的试剂盒，其特征在于，所述第二组分包括乳糖、蔗糖和/或甘露醇。
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