CN101184495B - 用于预防或降低患者中的不良作用的方法、组合物和制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于预防或降低患者有害副作用的与阿卡地新或其前药、类似物或盐和/或凝血抑制剂相关的方法、组合物、制剂和试剂盒。可能受益的患者的类型包括左心室功能降低的患者、以前有心肌梗塞的患者、经历非血管手术的患者、或分娩过程中的胎儿。

Description

用于预防或降低患者中的不良作用的方法、组合物和制剂
发明背景
Gruber(美国专利NO.4,912,092)描述了预防性施用AICA核苷化合物，包括其类似物和前药，以预防与不期望的血流降低相关的组织损伤。ACIC核苷化合物以0.1到500mg/kg/天的量施用。也可以施用AICA核苷的前药，包括在下列专利中所述的那些：美国专利NO.5,082,829，名称为“AICA核苷前药”，美国申请NO.07/408,107，1989年9月15日申请，名称为“AICA核苷递送和降低血糖的方法及化合物”，美国申请NO.07/466,979，1990年1月18日申请，名称为“AICA核苷递送和降低血糖的方法及化合物”，都全文在此引入作为参考。某些AICA核苷前药在这些文献中被定义，通常是当引入身体时代谢为AICA核苷或活性代谢物，例如AICA核苷一磷酸酯的化合物。其他前药包括AICA核苷的一，二，三-5’磷酸酯。
如Fox和Kelly在the Annual Reviews of Biochemistry，Vol.47，p635，1978中描述的，腺苷，9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤(腺嘌呤的核苷)，属于称为嘌呤核苷的生化物质类别，是一种重要的生化细胞调节分子。它与广泛的细胞类型反应，负责许多生物效应。例如，腺苷是一种有效的血管舒张剂，一种免疫细胞功能抑制剂，可在一定水平上增强肥大细胞的活化，是粒细胞氧自由基生产的抑制剂，可以抗心律失常，并且是一种抑制性神经递质。考虑到它的广泛的生物学活性，为建立腺苷及其类似物的实际治疗用途已经进行了大量的努力。
由于一般认为腺苷通过结合锚定在膜上的受体在细胞质膜水平上起作用，过去的工作包括试图通过施用腺苷到血流中以提高细胞外的腺苷水平。遗憾的是，腺苷在施用于患者以保持有效的细胞外治疗水平的浓度上是有毒的，因此单独施用腺苷的治疗用途是有限的。而 且，腺苷受体在暴露于腺苷之后遭受负反馈控制，包括受体的下调。
存在并研究了获得腺苷的高局部细胞外水平的效果的其他方法。它们包括：(a)利用特异性阻断腺苷转运的试剂干扰腺苷的吸收，如Paterson等，the Annals of the New York Academy of Sciences，Vol.255，p.402(1975)描述的；(b)预防腺苷的降解，如Carson和Seegmiller在the Journal of Clinical Investigation vol.57，p.274(1976)所述；和(c)利用构建的腺苷类似物结合腺苷细胞质膜受体。
有许多化学物质可抑制腺苷的细胞摄取。其中一些是特异性地抑制，并且基本是腺苷取的竞争性抑制剂，另外一些是非特异性地抑制。对硝基苄基硫肌苷(P-Nitrobenzylthionosine)是一种竞争性抑制剂，双嘧达莫和许多其他化学物质，包括秋水仙碱、苯乙醇和罂粟碱非特异性抑制摄取。
腺苷的细胞外水平可以通过利用抑制腺苷的酶降解的化学物质来提高。以前的工作集中在鉴定参与腺苷转化为肌苷的腺苷脱氨酶的抑制剂。腺苷脱氨酶活性被肋间型霉素、2’-脱氧肋间型霉素和盐酸红9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤抑制。
已经产生了许多具有嘌呤环上的结构修饰、附着于嘌呤环上的取代基团的改变、以及碳水化合物部分的附着位点的修饰或改变的腺苷受体激动剂和拮抗剂。卤化腺苷衍生物似乎最有希望成为激动剂或拮抗剂，并且如Wolff等在the Journal of Biological Chemistry，Vol.252，p681，1977中所述，在类似于腺苷所引起的实验性系统中发挥生物学效应。
尽管上面讨论的三种技术可能都具有优于单独使用腺苷的优点，但是它们有几个缺点，主要的缺点是它们依赖于具有有害治疗副作用的化学物质，主要是由于它们必须以有毒的剂量施用，并且它们非选择性地影响大多数细胞类型。如在Purine Metalolism in Man，(eds.DeBruyn，Simmonds and Muller)，Plenum Press，New York，1984中所述，大多数体内细胞携带腺苷受体。因此，通常提高体内腺苷水平的技术的使用可导致正常细胞生理学的不期望的、明显的改变。
至于缺血后心肌组织和腺苷，在Swain，J.L.，J.J..Hines，R.L.Sabina和E.W.Holmes，Circulation Research，51：102-105(1982)和Holmes等的美国专利NO.4,575,498(1986年3月11日授予)中表明，在暴露于嘌呤核苷5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷(AICA核苷)的缺血性犬心脏中腺苷浓度和血流没有改变。他们也表明了嘌呤核苷库、特别是三磷酸腺苷(ATP)的消耗，假定在(例如)缺血性事件后的功能障碍中起作用，并且声称已经证明了通过利用嘌呤类似物AICA核苷处理缺血后心肌获得提高的核苷合成和伴随的ATP库的充满(repletion)，声称ATP库的充满在理论上应当能够使组织损伤得到改善。
然而其他几组研究人员公开了其研究，其中他们不能证明通过Swain等(同上)的方法可以提高缺血性组织中ATP库的充满。Mentzer，R.M.，Ely，S.W.，Lasley，R.D.，Lee，B.K.和Beren，R.M.，Fed.Proc.43：903(1984)；Mitsos，S.E.，S.R.Jolly和B.R.Lucchesi，Pharmacology 31：121-131(1985)；Hoffmeister，H.M.，Nienaber，C.，Mauser，M.和Schaper，W.E.，Basic Research in Cardiology 80：445-458(1985)；Mauser，M.，H.M.，Hoffmeister，C.Nienaber和W.E.Schaper，Circul.Res.56：220-230(1985)。实际上，Hoffmeister等证明了通过另一种机制的ATP充满不改善心脏功能障碍。甚至Holemes和Swain已经证明了由于抑制肌苷一磷酸(IMP)向腺苷一磷酸(AMP)的转化，AICA核苷不有效地获得ATP。Sabina，R.L.，Kernstine，K.H.，Boyd，R，L.，Holmes，E.W和Swain，J，L.，J.Biol.Chem.257：10178(1982)；Amidon，T.M.，Brazzamano.S.，Swain，J.L.，Circ.Suppl.72：357(1985)；Swain，J.L.，Hines，J.J.，Sabina，R.L.，Harburg，O.L.和Holmes，E.W.，J.Clin.Invest.74：1422-1427(1984)。Amidon等(同上)声明“这些结果表明腺苷酸琥珀酸合成酶和/或裂解酶活性在分离的心脏中是有有限的，并且提示设计为在AN(腺嘌呤核苷酸)合成中绕开IMP的干扰对提高AN库大小可能是更有利的”。Swain等(同上)(J.Biol.Chem)也证明AICA核苷并不总是改变非缺血性心肌中 的ATP水平。
然而Mitsos等(同上)声称他们的研究证实了在冠状动脉内以高剂量输注的AICA核苷完全保护了缺血性心脏免受与缺血性损伤有关的机械性功能障碍，Hoffmeister等，Basic Res.Cardiol.80：445-458(1985)表明在狗中通过冠状动脉阻塞产生可逆性缺血后，AICA核苷的应用并不改善缺血后的功能，实际上，使其恶化。Swain等(同上)(J.Clin.Invest)确认了高剂量的AICA核苷对于肌肉收缩性的不利作用。因此，施用AICA核苷在ATP库充满方面有益于遭遇缺血事件的患者的说法可能是不正确的。
从前面的讨论可以认识到，在病理事件的特定时间中提高腺苷或腺苷类似物的细胞外水平、提高这些化合物而没有复杂的副作用、允许更高的腺苷水平选择性靶向将受益于它们的细胞的技术将具有相当大的治疗用途。例如，所述技术在缺血性事件(如心脏病发作或中风)或其他与不希望的、被限制的或降低的血流有关的事件(如动脉粥样硬化)的预防或反应中是特别有用的，因为腺苷是一种血管舒张剂并防止粒细胞产生超氧化物基团。所述技术在预防性或积极性治疗与细胞刺激提高有关的病理状态中也是有用的，所述病理状态例如是(1)癫痫发作或癫痫症，(2)心律不齐，和(3)炎症，例如由关节炎、自身免疫疾病、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)和如在透析或用心肺仪器的过程中出现的与人工膜接触的血液中补体活化粒细胞引起的炎症。它更进一步地在治疗可能具有慢性低腺苷的患者中是有用的，所述患者例如是患有孤独症、大脑性麻痹、失眠症和包括精神分裂症在内的其他神经精神病综合症的患者。包括AICA核苷的在本发明中有用的化合物可用于实现这些目的。
在医学上重要的另一个领域是治疗变应性疾病，这可通过防止肥大细胞激活或干扰肥大细胞分泌的变应性应答介质而完成。肥大细胞激活可通过免疫治疗(变态反应攻击)或通过肥大细胞稳定剂如cromalyn钠、皮质类固醇和氨茶碱下调。也有干扰肥大细胞产物的治疗剂，例如，抗-组胺剂和肾上腺素剂。肥大细胞稳定化的作用机理 还不清楚。在氨茶碱的情况中，可能它是作为腺苷受体拮抗剂而作用。然而，例如cromalyn钠和皮质类固醇的药剂还没有被很好地理解。
因此，应当认识到，利用没有上述化合物的任一副作用(例如对于抗组胺剂的嗜睡，对于肾上腺素剂的烦躁，和对于皮质类固醇的库欣疾病综合症)的化合物进行有效的变态反应治疗将具有重大的意义和实用性。与本发明中有用的化合物例如AICA核苷和利巴韦林相比，三种已知的肥大细胞稳定剂都不知道或被认为会在细胞中代谢为嘌呤核苷三磷酸或嘌呤核苷一磷酸。
Gruber(美国专利NO.5,817,640)描述了用于预防与人血流降低有关的组织损伤的AICA核苷的具体治疗浓度，以及可获得有效性同时避免不希望的副作用的剂量的确定。在一个方面，AICA核苷或其前药以从大约1μg/ml到大约20μg/ml的剂量施用于人，该剂量使血浆AICA核苷浓度保持足够的时间，从而降低该人的组织损伤的风险。在另一方面，AICA核苷以大约0.01mg/ml/min到大约2.0mg/ml/min的剂量施用于人以降低组织损伤的风险。另一方面的特征是通过施用总剂量为10mg/kg到200mg/kg的AICA核苷来预防组织损伤。
AICA核苷进入细胞并被磷酸化为AICA核苷一磷酸(“ZMP”)，这是一种在嘌呤生物合成中天然出现的中间体。AICA核苷在净ATP分解的情况下提高了细胞外腺苷水平，因此，由于腺苷保护心脏和保护神经的性质，它可具有潜在的治疗用途。然而，AICA核苷具有相对较低的效能和较短的半衰期。我们还发现AICA核苷不能很好地穿过血脑屏障，不能有效地从胃肠道中吸收。这些受限制的效能、受限制的口服生物利用度和受限制的脑渗透的特性降低了其用作治疗剂的潜力。
已经报道了AICA核苷治疗在许多心肌缺血模型中具有有益的效果。在一种狗模型中，其中慢走诱导了壁增厚和心内血流的明显进行性下降以及心肌内EKG的ST段偏移的增加，AICA核苷显著减轻了这些改变以保持收缩功能(Young和Mullane，Am.J.Physio.，在出版中(1991))。在另一种由冠状动脉阻塞诱发缺血症的狗模型中，据 报道AICA核苷通过显著降低缺血诱导的心律不齐并增强流向心肌的缺血区域的血流而是有益的(Gruber等，Circulation 80(5)：1400-1410(1990))。在一种通过将微球直接施用于冠状动脉循环中而诱导缺血的冠状动脉栓塞狗模型中，还报道了AICA核苷提高区域血流和保持收缩功能的效果(Takashima等，Heart and Vessels5(supplement4)：41(1990))。这种报道的AICA核苷对血流再分配的可能结果被认为是降低梗塞的大小(McAllister等，Clinical research 35：303A(1987))。用AICA核苷治疗据报道在其他心肌缺血症实验模型中也具有有利的效果。例如，Mitsos等(Pharmacology31：121-131(1985))报道AICA核苷改善了在分离血液灌注的猫心脏中缺血后功能的恢复，Bullough等(Jap.J.Pharmacol52：85p(1990))报道了在分离的缓冲液灌注的豚鼠心脏中提高了恢复。因此，已经报道了AICA核苷在多种实验模型中可减轻缺血引起的损伤。
也已经报道了AICA核苷在两种不同的脑缺血实验模型种保护脑组织免受损害。在一种沙鼠全身缺血模型中，AICA核苷被报道阻止了海马CA-1细胞的退化，在对比动物中其实际被完全破坏(Phillis和Clough-Helfman，Heart and Vessels5(Supplement4)：36(1990))。在一种大鼠局部缺血模型中，AICA核苷被报道引起梗塞大小显著降低。AICA核苷治疗的保护性效果也在其他缺血模型中被报道，包括大鼠皮瓣存活(Qadir等，Fed Proc.A626(1988)；Salerno等，Proceedings of 35th Annual Meeting of the Plastic Surgery ResearchCouncil，pp.117-120(1990))和胃肠缺血再灌注损伤(Kaminski和Proctor，Circulation Res.66(6)：1713-1729(1990))。
许多研究提示AICA核苷的有益效果至少部分上可归因于局部腺苷水平的提高，其具有类似的心脏保护(Olafsson等，Circulation76：1135-1145(1987))和神经保护性质(Dragunow和Faull，Trends inPharmacol.Sci.7：194(1988)；Marangos，Medical Hypothesis32：45(1990))。AICA核苷诱导腺苷水平提高的证据有直接的，即，在动物和细胞培养模型中腺苷自身的测量结果(Gruber等，Circulation80 (5)：1400-1410(1990)；Barankiewicz等，Arch.Biochem.Biophys.，283：377-385，(1990))，也有间接的，即，通过利用腺苷脱氨酶除去外源腺苷从而逆转AICA核苷的抗缺血性质所暗示的(Young和Mullane，Am.J.Physio.，在出版中(1991))。在经受缺血和再灌注的心脏中，细胞损害部分归因于微脉管被嗜中性粒细胞堵塞。已经报道了腺苷抑制嗜中性粒细胞粘附到冠状动脉内皮细胞上并因此抑制嗜中性粒细胞积累(Cronstein等，J.Clin.Invest.78：760-770(1986))。因此，在一些缺血和再灌注模型中，腺苷介导的AICA核苷在心脏中的保护性效果的另一特征可以是通过防止嗜中性粒细胞依赖的组织损伤。这可被AICA核苷降低心脏缺血性区域中嗜中性粒细胞积累的证据所支持(Gruber等，Circulation80：1400-1410(1990))。
对腺苷的心脏保护和神经保护的认识导致了探索外源性施用腺苷本身的治疗用途的努力。然而腺苷在血液中较短的半衰期(＜10秒)使得必须使用高剂量和持续输注，以保持适合大多数治疗的水平。腺苷自身引起低血压，即，降低血压；它也是一种负性变时和变传导剂，即，分别降低心率和心脏的电传导率。因此腺苷在引起心脏保护或神经保护作用所需的浓度下发挥显著的系统性血液动力学效应。这些系统性心血管作用在腺苷可应用的大多数临床条件下通常是禁忌的。与之对比，作为对腺苷水平的局部影响的结果，AICA核苷的施用不产生所述副作用，甚至在比预期治疗浓度高的多的剂量下也是如此(Gruber等；Circulation 80：1400-1410(1990)；Young和Mullane，Am.J.Physio.，在出版中)。
腺苷受体激动剂也已研究，已经报道了在许多实验模型中其效果与腺苷类似(Daly，J.Med.Chem.25(3)：197(1982))。另外，因为大多数细胞类型具有腺苷受体，外源性施用腺苷激动剂对靶器官之外的多种组织和器官显示出显著的反应，由此限制了它们的治疗潜力。
还研究了可能获得高局部细胞外腺苷水平的效果的其他方法。它们包括：a)利用特异性阻断腺苷转运的试剂干扰腺苷的摄取，如Paterson等在the Annals of the New York Academy of Sciences，Vol.255， p402(1975)中所述；b)防止腺苷的降解，如Carson和Seegmiller在The Journal of Clinical Investigation，Vol.57，p274(1976)中所述；和c)利用构建的腺苷类似物结合腺苷细胞质膜受体。
已经报道有许多化学试剂可以抑制腺苷的细胞摄取。据报道其中一些是特异性抑制，被认为基本上是腺苷摄取的竞争性抑制剂，而另外一些被认为是非特异性抑制。对硝基苄基硫肌苷是一种竞争性抑制剂，而双嘧达莫和许多其他化学试剂包括秋水仙碱、苯乙醇和罂粟碱表现为非特异性抑制摄取。
Fischer等的美国专利NO.4,115,641涉及据说具有心脏和循环动力学性质的呋喃核糖衍生物。具体来说，Fischer等涉及一些据说具有内在的腺苷样作用模式的化合物，这是通过测量心率和血压的降低而确定的。
与之相比，AICA核苷和AICA核苷样化合物在病理事件的特定时间和位置导致腺苷水平提高，因此允许选择性地靶向提高的腺苷水平而不产生不利的副作用。
本发明涉及显示出并且在许多情况中增强AICA核苷的阳性生物学效应的AICA核苷类似物。这些新型化合物相对于AICA核苷典型地显示出一种或多种下述改进：1)在较低剂量下的功能益处；2)更强的腺苷调节作用；3)提高的半衰期，或；4)提高的口服生物利用度和/或脑穿透性。
手术后并发症是发病率和死亡率和保健花费的重要来源。
对于心脏手术，大约每年有一百万患者要经受，其中大约六分之一发展成严重的与心脏、脑、肾、胃肠道和肺有关的主要器官并发症(Mangano等，1997，J.Intensive Care Med.12：148-160)。然而尽管在监控和技术上有大量进步，但是没有药物显示出能降低或预防这些并发症。重要的是出血，现在利用药物来预防出血。然而，抑制出血的药物一般引起血栓，因此可能诱导缺血症和不可逆的器官损伤(Cosgrove等，1992，Ann.Thorac.Surg.54：1031-36)。
对于非心脏手术，大约每年有2.5亿患者要经受，其中大约百分 之四发展成严重的与心脏有关的重要器官并发症(Mangano等，1990，Anesthesiology 2：153-84；Mangano等，1990NEJM 323：1781-88)。仅有一种药物显示出能够减轻伤害-阿替洛尔(Mangano等，1990 NEJM335：1713-20)。同样，主要考虑出血，预防血栓(抗-血小板，抗-凝血)的药物实际上是禁忌的(Eagle等，1999，JACC 34：1262-1347；Pearson等，1994，Circulation 90：3125-33；Baumgartner等，1994，JohnsHopkins Manual of Surgical Care，Mosby Yearbook，St.Louis)。
然而，对于心脏和非心脏手术，在手术后显著的兴奋毒性和炎性反应会发生数天，或者在手术后发生数月(Silicano和Mangano，1990，Mechanisms and Therapies.In：Estafanous，ed.Opioids in anesthesiaButterworth Publishers，pp.164-178)。所述显著增强的反应与可能参与血栓形成的血小板和凝血因子活化有关。
虽然认识到其可能性，但是所述药物是相对禁忌的，在一些情况(纤溶药物)中是完全禁忌的，因为害怕在手术部位和其他部位过度出血(Eagle等，1999，JACC 34：1262-1347；Pearson等，1994，Circulation90：3125-3133；Baumgartner等，1994，Johns Hopkins Manual of SurgicalCare，Mosby Yearbook，St.Louis)。而且，一些人认为，特别是在心脏手术后，血小板和凝血因子功能在手术后降低，因此不会有血栓形成(Kestin等，1993，Blood82：107-117；Khuri等，1992，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.104：94-107)。因此，没有努力研究抗凝血剂在手术后的立即应用。
最后，申请人已经表示围手术期事件出现在6到8个月或更长的时间(Mangano等.1992，JAMA 268：233-39)；因此，在医院中、在出院后持续使用所述抗凝血剂是合理的。
手术患者-现在单独在美国每年就有4千万人-的衰老比整个人群几乎快两倍。(见Mangano等，1997，J.Intensive Care Med.12：148-160)。
现在的护理标准对于这种关键问题是无能为力的，迫切需要新的方法来预防衰老人群中的手术后并发症。
胎儿心率的电子监控是妇女分娩过程中的一个重要部分。在一些情况中，胎儿心率的减速，包括丧失逐跳变异的持续性晚期减速、与逐跳变异丧失有关的不可靠的变异减速、延长的严重心搏徐缓、窦状型、与胎儿静止无关的逐跳变异的确认丧失、药物治疗或严重的早产，可能需要紧急的子宫内胎儿复苏和立即分娩。(Sweha等，1999，American Family Physician 59(9)：2487-2507；Kripke 1999，AmericanFamily Physician 59(9)：2416)。为了胎儿的健康需要有预防或降低这些事件的不良作用的方法。
发明内容
本发明涉及预防或降低患者中的不良作用的方法，包括施用阿卡地新或其前药、类似物或盐；或阿卡地新或其前药、类似物或盐和血凝抑制剂。另外，本发明包括与预防或降低患者不良作用有关的药物制剂、组合物、心脏麻痹液和试剂盒。本发明可能有益于几种患者，包括左心室功能降低的患者、以前发生心肌梗塞的患者、经历非血管手术的患者、或分娩过程中的胎儿。
参考引用
所有在说明书中提到的出版物和专利申请在此引入作为参考，等同于每个出版物或专利申请都明确和分别地引入作为参考。
附图说明
图1.腺苷的代谢途径。
图2.在体外与AICA核苷预孵育48小时对ATP分解过程中人淋巴母细胞分泌腺苷的影响。
图3.AICA核苷处理对冠状静脉腺苷浓度的影响。冠状静脉血液在冠状动脉阻塞之前及之后的不同时间里收集到2N高氯酸中。用阿拉明和氟利昂中和从这些提取物中获得的上清液，用高效液相色谱法评价。图中显示了五只盐处理的狗(●)和六只AICA核苷处理的狗 (□)的平均腺苷浓度+/-标准差。
图4.在体内AICA核苷在狗的冠状动脉阻塞过程中对局部心肌血流的影响。利用在阻塞5分钟(空白的)和60分钟(阴影线的)时输入左心房的放射性标记的微球测量局部心肌血流。图中显示平均值加标准差。星号(*)表示与盐处理的狗的显著性差异，p＜0.01。
图5.AICA核苷处理(●)和仅仅含有盐水的对照处理(□)对狗的肌苷水平的影响的比较。
图6.AICA核苷酸(ribotide)和利巴韦林核苷酸对酶AMP脱氨酶的抑制的影响。
图7.与AICA-核苷预孵育18小时对ATP分解过程中人淋巴母细胞分泌腺苷的影响。
图8.与AICA核苷预孵育3小时和孵育4小时对在体外在ATP分解过程中人淋巴母细胞分泌腺苷的影响。
图9.在体外用利巴韦林处理后人淋巴母细胞释放腺苷增加。
图10.从对照和利巴韦林处理的肥大细胞释放的β-己糖胺酶。小鼠骨髓来源的肥大细胞在单独的培养基(空白的)或含10μM利巴韦林的培养基(阴影线的)中培养3到7天，利用钙离子载体A23187进行攻击。静息的和被刺激的细胞释放β-己糖胺酶的百分率显示为来自七次实验的重复数值的平均值+/-SE。星号(*)表示与对照细胞有显著性差异的数据(p＜0.05)。利用DNP-BSA抗原刺激抗-DNPIgE-致敏的肥大细胞获得类似的结果。
图11.利巴韦林对肥大细胞β-己糖胺酶释放的剂量应答效果。肥大细胞在单独的培养基(对照)或含1、10或20μM利巴韦林的培养基中培养6天，洗涤，用A23187攻击，定量净β-己糖胺酶的释放。利巴韦林处理的细胞当用A23187攻击时在所有测试浓度下均释放出显著较少的β-己糖胺酶。介质含量和自发释放在对照和暴露于利巴韦林的细胞中没有差别。显示的是三次实验的重复测定值的平均值+/-SE。
图12.AICA核苷对在大鼠中用戊四唑诱导的癫痫发作的抑制。
图13.AICA核苷对在大鼠中用异丙肾上腺素诱导的心律不齐的抑制。
图14表示在实施例1所述的研究中安慰剂组(n＝37)患者的肌酐磷酸激酶MB带(CK-MB)水平的个体值。
图15表示在实施例1所述的研究中高剂量(0.01mh/kg/分钟)AICA核苷组(n＝35)患者的肌酐磷酸激酶MB带(CK-MB)水平的个体值。
图16表示在实施例1所述的研究中低剂量(0.05mg/kg/分钟)AICA核苷组(n＝41)患者的肌酐磷酸激酶MB带(CK-MB)水平的个体值。
图17表示在实施例1所述的研究中每个治疗组患者随着时间变化的肌酐磷酸激酶MB带的平均值。
图18表示在实施例1所述的研究中，在CABG手术过程中，在给患者恒速输注0.05或1mg/kg/分钟的药物的过程中或之后，AICA核苷的平均血浆浓度(μg/ml)。实线表示0.05mg/kg/分钟，虚线表示0.1mg/kg/分钟。
图19显示了在大鼠心脏缺血模型中，AICA核苷(表XII和XIII的化合物1(1-110))和N-4(系列1)取代的AICA核苷类似物(化合物10(1-186))对组织腺苷水平的剂量依赖性影响的对比。
图20A-C显示了在细胞培养模型中，AICA核苷(化合物1和2’-(系列IV)取代的AICA核苷类似物系列(化合物20(1-188)、34(1-250)和32(1-262))对腺苷利用(与肌苷和次黄嘌呤一起)的影响的比较。
图21显示了在沙鼠脑缺血模型中，N-4(系列1)取代的AICA核苷类似物(化合物10(1-186)和11(1-226)的效果。
图22显示了与指定浓度的化合物53(1-468)预孵育1分钟后WI-L2淋巴母细胞中腺苷转运的抑制。
图23显示了与指定浓度的化合物53(1-468)预孵育1小时后WI-L2淋巴母细胞中腺苷转运的抑制。
图24.阿司匹林、死亡和手术。提供了在阿司匹林和非阿司匹林组中致死性(N＝164)和非致死性(N＝748)缺血的结果。由于排除了在48小时内出现的相应结果，风险人群在个体结果之间改变。比值比和它的95％置信区间。
图25.阿司匹林、死亡和手术。提供了通过在5022名在CABG手术后最初48小时存活的研究患者中使用阿司匹林的住院存活率。提供了在5065名研究患者中使用阿司匹林的30天存活率。对使用阿司匹林的存活率进行Kaplan-Meier分析。
图26.阿司匹林、死亡和手术。提供了在阿司匹林和非阿司匹林组中与血小板输注相关的死亡率。所有对比都是显著性的。对于阿司匹林组，血小板输注对比无血小板输注(P＜0.001)，对于无阿司匹林组，血小板输注对比无血小板输注(p＜0.001)，对于血小板输注组，阿司匹林对比无阿司匹林(p＜0.001)，对于无血小板输注组，阿司匹林对比无阿司匹林(p＜0.001)。
图27.阿司匹林、死亡和手术。提供了在阿司匹林和非阿司匹林组中与使用抗纤溶治疗相关的死亡率。包括接受了抑肽酶(1578名患者)、ε-氨基己酸(1258名患者)、氨甲环酸(951名患者)或去氨加压素(61名患者)的3659名患者。所有对比都是显著性的。对于阿司匹林组，抗纤溶治疗对比无抗纤溶治疗(P＝0.04)，对于阿司匹林组，抗纤溶治疗对比无抗纤溶治疗(P＝0.31)，对于抗纤溶治疗组，阿司匹林对比无阿司匹林(p＜0.001)，对于无抗纤溶治疗组，阿司匹林对比无阿司匹林(p＜0.001)。
发明详述
“射血分数”指左心室功能的指标，也称为左心室射血分数(LVEF)。射血分数是每次心跳从左心室排出的血液的百分比。50％LVEF表示左心室每次收缩时射出其体积一半的血。正常的射血分数是50％或更高。射血分数降低表示患有心肌病。
在一个方面，本发明提供了预防或降低左心室功能降低、射血分 数小于30％的患者中的不良作用的方法，包括施用有效量的阿卡地新或其前药、类似物或盐。另一个实施方式提供了一种方法，其中所述患者是女性和/或年龄在65到95之间。
本发明的另一方面提供了一种降低与患者中低血流有关的组织损害的方法，包括施用有效量的阿卡地新或其前药、类似物或盐，其中患者是在分娩过程中的胎儿。在一个实施方式中，将有效量的阿卡地新或其前药、类似物或盐施用给分娩胎儿的妇女。
在一个方面，本发明提供了一种药物实施方式，本发明提供了一种包含阿卡地新或其前药、类似物或盐的药物制剂，用于在分娩过程中给胎儿施用，以预防或降低胎儿中与血流降低相关的组织损伤。
描述了新的方法，其用于提高腺苷释放，特别是在净ATP分解代谢过程中，即在细胞或细胞区室中ATP合成率降低或已降低到ATP分解的过程中。
也描述了新的稳定肥大细胞的方法。
本发明的范围中也包括一种针对提高细胞合成和腺苷释放的能力筛选嘌呤核苷化合物或类似物的方法，包括给培养的细胞施用含有待筛选的嘌呤核苷化合物或类似物的第一组合物，给所述培养的细胞施用含有促进三磷酸腺苷的分解代谢的化合物的第二组合物，并测定所述培养的细胞释放的腺苷的量或水平。
该最后一种方法可进一步包括没有加入第一组合物和所述第二组合物的第一培养细胞对照组、加入所述第一组合物的第二培养细胞对照组、和加入所述第二组合物的第三培养细胞对照组。培养的细胞可来源于人恶性细胞系，例如EB病毒转化的B淋巴细胞，或WI-L2人脾淋巴母细胞细胞系，例如本文实施例II所利用的。用于产生促进三磷酸腺苷净分解代谢的组合物的化合物包括钙离子载体和2-脱氧葡萄糖。
提高腺苷释放的方法利用施用确信可以改变腺苷代谢的一个或多个生化途径的化合物，以使净结果为腺苷的细胞外浓度提高(由一个或多个过程产生，包括提高的细胞内生产和/或腺苷释放)。本发明 中有用的化合物的例子包括广泛分类为嘌呤核苷和相关类似物的化合物，例如，AICA核苷、AICA核苷酸、1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-甲酰胺(利巴韦林)、利巴韦林一磷酸、和多种上述化合物的前体形式。这些化合物被细胞吸收，并且如必要，可转化为它们的一磷酸酯，并且，较少地转化为它们的三磷酸酯形式。还包括(1)可提高AICA核苷酸或代谢物的内源合成的试剂，例如嘌呤中间代谢物或可形成这些代谢物的化合物，如琥珀酰氨基咪唑甲酰胺(SAICA)核苷；(2)引起AICA核苷酸或其代谢物的形成的试剂，包括甲氨蝶呤，和(3)引起细菌菌落提高AICA核苷的产生的试剂，例如磺胺类药物。这些化合物在一些情况下可预防性地施用于患者，和/或在另外一些情况下对患者的身体状况直接响应。提高细胞核苷和/或腺苷类似物分泌的嘌呤核苷可以0.5微摩尔到0.5摩尔的浓度范围施用于活体系统，典型地，以高达0.5摩尔的浓度施用。
腺苷或肌苷在快速细胞能量利用过程中，例如在癫痫发作、心律不齐或导致血流降低的状况(缺血)如中风、心脏病发作或心绞痛过程中，由三磷酸腺苷产生。通常，在所述事件中，肌苷的产生比腺苷多。在冠状动脉阻塞中的低血流区域中，例如，静脉肌苷率与腺苷之比是大约100比1。一定百分比的肌苷和腺苷脱离细胞，在紧接的细胞外环境中出现。在此描述和要求保护的方法中利用的化合物已经显示提高细胞外腺苷浓度，并且肌苷的产生已经显示为降低。在患者中腺苷水平没有显著改变，因为腺苷产生的改变仅仅发生在净ATP利用的区域和时间，并且腺苷快速降解。因此，在此描述和要求保护的方法将导致细胞外腺苷的浓度局部增加，而不是系统性的或全身性的腺苷增加。
低密度脂蛋白(LDL)的氧化是动脉粥样硬化过程的最初骤之一，如果不是第一个步骤的话，一般认为该过程涉及炎症，并且是由于单核细胞和/或粒细胞活化引起的。氧化的脂质被巨噬细胞吸收而形成动脉粥样硬化斑。由于腺苷阻止粒细胞产生超氧化物自由基，本发明的提高了腺苷释放的化合物应该能延缓、预防或逆转动脉粥样硬化的发 展。
因为在炎性反应中预期会进行ATP分解代谢，患有下列疾病的患者用本发明中有用的化合物进行治疗应该会得到缓解：(1)自身免疫疾病，(2)关节炎，(3)牛皮癣，(4)器官移植排斥，(5)暴露于心肺或超滤膜之后补体介导的粒细胞活化，(6)ARDS，或其他炎性状况，无论是由于粒细胞活化(如上面(1)-(6))还是单核细胞活化。
患有可能与慢性低腺苷相关的疾病如失眠症、孤独症、精神分裂症和脑瘫的患者将也会从利用本发明提高腺苷浓度中获益。
而且，利用本发明的化合物进行治疗将使患有多种与肥大细胞降解相关的疾病的患者获益。它们包括患有变态反应、特别是哮喘、花粉热、慢性荨麻疹、色素性荨麻疹和湿疹的个体。AICA核苷和利巴韦林，例如，抑制肥大细胞活化，包括预防肥大细胞降解。降低的肥大细胞活性也使血流降低的患者获益，因为从肥大细胞释放的物质在缺血中可通过例如心律不齐或血管痉挛的过程而增加损害。
预期本发明有用的化合物以大约0.1mg/kg/天到大约500mg/kg/天、优选大约15mg/kg/天到大约200mg/kg/天的量有效施用。剂量范围应特别适合本发明应用的作为预防药物的化合物，以预防与不期望的限制的或降低的血流相关的组织损伤。对于所述预防，更期望使用至少大约0.1mg/kg/天的AICA核苷或AICA核苷酸，优选大约1.0mg/kg/天到大约500mg/kg/天，更优选大约20mg/kg/天到大约100mg/kg/天。对于所述预防还预期以至少大约0.1mg/kg/天的量、优选大约1.0mg/kg/天到大约20mg/kg/天的量施用利巴韦林或利巴韦林一磷酸盐。如果是治疗脑部疾病，例如中风、癫痫发作、癫痫、短暂性缺血发作、孤独症、精神分裂症、脑瘫和失眠，由于血脑屏障，需要超过200-500mg/kg/天的剂量。然而，利用定位于脑的前药可能会使低剂量成为可能。
图1显示了细胞内腺苷形成和降解的途径。腺苷可能被转运入细胞或从细胞中释放。腺苷的代谢可能利用下述的某些途径：1.S-腺苷 甲硫氨酸转甲基酶；2.S-腺苷高半胱氨酸水解酶；3.腺苷脱氨酶；4.嘌呤核苷磷酸化酶；5和6.黄嘌呤氧化酶；7.转运机制；8.腺苷磷酸化酶(在人类中没有建立)；9.腺苷激酶；10.5’核苷酸酶和非特异性磷酸酶；11.腺苷酸激酶；12.二磷酸核苷激酶；13.腺苷酸环化酶；14.AMP脱氨酶；和15.腺苷琥珀酸合成酶和腺苷琥珀酸裂解酶。
如下面更详细的描述，利用所述化合物，包括嘌呤核苷利巴韦林和AICA核苷，对细胞外腺苷浓度的效果已在体外和体内得到证实。为将这些分子施用于患者，预期它们主要通过口服施用，因为这些本发明的化合物不易被体内的胞外酶降解或因暴露于胃中的低pH而降解。这些药物也可静脉内施用、直接肌内注射、皮下、局部用于皮肤或粘膜、直肠、或通过吸入施用。药学应用可接受的组合物是公知的。也可使用前药，即，当导入体内时代谢为所述化合物的活性形式的物质。
由于嘌呤核苷AICA核苷可代谢为尿酸，这种药剂可同别嘌呤醇或其他防止尿酸合成的药物或与促尿酸尿剂例如丙磺舒一起使用。其代谢产物抑制AICA核苷酸转甲酰酶的某些药剂，如甲氨喋呤和利巴韦林，可导致内源AICA核苷的合成并产生类似于施用嘌呤核苷的效果。伴随着AICA核苷或AICA核苷酸施用AICA核苷酸转甲酰酶抑制剂应该至少具有加合效应。另外，任何一种从头产生的嘌呤核苷酸合成中间体(在嘌呤合成的第一步关键步骤之后)或它们的核苷或碱被认为可快速转化为AICA核苷酸。一个例子是SAICA核苷酸或其核苷或碱。
所述化合物可用于提高细胞外腺苷的浓度，并且，因此治疗由于流过特定器官或其部分的血流不足所引起或加重的疾病。例如，心脏病发作或中风、糖尿病的微脉管疾病(其可以影响大脑、肾脏、心脏、皮肤、视网膜和外周神经和与它们相关的微脉管系统)，或导致血流损失较小延长的事件，例如心绞痛、短暂性缺血发作、肠缺血、肾脏缺血、骨骼肌间歇性跛行、偏头痛和雷诺现象，可通过施用本发明的化合物治疗。已知腺苷既是一种有效的血管舒张剂，通过降低血管平 滑肌收缩起作用，又是一种粒细胞自由基产生抑制剂。如所提到的，它在动脉粥样硬化症的治疗中也是有用的。
与细胞接触后，一般认为本发明中有用的化合物进入细胞，在其中它们可被腺苷激酶磷酸化，或者在施用碱的情况中，它们可被磷酸核糖基转移酶转化核苷酸，以产生一磷酸嘌呤核苷酸，最终成为三磷酸核苷。三磷酸盐形式可包括将分解为一磷酸盐形式的库。
不希望被下述提出的作用模式所约束，推测本发明的化合物或其代谢物在腺苷生物学途径中抑制一种或多种酶，包括AMP脱氨酶，由此使ATP更多转为细胞生产、释放，较少腺苷的重吸收，同时远离细胞生产和肌苷释放。
重要的是注意到利巴韦林不能被代谢为正常的嘌呤，也就是说，它不能变为AMP、ADP、ATP、IMP或磷酸鸟苷GMP、GDP或GTP。换句话说，这些本发明中有用的化合物可提高腺苷释放，而不直接代谢为腺苷。AICA核苷具有类似于利巴韦林的生化性质，表现为通过类似的机理而不是通过迂回转化为腺苷从而提高腺苷的释放。所述化合物已经显示不受ATP库消耗的影响。
图1显示腺苷主要通过两种途径之一代谢。首先，如途径3所示，腺苷可被腺苷脱氨酶分解代谢以形成肌苷。肌苷然后主要进一步被途径4、5和6所示的酶降解，或穿过胞质膜从细胞中离开。显示了转运机制7，其使得腺苷可以在两个方向上通过细胞质膜转运。
如9所示，腺苷也可被腺苷激酶合成为一磷酸腺苷(AMP)，或如2所示，被S-腺苷高半胱氨酸水解酶合成为S-腺苷高半胱氨酸(依赖于高半胱氨酸的可利用性)。前者是一种需能反应。AMP然后或者被AMP脱氨酶(14)作用以形成一磷酸肌苷(IMP)，或者进一步被多种酶反应合成为三磷酸腺苷(ATP)或环-AMP。腺苷激酶或S-腺苷高半胱氨酸水解酶的抑制可间接导致腺苷摄取降低。
参见关于腺苷释放的实施例I-III，图2、3、7-9和表1中的结果显示，在净ATP分解代谢过程中AICA核苷的存在提高了腺苷的细胞释放，并同时降低了肌苷的细胞释放(见实施例IV和图5)，提示存 在对AMP转化为IMP的抑制，或存在腺苷转化为肌苷的抑制。
实施例I和II的细胞培养实验显示AICA核苷甚至在2-脱氧柯福霉素(腺苷脱氨酶的一种强抑制剂)的存在下也能提高腺苷的细胞释放。因此，看来本发明的化合物在腺苷途径上与腺苷脱氨酶催化的反应不同或除此之外的点上具有效果。它们被认为可以通过干扰AMP脱氨酶的作用而抑制AMP转化为IMP。本发明化合物的代谢物抑制AMP脱氨酶的能力在实施例VII中评价，结果显示在图6中。AICA核苷酸和一种结构上类似的化合物-利巴韦林一磷酸，显示对AMP脱氨酶具有类似的抑制效应。
但是，也有可能本发明的化合物抑制5’核苷酸酶将IMP酶促转化为肌苷，因此降低IMP的分解，结果导致腺苷的细胞释放量增加。而且，本发明的化合物可能直接或间接地抑制腺苷的细胞重摄取、磷酸化或脱氨基作用。
总的来说，使本发明中有用的化合物具有有益效果的一种提出的途径是所述化合物进入细胞，在其中它们被核糖基化(如果还不存在糖环)和磷酸化(如果仍未磷酸化)为一磷酸酯形式。所述化合物的一磷酸酯形式抑制了AMP脱氨酶。在ATP分解代谢过程中，AMP库在被处理细胞中比在未处理的细胞中提高得更多，因为AMP不再能容易地转为IMP。嘌呤一磷酸的切割导致了更高的腺苷的细胞释放，同时导致更低的肌苷的细胞释放。因为腺苷在某些病理事件中表现为天然有益的调节剂，通过引导ATP到腺苷而不是肌苷来提高其释放是一种新的且极为重要的治疗方法。
在心脏病发作中，如下所述，腺苷正常释放，并且通过血管舒张和抑制粒细胞产生自由基及同时的微脉管堵塞，保持缺血脉管的开放。本发明中有用的化合物提高了腺苷释放，因此，在所述局部缺血事件中提高了腺苷的正常保护效果。
尽管腺苷的释放有时是一种有益的事件，但不必要的区域内高浓度腺苷可能是有害的。在此描述并请求保护的本发明的一个优点是患者没有用腺苷本身治疗，本发明中有用的化合物选择性地提高腺苷从 细胞中的释放，所述细胞中存在净ATP分解。因此，仅仅只有邻近的细胞被处理。利用本发明中有用的化合物治疗患者允许提高的腺苷释放特异性靶向经历净ATP分解代谢的组织，即，需要腺苷释放的组织。腺苷施用的全身效应得到避免。而且，腺苷仅仅在必要的特定时间释放。所有在此描述或公开的疾病和病理性状态涉及或被相信涉及局部化的净ATP分解代谢。
另外，如果有益地响应腺苷的细胞持续性地处于高浓度腺苷中，则它们将更具有反应性。因为腺苷仅仅在必要时立即可获得，细胞例如粒细胞和平滑肌细胞表面的受体没有持续暴露，因此具有大得多的反应，因为它们的腺苷受体没有因持续性的腺苷暴露而被下调。
除了通过腺苷释放导致血管舒张之外，本发明的化合物还可通过第二种机理提高分支血流。研究已经显示在血流受限制的区域，粒细胞被活化，释放氧自由基，随后粘住并损害微血管系统。本发明中有用的药物通过提高的腺苷释放防止粒细胞产生自由基，因此，粒细胞较少粘住微血管(见实施例VIII)，其允许血流从分支血管流进封闭区域。如实施例IX所示，在一小时缺血时从AICA核苷处理的狗心脏中比从盐水处理的狗中更显著地洗出铟标记的粒细胞，导致提高的分支血流。因此，肌肉和/或内皮细胞摄取本发明的化合物，紧接着在局部缺血中释放腺苷，应该引起血管舒张和/或抑制粒细胞活化，并抑制伴随的微脉管的堵塞和损伤，因此导致心肌损害的减少。
如实施例I-VI，IX，XIII和XIV所示，本发明化合物的一个重要方面是它们可作为预防性试剂施用。当药物在局部缺血事件、癫痫发作或治疗所针对的其他机体状态之前存在时，净ATP分解可主要涉及腺苷而不是肌苷。
如果药物在引起局部缺血的事件之后或之中导入患者中到达局部缺血区域，由于目标ATP库被相对快速的耗尽，该药物将ATP在该部位变为腺苷的能力很低或缺失。而且，由于许多在局部缺血中的损害事件快速发生，理想地，药物应该在尽可能早的时候存在。当药物作为预防剂时，也有可能足够早地减慢试图中断的过程，从而预防 任何永久性的损伤。例如，由血管舒张获得的提高的微脉管血流和降低的白细胞粘附可保持微脉管的开放，并且在某种意义上有助于从邻近的动脉粥样硬化区域中洗去凝块、促凝血物质或其他有害物质。
其他因素使得在局部缺血事件之前或之中给药是重要的。如果药物在阻断之后施用，则更少能够到达涉及的组织，因为有很少或没有血液流向这个区域。见实施例III和图4。例如，也认为AICA核苷代谢为AICA核苷酸，并且后者是该分子的活性形式。这是一种利用ATP的需能反应。如果由于高代谢活性和/或ATP破坏增大而ATP不可获得，则AICA核苷或类似药物不能转化为其活性形式。另外，在快速ATP分解过程中，细胞内的肌苷可能显著地与药物竞争进入细胞中，两种化合物都是嘌呤核苷类似物。
而且，如下所述，预期本发明的化合物与某种其他治疗形式结合是有益的。由于本发明的化合物在预防性使用时在急性局部缺血事件中提高腺苷释放，因此经受所述治疗的心脏病发作患者可能具有更大的机会在进入医院之前不死于突发的心律不齐。另外，在患者被转运到医院过程中以及在可以进行其他治疗之前，微脉管床将得到保护。
急性局部缺血事件经常是沉默一段时间，在患者意识到发生了什么并寻求帮助之前有额外的迟延。当患者获得医疗帮助时，如当救护车到达或当患者到达医院时，可以给患者施用溶栓治疗。溶栓治疗，例如组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)、溶栓酶、尿激酶或抗凝血剂如肝素或华法林，都试图打开附近的阻塞，例如在心脏病发作或中风中发生的阻塞。目前，患者需要在急性局部缺血事件大约4小时内接受治疗。在几小时之后，会产生对组织的不可逆的损害，特别是对于微脉管床。如果患者预防性使用了AICA核苷或其他本发明的化合物，由于增多的腺苷的存在，患者的微脉管床将得到较长时间的保护。
提高的腺苷释放防止了超氧自由基的产生和/或粒细胞阻塞和微脉管的损害。因此，患者应当能在急性局部缺血事件后被保护更长一段时间。例如，心血管阻塞后大概8-16小时，仍然有可能建立一种 这样的溶栓治疗以打开附近的损害。另外，打开附近的损害仅仅当下游微脉管可以被灌注时才是有益的。
本发明中有用的化合物在与溶栓剂联合时也是有益的，所述溶栓剂例如是组织纤溶酶原激活剂，以及其他自由基清除剂或防止自由基产生的药物。自由基清除剂的例子有超氧化物歧化酶，一种在局部缺血事件后灌注的蛋白质，或具有较小功效的物质，例如过氧化氢酶、乙酰半胱氨酸(mucomyst)、维生素E、谷胱甘肽和硒。被认为防止自由基产生的化合物的例子有通过抑制黄嘌呤氧化酶起作用的别嘌呤醇、通过下调前列腺素代谢物起作用的异戊酸(icosopentanoicacid)、抗某些活化粒细胞上的受体的抗体，其防止它们在微脉管内的粘附。本发明中有用的化合物通过增加腺苷，抑制了粒细胞的NADPH氧化酶自由基产生系统，并因此在与例如别嘌呤醇(其抑制从黄嘌呤氧化酶的自由基产生)等药物联合时是有用的。
起因于或可导致血流受限制的另一种疾病是心肌心律不齐。尽管受限制的血流可引起心律不齐的发作，但是确切的原因还是未知的。但是，已知氧自由基引起的脂质过氧化反应是致心律失常的。由于氧自由基是粒细胞产生的，通过本发明方法抑制粒细胞超氧化物的产生预期可控制心律不齐。另外，肥大细胞在动脉硬化区域具有更高浓度。抑制它们的活化可能降低了心律不齐的其他调节因子的释放。腺苷对肌细胞也具有直接的抗-心律不齐效应。AICA核苷治疗对心律不齐的预防性效果被实施例VI和XIV证实，结果显示了室性早搏去极化和室性心动过速发作数降低。在心律不齐过程中快速的细胞激活导致了净ATP分解代谢和腺苷释放的增加。
当从神经元细胞释放的腺苷在癫痫发作行为中被刺激并分解ATP时，它们将反馈并抑制癫痫发作行为。在本发明有用的化合物存在下，抑制癫痫发作事件的程度应该显著提高。实施例XIII证实了AICA核苷导致了戊四唑诱导的癫痫发作的发生率降低和潜伏期延长。
患有自身免疫疾病、关节炎或其他炎性疾病的患者如果用本发明 中有用的嘌呤核苷或类似物治疗应该也会得到缓解，因为在与炎性应答有关的提高的细胞激发过程中预期会发生ATP分解代谢。炎性疾病在人体中自然地发生，涉及对个体自身组织的免疫应答。对于需要克服的自身免疫应答，需要不同的免疫细胞作用以支持这种应答。因此，干扰必需的细胞-细胞相互作用的化学剂预期可干扰该疾病的进程。一种产生自身免疫应答必需的细胞类型是淋巴细胞。由于公知腺苷是抑制淋巴细胞的，因此施用本发明中有用的化合物，例如AICA核苷或利巴韦林，应该在炎性事件中抑制或耗竭免疫细胞群，并因此对于炎性疾病患者具有相当的治疗益处。另外，如所提到的，腺苷抑制粒细胞产生氧自由基和与内皮细胞的粘附，两者在许多炎症过程如自身免疫疾病中都是重要的因素。
与慢性低腺苷潜在相关的状况也可用本发明的化合物治疗。这些病理状态包括孤独症、失眠、脑瘫、精神分裂症、和其他神经精神病综合症。预期0.1mg/kg/天到大约200mg/kg/天的剂量将是有益的。用AICA核苷在腺苷琥珀酸酶缺乏(孤独症)患者中的治疗实验显示在实施例X中。以5mg/kg/天的单一剂量口服AICA核苷，提高到2次5mg/kg/天，最终提高到2次10mg/kg/天，在两名患者之一中显示了明显的改善，两名患者都被父亲描述为“在治疗期间更快乐地活泼并且更易于控制”，从而促使他请求重新恢复试验。没有观察到临床的或生化的副作用，这提示可施用更高剂量以产生额外的有益效果。
对于肥大细胞脱粒，用例如AICA核苷或利巴韦林治疗将使患有多种疾病的患者获益。例如，患有变态反应特别是哮喘、花粉热(包括过敏性结膜炎和过敏性鼻炎)、慢性荨麻疹、色素性荨麻疹和湿疹的患者预期可从嘌呤核苷和嘌呤核苷类似物的治疗中获益。如B.Benacerra和A.Unanue在Textbook of Immunology(Williams&Williams Baltimore/London，1979)中所述的，抑制变态反应的关键是防止肥大细胞释放药理活性物质。肥大细胞是具有广泛的颗粒的大型嗜碱性着色细胞，所述颗粒包含例如组胺的物质，这些物质被肥大细胞在变态反应过程中释放，并且是支持变态反应所必需的。这些存在于 肥大细胞中的药理活性物质的释放称为“脱粒”。因此，预防脱粒的化学剂应该对于降低过敏反应的严重性具有有益的效果。因此，变态反应患者可利用AICA核苷或利巴韦林成功地治疗，因为这些分子防止肥大细胞脱粒。肥大细胞活化也导致了前列腺素和白三烯(非预先形成的介质)例如过敏性反应的慢反应物质的释放。本发明中有用的嘌呤核苷和类似物也防止这些炎症介质的释放。如实施例XI所示，利用利巴韦林预防性处理肥大细胞表现出β-己糖胺酶的释放显著减弱，这些结果显示在图10和11中。实施例XII的结果，类似地显示了AICA核苷抑制肥大细胞的活化(白三烯C4的释放)和脱粒(β-己糖胺酶的释放)。
申请人的发明与发现了用于预防人体中与血流降低相关的组织损害的AICA核苷特定治疗浓度以及确定了有效并避免不希望的副作用的剂量有关。申请人的发明还与发现了预防或降低具有所述事件风险的患者的有害临床后果(包括有害心血管和/或脑血管事件)严重程度的AICA核苷特定治疗浓度和剂量有关。申请人已经发现保持AICA核苷的血管内浓度为大约1μg/ml到大约20μg/ml是优选的，可以获得AICA核苷的有益效果，并防止可能在较高剂量时发生的副作用。申请人已经发现理想的范围是大约3到大约6μg/ml，特别是大约5μg/ml。
因此，在第一方面，本发明提供一种预防人体中与血流降低相关的组织损害的方法，包括以从大约1μg/ml到大约20μg/ml、优选大约3μg/ml到大约6μg/ml、更优选大约5μg/ml的量给人施用AICA核苷，所述量使AICA核苷的血液血浆浓度保持一段充分的时间，以致在该人中所述组织损害的风险降低。期望在人体中AICA核苷的浓度导致血清尿酸提高到不大于大约16.0mg/dl、更优选不大于大约9.0mg/dl的水平。
“防止组织损伤”表示减轻局部缺血事件的频率、持续时间和/或严重性，和/或降低不期望的血流降低对组织的损害性效果。局部缺血事件的发生频率、持续时间和严重性可通过本领域已知的方法进行测 量。例如，在AICA核苷在冠状动脉旁路移植手术(冠状动脉搭桥术，CABG)中的应用中，可以使用下列方法：(1)比较连续Holter心电图记录中ST段的变化；(2)通过经食道超声波心动图评价局部室壁运动；(3)肌氨酸酐磷酸激酶MB的系列测量；和(4)系列12-导联心电图分析。测量不希望的血流降低的有害作用的方法在本领域也是已知的。组织损害的有害作用可包括有害的临床后果，例如有害的心血管和/或脑血管事件，包括观察到的与CABG手术有关的事件。所述有害事件包括心源性死亡(即主要由于心脏相关原因导致的死亡)、透壁性和/或非透壁性心肌梗塞、脑血管意外、充血性心力衰竭、威胁生命的节律障碍，其可在所述手术之中和/或之后发生。其他可被AICA核苷施用预防的有害临床后果包括肝损伤(通过酶升高证明)、胰腺损伤(通过酶升高证明)、弥散性血管内凝血(包括肠失血引起的)和死亡(非心脏原因引起的)。降低组织损伤的风险是指与不施用AICA核苷相比组织损伤的机会减小。使用AICA核苷或其前药也可保护脑组织免受由降低的血流引起的伤害。
AICA核苷表示5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺(也称为阿卡地新)。
在第二个方面，本发明提供一种预防人体中与血流降低相关的组织损伤的方法，包括施用AICA核苷一段充分的时间以降低所述组织损伤的风险，施用剂量为大约0.01mg/kg/分钟到大约2.0mg/kg/分钟，优选从大约0.05mg/kg/分钟到大约0.2mg/kg/分钟，更优选对于被麻醉的患者为大约0.1mg/kg/分钟，对于非麻醉的患者或短时间麻醉的患者为大约0.125mg/kg/分钟。
在某些实施方式中，预防损伤的组织是心肌或心脏微脉管系统。在其他实施方式中，预防损伤的组织是脑组织或脑微脉管系统。
在某些实施方式中，所要预防的组织损伤是在手术中例如在心脏手术(如CABG手术)或在血管手术中发生的不希望的血流降低引起的组织损伤。在这些实施方式中，化合物可在麻醉诱发开始前很短的时间内施用，并在手术过程中持续，在手术完成后持续大约一个小时， 或手术完成后至少大约七个小时，或更长，这取决于例如手术持续时间等因素。
在另一个实施方式中，AICA核苷不仅给经历心脏手术的患者施用，而且包含于用来在所述手术过程中灌注患者心脏的灌注液中。优选地，灌注溶液中AICA核苷的浓度在大约5μM到大约100μM的范围内，更优选大约20μM。
在另一种实施方式中，AICA核苷与别嘌呤醇联合或一起施用，优选以大约100mg/天到大约1200mg/天、更优选以大约300mg/天的量施用。别嘌呤醇降低尿酸的水平，并因此可与AICA核苷(或AICA核苷的前药)联合或一起施用，以允许施用更大剂量的AICA核苷或前药，同时避免尿酸水平升高的有害副作用。如上提到的，期望尿酸水平不超过大约16mg/dl，优选不超过大约9mg/dl。
在另一个实施方式中，本发明进一步涉及在施用AICA核苷(或其前药)之前对需要预防所述血流降低的人进行鉴定。本领域技术人员应当理解，“鉴定”是指确定有组织损伤风险的患者，如经历手术或其他程序的患者。这些经历心脏手术的患者的危险因素包括高龄(例如，超过70岁)；紧急情况或紧急的手术，其可能被不稳定型心绞痛复杂化；失败的经皮腔内冠状动脉形成术；降低的左心室功能(如根据小于大约40％的射血分数所确定的)；慢性或急性肾衰竭；节律障碍(在治疗中)；或在过去几年中的MI。参见例如，Mangano，Anesthesiology 72：153-184(1990)。那些经历非心脏手术的患者的危险因素包括高龄(例如，超过65-70岁)；动脉粥样硬化心脏疾病，即，冠状动脉疾病，通过外周血管疾病或颈动脉疾病所证实；糖尿病；肾衰竭；当前处于治疗中的心力衰竭；左心室肥大和高血压；超过5年的高血压；突发事件或紧急手术；手术前6个月到1年之内的MI；心绞痛；心律不齐或高胆固醇血症。本发明还包括鉴定由于慢性、遗传性或类似情况、或由于心绞痛、短暂性缺血发作、进展性的或最近的MI、或进展性的或最近的中风而需要预防性施用AICA核苷的患者。因此，那些没有经历手术的人也可能面临增加的组织损伤的风险。
在另一方面，本发明提供一种预防人体中与血流降低相关的组织损伤的方法，包括施用总剂量为10mg/kg到200mg/kg、优选30mg/kg到160mg/kg的AICA核苷。对于心脏手术，优选的量是大约40mg/kg。对于其他的适应症，例如非心脏手术，优选的量是大约120mg/kg。本领域技术人员应当认识到所述总剂量可通过改变所施用的AICA核苷的浓度、施用速率和/或持续时间而获得。
在另一方面，本发明提供一种预防人体中与不希望的血流降低相关的组织损伤的方法，包括以能有效提供大约1μg/ml到大约20μg/ml、优选大约3μg/ml到大约6μg/ml、更有选大约5μg/ml的血浆AICA核苷水平的量施用AICA核苷前药。获得这些水平所需的前药的量可由本领域技术人员利用标准方法容易地确定。前药可与别嘌呤醇联合一起施用，优选的别嘌呤醇的施用量为大约100mg/天到大约1200mg/天，优选大约300mg/天。所述施用将避免高尿酸水平的有害副作用。前药可如以上关于AICA核苷本身所述同样地施用。
在另一方面，本发明提供一种在有危险的患者中预防有害的临床后果的方法，所述临床后果包括有害的心血管和/或脑血管事件，该方法包括以提供大约1μg/ml到大约20μg/ml、优选大约3μg/ml到大约6μg/ml、更优选大约5μg/ml的血浆AICA核苷浓度的量施用AICA核苷或其前药。“有害的临床后果”表示对患者具有临床不利影响的事件。“有害的心血管事件”表示对患者有害的与心脏或血管有关的事件。“有害的脑血管事件”表示对患者有害的与影响大脑的血管有关的事件。
本发明进一步涉及鉴定具有有害临床后果危险的患者，所述有害临床后果包括有害的心血管和有害的脑血管事件。经历心脏手术的患者的危险因素包括高龄(例如，超过70岁)；突发事件或紧急手术，其可能被不稳定型心绞痛复杂化；失败的经皮腔内冠状动脉形成术；降低的左心室功能(如根据小于大约40％的射血分数所确定的)；慢性或急性肾衰竭；节律障碍(在治疗中)；或在过去几年中的MI。参见例如，Mangano，Anesthesiology72：153-184(1990)。那些经历非心 脏手术的患者的危险因素包括高龄(例如，超过65-70岁)；动脉粥样硬化心脏疾病，即，冠状动脉疾病，通过外周血管疾病或颈动脉疾病证实；糖尿病；肾衰竭；当前处于治疗中的心力衰竭；左心室肥大和高血压；超过5年的高血压；突发事件或紧急手术；手术前6个月到1年之内的MI；心绞痛；心律不齐或高胆固醇血症。本发明还包括鉴定鉴定由于慢性、遗传性或类似情况、或由于心绞痛、短暂性缺血发作、进展性的或最近的MI、或进展性的或最近的中风而需要预防性施用AICA核苷的患者。因此，那些没有经历手术的人也可能面临增加的组织损伤的风险。
在另一方面，本发明提供一种在有危险的患者中预防有害的临床后果的方法，所述临床后果包括有害的心血管和/或脑血管事件，该方法包括施用AICA核苷一段充分的时间以降低所述事件的危险，施用剂量为大约0.01mg/kg/分钟到大约2.0mg/kg/分钟，优选大约0.05mg/kg/分钟到大约0.2mg/kg/分钟，更优选大约0.1mg/kg/分钟到大约0.125mg/kg/分钟，取决于麻醉。
在某些实施方式中，所预防的有害的心血管事件是心肌梗塞。“心肌梗塞”包括透壁性和非透壁性心肌梗塞。对于CABG治疗，透壁性MI通过在ECG检查出现新的Q波和提升的CK-MB浓度而得到证实，非透壁性MI通过升高的CK-MB浓度而没有新Q波而得以证实。在其他实施方式中，所预防的心血管事件是心源性死亡。“心源性死亡”是指由于主要心脏原因引起的患者死亡，例如，由于心肌梗塞、节律障碍或心室障碍。
本发明的另一方面提供了一种预防或降低具有心肌梗塞的患者的不良作用的方法，包括施用有效量的阿卡地新或前药、类似物或其盐。在一个实施方式中，心肌梗塞发生在最近24、36或48小时内。另一个实施方式提供了一种方法，其中患者是女性并且年龄为65到95岁之间。
在某些实施方式中，所预防的脑血管事件是脑血管意外。“脑血管意外”是指与降低的血流相关的脑损伤，如，中风。
在某些实施方式中，有害的心血管或脑血管事件的风险是例如心绞痛或短暂性缺血发作的适应症的结果。在其他实施方式中，有害的心血管或脑血管事件是心脏手术例如CABG手术的结果，或是非心脏手术例如血管手术的结果。在手术的情况中，AICA核苷可在麻醉诱发前很短的时间内开始施用，并在手术过程中持续，在手术完成后持续大约一个小时，或总共持续大约七个小时。给药可持续更长时间，例如，手术后24小时或更长。延长给药对于非心脏手术特别有效，因为有害的事件倾向于更晚发生。例如，已经观察到在心脏手术中，MI倾向于主要在手术后第一天内发生，但是，在非心脏手术中，MI倾向于主要在手术后第二天或第三天发生。因此，在非心脏手术的情况中，AICA核苷(或前药)在手术后施用一段延长的时间，例如，7-48小时。
本发明的另一方面提供了一种预防或降低经历非血管手术的患者的不良作用的方法，包括施用有效量的阿卡地新或前药、类似物或其盐。非血管手术包括腹部、神经、妇产科、整形外科、泌尿科和耳鼻喉科手术。更具体地，非血管手术包括小肠或大肠切除术、阑尾切除术、腹腔镜检查、穿刺术、经尿道前列腺切除(TRUP)、子宫切除术、输卵管结扎、输精管切除术、输卵管卵巢切除术、剖腹产术、痔切除术、扁桃体切除术、鼓膜切除术、放置鼓膜切开管、去除结肠和直肠的息肉、直肠脱垂的修复、肠瘤的去除和治疗、刮除术、胸腔穿刺术、胸廓切开术、鼻成形术、脂肪抽吸术等。
在另一个实施方式中，AICA核苷不仅给经历心脏手术的患者施用，而且包含在用来在所述手术过程中灌注患者心脏的灌注液中。优选地，灌注溶液中AICA核苷的浓度在大约5μM到大约100μM的范围内，更优选大约20μM。
在另一个实施方式中，AICA核苷与别嘌呤醇联合或一起施用，优选的施用量为大约100mg/天到大约1200mg/天，更优选大约300mg/天。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种预防或降低经历CABG 手术的患者中发生有害的心血管或脑血管事件的方法，所述方法包括以下步骤：(a)围手术期给所述患者静脉内施用0.1mg/kg/分钟的AICA核苷大约7小时，和(b)用20μM的AICA核苷的灌注液灌注患者的心脏。
本发明的另一方面还提供了一种预防经历CABG的患者中风的方法，包括施用有效量的阿卡地新或前药、类似物或其盐。
在另一方面，本发明提供一种预防或降低有心肌梗塞风险的人的心肌梗塞严重性的方法，所述方法包括给所述患者施用AICA核苷或其前药，其施用量为在所述人中提供大约3μg/ml到大约6μg/ml的血浆AICA核苷浓度，其施用时间足以降低所述心肌梗塞的风险。心肌梗塞增加的风险可能是由于手术引起的，可能是心脏手术，如CABG手术，也可能是非心脏手术，如血管手术，或是由于手术之外的因素引起的，如，可逆局部缺血的指征，如心绞痛或无症状性缺血，或进展中的或最近的MI或中风。
在另一方面，本发明提供一种预防或降低有脑血管意外风险的人的脑血管意外严重性的方法，所述方法包括给所述人施用AICA核苷或其前药，其施用量为在所述人中提供大约3μg/ml到大约6μg/ml的AICA核苷的血浆浓度，其施用时间足以降低所述脑血管意外的风险。增加的脑血管意外的风险可能是由于心脏(如CABG手术)或非心脏(如血管手术)手术或非手术风险例如短暂性局部缺血发作引起的。
在另一实施方式中，本发明提供一种预防或降低心源性死亡的严重性的方法，所述方法包括将AICA核苷或其前药以在所述人中提供大约3μg/ml到大约6μg/ml、优选大约5mg/ml的血浆AICA核苷浓度的量给所述患者施用充分时间，以降低所述心源性死亡的风险。增加的心源性死亡风险可能是由于心脏或非心脏手术引起的。例如，风险可能来自CABG手术。
AICA核苷可持续施用或以多个剂量施用。为了降低组织损伤的风险，AICA核苷可施用至少大约15分钟的时间。它可持续施用超过大约4小时，优选持续大约7小时。在其他例子中，AICA核苷可持 续施用超过大约10、12、16、24或甚至大约48小时。
AICA核苷可静脉内施用、通过冠状动脉内或动脉内输注、口服、或通过其他本领域已知的方法施用，包括通过体外循环(例如利用心肺机或透析)导入患者血液中。AICA核苷可预防性地施用，或响应已知的身体状况而施用。
在一种实施方式中，AICA核苷个由冻干形式制备为治疗溶液，以预防储存过程中可观察到的液体制剂的易发生的变色。优选地，AICA核苷是无热原的。
另一方面提供了一种药物制剂，该制剂包含阿卡地新或前药、类似物或其盐和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中该制剂在足够长的时间内给需要的患者提供大约1μg/ml到大约20μg/ml的阿卡地新或其前药、类似物或盐的血浆浓度，并且该制剂是亲脂性的。在一个实施方式中，时间大约是7小时。在另一实施方式中，药物制剂是微团(micelle)形式。
在另一方面，本发明提供一种用于给经历心脏手术例如CABG手术的患者施用ACIA核苷的试剂盒，其中包含用于制备给经历心脏手术的患者静脉内输注的AICA核苷溶液的冻干AICA核苷，和用于制备用来灌注经历心脏手术患者心脏的心麻痹灌注液的溶液中的AICA核苷。优选地，所述AICA核苷是无热原的。优选地，冻干AICA核苷以100mg到2000mg的量提供；更优选地，以500mg的量提供。优选地，溶液中的AICA核苷以1到20ml的体积提供；更优选5ml。优选地，溶液中AICA核苷的浓度是大约1mg/ml。
冻干的AICA核苷可与适合的稀释剂例如水或盐水溶液联合，以将其成为适于给患者输注的形式。
溶液中的AICA核苷可以是在水溶液中、盐水溶液中或心麻痹溶液中。溶液中AICA核苷的浓度适于添加到心麻痹灌注溶液中，以使得心麻痹液中的最终AICA核苷浓度是5μM到100μM，优选20μM。例如，如果5ml 1mg/ml的AICA核苷被添加到一升心麻痹灌注溶液中，结果浓度将是大约5μg/ml或20μM。
申请人发现的AICA核苷的特别有用的治疗浓度和剂量的一个优点是可在一定浓度下获得功效，在该浓度下血清或尿中尿酸水平升高的副作用和/或晶尿症被减少(如果不是完全避免的话)，并且它避免了血液葡萄糖水平降低。
申请人还发现，在麻醉患者中比在非麻醉患者中获得所需的血液浓度水平需要更低的AICA核苷剂量。麻醉患者需要的剂量可比非麻醉患者需要的剂量低大约20-25％。因此，在非麻醉患者或短时间麻醉患者中AICA核苷(或前药)的优选浓度大于麻醉患者的优选剂量。相应地，在所述情况中，剂量优选为大约0.075mg/kg/分钟到大约0.30mg/kg/分钟，更优选为大约0.10mg/kg/分钟到大约0.15mg/kg/分钟，最优选为大约0.125mg/kg/分钟。
定义
如此处所用的，下列术语具有下列含义，除非特别说明为相反含义。
术语“烃基”指主要包含碳和氢的有机基团，包括烷基、链烯基、炔基，以及包括芳基、芳烷基的芳香族基团、具有饱和和不饱和键混合的基团、脂环(碳环或环烷基)基团或芳基(芳香族)取代的所述基团，或其组合，并可以指直链、支链或环状结构，或具有其组合的基团。
术语“烷基”指饱和脂肪族基团，包括直链、支链和碳环基团。术语“低级烷基”指具有总共1到6个碳原子的直链和支链烷基基团，包括伯、仲、叔烷基基团。典型的低级烷基包括，例如，甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、异丁基、叔-丁基、正-戊基、正-己基等。
术语“芳基”指具有大约6到14个碳原子的芳香族基团，包括环芳香族体系例如苯基和萘基。
术语“芳烷基”指用6到10个碳原子的芳基基团取代的大约1到4个碳原子的烷基基团，并包括，例如，苄基、对-氯苄基、对-甲基苄基基和2-苯乙基。
术语“链烯基”指具有至少一个双键的不饱和烷基基团，例如CH3CH＝CH(CH2)2-，包括直链和支链链烯基基团。
术语“炔基”指具有至少一个三键的不饱和基团，例如，CH3 C≡C(CH2)2-，包括直链和支链炔基。
术语“卤代”或“卤素”指氟、氯、溴和碘。
术语“酰基”指基团：
Figure S2006800187562D00331
其中R’是烃基。
术语“亚烷基”指直链、支链和碳环亚烷基基团，其是二价基，包括，例如，亚乙基、亚丙基、2-甲基亚丙基(如
1，6-正-亚己基、3-甲基亚戊基(如，
Figure S2006800187562D00333
1，4-亚己基等。
术语“酰胺”或“酰氨基”指基团
Figure S2006800187562D00334
其中每个R″独立地是氢或烃基，或指具有至少一个所述基团的化合物。
术语“甲酰胺”指基团
其中R″独立地是氢或烃基。术语“未取代的氨甲酰”指
术语“酰氨基”指基团
其中R′是烃基。术语“低级酰氨基”指其中R′为1到6个碳原子的烷基的酰氨基。
术语“碳酸酯“指基团
Figure S2006800187562D00343
其中R′是烃基，或指具有至少一个所述基团的化合物。
术语“酰基酯”指基团
其中R′是烃基，或指具有至少一个所述基团的化合物。
术语“磷酸酯”指基团
Figure S2006800187562D00345
其中R″独立地是氢或烃基，和/或指具有至少一个所述基团的化合物，并包括其盐。
术语“混合酯”指具有至少一个碳酸酯基团和至少一个酰基基团的化合物，或指具有不同酰基酯或碳酸酯基团的组合。
术语“羧酸酯”或“羧基”指基团
Figure S2006800187562D00351
其中R′是烃基，或指具有至少一个所述基团的化合物。
术语“碳环AICA核苷”指一种AICA核苷类似物，其中核糖基环上的氧原子被亚甲基(--CH2-)取代。
术语“烃氧基”指基团R′O--，其中R′是烃基。
术语“烷氧基”指基团R′O--，其中R′是烷基。
术语“烃硫基”指具有通式R′S-的基团，其中R′是烃基。
术语“烃氨基”基团--NHR′或--NR′2，其中R′是独立选择的烃基。
术语“烃酰亚胺”指基团
Figure S2006800187562D00352
其中R″是烃基。
术语“酰胺肟”指基团
Figure S2006800187562D00353
术语“烃氧脒”指基团
Figure S2006800187562D00354
其中R′是烃基。
术语“烃氧羰基”指基团
Figure S2006800187562D00355
其中R′是烃基。
术语“烃氧羧基”指基团
Figure S2006800187562D00356
其中R′是烃基。
术语“硫酯”指基团
Figure S2006800187562D00361
其中R′是烃基。
优选的AICA核苷类似物
根据本发明，优选的AICA核苷类似物包括通式I的化合物
Figure S2006800187562D00362
或其药学上可接受的盐，其中X是--O--或-CH2-；R1是氢、氨基、烃氨基、酰基氨基、或二烃氨基亚烷基亚氨基，R2是氢、氰基、烃酰亚胺、酰胺肟、烃氧脒、甲酰胺、或羧酸或酰胺、酯、硫酯或其盐。R3是氢、烃基、氨基、烃氨基、卤素、羟基(包括互变异构2-咪唑酮)、烃氧基、巯基(包括互变异构2-咪唑硫酮)、或羟硫基；R4和R5独立地是氢、烷基、酰基、或烃氧羰基；R6是氢、烃基、卤素、羟基、烃氧基、巯基、烃硫基、胺磺酰氧、氨基、烃氨基、叠氮基、酸基、烃氧羧基、或磷酸酯基团或其盐；条件是如果R1是氨基，R2是未取代的甲酰胺，R4和R5是氢、酰基或烃氧羰基，则R6不是羟基、酰氧基或烃氧羰基。
可选地，R2可以是下述通式的基团
Figure S2006800187562D00371
其中R1、R3、R4和R5和R6如前面在通式(I)中定义，alk是2到8个碳原子的亚烷基。适当的alk基团包括正-亚己基和1，4-环亚己基。由于其中R3是羟基或巯基的上式化合物可以异构体(互变异构体)咪唑-2-酮和咪唑-2-硫酮形式存在，这些异构体也被包括在通式I的范围内。
优选的化合物包括以下化合物，其中：(i)R1是氨基，R2是其中一个酰胺氢原子被烃基取代的甲酰胺，更优选芳烷基(所述烃基或芳烷基任选地被取代，适合的取代基包括以下所述)；更优选R3是氢，R4和R5是氢或烃氧羰基，并且R6是羟基或氨基(系列I)；(ii)R1 是氨基，R2是甲酰胺，R3是卤素或巯基，R4是氢，R5是氢，R6是羟基(系列II)；(iii)R1是氨基，R2是甲酰胺，R3、R4和R5是氢，R6 是氨基(系列III)；和(iv)R1是氨基，R2是甲酰胺，R3是氢，R4 是烷基，R5是氢，R6是羟基(系列IV)。
特别地，由于在不同试验模型中所证实的活性，优选的化合物包括表XII和表XIII中的化合物10、23、25、29、47、52、53(系列I)、27、43(系列II)、21、66(系列III)和20、34(GP-1-250)和32(GP-1-262)(系列IV)。
优选的新的AICA核苷类似物
式I化合物的一个优选的组包括某些新的AICA核苷类似物，其中X是--O--或--CH2-；R1是氨基、烃氨基或二烃氨基亚烷基亚氨基，R2是甲酰胺，其中一个酰胺氢原子(与氮原子连接)任选地被取代为任选地用1到3个取代基取代的烷基、环烷基、或芳基、或芳烷基， 所述取代基独立地选自卤素、烷基、芳基、硝基、氨基、烃氨基、巯基、烃硫基、羟基、烃氧基、三氟甲基、或磺胺；R2是甲酰胺，其中两个酰胺氢都被烷基取代或一起被亚烷基或芳基亚烷基取代以形成环；或者R2是-C(O)-S-R7，其中R7是任选地被1到3个取代基取代的烷基、环烷基、芳基或芳烷基，所述取代基独立地选自卤素、烷基、芳基、硝基、氨基、烃氨基、巯基、烃硫基、羟基、烃氧基、三氟甲基或磺胺；或进一步地，R2是式II的基团，其中R1、R3、R4、R5和R6如式I所定义，alk是2到8个碳原子的亚烷基；R3是氢、氨基、烃氨基、卤素、羟基(包括互变异构2-咪唑酮)、烃基、巯基(包括互变异构2-咪唑硫酮)或烃硫基；R4和R5独立地是氢、烃基(1到18个碳原子)、酰基或烃氧羰基；R6是羟基、氢、烃基、卤素、烃氧基、巯基、烃硫基、氨磺酰氧基、氨基、烃氨基、叠氮基、酸基、烃氧羧基或磷酸酯或其盐；条件时如果-X-是-O-或--CH2-，R1是氨基，R2是未取代的甲酰胺，R3是氢，R4和R5独立地是氢、酰基或烃氧羰基，则R6不是氢、羟基、酸基或烃氧羧基，或当R4和R5都是氢时，则R6不是磷酸酯；当X是氧，R1是氨基，R2是未取代的甲酰胺，R3是巯基，并且R4和R5都是氢时，R6不是乙酸基；当X是氧，R1是氨基，R2是未取代的甲酰胺并且R3是氯、溴、氨基或甲氧基，并且R4和R5都是氢时，则R6不是羟基，或者当R4和R5都是乙酰基时，则R6不是乙酸基；并且条件进一步是当X是氧，R1是氨基，R2是苄基甲酰胺或对-碘苯基甲酰胺，R3是氢时，则R4和R5都不是氢并且R6不是羟基；或者当R2是对-碘苯基甲酰胺时，则R4和R5 都不是乙酰基并且R6不是乙酸基。
优选的化合物包括如下化合物，其中R1是氨基，R2是用芳烷基、更优选用具有如上所述的1到3个环取代的苯甲基或用环烷基取代的甲酰胺。由于在不同实验模型中的活性，优选的化合物包括化合物23、25、29、47、52和53。
一种特别优选的化合物的例子是这样一种化合物，其中X是氧，R1是氨基，R2是对-氯苯甲基甲酰胺，R3、R4和R5是氢并且R6是氨 基，和其盐。一种特别优选的盐是盐酸盐。其他特别优选的盐是钠盐和钾盐，特别是二钠盐和单钾盐。
一种优选的AICA核苷类似物是式(Ia)表示的化合物
Figure S2006800187562D00391
在一个实施方式中，本发明提供了式Ia的化合物的前药、类似物或盐。
在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于将式Ia的化合物或其前药、类似物或盐施用于经历心脏手术的患者，其中包含用于给患者输注的冻干形式的式Ia的化合物或其前药、类似物或盐，和用于向患者心脏内灌注的溶液中的式Ia的化合物或其前药、类似物或盐。在另一方面，本发明提供了一种将式Ia的化合物或其前药、类似物或盐施用于患者的试剂盒，其中包含冻干的式Ia代表的化合物或其前药、类似物或盐的无菌容器。
在一个实施方式中，本发明提供了一种心麻痹溶液，所述心麻痹溶液包含含有式Ia的化合物的组合物。
在另一实施方式中，本发明提供了一种预防或降低经历CABG手术的患者的不良作用的方法，包括在围手术期给患者施用有效量的包含式Ia的化合物或其前药、类似物或盐的组合物。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种药物制剂，其包含式Ia的化合物或其前药、类似物或盐，和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，该制剂给有此需要的患者在充分的时间内提供大约1μg/ml到大约20μg/ml的血浆浓度。在另一个 实施方式中，所述时间大约是7小时。在另一实施方式中，该制剂是适于口服施用的。在另一实施方式中，该制剂是适于口服施用的固体剂型。
在另一个方面，本发明提供了一种心麻痹溶液，其包含含有式(IIa)所代表的化合物的组合物
Figure S2006800187562D00401
其中R2选自氢，--CN和基团
Figure S2006800187562D00402
其中T选自氧、硫、NOH、NH和NO(CH2)nCH3，其中n是0到2，并且U选自低级烷氧基、氨基，任选地与3-6元芳环稠合的3到6元杂环，和基团
Figure S2006800187562D00403
其中A是NH和硫之一，n是0到3，I是0到2，Q是氢和羟基之一，E代表硝基或羟基，条件是如果U是氨基，则T不是硫、NOH、NH和NOCH3之一；其中T是氨基，U不是低烷氧基；并且如果A是氨基且n是1，则Q不是羟基；
R3选自氢、卤素和S--W，其中当T不是氧且U不是氨基时，W是苯基，或取代的苯基，或氢；
R4和R5各自独立地选自氢、-COCH3和低级烷基，或一起形成环碳酸酯；并且
R6选自羟基、磷酸酯、-OSO2NH2、巯基、卤素、-OCOCH3、-SCH3、-SOCH3、NH2和N3；和其药学上可接受的盐；
条件是如果R2是CONH2、CONH-对-碘苯基、氢、CN或CONHCH2-且R3是氢或卤素，且R4和R5是氢、酰基、或一起形成环碳酸酯，则R6不是卤素、磷酸酯、OH或-O-酰基，其中所述化合物、其前药、类似物或盐的浓度在5μm到100μm之间。
在一个实施方式中，一种用于将阿卡地新类似物施用给经历心脏手术的患者的试剂盒可包含用于给患者输注的冻干形式的式Ia或IIa的化合物、其前药、类似物或盐，和/或用于向患者心脏内灌注的溶液形式的式Ia或IIa的化合物、其前药、类似物或盐。
一种优选的AICA核苷类似物是5-氨基-1-β-D-(5-苄基氨基-5-脱氧-1-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺，其具有式(IIIa)的化学结构
Figure DEST_PATH_GSB00000230164100011
另外一种优选的AICA核苷类似物是5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺，具有式(IVa)的化学结构
Figure DEST_PATH_GSB00000230164100012
在一个实施方式中，提供了式IIIa或式IVa的化合物的前药、类
似物或盐。
在一个方面，本发明提供了一种包含浓度为大约5μm到大约100μm的式IIIa或式IVa的化合物的心麻痹溶液。在另一方面，提供了一种将式IIIa或式IVa的化合物施用给经历心脏手术的患者的试剂盒，其中包含用于给患者输注的冻干形式的式IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐，和用于向患者心脏内灌注的包含式IIIa或式IVa的化合物或其前药类似物或盐的溶液。
在另一方面，本发明提供了一种用于给患者施用式IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐的试剂盒，其中包含冻干的式IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐的无菌容器。
在另一方面，本发明提供了一种预防或降低左心室功能降低、射血分数大约小于30％的患者的不良作用的方法，包括给患者施用有效量的式Ia、IIa、IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐。在另一方面，本发明提供了一种预防或降低患者中的不良作用的方法，包括施用有效量的式Ia、IIa、IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐，其中患者过去有一、二、三次或多于三次的心肌梗塞。在一个实施方式中，最近的心肌梗塞发生在过去的24、36或48个月内。在上述两种方法的另一个实施方式中，患者是女性并且/或者年龄在65到95岁之间。在另一实施方式中，式Ia、IIa、IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐以给患者提供大约1μg/ml到大约20μg/ml之间的血浆浓度的浓度施用。在一个实施方式中，血浆浓度保持超过大约7小时。在另一实施方式中，式IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐以0.1mg/kg/分钟施用。在另一实施方式中，式IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐在大约7小时内给患者施用。
本发明的另一方面提供了一种预防或降低经历非血管手术的患者的不良作用的方法，包括给患者施用有效量的式Ia、IIa、IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐。在一个实施方式中，本发明可用于多种非血管手术，包括但不限于心脏、腹部、神经、妇产科、整形外科、泌尿科、血管、以及与耳鼻喉科相关的手术。更具体地，非 血管手术包括，小肠和大肠切除术、阑尾切除术、腹腔镜检查、穿刺术、经尿道前列腺切除(TRUP)、子宫切除术、输卵管结扎、输精管切除术、输卵管卵巢切除术、剖腹产术、痔切除术、扁桃体切除术、鼓膜切除术、放置鼓膜切开管、去除结肠和直肠的息肉、直肠脱垂的修复、肠瘤的去除和治疗、刮除术、胸腔穿刺术、胸廓切开术、鼻成形术、脂肪抽吸术等。
另一方面提供了一种药物制剂，该制剂包含式Ia、IIa、IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中该制剂在充分的时间内给有此需要的患者提供大约1μg/ml到大约20μg/ml的式Ia、IIa、IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐的血浆浓度。在另一实施方式中，时间大约为7小时。在另一实施方式中，所述药物制剂是微团形式的。在一个实施方式中，所述制剂是亲脂性的。
在另一方面，本发明提供了一种药物制剂，该药物制剂用于将阿卡地新、或式Ia、IIa、IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐施用给有此需要的患者，其中该制剂是适于作为喷雾剂或气雾剂应用。
在另一方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒用于将式Ia、IIa、IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐施用给经历心脏手术的患者，其中包含冻干形式的阿卡地新或式Ia、IIa、IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐，该冻干形式用于制备给患者输注的含有阿卡地新或式Ia、IIa、IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐的溶液，并且包含气雾剂或可喷射形式的阿卡地新或式Ia、IIa、IIIa或式IVa的化合物或其前药、类似物或盐，用于直接应用于患者的心脏。在另一实施方式中，用于输注的溶液是适于作为喷雾剂或气雾剂应用。
优选的新的AICA核苷类似物的制备
本发明新的取代的咪唑类似物可通过下述实施例中展示的公知的化学反应而合成。通常，式(I)的化合物可通过Baker等(Baker D.， J.Org.Chem.47：3457(1982))所述的流程从4-甲基-5-硝基-1H-咪唑制备1-苯甲基-5-硝基-1H-咪唑-4-羧酸，接下来通过还原硝基基团的附加步骤在R1上获得期望的氨基基团。可选地，Ferris等(Ferris，J.P.，J.Org.Chem.50：747(1985)报道的AICA核苷的合成，允许一种通用的从适当保护的核苷和二氨基马来腈开始制备4-取代的5-氨基咪唑的流程。该流程允许通过在马来腈环化为咪唑的反应中选择恰当的原酸酯引入期望的R3烷基、烃基和芳基基团。其他期望的R3取代基可通过Miyoshi等(Miyoshi T.，Chem.Pharm.Bull.24(9)：2089(1976)描述的制备2-溴和5-氨基-2-硫-1-(2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-4-咪唑甲酰胺的方法引入，或通过Ivanovics等(Ivanovics，G.A.等，J.Org.Chem.25：3631(1974))描述的制备2-烷氧基、3-氨基和2-羟基(作为互变异构2-咪唑酮)取代的5-氨基咪唑-4-甲酰胺的方法引入。其中期望的R1取代基是酰氨基的化合物可通过用期望的酰酐酰化相应的适当保护的R1氨基化合物、然后利用氨或甲醇钠进行脱-O-酰化而制备。其中R1是烷氨基或芳氨基的化合物可如Sato等(Chem.Pharm.Bull.37：1604(1989))所述，通过用期望的烃氨对相当适当保护的R1 氨基化合物进行还原烷化而制备。
其中R6为酸基或烃氧羧基的化合物的制备可包括：通过恰当的烃酸酐或烃氯碳酸盐与2′，3′-O-异亚丙基保护的核苷进行选择性反应，接下来用酸的稀水溶液除去异亚丙基基团，如Miyoshi等(见上文)所述。其中R6是烃氧基的化合物可利用Ferris等(见上文)的方法，由被保护的5-取代的戊糖制备(Snyder J.R.，Carbonhydr.Res.163：169(1987))。其中R6是巯基、烃硫基或烃氨基的式(I)的化合物可通过用期望的胺或硫醇对卤素进行亲核取代由5′-脱氧-5′-碘-2，3′-异亚丙基咪唑核苷制备(Srivastava P.C，J.Med.Chem.18：1237(1975))。其中R6是烷基酰氨基或芳基酰氨基的式(I)的化合物可由相应的5-氨基-5’-脱氧咪唑核苷通过与期望的烷基或芳基酸酐酰化然后用氨或甲醇钠进行脱-O-酰化而制备。其中R6是烃基的式(I)的化合物可如Montgomery等(J.Het.Chem.11：211(1974))所述通过核苷的Vittig反 应修饰由1-(2，3-O-异亚丙基-β-D-核糖-戊-1，5-二醛-1，4-呋喃糖基)咪唑制备。其中R6是磷酸盐或磷酸酯的式(I)的化合物可通过Khwaja等(Tetrahedron 27：6189(1971))所述的制备核苷磷酸盐的一般方法制备。
实用性
本发明的AICA核苷类似物化合物在降低或预防局部缺血相关事件中，也就是由于血液供应的限制引起的状况中，是特别有用的。这包括心脏病发作，或心肌梗塞，这是由供血到心肌的冠状动脉的一次或多次阻塞引起的状况，如果延长，导致不可逆的组织损伤。类似AICA核苷的化合物导致局部腺苷水平的增加，因此提高流向局部缺血心肌的血流，将改善所述组织损伤。
一种现行的心脏病发作的治疗方法是溶栓治疗，其涉及施用血凝块溶解剂如链激酶或组织纤溶酶原激活剂(tPA)。但是，这些药物必须在心脏病发作的几小时(1-3小时)之内使用，并且随着时间延长它们的效用急剧降低。本发明的化合物可以预防性地施用(也就是，在事件之前)以获得益处，因此显然是有用的。
心绞痛是一种血液供应足以满足心脏的正常需要、但在需要心率增加时(例如，锻炼中)和/或血液供应变得更有限时(如，在冠状动脉痉挛中)不足的状况。具有心绞痛或相关状况例如短暂局部缺血或无症状性缺血的患者可类似地获益于所述腺苷干预。
在晚期冠状动脉疾病或持久性胸部休息痛中，当前使用了许多临床方法以增进血液对心脏的供应。这包括经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)，也称作血管成形术；经皮腔内定向冠状动脉粥样斑块切除术，激光粥样斑块切除术，血管内支架和冠状动脉旁路移植手术。本发明的化合物作为这些技术的辅助治疗也是有用的。
导致心血管问题的另外因素是异常心律，或心律不齐，这将导致心脏的供血缺陷。这些化合物的的降低心律不齐的能力，如AICA核苷，将也使得它们在抑制这些状况中是有用的。
中风和中枢神经系统损伤状况由向CAN的供血降低引起，因此适合向受损组织提供增加的腺苷水平以促进组织存活的干预。其他由影响局部血流的试剂改善的适应症包括器官移植、重建手术中的皮瓣移植、外周血管疾病、内毒素血症、出血性休克、肺水肿、烧伤继发的肺部损伤(热伤)或败血病、肺高血压、微栓塞、阳痿、肾小球性肾炎或进展性肾小球硬化、动脉粥样硬化、心肌炎、血管炎和心肌病和心肺骤停。
现在清楚了中风或CAN损伤引起的神经变性的显著成分是由刺激性氨基酸释放的增加导致的，其导致神经原刺激致死。据报道腺苷抑制刺激性氨基酸的释放(Burke和Nadler J.Neurochem.51：1541(1988))。本发明的化合物增加腺苷水平，因此也可用于与刺激性氨基酸有关的疾病，例如亨廷顿舞蹈症或阿尔茨海默病(Marangos等Trends Neurosci.10：65(1987))和帕金森疾病(Sonsella等Science 243：398(1989))。这些研究，与记忆试验模型的结果一起，提示这些化合物在治疗与衰老过程影响CNS功能相关的疾病中的附加效用。
据报道腺苷是一种依靠其对于受刺激粒细胞功能(Cronstein等，J.Clin.Invest.78：760-770(1986))和巨噬细胞、淋巴细胞和血小板功能的作用的内源性炎症调节因子。本发明的化合物将因此在炎性过程为主的疾病中是有用的，例如关节炎、骨关节炎、自身免疫性疾病、成人呼吸窘迫综合症(ARDS)、炎症性肠病、坏死小肠结肠炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和其他炎性疾病。
已经建议了使用腺苷作为一种天然抗痉挛药物(Lee等，BrainRes.321：1650-1654(1984)；Dunwiddie，Int.Rev.Neurobiol.27：63-139(1985))。因此提高腺苷水平的药物对于治疗癫痫发作是有用的。在最近的研究中，Marangos等，Epilepsia 31：239-246(1990)报道了AICA核苷在一种试验动物模型中是癫痫发作的抑制剂。
AICA核苷类似物在治疗可能具有慢性低腺苷水平或可能从提高的腺苷中受益的患者中是有用的，所述患者例如患有孤独症、脑瘫、失眠症、焦虑或其他神经精神症状或患有刺激性肠综合症。实际上， 许多研究(Komhuber和Fischer Neurosci.Lett.34：32(1982)；Kim等Eur.Neurol.22：367(1983))已经将刺激性氨基酸和精神分裂症的病理学联系起来。
本发明的化合物也可用于治疗其中AICA核苷本身具有有益效果的其他疾病。例如，已经报道了AICA核苷在一种由抗原致敏诱导的支气管痉挛的豚鼠模型具有抗过敏作用(Bergren等，J.of Allergy andClinical Immunology(1990))，因此AICA核苷类似物在治疗哮喘、花粉热或变态反应疾病中可能具有治疗益处。
本发明的AICA核苷类似物因此在治疗多种临床状况中是有用的，其中提高细胞外腺苷水平，并且在一些例子中，同时提供自由基清除和/或抗氧化活性是有益的。
本发明的化合物以0.01到3.0μmol/min/kg、优选0.1到1.0μmol/min/kg的速率向病患组织施用。在期望更长输注的情况下，所述化合物可以低速率施用，例如，0.003到0.3μmol/min/kg，优选0.01到0.1μmol/min/kg。当所述化合物如上所述静脉内施用时，所述速率可容易地保持。当使用其他方法时(如口服)，优选利用时间-释放制剂以控制活性成分的释放率。所述化合物可以大约0.01mg/kg/天到大约200mg/kg/天、优选大约0.5mg/kg/天到大约100mg/kg/天的剂量施用。示例性的优选口服剂量是0.3到30mg/kg/天，最优选1到10mg/kg/天。
为了本发明的目的，本发明的化合物可通过多种方式施用，包括口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、或直肠途径施用含有常规非毒性药学上可接受的载体、佐剂和赋形剂的制剂。在此使用的术语肠胃外包括用多种输注技术的皮下、静脉内、肌内、动脉内注射。在此使用的动脉内和静脉内注射包括通过导管施用。对某些适应症优选使用允许快速接触到被治疗的组织或器官的方法，例如用于治疗心肌梗塞的静脉内注射。当治疗体外器官时，优选灌注。
含有活性成分的药物组合物可以是适于预期施用方法的任何形式。例如当用于口服时，可以制备成片剂、含片、锭剂，水或油悬浮 液、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。计划口服的组合物可根据任何本领域已知的制备药物组合物的方法制备，并且所述组合物可包含一种或多种试剂，所述试剂包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以提供一种合意的制剂。含有活性成分与适于制备片剂的药学上可接受的非毒性赋形剂混合物的片剂是可接受的。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释液，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如玉米淀粉或褐藻酸；粘合剂，例如淀粉、凝胶或阿拉伯树胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的或可被包括微包封在内的已知技术包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并因此在较长的时期内提供持续的作用。例如，可以使用时间延迟材料，例如单独使用或与蜡一起使用一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服制剂也可以呈现为硬凝胶胶囊，其中活性成分与惰性固态稀释剂例如磷酸钙或高岭土混合，或呈现为软凝胶胶囊，其中活性成分与水或油性介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
本发明的水悬浮液包含与适于制备水悬浮液的赋形剂混合的活性物质。所述赋形剂包括悬浮剂，如羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯胶，和分散或湿润剂，例如天然存在的磷脂(如卵磷脂)、烯氧化物和脂肪酸的缩合产物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)、乙烯氧化物与长链脂肪族醇的缩合产物(如十七基亚乙基氧基鲸蜡醇)、乙烯氧化物与获自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(如聚氧乙烯山梨聚糖一油酸)。水性悬浮液也可包含一种或多种防腐剂例如正-丙基对-羟基苯甲酸乙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。
油性悬浮液可通过将活性成分悬浮在植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中或矿物油如液体石蜡中而配制。口服悬浮液可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。可添加甜味剂，例如上述的那些，和调味剂，以提供可口的口服制剂。这些组合物可通过添 加抗氧化剂如抗坏血酸而保存。
本发明的适于通过添加水制备水溶液的可分散粉末和颗粒提供了与分散或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适合的分散或湿润剂和悬浮剂通过上面公开的内容举例说明。也可存在另外的赋形剂，如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物也可是水包油型乳剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，矿物油，例如液体石蜡，或这些物质的混合物。适合的乳化剂包括天然存在的橡胶，例如阿拉伯树胶和黄芪胶，天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如山梨聚糖一油酸酯，和这些偏酯与乙烯氧化物的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨聚糖一油酸酯。所述乳剂也可以包含甜味剂和调味剂。
糖浆和酏剂可用甜味剂例如甘油、山梨醇或蔗糖配制。所述制剂也可包含缓和剂、防腐剂、调味剂或着色剂。
本发明的药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射的水或油性悬浮液。这种悬浮液可根据本领域已知的方法利用适当的上面提到的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂也可是无菌可注射溶液或在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶解剂中的悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液，或制备为冻干粉末。可使用的可接受载体和溶解剂是水、林格液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发性油通常可用作溶剂或悬浮介质。为此目标可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可同样地用于制备注射剂。
可与载体物质联合生产单剂量形式的活性成分的量将依赖被治疗的受体和特定给药方式而改变。例如，一种用于人口服的时间-释放制剂可以包含20到20μmol的活性物质，所述活性物质与适合且便利的量的载体混合，所述载体的量可以是总组合物的大约5％到大约95％。优选制备可提供容易测量的给药量的药物组合物。例如，一种计划静脉内输注的水溶液应该含有每毫升溶液大约20到50μmol的 活性成分，以使得可以大约30ml/hr的速率输注适当的体积。
但是，应当理解，用于任何特定患者的具体剂量水平将依赖于多种因素，包括使用的特定化合物的活性；被治疗个体的年龄、体重、综合健康状况、性别和饮食；给药时间和途径；排泄率；先前施用的其他药物；和经历治疗的特定疾病的严重性，如本领域技术人员将能很好的理解的那样。
利用本发明的方法的例子包括下述。应当理解这些例子是示例性的，本发明的方法不仅仅限于这些例子。
所述方法可在对冠状动脉梗塞溶栓之后使用。化合物作为以水或等渗氯化钠作为溶剂的无菌可注射制剂施用。溶液可静脉内施用或在左心脏导管插入术中直接施用到冠状动脉或施用到颈动脉。给药速率可在0.2到1μmol/min/kg之间变化，例如输注量为30ml/hr。治疗持续时间将一般是大约96小时。
心绞痛和早期心肌梗塞可通过利用无菌注射制剂以上面所述的速率静脉内给药来治疗。
本发明的化合物也可在心脏旁路手术中静脉内给患者施用或给其他具有心肌梗塞风险的手术患者施用。化合物可以上面所述的速率直接加入到通过膜氧化施用的溶液中，或加入到心脏保护溶液中。
可利用本发明的方法通过灌注含有本发明化合物的溶液而保护器官。给药剂量可根据器官灌注的速率而不同，如本领域技术人员所理解的那样。本方法特别适用于在器官移植中使用的器官和组织。
优选实施方式的描述
我们鉴定了多种AICA核苷类似物，其在局部缺血试验模型中增强局部缺血后功能的恢复。如表I中所显示的，利用优选类似物治疗获得的益处至少与AICA核苷相同(化合物11，40(系列I)，和19(系列III))，在许多例子中在低于AICA核苷的浓度下获得所述益处(如，化合物10、23、25、29、47、52、53(系列I)、27(系列II)、21和66(系列III))。优选的化合物包括前药，如2′和3′羟基的羧酸酯。例 如，系列III的优选前药是其中R4和R5(式I)一起形成环碳酸酯的物质。在特异地评价化合物提高细胞外腺苷水平的能力的功能测试中，许多这些优选类似物显示了与AICA核苷相比显著提高的能力。评价了化合物抑制分离的回肠受刺激收缩的能力，这是一种腺苷介导的功能应答，结果显示每个优选系列中的化合物都比AICA核苷更有效(表II)。另外，N-4取代的AICA核苷类似物(系列I)与AICA核苷相比显著更高程度地提高了缺血大鼠心脏中的组织腺苷水平(表III)并抑制了冠状内皮细胞中的腺苷利用(表IV)。来自该优选系列(I)的许多化合物也以更高的亲和力与NBTI-特异性腺苷转运位点结合(表V)。这些数据提示，这些优选类似物系列与AICA核苷相比提高的功能益处，至少在部分上，产生于它们提高细胞外腺苷水平的能力，并且这种能力可通过抑制腺苷转运而引起(见表V和图22和23)。C-2取代的AICA核苷类似物(系列II)也表现出增加了腺苷释放，如化合物13对细胞培养物中腺苷产生的影响所例示的那样(表VI)。而且，某些化合物是腺苷代谢酶腺苷激酶的抑制剂(见表VII)。2′-C取代的AICA核苷类似物(系列IV)在细胞培养物模型中极大地调节了腺苷的利用(图2A，2B和2C)。在优选系列(IV)中，每个测试化合物也是有效的腺苷脱氨酶(另一种重要的腺苷代谢酶)的抑制剂(表VII)。因此，这些化合物比AICA核苷更有效地提高了细胞外腺苷水平，并且这可解释为由于增强了腺苷脱氨酶的抑制。
也评价了AICA核苷类似物对于血小板功能的效果。如表IX中所显示的，某些化合物抑制人全血中的血小板聚集。许多试验化合物对血小板聚集的抑制在非抑制性浓度的腺苷的存在下提高。已经报道了腺苷是一种有效的抗血小板剂，但在血中的半衰期较短。因此，在AICA核苷类似物存在下观察到的血小板聚集的抑制可归因于这些化合物的腺苷调节活性。
某些优选的AICA核苷类似物(化合物53(1-468)、化合物21(1-227))在狗中也是可口服生物利用的(见表X)。而且，用AICA核苷类似物化合物53(1-468)进行治疗在一种稳定型心绞痛的犬模型中 提供功能性益处(见表XI)。除了它们的心血管益处之外，某些AICA核苷类似物(化合物10(1-186)和11(1-226)(系列I))也在一种脑缺血的沙鼠模型中显示了保护性效果(图21)。
为帮助理解发明，示出了一系列试验的结果，证实了这些优选类似物在缺血模型中的益处，并进一步提供了这些类似物与AICA核苷相比显示出提高的能力的一种原理。还提供了一系列举例说明这些化合物的合成的实施例。当然，这些例子不应解释为具体限制本发明，现在已知的或后来发展的、本领域技术人员可以预见的本发明的变化，都被认为落入如此处所描述的和要求保护的本发明的范围内。
此处已经显示和描述了本发明的优选实施方式，对于本领域技术人员来说显而易见所述实施方式仅仅作为例子提供。本领域技术人员可以在不偏离本发明的条件下进行多种变化、改变和取代。应该理解在此描述的本发明实施方式的多种选择可应用于实践本发明。下述权利要求用于限定本发明的范围，因此也包括这些权利要求范围中的方法和结构以及它们的等同方案。
定义
“施用”或“给药”指将凝血抑制剂导入患者。施用指由人(包括，例如，医疗提供者或患者自己)施用一定剂量。
“凝血抑制剂”指任何可以阻断、预防或抑制凝血块形成或溶解或分解血凝块的药物、试剂或药物组合物。凝血抑制剂可以是本领域技术人员现在已知的或将来发展的任何凝血抑制剂。凝血抑制剂可来自本领域技术人员已知的任何凝血抑制剂的药物种类，包括但不限于，抗血小板试剂、溶栓酶、聚集抑制剂、糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂、粘多糖、凝血酶抑制剂、抗凝血剂、肝素、低分子量肝素、香豆素、茚满二酮衍生物、组织纤溶酶原激活剂和其组合。凝血抑制剂可以是任何药物剂量形式并通过任何本领域技术人员已知的途径施用。
“围手术期”指手术前、手术后、手术过程中和/或此处所述的任意组合。例如，凝血抑制剂可在围手术期施用48小时；也就是说，凝 血抑制剂可在手术前施用48小时、在手术后、手术过程中或这些给药时间的任意组合的时间中施用48小时。围手术期的施用可以是单个剂量或在围手术期之内的多个剂量。本领域技术人员将认识到手术前指手术之前的时间，手术后指手术之后的时间，手术中指手术过程中的时间。
“长期”指出院后的时间，延长6个月或更长。例如，凝血抑制剂可在出院时以一个剂量施用，然后在围手术期后可持续6个月、一年或更长。
“手术”或“手术的”指任何治疗或预防疾病、损伤或畸形的人工或手术方法或操作。手术包括当患者在麻醉(包括局部或全身麻醉)下进行的方法或操作。手术可由医生、外科医生或牙医进行，通常在医院或其他保健机构进行。进行手术的患者可以是住院的或非住院的，如门诊手术。手术不包括经皮干预(PTI)或经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)。
“冠状动脉旁路移植”或“CABG”指通常利用隐静脉或内部乳房动脉作为移植物，将一种或多种旁路移植物植入主动脉和冠状血管之间的心脏手术。“静脉移植CABG”指利用隐静脉移植的CABG手术。“动脉移植CABG”指利用内部乳房动脉移植的CABG手术。
施用时间安排
凝血抑制剂可在围手术期施用；也就是说，在手术前、手术后和/或手术过程中或在此处所述的任何组合的时间施用。例如，如果药物的半衰期较长(12-48小时)，凝血抑制剂可在手术前48(或24)小时内以一次剂量施用，在手术中或之后以重复剂量施用。半衰期较短的药物可在手术前不久施用，然后在手术中或之后施用。对于一些患者和一些情况，治疗的医师可决定暂停手术前治疗，仅仅在手术后开始给药，如，手术后48小时，在伤口闭合之后，以确保在开始抗凝血治疗之前在该区域(没有开放的血管)不再出血。所述立即手术后施用凝血抑制剂在本发明的范围内。
围手术期施用包括在手术前、手术后、手术中的时间，和/或此处描述的时间的任何组合。例如，凝血抑制剂可在围手术期施用6个月、3个月、1个月、1周、96小时、48小时或更少；也就是说，凝血抑制剂可在手术后施用6个月、3个月、1个月、1周、96小时、48小时或更少，手术后6个月、3个月、1个月、1周、96小时、48小时或更少，或手术前或后6个月、3个月、1个月、1周、96小时、48小时或更少。另外，凝血抑制剂可例如在围手术期施用36、24、12、8、6、4、2或1小时；也就是说，凝血抑制剂可例如在手术前施用36、24、12、8、6、4、2或1小时和/或在手术后和/或手术中施用36、24、12、8、6、4、2或1小时。可以将凝血抑制剂在手术前后施用相同的时间。例如，可在手术前施用48小时，在手术后施用48小时。可以将凝血抑制剂在手术前和后施用不同的时间。例如，可在手术前施用凝血抑制剂48小时，在手术后施用24小时。例如，可在手术前施用凝血抑制剂36小时，手术后施用12小时。例如，可在手术前施用凝血抑制剂12小时，手术后施用12小时。例如，可在手术前施用凝血抑制剂8小时，手术后施用8小时。例如，可在手术前施用凝血抑制剂6小时，手术后施用8小时。例如，可在手术前施用凝血抑制剂6小时，手术后施用6小时。例如，可在手术前施用凝血抑制剂8小时，手术后施用4小时。可在手术前施用凝血抑制剂4小时，手术后施用4小时。可在手术前施用凝血抑制剂2小时，手术后施用8小时。可在手术前施用凝血抑制剂4小时，手术后施用1小时。例如，可在手术前24小时和手术中施用凝血抑制剂。例如，可在手术中和手术后6小时施用凝血抑制剂。
围手术期施用可以是单一、一次剂量或多个剂量的凝血抑制剂。在某些实施方式中，围手术期施用可以是连续的、不中断的凝血抑制剂施用(如，连续灌注或透皮施用)。在另一实施方式中，围手术期施用是在围手术时间框架内单次或多次离散的施用(如，围手术期内的单次施用的剂量或围手术期内的多次施用的剂量)。在一个实施方式中，凝血抑制剂可在围手术期在6、5、4、3、2或1天内施用。在 另一实施方式中，凝血抑制剂可在围手术期内在48、36、24、12、8、6或1小时内施用。
凝血抑制剂可在手术中施用，例如，与心肺分流术同时或停止时施用，或与局部缺血区域的灌注同时施用。施用可持续长时间，如手术后、出院后，以及手术后6个月、一年或更长。
在某些实施方式中，当患者在手术前进行长期凝血抑制剂治疗时，与标准实践不同，在手术前并不停止凝血抑制剂。
在围手术期，患者对于施用凝血抑制剂不必是清醒的。例如，凝血抑制剂可在手术中施用，此时患者处于麻醉中。在一些非住院或门诊手术中，患者保持清醒，在这些情况下，凝血抑制剂可在患者清醒时在手术中施用。
所述治疗可在出院后继续。在长期治疗中，如上所述，制剂和剂量可以是连续的或调整的，或凝血抑制剂的类型可改变为另一种凝血。
手术和手术并发症
本发明提供了预防或降低手术后的发病率和死亡率的方法。在某些方面，所述方法包含了围手术期施用凝血抑制剂以预防或降低手术后并发症。凝血抑制剂可在围手术期施用；也就是在手术之前、之中和/或之后和出院之后施用。有意义的是，手术后发病率和死亡率的预防或降低延伸到了住院治疗之外。
手术指治疗或预防疾病、损伤或畸形的任何人工或手术方法或操作。手术包括当患者在麻醉状态(包括局部或全身麻醉)下进行的方法。手术可由医生、外科医生或牙医进行，通常在医院或其他保健机构进行。进行手术的患者可以是住院的或非住院的，如门诊手术。用于本发明目的的手术包括但不限于腹部手术(如，腹部内脏手术)、离体手术(如，对从身体中取出的器官进行的手术，然后可以重新植入)、心脏(如，心脏手术)、脑(如，对脑的手术)、运动成形切断术(如，创造通过与截肢后的残肢相邻的肌肉的通道，以允许使用该肌肉操作假体)、美容(如，通过整形复原、矫正或去除斑点改善患 者外观的手术)、牙面(如涉及嘴的外观和结构缺陷的手术)、神经(如，涉及外周或中枢神经系统的手术)、口腔(如，涉及嘴、颚和相关结构的缺陷的手术)、整形外科(如，处理骨和骨样结构的手术)、骨盆(如，涉及骨盆、主要是产科和妇产科的手术)、整形(如，涉及复原、重建、矫正或改善由于损伤、疾病或生长和发育而有缺陷的、被损害的或畸形的身体结构的形状和外观的手术)或直肠(如，直肠手术)、泌尿(如，与泌尿生殖器系统相关的手术，主要是男性)、血管(如，血管手术)和耳鼻喉科相关手术(如，耳，鼻，喉或相关结构的手术)。所述手术可以是保守的(如，保持或以最小风险去除患病的或受损害的器官、组织或肢体)或根治性的(如，设计为摘除局部大范围疾病的所有区域和淋巴腺排泄的相邻区域的手术)。在某些实施方式中，所述手术可以是心脏手术，包括贲门瓣置换、心脏和心肺移植、和人工心脏装置和去纤颤器的插入、贲门瓣置换或贲门瓣修复和先天性手术。
在某些实施方式中，当心脏手术是CABG时，手术可以是利用隐静脉或内部乳房动脉的冠状动脉旁路移植术，此处分别表示为静脉移植CABG或动脉移植CABG。在一个实施方式中，当手术是静脉移植CABG时，凝血抑制剂不是从手术前12小时开始到手术后7小时施用的阿司匹林。在另一实施方式中，当手术是静脉移植CABG时，凝血抑制剂不是从手术前48小时开始到手术后24小时施用的双密达莫。见Goldman，等，1988，Circulation 77：1324-32；Chesebro，等，1982，NEJM 307：73-8；Chesebro，等，1984，NEJM 310：209-14。在另一实施方式中，当手术是静脉移植CABG时，凝血抑制剂不是噻氯匹定或抑肽酶。见Drug Facts and Comparisons，updated monthly，September，2002，Facts and Comparisons，Wolters Kluwer Company，St.Louis，MO。
在某些实施方式中，当心脏手术是动脉移植CABG时，凝血抑制剂不是抑肽酶。
本发明可用于多种手术，包括但不限于，心脏、腹部、神经、妇产科、整形外科、泌尿、血管和与耳鼻喉相关手术。更具体地，手术 包括小肠和大肠切除术、阑尾切除术、腹腔镜检查、穿刺术、经尿道的前列腺切除(TURP)、子宫切除术、输卵管结扎、输精管切除术、输卵管卵巢切除术、剖腹产术、痔切除术、扁桃体切除术、鼓膜切除术、放置鼓膜切开管、去除结肠和直肠的息肉、直肠脱垂的修复、肠瘤的去除和治疗、刮除术、胸腔穿刺术、胸廓切开术、鼻成形术、脂肪抽吸术等。
非住院的或门诊手术包括通常不需要住院和/或麻醉的手术。所述手术包括放置鼓膜切开导管、痔切除术等。
本发明可在手术后住院恢复期和出院后降低手术后发病率和死亡率。手术后发病率和死亡率可由于任何手术并发症引起。手术并发症可以是心脏的(心肌梗塞、充血性心力衰竭、严重心律不齐、局部缺血)、神经的(中风、脑病、认知障碍、短暂性缺血发作、痉挛发作)、肾脏的(衰竭、功能障碍或肾脏死亡)、胃肠的(梗塞形成、肠梗阻、局部缺血、肠系膜血栓或GI死亡)、肺部的(衰竭、呼吸窘迫综合症、水肿)，等等。
凝血抑制剂
本发明提供了预防或降低手术后发病率和死亡率的方法。在某些方面，本方法包括围手术期施用凝血抑制剂以预防或降低手术后并发症。凝血抑制剂可围手术期施用；也就是在手术之前、之中和/或之后、在出院之后施用。
本发明的凝血抑制剂可以是任何预防或抑制凝血的药物、试剂或药物组合物。抑制剂可通过依靠多种机理中的任一种来预防或抑制血凝块的形成而起作用，所述机理包括降低凝血因子或降低血小板活化或聚集，或减轻鼓动因子的效应，例如炎症或应激。凝血抑制剂也可通过分解或溶解形成的血凝块而起作用。对于本领域技术人员来说很明显有多种凝血抑制剂，包括抗血小板试剂、溶栓酶、聚集抑制剂、糖蛋白IIb/IIIa抑制剂、粘多糖、凝血酶抑制剂、抗凝血剂、肝素、低分子量肝素、香豆素、茚满二酮衍生物、组织纤溶酶原激活剂。见The Physicians′Desk Reference(56th ed.，2002)Medical Economics； Mosby′s Drug Consult，2002，Elsevier Science；Goodman and Gilman′sThe Pharmacologic Basis of Therapeutics，(9th ed.1996)Pergamon Press；Drug Facts and Comparisons，updated monthly，September，2002，Factsand Comparisons，Wolters Kluwer Company，St.Louis，MO。
对于本发明的目的，任何预防或抑制血凝块的形成或溶解或分解血凝块的药物、试剂或药物组合物是适于应用于本发明的。例如，所述血凝块抑制剂可以是西洛他唑(PLETAL(R)，Otsuka)、氯吡格雷(PLAVIX(R)，Sanofi)、噻氯匹定(TICLID(R)，Syntex)、替罗非班(AGGRASTAT(R)，Merck)、埃替非巴肽(INTEGRILIN(R)，CORTherapeutics)、阿昔单抗(REOPRO(R)，Eli LiIl y)、阿那格雷(AGRYLIN(R)，Roberts)、双密达莫(PERSANTIN(R)，BoehringerIngelheim)，阿司匹林(ECOTR(R)等)、双密达莫/阿司匹林(AGGRENOX(R)，Boehiinger Ingelheim)、达肝素(FRAGMIN(R)，Pharmacia)、依诺肝素钠(LOVENOX(R)，Aventis)、亭扎肝素(INNOHE(R)，DuPont)、肝素(各种)、达那肝素(ORGANON(R)，Organon)、抗血栓III(THROMBATE(R)，Bayer)、来匹卢定(REFLUDAN(R)，Hoechst-Marion Roussel)、阿加曲班(ACOVA(R)，SmithKlineBeecham)、比伐卢定(ANGIOMAX(R)，MedicinesCompany)、华法林(COUMADIN(R)，DuPont)、茴茚二酮(MIRADON(R)，Schering)、阿替普酶(ACTIVASE(R)，Genetech)、瑞替普酶(RETAVASE(R)，Boehringer Mannheim)、替奈替普酶(TNKASE(R)，Genentech)、替加色罗(XIGRIS(R)，Eli Lilly)、阿尼普酶(EMINASE(R)，Roberts)、链激酶(STREPTASE(R)，Astra)、尿激酶(ABBOKINASE(R)，Abbott)、以及上述物质的组合。
本领域技术人员将会认识到凝血抑制剂用于治疗阻塞的尿导管和维持血管通道装置开放。肝素、尿激酶、链激酶和阿替普酶一般应用于所述用途。利用凝血抑制剂治疗阻塞的尿导管和维持血管通道装置开放不在本发明的范围内。
在其中凝血抑制剂是低分子量肝素的某些实施方式中，手术优选 不是臀置换、膝置换或腹部手术。当药物是达肝素时，剂量优选不是一天一次皮下2500IU，手术前1到2小时内开始，手术后重复5-10天每天一次，或手术前晚皮下5000IU并手术后重复5-10天每天一次。当药物是依诺肝素钠时，剂量优选不是皮下每天施用40mg，手术前9-15小时开始，持续21天，或手术前2小时开始皮下每天40mg并持续7-10天；如果耐受则为12天。
在其中凝血抑制剂是肝素的某些实施方式中，手术优选不是腹胸或心脏手术。当药物是肝素时，剂量优选不是手术前皮下2小时5000单位，并且之后8-12小时5000单位持续7天，或直到患者完全不用住院为止。当药物是肝素时，对于经历对开放心脏手术的全身灌注的患者，剂量优选不是150单位/kg。当药物是肝素时，对于小于60分钟的过程，剂量优选不是300单位/kg，对于长于60分钟的过程优选不是400单位/kg。
在其中凝血抑制剂是达那肝素的某些实施方式中，剂量优选不是手术之前1-4小时开始皮下每天两次750抗-Xa单位，并且手术之后不早于手术后2小时持续7-10天。
在其中凝血抑制剂是华法林的某些实施方式中，手术优选不是贲门瓣置换手术。当药物是华法林时，剂量优选不是每天1mg，直到手术前20天。
在某些实施方式中，当心脏手术是静脉移植CABG时，凝血抑制剂不是在手术前12小时内到手术后7小时施用的阿司匹林。在某些实施方式中，当心脏手术是静脉移植CABG时，凝血抑制剂不是在手术前48小时到手术后24小时施用的双密达莫。见Goldman等，1988，Circulation 77：1324-32；Chesebro，等，1982，NEJM 307：73-8；Chesebro，等，1984，NEJM 310：209-14。在在某些实施方式中，当心脏手术是静脉移植CABG时，凝血抑制剂不是噻氯匹定或抑肽酶。参见，DrugFacts and Comparisons，updated monthly，September，2002，Facts andComparisons，Wolters Kluwer Company，St.Louis，MO。
抑肽酶以两个给药方案之一(方案A或B)用于CABC手术。 方案A是施用2百万KIU(激肽释放酶抑制单位)的静脉内负荷剂量；2百万KIU进入心肺旁路仪器(称为泵原始体积)并且500000 KIU/hr的操作时间作为一种静脉内灌注的持续维持。方案B是一种1百万KIU静脉内负荷剂量的给药，1百万IKU进入泵原始体积，并且250000KIU/hr的操作时间作为一种静脉内灌注的持续维持。抑肽酶的施用在麻醉诱导后开始，但早于胸骨切开术，并持续到手术完成和患者离开手术室。Drug Facts and Comparisons，updated monthly，September，2002，Facts and Comparisons，Wolters Kluwer Company，St.Louis，MO。在某些实施方式中，当手术是静脉移植或动脉移植CABG，凝血抑制剂不是抑肽酶。
凝血抑制剂可以是两种或多种凝血抑制剂的组合。凝血抑制剂的组合可包括来源于多于一种此处描述的药物类型的凝血抑制剂。另外，凝血抑制剂的组合可包括对每种凝血抑制剂不同的给药途径。凝血抑制剂的组合可同时或同时期地施用。另外，凝血抑制剂的组合可分开施用。
剂量、制剂和给药
可通过使凝血抑制剂与凝血抑制剂的作用部位在患者体内接触的任何方法，给患者施用此处描述的凝血抑制剂以降低手术后的发病率和死亡率。凝血抑制剂可以是一种可通过任何可用的方法施用的药物组合物。对于本领域技术人员来说，可与药物载体一起施用的药物组合物是显而易见的。药物组合物和/或药物载体可基于选择的给药途径和标准药学实践而选择。本发明的药物组合物可适于口服、肠胃外或局部给药，并可以是单元剂量形式，以药物领域已知的给药方式。肠胃外给药包括单不限于皮下注射、静脉内、腹膜内或肌肉内。例如，对于本领域技术人员来说，很明显口服剂量形式可以通过多种途径给药，包括单不限于直肠和阴道和通过任何将物质传递到胃肠道中的方法，例如通过鼻饲导管。
当然，施用的剂量将依赖于已知的因素而改变，例如：特定凝血 抑制剂的药物动力学特征和给药模式和途径；患者的年龄、健康、身高和体重；同时进行的治疗的种类；治疗频率；和期望的效果。凝血抑制剂的剂量不需要保持恒定，但可根据本领域已知的参数进行调整。另外，凝血抑制剂的剂量可以是治疗剂量之下或之上。
单剂量的活性成分可在适合患者个体的正常剂量范围内。例如，阿司匹林可以40mg-160mg/天口服。双密达莫可以75mg-100mg每天四次口服。阿司匹林和双密达莫可作为单独商业上可获得的产品以25mg阿司匹林/200mg双密达莫(AGGRENOX
Figure 2006800187562_0
)的剂量联合施用，或者可以此处描述的剂量范围作为各自的组合物同时一起施用组合物。肝素可以起始剂量10,00-20,000单位(可在之前施用5,000单位的静脉内负荷剂量)皮下使用，紧接着每8小时8,000-10,000单位或每12小时15,000-20,000单位，根据局部促凝血酶原激酶时间(PTT)调整到正常值的大约1.5到2倍。华法林可以0.5-30mg/天口服或肠胃外施用。西洛他唑可以50-100mg一天两次口服。氯吡格雷可以75mg每天一次口服，具有或不具有300mg的负荷剂量。噻氯匹定可以250mg每天两次口服。替罗非班可以0.4mcg/kg/min肠胃外施用超过30分钟，然后以0.1mcg/kg/min持续。埃替非巴肽可作为静脉推注以180mcg/kg肠胃外施用，然后在起始的静脉内推注10分钟之后用第二丸剂以2mcg/kg/min连续输注。第二肠胃外推注剂量可以是180mcg/kg。阿昔单抗可作为静脉内丸剂以0.25mg/kg输注超过10到60分钟肠胃外利用，然后以0.125mcg/kg/min连续输注12小时，到最大值为10mcg/min。阿那格雷可以0.5mg一天四次到1mg一天两次滴定到最大值10mg/天口服。达肝素可以2500-5000IU一天一到两次皮下施用。依诺肝素钠可以1mg/kg一天两次皮下施用。亭扎肝素可以175抗-Xa IU/kg一天一次皮下施用。达那肝素可以750抗-Xa单位一天两次皮下施用。抗凝血酶III可以基于治疗前血浆抗凝血酶III(AT)水平的剂量肠胃外施用。剂量可以通过下式计算
需要的单位(IU)＝[期望值-基线(AT)]/1.4×重量(kg)
或可替代地：
需要的因子IX的量(IU)＝体重(kg)×期望的因子IX增加(％或IU/dL)×观察到的复原的倒数(IU/kg每IU/dL)
(见Drug Facts and Comparisons，updated monthly，September，2002，Facts and Comparisons，Wolters Kluwer Company，St.Louis，MO)。
来匹卢定可以0.4mg/kg的药丸剂量肠胃外施用，静脉内推注超过15-20秒，然后以0.15mg/kg连续静脉内输注。阿加曲班可作为连续输注液以2mcg/kg/min施用。比伐卢定可以1mg/kg静脉内药物施用，然后以2.5mg/kg/hr进行4小时静脉内输注。茴茚二酮可以25-300mg/天口服。对于体重超过67kg的患者，阿替普酶可作为15mg静脉内药丸以100mg剂量静脉内施用，然后在接下来的30分钟内进行50mg输注，然后在接下来的60分钟内进行35mg输注。在体重小于67kg的患者中，阿替普酶可以总剂量100mg静脉内施用；15mg的静脉内推注，然后在接下来的30分钟内以0.75mg/kg输注不超过50mg，然后在接下来的60分钟内以0.5mg/kg输注，不超过35mg。瑞替普酶可作为10单位的静脉内推注超过2分钟进行肠胃外施用，然后30分钟后进行第二次10单位的静脉内推注超过2分钟。替奈替普酶可以剂量30-50mg肠胃外施用，根据患者体重，并作为单独药丸施用超过5秒钟。替加色罗可以24mcg/kg/hr肠胃外施用，总输注持续96小时。阿尼普酶可以30单位静脉内施用超过2到5分钟进行肠胃外施用。链激酶可以剂量250,000单位输注超过30分钟进行肠胃外施用。另外，链激酶可以20,000IU药丸静脉内输注，然后以剂量2,000IU/分钟进行60分钟。尿激酶可以剂量4400单位/kg肠胃外施用超过10分钟，然后以15ml/hr的速率以4400单位/kg/hr连续输注12小时。
凝血抑制剂的活性成分可以固体或半固体剂型口服，例如硬或软凝胶胶囊、片剂或粉末，或以液体制型口服，如酏剂、糖浆或悬浮液。可以无菌液体剂型肠胃外给药。其他的剂型是潜在可能的，例如贴剂或软膏或透皮施用。
例如，肠胃外剂型可以是可注射的制剂，包括活性物质在水或油性载体中的无菌悬浮液、溶液或乳剂。组合物还可包含配制辅剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。注射制剂可以单位剂量形式存在，例如，存在于安瓿或多剂量容器中，并且可包含添加的防腐剂。
可注射的制剂可以是粉末形式，在使用前，用适当载体重建，所述载体包括但不限于无菌无热原水、缓冲液、葡萄糖溶液等。
对于在手术过程中给药，活性成分可以直接施加到心肺分旁路仪器中、直接施用到心包或直接施用到暴露在手术区域的血管中。
对于延长给药，活性成分可以配制为储库型制剂，通过植入，如皮下、皮内、或肌肉内注射而施用。因此，例如，活性成分可与适当的聚合或疏水性物质(如，配制为在可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物。
可选地，可使用制造为缓慢释放活性成分用于皮下吸收的粘片或贴剂的透皮给药系统。为此目的，渗透增强物可用于促进凝血抑制剂的透皮渗透。
对于口服给药，例如，药物制剂或凝血抑制剂可采取片剂或胶囊的形式，所述形式通过常规方法用药学上可接受的赋形剂制备，所述赋形剂例如结合剂(如，预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(如，土豆淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(如，十二烷基硫酸钠)。片剂可用本领域公知的方法包衣。
例如，用于口服的液体制剂可采取溶液、糖浆或悬浮液的形式，或它们可作为干产品，在使用前用水或其他适当载体重建。所述液体制剂可通过常规方法用药学上可接受的添加剂制备，所述添加剂例如悬浮剂(如山梨醇浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(如，卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水载体(如，杏仁油、油脂、酒精或分馏的植物油)；和防腐剂(如，对-羟基苯甲酸甲酯或丙酯，或山梨酸)。
所述制剂也可适当地包含缓冲盐、调味剂着色剂和甜味剂。用于 口服的制剂可适当地配制为控释活性化合物。
对于口服给药，组合物可采取以常规方法配制的片剂或锭剂的形式。对于直肠和阴道给药途径，活性成分可配制为溶液(或保留灌肠剂)、栓剂或药膏。
对于吸入给药，活性成分可以作为来自压力包装或喷雾器的气雾剂喷雾形式利用适当的抛射剂便利地给药，所述抛射剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他适当的气体。在加压气雾剂的例子中，剂量单位可通过提供输送计量量的阀门而确定。如，用于吸入器或吹入器的明胶胶囊和弹药型制剂可制备为包含一种化合物和适当的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
如果期望，所述组合物可存在于包装或分配装置中，该装置中可包含含有活性成分的一个或多个单位剂量形式。包装例如可包含金属或塑料薄片，如水泡包。所述包装和分配装置可附有用药说明。
凝血抑制剂可通过任何本领域已知的确保循环中的生物可利用性的适当途径而给药。给药可通过肠胃外给药途径而获得，包括但不限于，静脉内(IV)、肌肉内(IM)、皮内、皮下(SC)和腹膜内(BP)注射。在某些实施方式中，给药是通过旁路仪器、灌注器、渗透器或导尿管。在某些实施方式中，凝血抑制剂通过注射、皮下可植入泵或通过储库型制剂，以获得治疗效果的剂量施用。适当的剂量形式进一步描述在Remington′s Pharmaceutical Sciences，1990，17th ed.，MackPublishing Company，Easton，PA中，其是本领域的标准参考文献，在此全文引入作为参考。
给药可通过多种不同的治疗方案获得。例如，几种口服剂量可在一天之内周期性施用，凝血抑制剂的累积总剂量不达到每天毒性剂量。可选地，例如，凝血抑制剂可在手术前48小时每天施用，直到手术后48小时。
静脉内注射可在一天内周期性施用，累积总注射量不达到每天毒性剂量。可选地，例如，静脉内注射可每天施用，例如，开始于手术前48小时，每天持续，例如，直到手术后48小时。凝血抑制剂的剂 量可改变。例如，可施用提高的剂量。依赖于患者的需要，给药可通过缓慢输注持续一个多小时，快速输注一个小时或更少，或通过单次推注。
也可使用其他给药途径。例如，通过口服给药(包括但不限于摄入，通过鼻饲导管，经口和舌下途径)可实现胃肠道吸收。可选地，可利用通过粘膜组织例如阴道和直肠给药模式给药。在另一选择方案中，本发明的制剂可透皮(也就是穿过皮肤的)或吸入给药。应当认识到优选的途径可根据受体的条件和年龄而不同。
凝血抑制剂的实际剂量可根据给药途径而改变。凝血抑制剂通常以有效量施用以获得预期目标。当然，可以理解使用的剂量将依赖于具体应用。
例如，有效量可根据手术类型、患者状况、患者年龄、患者体重、患者医疗历史、给药方式和开药医师的判断而改变。本领域技术人员应当认识到血液的抗凝血程度可通过例如凝血酶原时间(PT)和局部促凝血酶原激酶时间(PTT)等试验值来监测。有效量的确定在本领域技术人员的能力范围之内，特别是根据在此提供的细节披露的基础上。
凝血抑制剂的施用可断续地重复。凝血抑制剂可单独施用或与其他药物例如其他手术前药物例如抗生素或麻醉剂联合施用。
凝血抑制剂和阿卡地新的联合
在本发明的另一方面，提供一种预防或降低经历手术的患者的不良作用的方法，其中首先施用阿卡地新或其前药、类似物或盐，然后施用凝血抑制剂。在一个实施方式中，凝血抑制剂在阿卡地新或其前药、类似物或盐的给药过程中施用。在一个实施方式中，阿卡地新或其前药、类似物或盐以大约10mg/kg到大约200mg/kg的总剂量施用。另一方面提供了一种预防或降低经历非血管手术的患者的不良作用的方法，其中施用阿卡地新或其前药、类似物或盐，并且然后施用凝血抑制剂。本发明可用于多种非血管手术，包括但不限于心脏、腹部、 神经、妇产科、整形外科、泌尿科、血管和与耳鼻喉相关的手术。更具体地，非血管手术包括，小肠和大肠切除术、阑尾切除术、腹腔镜检查、穿刺术、经尿道前列腺切除(TRUP)、子宫切除术、输卵管结扎、输精管切除术、输卵管卵巢切除术、剖腹产术、痔切除术、扁桃体切除术、鼓膜切除术、放置鼓膜切开管、去除结肠和直肠的息肉、直肠脱垂的修复、肠瘤的去除和治疗、刮除术、胸腔穿刺术、胸廓切开术、鼻成形术、脂肪抽吸术等。
在一个实施方式中，凝血抑制剂是阿司匹林。在一个实施方式中，经历手术或非血管手术的患者过去具有心肌梗塞。在另一实施方式中，过去的心肌梗塞发生在手术前24、36或48个月内。
本发明的另一方面提供了一种预防或降低经历CABG手术的患者的不良作用的方法，包括首先施用阿卡地新或其前药、类似物或盐，然后施用凝血抑制剂。在一个实施方式中，凝血抑制剂的施用在阿卡地新或其前药、类似物或盐的给药过程中进行。在另一实施方式中，阿卡地新或其前药、类似物或盐以大约10mg/kg到大约200mg/kg的总剂量施用。另一实施方式提供了以0.1mg/kg/分钟施用阿卡地新或其前药、类似物或盐。另一实施方式提供了在大约7小时的时间内施用阿卡地新或其前药、类似物或盐。另一实施方式提供了以大约400mg到大约5g的剂量施用阿司匹林。另一实施方式提供了在手术后48小时内至少施用一次阿司匹林。
本发明的另一方面提供了一种制剂，其包含阿卡地新或其前药、类似物或盐，阿司匹林，和药学上可接受载体、稀释剂或赋形剂，其中所述制剂在大约7小时的时间内给患者提供大约1μg/ml到大约20μg/ml的血浆浓度，并且以大约40mg到大约5g的剂量提供阿司匹林。在另一实施方式中，本发明提供了一种预防或降低经历手术的患者的不良作用的方法，包括在手术的48小时内施用上述药物组合物。在另一实施方式中，所述手术是CABG。
实施例
下列实施例描述了本发明的特定方面以对本发明进行解释，提供了本发明的方法、组合物和制剂的说明。实施例不是用于对本发明作出限制，实施例仅仅是提供有利于理解和实现本发明的特定方法。
实施例I
AICA核苷增强淋巴母细胞释放腺苷
对于通过所述方法增强腺苷的体外释放，用人脾淋巴母细胞系(WI-L2)证明AICA核苷对腺苷释放的影响。Hershfield等人在Science，Vol.197，p.1284，1977中已经描述了上述细胞系的历史和特性。该细胞系在RPMI1640细胞培养基中培养，所述培养基添加20％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和不同浓度的AICA核苷，在含5％二氧化碳的空气中生长48小时。胎牛血清包含嘌呤和嘌呤代谢酶，但是，为了确定2-脱氧葡萄糖接触期间AICA核苷的影响，WI-L2细胞在RPMI1640培养基中孵育，所述培养基添加10％热灭活、透析的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和1μM脱氧柯福霉素。
通过添加2-脱氧葡萄糖或者钙离子载体刺激细胞ATP储存的分解代谢。通过将30μl的预冷4.4N高氯酸与300μl的上清液混合，或者向收集的细胞沉淀中添加300μl的预冷0.4N高氯酸并在4℃以500×G离心混合物10分钟，在不同时间检测细胞释放到上清液中的腺苷量或者细胞中残留的核苷酸量。每种所获上清液用660μl包含2.4克三-正-辛胺(Alamine 336)(General Mills)的溶液中和，所述溶液溶于12.5ml 1，1，2-三氯-1，2，2-三氟代乙醇(Freon-113)溶剂，如Kliym在Clinical Chemistry，Vol.21，p.1245，1975中所述。然后在4℃下以1500×G离心3分钟，除去水相并在-20℃冷冻，直到用于腺苷、肌苷或者核苷酸的检测。在C-18microBondapak反相柱上等度分析腺苷，所述反相柱用4毫摩磷酸钾(pH3.4)∶60％乙腈水溶液(95∶5v/v)缓冲液平衡。在8-10分钟时腺苷被洗脱，通过其对腺苷脱氨酶的灵敏度和通过掺加腺苷标准品，确认其身份。在Whatman Partisil-10(SAX)柱上通过高压液相层析对从细胞沉淀提取的样品进行核苷酸分析，所述柱用10毫摩磷酸钾，pH3.78平衡，用到0.25摩尔磷酸钾， 0.5摩尔KCl，pH3.45的线性梯度进行洗脱。通过254和280nm处的吸光度进行连续监控。通过与适当标准品的高压液相层析分析进行比较，来定量峰值。
图2显示，48小时的AICA核苷预处理在100-500微摩尔范围内促进淋巴母细胞释放腺苷。在没有本发明的药物的存在情况下分泌大约1.4纳摩尔的腺苷/106 WI-12细胞，在500微摩尔AICA核苷浓度下  这个数字增加到大约2.3纳摩尔。当细胞在接触2-脱氧葡萄糖前与AICA核苷预孵育18小时时，如图7所示，腺苷释放增强。与AICA核苷(图8)或者利巴韦林(图9)的3小时预孵育和4小时孵育(在2-脱氧葡萄糖处理期间)也导致腺苷释放增加。在图2中细胞生长到大约0.5×106细胞/ml(对数中期)，在图7-9中大约1.0×106细胞/ml。
实施例II
AICA核苷对神经母细胞瘤细胞中腺苷释放的体外影响。
对于神经肌肉疾病例如脑性麻痹、孤独症、精神分裂症和失眠，腺苷释放的增加可能是有益的。神经母细胞瘤细胞系在实施例I描述的培养基和条件下生长。培养基中添加0或者50μm AICA核苷。为诱导ATP分解代谢，用包含微摩尔量的钙离子载体A23187和1.0μM脱氧柯福霉素的培养基替换生长培养基。在这些条件下显示处理后的细胞比对照细胞分泌的腺苷至少多两倍。次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶缺陷的细胞比具有正常酶的细胞分泌的腺苷少两倍，这可以通过用AICA核苷或者利巴韦林预处理进行校正。结果如下面表1所示。
表1
实施例III
AICA核苷对犬的腺苷水平和血流增加的体内影响。
对犬进行实验，检测AICA核苷处理引起的腺苷水平升高，以及因此产生的伴随的血流增加。
图3和4显示第二系列实验的结果，进行所述实验来证实AICA核苷对血液中腺苷水平的影响，并使腺苷的增加与血流的增加相互关联。十三只杂种犬用苯巴比妥麻醉。将导管插入前冠状静脉，收集血液样品到2N高氯酸中。在冠状动脉闭合前以1ml/min的速度随机选择盐水或者溶于盐水的100mM AICA核苷输注股静脉45分钟。收集冠状静脉血，在闭合前5分钟和左前下行冠状动脉闭合后1、10、20、30和50分钟，以及再灌注后1分钟，按照实施例I所述检测相似的方式检测腺苷。在局部缺血5和60分钟时，将15μm放射性标记的小球注入左心房，检测局部心肌血流，如Heymann等人在Prog.C.V.Dis.20；55(1977)中所述。在整个局部缺血期间监控心电图和动脉压。6只AICA核苷-处理的犬和5只盐水-处理的犬在所述方法中幸存。幸存的盐水-处理动物中的两只心脏有纤颤。刚闭合前AICA核苷-处 理犬中AICA核苷的浓度是57.4+/-40.2μM。范围是4.4-100μm。
图3显示灌注AICA核苷的犬中，引流至局部缺血区域的血液中的腺苷水平显著增加。局部缺血前，在AICA核苷或者盐水输注前或者期间，没有犬具有可测的静脉腺苷(＜0.01μm)。盐水-处理动物在闭合后10分钟具有峰值腺苷水平(0.22+/-0.08μM)，到60分钟下降到不能检测的水平。相反，AICA核苷-处理动物在局部缺血1分钟时具有峰值腺苷水平(1.79+/-0.35μm)，在60分钟时仍然保持较高(0.18+/-0.15)。再灌注在盐水-处理动物中导致没有可检测的腺苷洗出物，但在AICA核苷-处理动物中有显著的升高。在盐水和AICA核苷-处理犬中，从右心房(体循环血液的样品)获得的血液没有可检测的腺苷。
图4显示在AICA核苷-处理动物中，流向局部缺血心肌的局部心肌血流比在盐水-处理动物中显著更大。在心内膜和心外膜中也观察到流量差异的相似程度，在局部缺血的5和60分钟之间没有改变。AICA核苷不改变流向正常心肌的血流，因为非局部缺血组织的流量在两组间是非常类似。5和60分钟时的体循环动脉压和心率在两组犬之间没有显著性差异。动脉血气含量和体循环静脉粒细胞计数在两组间没有显著性差异。因此，AICA核苷被认为促进流向局部缺血心肌的并行冠脉血流，如上所指出，这是通过增加局部腺苷释放，从而在局部缺血区域舒张血管和/或抑制粒细胞自由基产生和随后的毛细血管损伤和/或阻塞。
实施例IV
AICA核苷处理对犬肌苷水平的影响
通过分析实施例III中犬静脉血的肌苷水平，显示腺苷水平的增加至少部分地与被转化为肌苷的ATP量的减少相关。图5显示在60分钟试验期间，AICA核苷-处理犬的肌苷水平下降超过两倍。这些数据表明本发明的化合物通过将ATP分解代谢从通常更普遍的最终产物肌苷重新定向到腺苷，提高了腺苷的释放。
实施例V
AICA核苷处理对心肌梗塞面积的影响
在大鼠中检测AICA核苷处理对心肌梗塞面积的影响，给所述大鼠施用溶于盐水的AICA核苷或者单独的盐水，然后通过结扎左前下行冠状动脉诱导受限的血流。利用本领域公知的渗透小型泵，通过输注溶于盐水的AICA核苷或者盐水，动物被连续暴露。三周后，处死大鼠，通过计算染色的固定化心脏切片的面积定量梗塞面积。结果显示在AICA核苷处理的心脏中梗塞面积比盐水处理的对照减少33％(p＜0.05)。
实施例VI
AICA核苷处理对心律不齐的影响
心肌缺血的一个后果是心律不齐，心律不齐的频率与血流降低的程度有关。因为已知腺苷可以抗心律不齐并且抑制粒细胞自由基的产生，所述自由基可能通过脂质过氧化作用引起心律不齐，因此检测AICA核苷处理对心律不齐的预防作用。对实施例III局部缺血期间记录的心电图，分析室性过早去极化(PVD)和心室性心搏过速(VTAC)发作的次数。表2显示在局部缺血期间，盐水-处理的犬具有112.2次PVD和18.2次VTAC的发作，与此相对是AICA核苷处理的动物为37.8次PVD和4.7次VTAC的发作(p＜0.01)。这条AICA核苷处理的犬(频发心律不齐的#3)比另一条AICA核苷处理的犬具有低得多的并行血流速度和腺苷浓度(但AICA核苷血液浓度是27.2μm)。
表2
实施例VII
AICA核苷酸和相关分子对腺苷酸脱氨酶的抑制
如图6的试验结果所示，AMP利用酶，腺苷酸脱氨酶，被AICA核苷和利巴韦林的磷酸化衍生物抑制。磷酸化形式分别被称为AICA核苷酸和利巴韦林单磷酸盐。利用200μm各种核苷酸，腺苷酸脱氨酶分别被抑制38％和54％。通过检测14C-AMP到14C-IMP的转换进行酶活性测定(改自T.J.Wheeler和J.M.Lowerstein，J.Biol.Chem.254：8994(1979))。按照Gruber等人，Biochim.Biophys.Acta 846：135-144，1985的描述，利用来自人淋巴母细胞系的细胞质裂解产物进行反应。在薄层色谱板上分离底物和产物，在液体闪烁计数器中计数。这种酶的抑制引起细胞中AMP浓度的增加，AMP是腺苷的直接前体。
实施例VIII
腺苷对粒细胞/内皮细胞相互作用的影响
进行研究以证明腺苷是否降低粒细胞对内皮细胞的胶粘亲和力或者“粘性”，这种情况将增加微血管中的血流。检测的参数是两种细胞类型之间的断裂应力。
腺苷降低粒细胞和内皮细胞(构成血管壁)之间的断裂应力二分之一，通过表面灌流20μM溶液使微血管暴露于腺苷，粒细胞的滚动速度增加两倍，在血管中得到大约2μm的浓度。通过在大鼠肠系膜微血管的粒细胞活体镜检法摄片进行这些研究。在腺苷给药前后计算粒细胞的滚动速度相对红细胞的流动速度。
实施例IX
AICA核苷对局部缺血心肌中粒细胞积聚的影响
AICA核苷降低局部缺血心肌中111铟-标记粒细胞的积聚。在实施例III描述的一系列犬中，取出粒细胞，用111铟标记，再灌注。在局部缺血1小时后，杀死动物，定量心肌组织中的粒细胞，利用γ计数器检测心肌活组织切片中的111铟含量。局部缺血的心内膜中的粒细胞含量在AICA核苷-处理犬(1.03+/-0.21×106细胞/克)比在盐水-处理处理动物(1.55+/-0.24×106细胞/克)中显著更少。并行血流的放射性标记的微球检测得到与实施例III所示基本相同的结果，即ACA核糖核苷处理犬中的血流显著大于盐水处理动物。
实施例X
用AICA核苷治疗孤独症患者
进行研究，以测定AICA核苷对治疗孤独症个体的有益作用。
得到授权后，在两个患有腺苷酸琥珀酸酶缺陷(孤独症)的患者中进行AICA核苷治疗试验。在第1天通过口服5mg/kg/天单一剂量的AICA核苷开始治疗试验。当日，在不同时段收集血液和尿液样品，在施用AICA核苷后2和3小时分别对每位患者进行单次腰椎穿刺。鉴于不存在临床副作用，在以后几天施用相同剂量的AICA核苷，在此期间患者仍然住院，继续收集尿液。因为没有观察到核苷施用的副作用，AICA核苷剂量增加到2×5mg/kg/天，患者在第8天出院，继续这个疗法。在第55天，两位患者短时重新入院进行临床、生化和精神病学评定。因为不存在任何临床副作用，AICA核苷的剂量从第46天增加到2×10mg/kg/天。治疗一直持续到第71天，在那天结束。
第119天用20mg/kg/天剂量进行静脉内负荷试验，1小时后腰椎穿刺，其特定目的是评价AICA核苷在脑-脊髓液(CSF)中的渗透。
在所有使用的剂量中，利用现有方法无法在血浆和CSF中检测到AICA核苷。尽管如此核苷在肠中再吸收，证据是在长期口服期间发现其三磷酸盐衍生物，AICA核苷三磷酸盐，存在于红细胞中。在静 脉内施用1小时后，在血浆中还是无法检测到AICA核苷，但是AICA核苷三磷酸盐类似地在红细胞中积聚，表明AICA核苷的快速细胞吸收和新陈代谢。不能获得肾损失核苷的正确评价。
给药AICA核苷对这些患者排泄的两种异常化合物丁二酰腺苷尿和SAICA核苷的尿排出量仍然没有显著影响，对尿酸的尿排出量也没有影响。它对红细胞中ATP和GTP浓度也没有显著影响。在AICA核苷的口服及静脉内给药后，达到的AICA核苷三磷酸盐浓度与GTP的相同。
两患者在AICA核苷治疗试验刚刚开始前的精神发育鉴定显示严重的精神运动性阻滞(按Bayley等级，精神发育大约3个月)，伴随下列孤独症特征：刻板的不协调动作、对听觉和触觉刺激的反应缺失和对视觉刺激的微弱反应。
连续AICA核苷施用2个月后对这些特征的再评估显示在年长患者中没有任何改变。但是他的妹妹显示明显的好转：刻板运动的频率降低，对视觉刺激的反应有改善，最显著地，对听觉和触觉刺激的反应现在可以记录到。2个月后，AICA核苷治疗然后中断6周，其父亲描述两个患者为“在治疗期间更快乐地活泼和更容易控制”，因此提出恢复试验的要求。
在AICA核苷治疗试验前和期间，发现下列参数是正常的：红细胞数、白血细胞数、血小板和网织红细胞数；白细胞分化；血细胞比容、电离图、Ca、磷酸盐、尿素、肌酐、尿酸、胆固醇、脂类、血清谷-草转氨酶(SGOT)、血清谷-丙转氨酶(SGPT)、肌酸磷酸激酶(CPK)、葡萄糖、乳酸盐和氨。
实施例XI
利巴韦林对肥大细胞脱粒的影响
通过阻止肥大细胞脱粒，有可能预防或者控制患者的变态反应。从Balb/C小鼠股骨获得的骨髓在Razin培养基和条件培养基的1∶1混合物中培养，所述条件培养基按Razin等人在Proc.Natl.Acad.Sci. USA 28：2559-2561，1981中的描述，在刀豆素A(Concanavalin A)存在条件下通过共培养C57B1/6J和C3H小鼠的脾细胞产生。在传代数周并且进行组织培养至少15天后，所获细胞是90％纯度的肥大细胞，通过台盼蓝排除法证明95％有活性。培养中接触利巴韦林的细胞在实验前先洗涤3次。只在培养基中生长的细胞平行培养物被用作药理学调控肥大细胞的对照。通过在特定时点计数细胞，比较利巴韦林-处理细胞的实际数目和只在培养基中生长的细胞数目，对细胞生长进行评价。
β-氨基己糖苷酶被选作典型的粒-结合的、预先形成的肥大细胞调节剂，因为它可以容易地被定量，其释放几乎与组胺的释放完全平行。小鼠骨髓-起源的肥大细胞在200×g离心5分钟，在不含二价阳离子的Tyrode′s缓冲液中洗涤3次，用抗-DNP(二硝基苯基磷酸盐)IgE(1μg/106细胞)致敏30分钟，用溶于400μl完全Tyrode′s缓冲液的DNP-BSA抗原(175ng/3×105细胞)或者A23187(10μg/ml/3×105 细胞)激发10分钟。反应混合物在200×g离心10分钟，上清液和沉淀β-氨基己糖苷酶浓度按照Schwartz等人在J.Immunol.123，1445(1979)中的描述，通过p-硝基苯基-β-D-氨基葡萄糖检测。在未激发细胞中检定自发的β-氨基己糖苷酶释放。β-氨基己糖苷酶释放的净％按如下定义：##EQU1##其中[β-hex]是β-氨基己糖苷酶，super.是上清液。当外源腺苷存在于反应混合物中时，它与促分泌剂同时添加。
用A23187或者DNP-BSA抗原激发的小鼠骨髓-来源肥大细胞释放8-15％的全部细胞β-氨基己糖苷酶，一种预制的、粒结合调节剂。在肥大细胞刺激时添加利巴韦林(10μM)不影响β-氨基己糖苷酶的释放。但是，肥大细胞在10μM利巴韦林中孵育3到7天，洗涤，用A23187激发，与只在培养基中培养的平行细胞相比，β-氨基己糖苷酶的释放显著降低(图10)。星号(*)表示数据显著地不同于对照细胞(p＜0.05)。利巴韦林接触不改变肥大细胞调节剂含量(即，总细胞β-氨基己糖苷酶浓度)，也不改变细胞活性，在两组细胞间β-氨基己糖苷酶的自发释放是相似的。图11描述了利巴韦林接触和预制 调节剂释放的剂量反应关系。尽管1μM利巴韦林作用6天显著地抑制调节剂释放，在10μM和20μM之间抑制最强。
实施例XII
AICA核苷对肥大细胞活化和脱粒的调节
肥大细胞的活化和脱粒在变态反应疾病例如哮喘中起着重要作用。因此，一种阻止活化和脱粒的方法提供了一种控制疾病的方式。
A.肥大细胞分离。为了证实通过所述方法阻止脱粒和活化，首先按照实施例XI的描述分离和培养细胞。
B.AICA核苷对脱粒的影响。通过显示AICA核苷抑制钙离子载体A23187诱导的脱粒证明了AICA核苷对脱粒的抑制，这反应在酸性糖苷外切酶-β-氨基己糖苷酶的释放。1μg/mlA23187，包括或者不包括AICA核苷，在37℃被添加到Tyrode′s缓冲液中的2-5×106肥大细胞，检测释放的肥大细胞β-氨基己糖苷酶的量。在100微摩尔AICA核苷存在的条件下，只有17.6％氨基己糖苷酶被释放，而在其缺失时28.8％被释放。因此AICA核苷抑制肥大细胞脱粒。β-氨基己糖苷酶的百分比释放，以及酶的检测方法按照Schwartz等人在J.of Immun.，Vol.123，October，1979，p.1445的描述进行。
AICA核苷对白细胞三烯C4释放的影响
细胞只在培养基中或者含有100μM AICA核苷的培养基中生长6天，洗涤，用A23187激发20分钟。通过放射免疫试验测定悬浮白细胞三烯C4的浓度，证实对照和AICA核苷处理细胞分别是51和13纳克/106细胞。用AICA核苷预处理后白细胞三烯C4释放显著降低(p＜0.01)75％。用10μM利巴韦林预处理4到6天获得类似的结果，此处利用抗原结合肥大细胞表面的IgE完成肥大细胞的活化。
实施例XIII
卡地阿佐诱导的癫痫发作的抑制
为检测AICA核苷抑制卡地阿佐诱导的癫痫发作的能力，在注射 60mg/kg卡地阿佐前，大鼠(每种条件10只)经腹内溶于盐水(0.9％)的1000mg/kg或者100mg/kg AICA核苷或者等体积的盐水预先处理(随机和盲试)30分钟和5分钟。两个独立的癫痫发作方面专家观察动物1个小时。
在接受2000mg/kg(总剂量)的组中发作动物减少40％，在这个组中存在显著的癫痫发作潜伏期延长(图12)。
实施例XIV
儿茶酚胺诱导的心律不齐的抑制
为检测AICA核苷是否保护心脏免受异丙肾上腺素(isuprel)-诱导的心律不齐，检测9对大鼠，每对中的一个动物腹膜内注射1000mg/kg溶于水的AICA核苷。每对中的另一只动物作为对照，类似的注射与AICA核苷溶液体积相同的(0.9％)盐水。
5分钟后动物腹膜内注射330mg/kg水合氯醛进行麻醉。然后单一EKG导线连接到每只大鼠同时记录每对大鼠的心电图。为产生心律不齐，每只大鼠皮下注射异丙肾上腺素(1000mg/kg)。
在异丙肾上腺素注入30分钟后，运行心电图仪记录纸速度(5cm/秒)10分钟以计数两只动物的心律不齐拍数。
在AICA核苷-处理大鼠中存在阵发性心室收缩39％的降低和心室纤颤的完全抑制(图13)。
通过下列实验，申请人已经测定降低局部缺血事件的频率、持续时间和严重程度以及减少组织损伤的AICA核苷浓度和剂量，而且能够避免副作用例如临床显著升高的血清和泌尿尿酸水平和晶尿症。申请人还测定了预防或者降低有害临床后果，例如有害的心脏血管和脑血管的事件、严重程度的AICA核苷的浓度和剂量。
下列实施例不是用于限制本发明。本领域技术人员意识到给药所述数量的AICA核苷将缓解血流减少引起的组织损伤，并且将减少有害临床后果的发生，例如有害的心脏血管和脑血管事件，在除了CABG手术的情况下。
实施例1
在接受冠状动脉旁路移植术(CABG)手术的患者中AICA核苷的影响：2期临床试验
进行这些实验来评价AICA核苷对CABG手术期间和之后心脏局部缺血事件的频率、持续时间和严重程度以及左心室功能的影响。还评定了AICA核苷治疗对心肺分流术撤除困难的影响。此外，AICA核苷对某些有害临床后果发生的影响也被评估。
研究设计
本研究是多中心随机双盲多剂量安慰剂对照的平行组研究，评价4个中心的118名患者。预定进行非急诊CABG手术的患者被随机分配，用两种AICA核苷剂量中的一种或者安慰剂进行治疗，在整个过程中持续输液。记录临床后果、血液动力学和局部缺血的发生和严重程度(通过连续的心电描记法(ECG)和经食道的超声心动图(TEE)，在不同治疗组间进行比较。
患者
研究包括的是没有生育能力的女性和至少30岁以上的男性，他们预定进行非急诊CABG手术以治疗冠状动脉病，所述冠状动脉病是在手术前6个月内通过冠状血管造影显示的典型病变(2个或更多主要血管至少50％狭窄)确诊的。如果患者已经稳定至少24小时并且在先前2周内没有发生心肌梗死，则包括患有不稳定心绞痛的患者。从研究中排除的是接受急诊CABG或者反复CABG的患者；和那些静止射血分数小于30％，心脏指数小于1.5L/分钟/m2，或者患有特发性心肌病、严重心瓣膜病、严重左心室肥大或者主要心室内传导反常的患者。那些患有胰岛素依赖型糖尿病或者血糖过低，肝脏或者肾脏疾病，不受控制的痛风或者近期有酒精或者其他药物滥用史的患者也被排除。溶解血栓疗法在手术前2周被禁止，在研究前60天禁用胺碘酮，24小时前禁用潘生丁、茶碱和氨茶碱。在给药前12小时禁止吸烟和摄取任何包含甲基黄嘌呤的食物或者饮料，直到从重症监护室转出。
治疗和方法
预定进行CABG手术并如上所述被选取的患者被随机分配接受AICA核苷(最初0.19mg/kg/分钟或者0.38mg/kg/分钟；前6个患者后0.05mg/kg/分钟或者0.1mg/kg/分钟)或安慰剂输液，在麻醉诱导之前不久开始并持续7小时；在所有情况下这表示输液直到手术已经完成和患者在重症监护室恢复才终止。AICA核苷(最终浓度20μM)或者安慰剂还被添加到结晶状心脏麻痹溶液，用于在分流术期间灌注冠状循环。没有其他药物被添加到结晶状心脏麻痹溶液。
在手术前，获得常规病史、身体检查、实验室测定、心电图(ECG)和胸部X光片。获得插管前至少8小时的连续ECG(Holter)记录。常规心脏血管药物治疗持续到手术当天上午。在手术刚刚开始前，在桡动脉中放置一根导管用于血压测量和动脉血取样。在肺动脉中引入三腔热稀释导管用于血液动力学的测量。在气管插管后，利用经食道的方法在中-乳头肌水平位置放置超声心动图传感器。
在手术期间，通过连续输液芬太尼和咪达唑仑保持麻醉。利用标准手术室监控装置记录常规临床参数。记录连续的2-导Holter ECG和TEE数据。使用标准手术过程(例如，主动脉阻断，结晶状心麻痹，心-肺分流术，低体温)。当体温是37℃时，构建网结，除去主动脉阻断，患者停止分流。外科医生判断网结的质量。根据需要一个或多个下列介入来判断分流术撤除中的困难：起搏器、重启分流术、气球抽吸或者血管加压给药。血液动力学测量，包括心率、动脉血压、肺毛细血管楔压和心输出量，在胸骨切开术前、分流术后15和30分钟以及胸部闭合时记录。检测桡动脉和肺动脉压力、心肌和全身温度、O2饱和度、呼气末CO2和动脉血气体，并获得临床ECG记录。利用指定的用药法将血液动力学变化(血压、心率、肺毛细血管楔压)控制在基准的20％以内。
在术后第一天，使用吗啡和咪达唑仑进行镇静和镇痛。记录所需的心脏血管药物治疗。在这段时间，进行连续的ECG监控(Holter)直到48小时。在2、4、8和12小时(一些情况下在24和48小时) 以及任意临床指征的时候，进行血液动力学检测(肺动脉压力和心输出量)。
在进入重症监护室和手术后第1、2、3和出院时获取12-导ECG。48小时内每隔8小时及指定时获取肌酐磷酸激酶MB带(CK-MB)。在术后大约14天和尽可能接近出院时进行射血分数的放射-核素脑室造影术和壁运动评分。当临床需要心肌梗死或者充血性心力衰竭的诊断或者评价时，进行其他化验和检测(例如，胸部X光、肺动脉楔形压PCWP)。手术后48小时内的所有心脏血管药物治疗的时间和剂量均被记录。记录术后24小时所有止痛药的总剂量。记录液体摄取和排出(例如，血液置换和尿液排出)48小时。手术后24小时记录收缩药品的类型和持续时间以及抗心律不齐药紧急请求。在第3期，插管前8小时，从插管指导手术结束，以及术后24-48小时获取双通道Holter记录。
安全性评估
除了上述血流动力学监护外，在术后第一天和出院日进行下列检测来筛查：
1.血液学包括血红蛋白，总白细胞计数和差异，血细胞比容和血小板计数。
2.生化学包括血清钠，钾，氯化物，磷，镁，尿素，肌酐，血清谷丙转氨酶(SGPT)，血清谷草转氨酶(SGOT)，总胆红素，白蛋白，总蛋白，尿酸，碱性磷酸酶，肌酸磷酸激酶和CPK-MB。在胸部闭合后48小时每隔8小时检测CPK-MB。在输液，心肺分流术(CPB)前，在CPB后，在进入重症监护室(ICU)以及其后4和8小时，检测血糖和尿酸水平。还在CPB后24小时和出院时检测上述水平。
3.尿分析包括血液，pH，蛋白，葡萄糖，酮，红细胞，白细胞管型和晶体。还在治疗前、输液结束和输液结束后4到8小时收集尿液用于检测尿酸含量。
4.调查员记录整个过程中的任何有害事件，调查员评定它们的严重程度以及这些有害经历与治疗的关系。
有效性评价
有效性的检测是AICA核苷将局部缺血事件的发生、持续时间和/或严重程度降低到何种程度(通过比较治疗过程前、期间和之后48小时连续Holter记录上的S-T段改变)。还检测AICA核苷在降低局部缺血对心肌功能有害作用中的有效性(通过评价分流术前后TEE的局部壁运动，并通过手术前后射血分数的测量)。两个独立的盲态观察者对Holter带和回波录像磁带进行集中的评价；如果两者间存在不同意见，用第三个观察者“打破平衡”。在整个研究中使用相同的观察者。
有害临床后果的发生，比如心源性死亡(患者死亡主要归因于心脏原因，非-致命透壁MI(通过12-导ECG上出现新的Q-波加上CK-MB值50单位来测量)，非-透壁MI(CK-MB值50单位)，充血性心力衰竭(需要主动脉内球囊泵或者左心室辅助装置的心输出量下降)或者危急生命的节律障碍(心室纤维性颤动，或者需要心脏复律或者药物治疗的心室性心搏过速)在安慰剂和治疗组之间进行比较。为诊断心肌梗死，对治疗盲态的观察者集中评定ECG描图和CK-MB值。患者撤除分流术的困难，如果存在，在安慰剂和治疗组之间进行比较，通过记录一个或多个下列治疗的需要：起搏器，重启分流术，气球抽吸或者使用血管加压药。
统计分析
此处报道的结果没有覆盖所有检测的参数，但是给出了利用所述方法得到的下列检测值。
1.组可比性。为评定3个治疗组间的可比性，利用对离散变量列联表的连续变量和卡方检验的单向方差分析，评价下列基准和术中的检测值。
2.基准。年龄，性别，心血管病史(心绞痛，高血压，前MI，CHF，心律不齐)，射血分数，导管插入术数据(患狭窄症血管的数量)，分流术前局部缺血事件的数量和每小时局部缺血的分钟数(通过Holter ECG检测)。
3.术中。移植血管的数量，主动脉阻断时间，手术时间，分流术时间。
4.临床后果。对心源性死亡的结果、MI、CHF和危急生命的节律障碍进行比较。分析的特定终点整合成二分终点，即，上述4个事件中至少1个发生相对于没有事件发生。利用小量样品的Fisher′s精确检验比较3个治疗组之间的临床后果比率。对组合积极疗法相对安慰剂进行相同比较。
5.局部缺血事件--TEE。在两个时间段--分流术前和分流术后评价局部缺血事件数据，利用下列分析：
a)利用Fisher′s精确检验比较组间患者患局部缺血事件的数量。这些分析还包括前-后改变和前-和后-组合。
b)对发生事件的患者进行局部缺血的平均持续时间和严重程度的分析。只利用发生局部缺血事件的患者将降低分析中包括的数量，但允许检测药物是否有效降低事件的数量，如果它们存在。发现局部缺血持续时间的分布是偏态的，所以使用log10转换导致正态分布，利用单向ANOVA比较各组。对事件的严重程度(普通变量，0-4级)和数量，使用Kruskal-Wallis非参数检验。对组合的积极疗法组进行相同比较。
6.局部缺血事件--ECG。利用和回波事件相同的方法分析ECG指示的局部缺血事件。时间段分析是：(a)基准(Holter启始到输液启始)，(b)分流术前(输液启始到分流术启始)，(c)分流术后(夹板关闭到输液结束)，和(d)治疗后(输液结束到Holter结束)。对发生事件的患者，分析下列变量：平均持续时间，ST改变最大值和显著ST段偏差曲线下的面积。使用方差分析(ANOVA)。
对组合的积极疗法组进行相同比较。
7.局部缺血对结果。利用Fisher′s精确检验分析上面列出的时间段内检测的局部缺血(TEE和ECG)间的关系和临床后果(参见J.Leung，等人：Prognostic Importance of Postbypass RegionalWall-Motion Abnormalities in Patients Undergoing Coronary Artery Bypass Graft Surgery.Anesthesiology 71：16-25，1989)。
8.撤除困难。如果患者需要一个或多个下列介入，它们被认为具有撤除困难：起搏器、重启分流术、气球抽吸或者血管加压给药。利用X2和Fisher′s确切检验分析接受每种上述介入的患者数目，这就是分类为撤除困难患者的数目。此外，通过单向方差分析比较经历困难的患者中的撤除时间(定义为阻断去除到分流术结束的时间)。
9.射血分数。利用不同方法检测术前和术后的射血分数；因此，不能对变化值进行统计分析。组平均射血份数和CABG前-和后-被展示，组间的显著差异被描述。
10.血浆水平。检测AICA核苷血浆水平以检验符合随机治疗和证明剂量-比值和评定达到的血浆水平。个体值和组平均值被列表显示，计算药物清除率。剂量比值被评定。
11.副作用。治疗组任何副作用的发生、严重程度和药物-相关性被列表显示，在高剂量组这种影响的发生降低。不进行统计分析。
12.实验室数据。作为选定的关注参数，个体值、相对基准的平均变化和百分比变化被列表显示，对治疗组相对时间制图。下列参数被列出：
尿液-尿酸，肌酐，尿酸/肌酐比例，pH，体积，晶体。所有值列表显示为±S.E.M。
血液化学--CPK，CK-MB，尿酸，葡萄糖。
所有值列表显示为±S.E.M。
结果
此处描述的研究代表AICA核苷的延长连续输液与患者的第一次接触，所述患者接受麻醉、心肺分流术手术和低体温。利用健康志愿者个体或者有意识的温度正常患者的结果评价剂量水平，对在健康志愿者个体或者有意识的温度正常患者中利用短输液周期进行药物动力学研究的适用性还存在不确定性。
研究中包括的前6个患者被施用0.19mg/kg/分钟和0.38mg/kg/分钟。当检测AICA核苷的血浆水平时，出乎意料的发现它们比预期要 高大约2-4倍。而申请人不希望被任意特殊理论限制，更高的AICA核苷水平也许因为药物代谢的降低，这是低速肝血流和低体温造成的。更高水平还可能是延长输液对清除率的影响造成的。剂量水平从0.19和0.38mg/kg/分钟降低到0.05和0.1mg/kg/分钟。然后这在后来的患者中获得大约2.5和5.0μg/ml的稳态血浆浓度。
来自这些前6个患者的结果，它们在初始高剂量被研究，在下面概述，并被归入总体安全性分析。除接受安慰剂的患者A4以外，这些结果不被包括在效率的评价内，除非关于这种结果清楚表述。
在初始高剂量组中，存在4个患者接受低剂量(0.19mg/kg/分钟)，1个接受高剂量(0.38mg/kg/分钟)和1个安慰剂患者。通常，药物被良好耐受和不存在严重的有害经历。如表1所示，大部分时间在所有患者中血糖水平升高；没有值低于正常值的限制。存在显著的高尿酸血和晶尿症的升高泌尿尿酸水平，这迫使在5个药物-治疗患者中进行导尿管的冲洗(表1)。在这些患者中，尿液具有透明、绿色颜色，可能起因于高浓度的AICA核苷和/或其分解产物。而且，如表1数据所示，血糖水平没有降低。
除这些对血浆和尿中尿酸水平和晶尿症的影响外，没有有害事件被认为与AICA核苷治疗有关。在低剂量(0.19mg/kg/分钟)，4个患者中的2个(A3和A6)没有其他有害事件，患者1(A1)具有期外收缩，不稳定的血压和低血PO2的发作，这些被安全的校正。这位患者还患有直肠-乙状结肠癌，显然与药物治疗无关，对它建立了合适的疗法。第四个低剂量患者(A2)出现分流术后完全性心脏传导阻滞的发作，然后是4小时后的高血压。患者A5，接受0.38mg/kg/分钟，除了分流术后ECG的S-T段升高，没有事件发生。
表1
INF前-AICA核苷或者安慰剂输注前
CPB前-心肺分流术前
CPB后-心肺分流术后
ICU+0-进入重症监护室时
ICU+4-进入重症监护室后4小时
ICU+8-进入重症监护室后8小时
24HR后-心肺分流术后24小时
(H)表示高于正常范围
患者特征
表2和3显示被认为对手术期间病态的诊断非常重要的临床和手术数据。任意参数中都未发现显著差异，除了下列例外：安慰剂和高剂量组的所有患者，但只有83％的低剂量组，具有稳定心绞痛病史(p＝0.021)；在低剂量组有3个女性，在高剂量组没有，在安慰剂组1个(p＝0.090)。总的来说所有组符合人口分布、疾病的严重程度和手术过程的程度。
Figure 2006800187562A00800861
没有差异达到显著统计学意义。
表2
Figure 2006800187562A00800862
表3
Figure 2006800187562A00800871
没有差异达到显著统计学意义。
综合评定
有害事件
在设置CABG手术时，预期副作用是经常发生的。在这个研究中，3 7个安慰剂患者中的29个发生一种或更多有害事件。药物-治疗患者发生事件的数目在高剂量组是30/35(0.1mg/kg/分钟)，在低剂量组是28/41(0.05mg/kg/分钟)。没有证据表明相对安慰剂，在药物-治疗患者中任意这些事件更经常发生。
在所有治疗组中的几乎所有这些事件在严重程度上都是适度或者温和的，不需要其他特定药物治疗。5个其他事件被分类为严重的；两个急性心肌梗塞(患者A26和A39)，其中1个还患有CHF需要主动脉内球囊泵辅助，1个肺栓子(患者A12)，和1个右腿动脉栓需要切断术(患者A14)。
到现在研究中有1例死亡；患者A36，安慰剂组的67岁男性，患有术前不稳定心绞痛，不受控制的高血压和高等左主血管疾病。在一个简单手术过程后，他在重症监护室患上呼吸困难，呼吸机被记录出了故障。体外起搏术和最后体内心脏按摩，随后的其他复苏检测都是不成功的。
事实上全部情况(包括全部上面所列严重事件)，调查员认为事 件与药物无关，或者它们起因于药物的概率是非常低的，除了下列例外：患者A2，接受0.19mg/kg/分钟，患有高尿酸血和尿液中的橙色颗粒，和患者A14，在0.05mg/kg/分钟剂量，其尿液出现与初始高剂量患者中描述的相同绿色。
血清尿酸和葡萄糖水平
在前6个患者后，AICA核苷的剂量降低，血清尿酸没有进一步临床升高。如表4a所示，治疗组的平均变化显示血清尿酸明显倾向剂量-相关的增加。但是，没有观察到临床相关的高尿酸血或者晶尿症。在此过程中，施用包含葡萄糖的输液。如表4b所示，在所有组中血浆葡萄糖水平升高。
表4a
Figure 2006800187562A00800881
表4b
Figure 2006800187562A00800891
(缩略语的解释参见表1)
临床有效性
1.透壁性心肌梗塞。透壁性心肌梗塞，解释为在术后12-导ECG出现新的Q-波和CK-MB水平.gtoreq.50I.U.，发生在安慰剂组5个患者中，在接受低剂量AICA核苷的2个患者中，和在2个高剂量患者中(表5)。Fisher’s确切检验显示组间没有统计学意义上的显著差异，当两个治疗组组合与安慰剂相比也没有显著差异(p＝0.15)。但是，考虑到每组个体的小数量，这些结果(术后心肌梗死频率降低64％)显示AICA核苷治疗相关的透壁MI下降趋势。
表5
所有梗死发生在进入重症监护室时或者术后第1天。患有心肌梗死的患者(A39)在撤泵时还需要主动脉内球囊泵用于严重的低血压症状；除了这个例外，没有其他被鉴定的结果(需要主动脉内球囊泵的CHF或者左心室辅助装置，心源性死亡或者危急生命的心律不齐)在任意3组中发生。
2.非透壁性心肌梗塞。肌酐磷酸激酶MB带(CK-MB)水平的临床显著升高，50I.U.，伴随或者不伴随S-T段升高，在12-导ECG出现或者不出现新的Q-波，在17个(47％)安慰剂组患者，13个(13.7％)接受低剂量AICA核苷患者，和8个(23.5％)高剂量组(p＝0.10，X2检验)患者中观察到(表6)。综合治疗组相对安慰剂组，结果是统计上有显著意义的(p＝0.046)。
表6
Figure 2006800187562A00800901
在全部患者中，与安慰剂组相比治疗组中存在总CK水平降低的倾向(表7a)。在CK-MB释放中显示明显的相同趋势(表7b)。
表7a
表7b
3.心肌缺血。利用连续Holter ECG和TEE检测心肌缺血。从术前1天到术后第2天进行连续Holter ECG。局部缺血的ECG发作被定义为可逆S-T降低1mm或者更大，持续1分钟或者更久。手术期间在左心室中-乳头肌水平连续记录TEE数据。4段中每个壁运动划分为0-4个等级(运动障碍作为标准)。TEE局部缺血被定义为局部壁运动恶化为至少2个等级，持续1分钟或者更久。术前(基准)ECG局部缺血的发生(局部缺血患者的百分比)或者严重程度在安慰剂组、低剂量和高剂量组(分别为18％，14％和14％局部缺血)没有差异。在分流术前，在安慰剂，低剂量和高剂量组(分别为0％，3％和3％)ECG局部缺血的发生基本相似。相对安慰剂(19％)和低剂量组(15％)，高剂量组中TEE局部缺血的发生倾向于降低(6％)，p＝0.22。在分流术前，在安慰剂，低剂量和高剂量组(分别为29％，27％和24％局部缺血)中，TEE局部缺血的发生基本相似；p＝0.86。
高剂量组(11％)中ECG局部缺血的发生倾向低于安慰剂或者低剂量组(分别为18％和22％)，p＝0.42。如表8所示，在经历局部缺血事件的患者中，高剂量组中分流术后ECG局部缺血发作的严重程度低于低剂量或者安慰剂组，通过平均持续时间、S-T曲线下的平均面积AUC)，在毫米分钟(mm-min)中和监控的每小时局部缺血分钟(Isch min/h)进行判断。
表8
Figure 2006800187562A00800921
这些数据显示AICA核苷限制了接受CABG手术患者术后心肌缺血的程度。
分流术撤除困难
如果患者需要一种或多种下列介入，患者被界定为心肺分流术撤 除困难：起搏器插入，重启分流术，气球泵的使用或者给药血管加压药，或者研究确定指示撤除困难的其他介入。组间对起搏器的需要，重启分流术或者气球泵辅助没有显著差异。低剂量组和高剂量组均显示强烈倾向于血管加压药辅助需要的减少(p＝0.19)。参见表9a。当高低剂量组组合与安慰剂组比较时(表9b)，血管加压药辅助的减少需求达到统计显著性(p＝0.08)。作为在高低剂量药物治疗组血管加压药辅助需要减少的结果，与这些患者中其他辅助需要的减少结合，药物治疗组强烈趋向于撤除困难的缓解(当分别与安慰剂组相比时p＝0.17，当组合剂量组与安慰剂组相比时p＝0.06)。高低剂量组间上述讨论的任意撤除困难参数没有差异(表9c)。
对于从阻断去除到分流术终止的时间测量的撤除时间，各组之间没有统计上有显著意义的差异。但是如果只鉴定分流术撤除中有困难的患者，药物治疗患者中观察导时间强烈倾向于减少(表9d)。
表9a
Figure 2006800187562A00800931
表9b
Figure 2006800187562A00800932
表9c
表9d
Figure 2006800187562A00800942
血液动力学有效性
全部患者术前(通过血管造影)和从重症监护室出来时(通过放射性核素心室造影)检测的射血分数结果列于下表10中。
表10
Figure 2006800187562A00800943
在基准上，相对于射血分数各组是非常类似的。术后，虽然差异不是统计上有显著意义的，分流术后AICA核苷组比安慰剂组具有更 高的平均射血分数。
药物动力学
下面的表11给出了接受0.05mg/kg/分钟的40位患者和剂量为0.1mg/kg/分钟的31位患者在分流术前、分流术后、输液结束时和输液后60分钟的平均血浆AICA核苷浓度。上述数据还在图18中用图表显示。
表11
Figure 2006800187562A00800951
搭桥术前和术后两个时间点时，低剂量和高剂量各自的稳定血浆浓度均非常接近，分别是2.5和5.0μg/mg，显示出良好的剂量比例关系。在这两个时间点时，低剂量和高剂量下的平均总血浆清除率(CLp)相同，约为1.2L/hr/kg(范围是1.1至1.2L/hr/kg)。此结果表明在本研究所采用的灌流速率下，经受CABG手术患者体内的AICA肌苷显示出线性动力学性质。该清除率约为以前对有意识健康男性样本测得清除率的40-50％。Dixon，R.，等，J.Clin.Pharm.31：342-347(1991)。申请人不希望被任何特殊理论所束缚，因而药物清除率的这种差异可能是由于低血压引起的代谢下降、组织摄取减少、CABG术中肝脏血流降低或是长时间灌流相关的代谢改变等因素导致的结果。在搭桥术后期间，CLp显示出增加的趋势，这种变化与此期间体温和肝脏血流的增加以及麻醉中断相符。一旦灌流终止，血浆AICA肌苷浓度在一小时后即可快速降至稳态时的10％。
讨论
手术期间心肌梗塞(MI)并非CABG手术的罕见并发症，根据诊断标准的不同，报道发生率为10％至50％。近期研究报道了手术期间MI对立即死亡率、长期生存或这两者的不良作用(见H.Schaff，等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.88：972-981(1984)；P.Val.等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.86：878-886(1983)；W.Fennell等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.78：244-253(1979)；R.Seitelberger，等，Circulation83：460-468(1991).)。
本研究表明在手术期间包括术后即刻(术后再灌)，通过与心脏停搏液混合而给药，AICA肌苷可对抗组织缺血的不良作用，防止心肌细胞不可逆坏死，减轻缺血损伤造成的心功能受损程度。
此处描述的实验结果通过对新Q波和血浆酶的改变进行评价，显示了安慰剂(13.5％)和低、高剂量AICA肌苷(各为4.9％和5.7％)之间的透壁性MI发生率具有降低趋势。该趋势在非穿透性MI的减少中更为明显，即CK-MB水平高于50I.U.且ECG无变化(安慰剂47.2％，低剂量31.7％，高剂量23.5％)。
尽管在对三组进行比较时，手术期间MIs具有明显的降低趋势(p＝0.10)，但其结果未达到显著性差异。然而，所有给药处理患者(包括前5位接受高剂量的患者)与安慰剂组相比，药物处理组的手术期间梗塞率则具有统计学意义的显著性降低(p＜0.05)。
申请人还展示了AICA肌苷可改变缺血事件的持续时间和严重程度。安慰剂组患者搭桥术后缺血的平均持续时间为175分钟(±156分钟)。经AICA肌苷治疗可减少搭桥术后缺血的平均持续时间(p＝0.04)，其中低剂量组降至125分钟(±80分钟)，高剂量组降至36分钟(±20分钟)。并且，高剂量组的搭桥术后缺血每小时分钟数(27±20)低于安慰剂组(35±14)和低剂量组(40±15)。
高剂量AICA肌苷给药还可减轻搭桥术后缺血的严重程度。安慰剂组和低剂量组患者的S-T段下平均面积分别为35±14和40±15。而高剂量给药组的结果值为27±20。
AICA肌苷还显示出对搭桥术前缺血的作用，至少对TEE缺血的发生率有影响(高剂量为6％vs.安慰剂19％和低剂量15％)。
本研究结果还显示出对患者结束搭桥术的生理功能方面具有改善作用。接受AICA肌苷的患者更少需要血管加压药的辅助以重获搭桥术后功能。事实上，药物处理组中血管加压药的使用减少几乎达到了统计学意义的显著性。该结果表明接受药物的患者与安慰剂组相比所受损伤更少。
对于CABG手术中的血液动力学改变难于进行解释；心率和血压在很大程度上被各种药物制剂及对循环量的调整加以控制，因而AICA肌苷对这些参数无影响。然而，与安慰剂组和低剂量组相比，高剂量AICA肌苷组在即将转出重症监护病房时具有更高的射血分数。这种心功能的改善作用与其对缺血水平和心肌梗塞发生率的影响一致。
所有这些结果均显示出AICA肌苷给药的良好疗效，特别是在0.1mg/kg/min的剂量之下。当合并有高尿酸血症和结晶尿时，AICA肌苷的给药剂量为0.19mg/kg/min，特别剂量为0.38mg/kg/min，结果表明AICA肌苷的特定治疗剂量为0.1mg/kg/min。
结论
本领域内的普通技术人员从上述实施例的数据即可看出，为防止血流下降而导致组织损伤所采用的AICA肌苷给药剂量是安全和有效的。若按此处描述的剂量给药，临床上将避免出现高尿酸血症和/或结晶尿，并且具有持续作用。
实施例2
AICA肌苷对经受冠状动脉旁路搭桥术(CABG)患者的影响：3期临床试验
与实施例1所述的试验相似，进行下述试验用于评价AICA肌苷给药对于接受CABG手术患者的影响，测定AICA肌苷的有效剂量和浓度。申请人发现了AICA肌苷与安慰剂相比可防止不良临床后果出 现的有效浓度和剂量，例如不良心血管事件的发生，包括心肌梗塞和心源性死亡。申请人还发现了AICA肌苷与安慰剂相比可有效防止不良脑血管事件的发生，例如脑血管意外。申请人还发现了AICA肌苷可有效减少合并不良心血管和脑血管事件发生率的浓度和剂量。AICA肌苷的这个浓度和剂量还被认为可有效防止或减少充血性心力衰竭和致死性心律失常的发生率。
本实施例2中所描述的是一项多中心、安慰剂对照、双盲研究，对美国境内20个中心的近600名患者进行试验。患者接受的给药方案与实施例1研究中描述的相同：安慰剂或是两个剂量的AICA肌苷(0.05或0.1mg/kg/min给药7小时)。在所有病例中，凡接受AICA肌苷处理的患者均以浓度为5μg/ml AICA肌苷的心脏停搏液进行给药。
实施例2描述的研究与实施例1的区别在于对患者的选择标准不同。实施例1描述的研究排除了被认为在CABG术中的手术和药物方面具有高风险的患者，即再次CABG患者、急诊和左心室功能减退的患者。在实施例2描述的研究中，所有经受CABG手术的患者均被认为适合纳入研究，除近期患有或正在发作心肌梗塞的患者而外，这样才能诊断出新的心肌梗塞。并且，实施例2中允许选择的心脏停搏液范围更为广泛，反映了使用典型的手术模式。
下表12描述了对心肌梗塞(按ECG和CK-MB水平定义，即透壁性MI)、脑血管意外、心源性死亡、充血性心力衰竭和致死性心律不齐发生率的统计学分析。与实施例1相同，AICA肌苷低剂量为0.05mg/kg/min，高剂量为0.1mg/kg/min。
表12
Figure 2006800187562A00800991
*无统计学显著差异
表12所列MI数据反映的是同时依照ECG和CK-MB的诊断结果。即单单表现ECG指征或CK-MB指征的MI患者(但不同满足)被排除在外。在ECG试验中出现新Q波(明尼苏达编码1)诊断为MI。CK-MB中如下列标准至少满足一个即诊断为MI：
1.术后任何时间CK-MB浓度升至≥100ng/ml，而此前或其后CK-MB样本≥该峰值的50％；
2.术后12小时以后任何时间CK-MB浓度升至≥70ng/ml，而此前或其后CK-MB样本≥该峰值的50％；或
3.术后超过24小时出现新的CK-MB释放增加，达到峰值≥12ng/ml，而该峰值前后的另一测量值至少为10ng/ml。如果CK-MB水平之前有过升高，则在第二次升高出现之前其水平必须降至10ng/ml以下。
脑血管意外(CVA)通过持续24小时以上的明显神经缺欠的迹象和/或症状进行确诊。如果局部神经损伤持续超过24小时，即认为CVAs为研究终点。非局部损伤的患者，仅仅在神经会诊医师诊断为CVA或是CT或MRI扫描报告有新的脑梗塞或出血现象的情况下作为研究终点。
心源性死亡定义为患者由于原发的心脏诱因导致死亡，例如心肌梗塞、心律不齐或心室功能紊乱。所有死亡病例均由3名对药物处理组信息不知情的心脏病专家组成的小组进行确认。
充血性心力衰竭(CHF)通过以下任一项进行诊断：(1)左心室功能严重减退，需要使用主动脉内气囊搏动或左心室辅助设备获得CI＜1.5l/min/m2；(2)心源性休克伴随CI＜1.5l/min/m2和PCWP＞20cm超过1小时。
致死性心律失常通过以下任一项进行诊断：(1)心室心律失常需要心脏复律；或(2)心律失常出院时需植入起搏器。
表12中的组合后果结果代表下述不良心血管事件的发生率：合并MI、CVA、心源性死亡、CHF和致死性心律失常。尽管未达到统计学上的显著性功效，但在接受低剂量AICA肌苷的患者中具有不良事件发生率降低的趋势。因此，表12中的p值反映的是高剂量(0.1mg/kg/min)与安慰剂之间的差异。
表12显示高剂量组与安慰剂组相比(5.3％比13％)并发症发生率下降61％，p＜0.05。
数据显示高剂量组与安慰剂组相比(1.5％比4.7％)MI发生率下降68％，p＜0.05，高剂量组比安慰剂组(0.5％比4.2％)的脑血管意外发生率下降68％(p＜0.05)。结果还显示高剂量组与安慰剂组相比(0比0.4％)心源性死亡具有明显降低趋势，但p值未达显著性差异。
对于充血性心力衰竭和致死性心律失常的不良后果，高剂量组相比安慰剂组也表现出下降趋势(CHF：2.9％比3.8％；心律失常：1.4％比1.9％)。
高剂量组总死亡发生率低于安慰剂组(高剂量组0.5％比安慰剂 组3.3％)。ECG或CK-MB诊断的心肌梗塞发生率也是高剂量组低于安慰剂组(高剂量组20.8％比安慰剂组24.1％)。
研究中所有患者均予监测尿酸浓度。尽管药物治疗患者的尿酸浓度具有明确的剂量依赖性升高，但总体上血浆尿酸浓度维持或接近于正常范围，临床未见明显结晶尿(数据未列出)。
下表13列出了根据不同血浆AICA肌苷水平所得的心肌梗塞及组合临床后果(MI，CVA，心源性死亡、CHF和致死性心律失常)发生率。从这些数据显而易见，最有效的血浆AICA肌苷水平范围是3-6μg/ml。表13的数据反映的是同时符合ECG和CK-MB的诊断结果(如表12所述)。
表13
Figure 2006800187562A00801011
其他实施方式
其他实施方式包括在下述权利要求中。在一个优选实施方式中，AICA肌苷(或前体药)被冻干以避免各种污染。也可以采用前体药，即当药物进入人体后可被代谢为AICA肌苷的活性形式。AICA核苷前体药混合物包括经修饰的AICA肌苷，可含有部分糖基化AICA和 至少一种与糖基化AICA相同重量的烃氧羰基或烃羰基化产物。这种AICA肌苷前体药通常表现一项或多项下列改进处优于AICA肌苷，包括：(1)更强的腺苷释放作用；(2)半衰期延长；(3)大脑穿透性增加；(4)口服生物利用度增加；(5)心肌靶向性加强；(6)在某些情况下，有效性增加超过AICA肌苷本身。
AICA肌苷及其前体药(“AICA肌苷混合物”)可以采用适合药理作用的缓冲液进行配制并按任意常规方式给药。为向患者施用AICA肌苷混合物，需要预先确定给药途径为静脉内、冠状动脉内或动脉内输注、直接肌肉注射、皮下注射、口服、局部皮肤或黏膜给药、直肠给药或是吸入。AICA肌苷混合物还可给药至患者的体外血液中，例如，利用心肺机或透析仪。化合物的药理作用均为大家所熟知。
优选地，AICA肌苷混合物进行预防给药。若该混合物在缺血事件之前就存在，则ATP可直接分解为更多的腺苷而非肌苷，由此防止组织损伤。如果药物给予患者后抵达缺血区域或是在引起缺血的事件发生之后给药，则其促进该部位ATP直接转换为腺苷的能力将降低，因为靶标ATP池会相对快速的耗竭掉。若药物作为预防用药，还有可能尽早减缓破坏过程，阻止伤害事件或任何持续性损伤。
还有其他因素也使在缺血事件之前和/或当中给药变得重要。如果在梗塞之后给药，由于局部血流很少甚至没有，而导致药物到达相关组织的可能性降低，除非给缺血区域进行妥当的再灌注，诸如施用tPA、进行血管成形术或搭桥手术。还有人认为如AICA肌苷可代谢为AICA核苷酸，也是该分子的一种活性形式。该代谢作用是一种需要利用ATP的耗能反应。如果由于高代谢活性和/或净ATP降解增加而致ATP缺乏，则AICA肌苷不能转化为这种活性形式。
实施例1
离体心脏的功能恢复的改善
在离体大鼠心脏模型中观察一系列优选的AICA肌苷类似物改善缺血后心脏功能的能力。
根据Langendorff方法，离体大鼠心脏经升主动脉插管并连接到灌注装置上。以100cm H2O的恒压向心脏灌注37℃改良Krebs-Henseleit缓冲液(pH 7.4)。作为心脏功能的测量值，持续监测左心室形成压(LVDP)。在心脏经过30min的平衡时间后，通过降低压力至10cm H2O维持30min使心脏流量减少，即造成缺血。接着通过将压力恢复到初始水平(100cm H2O)而恢复流动，再继续30min。为了进行比较，将各种AICA核苷类似物及AICA核苷本身加入灌流缓冲液中，使终浓度为5μM或20μM。结果见表I。
表I
Figure 2006800187562A00801031
1NS＝无显著性差异
2已知化合物
实施例2
离体回肠收缩的抑制
比较几种优选AICA核苷类似物抑制离体回肠肌肉刺激性收缩的能力。
从豚鼠的回肠上分离一段(约1cm)纵肌，连接到等张力传感器上，悬浮在含有用95％O2/5％CO2充气的Krebs-Ringer溶液的带套组织浴槽中。采用并联铂电极输送电流，每次间隔1分钟，电压需足以诱发最大收缩量的90％。受试化合物加入组织浴中，测定50％抑制收缩时的浓度(IC50)。结果见表II。
表II
Figure 2006800187562A00801041
实施例3
AICA核苷类似物(系列I)在大鼠心脏缺血模型中的作用
测定系列I(N-4)取代的AICA核苷类似物增加缺血大鼠心脏中组织腺苷水平的能力。
向雄性大鼠腹腔注射AICA核苷类似物、AICA核苷或作为对照 的生理盐水。60分钟后，取出心脏置37℃继续孵育60分钟。制备组织提取物并采用高效液相色谱(HPLC)测定腺苷。该优选系列的AICA核苷类似物增加组织腺苷水平的能力与AICA核苷的对比见表III。从该优选系列中选择的一个AICA核苷类似物(化合物10)对组织腺苷水平的剂量依赖作用与AICA核苷(化合物1)的更详细比较见图19。
表III
Figure 2006800187562A00801051
实施例4
在细胞培养中AICA核苷类似物(系列I)对腺苷利用的抑制作用
采用培养的冠状内皮细胞比较系列I(N-4)取代的AICA核苷类似物对腺苷利用的影响。在该检测中，内皮细胞与5μM或50μM受试化合物以及1μM3H-腺苷共孵育15分钟。在采用薄层色谱(TLC)分离后利用闪烁计数法测定细胞外腺苷浓度，以确定对腺苷利用的抑制作用。评价结果见表IV。
表IV
Figure 2006800187562A00801061
2已知化合物
实施例5
AICA核苷类似物(系列I)在3H-NBTI结合测定中的作用
比较选择的系列I(N-4)取代的AICA核苷类似物影响3H-硝基苄基硫代肌苷(NBTI)与细胞膜结合的能力。浓度逐渐升高的受试化合物与0.5mg神经元膜蛋白及0.5nM溶于Tris缓冲液(pH7.4)的 3H-NBTI室温孵育30分钟。猝灭该试验，并采用快速过滤收集细胞膜。将过滤产物溶解后采用闪烁计数法测定放射性。每个受试化合物导致结合的3H-NBTI被50％置换时的浓度，即ED50，详见表V。
表V
Figure 2006800187562A00801071
实施例5A
WI-L2淋巴母细胞中的腺苷转运的抑制
采用下述方法测定本发明中的一种AICA核苷类似物对WI-L2淋巴母细胞腺苷转运的抑制作用。
将200μl WI-L2淋巴母细胞悬液(0.5×106)在100μl硅油∶矿物油化合物(体积比8∶2)上分层。将浓度分别为5.0、50.0、500.0μM的化合物53(1-468)加入细胞中，所得混合物孵育1分钟或1小时。接着，向细胞悬液中加入5μl放射性标记的腺苷(2.5μCi，起始浓度为1μM)并孵育10秒。细胞以13000rpm离心15秒，得到细胞沉淀用于测定放射性。
将200μl WI-L2淋巴母细胞悬液(0.5×106)在100μl硅油∶矿物油化合物(体积比8∶2)上分层。将浓度分别为5.0、50.0、500.0μM的化合物53(1-468)加入细胞中，所得混合物孵育1分钟或1小时。接着，向细胞悬液中加入5μl放射性标记的腺苷(2.5μCi，起始浓度为1μM)并孵育10秒。细胞以13000rpm离心15秒，得到细胞沉淀用于测定放射性。
图22显示与化合物53(1-468)预孵育1分钟对腺苷转运的抑制作用，图23显示与化合物53(1-468)预孵育1小时对腺苷转运的抑制作用。
实施例6
AICA核苷类似物(系列III)对分离细胞腺苷释放的影响
比较系列II(C-2)取代的AICA核苷类似物与AICA核苷本身影响冠状内皮细胞腺苷释放的能力。在本实验模型中，将细胞用50μM受试化合物进行处理，37℃孵育16小时。接着用磷酸缓冲液洗涤细胞，重悬于无蔗糖(抑制糖酵解)、含50μM抗霉素A(抑制氧化磷酸化)和20μM脱氧柯福霉素(抑制腺苷脱氨酶的腺苷利用)的标准培养基中。该处理方法通过诱导净ATP分解而模拟缺血状况。接着将培养基进行HPLC检测。腺苷值见表VI。
表VI
Figure 2006800187562A00801081
实施例7
AICA核苷类似物(系列II)对腺苷激酶活性的影响
酶活性的抑制作用采用0.1ml检测混合液进行测定，其中含有50mM Tris-马来酸盐pH7.0、0.1％(w/v)BSA、1mM ATP、1mMMgCl2、0.5μM14C-腺苷(500mCi/mmol)和0.1μg纯化的猪心脏腺苷激酶。不同浓度的受试化合物在检测混合液中37℃孵育20分钟。从每个反应混合液中吸出20μl点样在2cm2 Whatman DE81滤纸片上。滤纸用1mM甲酸铵、去离子水及95％乙醇依次洗涤以去除14C- 腺苷。干燥滤纸，采用闪烁计数法测定14C-AMP。由14C-AMP生成量确定酶活性。
结果见表VII。
表VII
Figure 2006800187562A00801091
实施例8
AICA核苷类似物(系列IV)对分离细胞中腺苷利用的影响
检测系列IV2’-取代的AICA核苷类似物抑制人B淋巴母细胞中腺苷利用的能力。在本试验中，细胞与5.0μM、50.0μM或500.0μM的受试化合物及3H-腺苷(1μM)预先孵育10分钟。经TLC分离核苷后采用闪烁计数法测定细胞外3H-腺苷浓度，由该浓度确定腺苷利用的抑制情况。同时还测定次黄嘌呤和肌苷水平。AICA核苷的2’-O-甲基(化合物20)、2’-O-乙基(化合物34)和2’-O-正-丁基(化合物32)类似物与AICA核苷的对比结果见图20A。
AICA核苷类似物对次黄嘌呤和肌苷水平的影响(分别见图20B和20C)反映了其对腺苷水平的作用，提示药物对由腺苷脱氨酶抑制介导的腺苷利用的影响增大。对类似物抑制分离的腺苷脱氨酶的能力的直接测定也支持该解释。
腺苷脱氨酶活性的抑制采用分光光度法进行测定，使用的1ml检测混合液含有50mM磷酸钾pH7.0、1mM α-酮戊二酸、15单位谷氨酸脱氢酶、0.125mM NADH、80μM腺苷和0.002单位小牛肠粘膜腺苷脱氨酶。不同浓度的受试化合物在检测混合液中37℃孵育10分钟。根据340nm吸光度的变化持续监测反应中NADH的氧化。
结果见表VIII。
表VIII
Figure 2006800187562A00801101
实施例9
AICA核苷类似物对人全血中血小板聚集的影响
观察优选的AICA核苷类似物抑制人全血血小板聚集的能力。全血取自健康供者，加入0.1体积的枸橼酸钠以防止凝血。血小板聚集采用全血聚集测量计依靠阻抗技术测定。受试化合物在全血中37℃孵育10分钟，在引发聚集前5分钟加入10gM腺苷。通过加入可使未处理对照样本完全聚集的最小浓度的ADP(6-25μM)引发聚集。
结果见表IX。
表IX
Figure 2006800187562A00801102
实施例10
AICA核苷类似物的口服生物利用度增加和半衰期延长
在禁食的成年比格犬中检测部分优选AICA核苷类似物的口服生物利用度的增加。AICA核苷类似物以10mg/kg经头下肢静脉推注，或作为20mg/kg溶液经胃管给药。24小时内以选定时间间隔收集肝素化血液和尿。将每个样本冷却、4℃离心后冻存以备HPLC测定。
结果见表X。
表X
Figure 2006800187562A00801111
实施例11
化合物53(1-468)在稳定型心绞痛临床前模型中的有效性
分析AICA核苷类似物(1-468)防止与需求诱发的缺血反复发作相关的累积性心功能不全的能力。用麻醉的雄性狗检测在左前降动脉狭窄中右房起搏时的局部心肌壁增厚(Young和Mullane Am.J.Physiol.待出版(1991))。表XIA比较了在治疗组动物与生理盐水处理的对照组动物中6次反复起搏对壁增厚和动脉压的影响，所述治疗组动物在第一次起搏后以50μg/kg/min持续静脉内输注受试化合物。表XIB列出了起搏后间期心率和平均动脉压的变化，表明在无明显血液动力学影响的情况下对壁增厚具有保护作用。
表XIA
Figure 2006800187562A00801121
*P＜0.05，与生理盐水相比
表XIB
实施例12
AICA核苷类似物(系列I)在实验性中风模型中的作用
评价系列I(N-4)取代的AICA核苷类似物在沙鼠中风模型中影响海马锥体细胞存活的能力。在该实验中，雄性蒙古沙鼠采用在N2O:O2中的2-3％三氟乙烷麻醉后暴露颈总动脉。通过双侧闭合颈总动脉5分钟诱导缺血。缺血损伤7天后，取出大脑进行组织学分析。图21所示的数据显示的是沙鼠经500mg/kgAICA核苷类似物(化合物10(1-186)或11(1-226))或作为对照的生理盐水预处理后的效果。
实施例A
5-氨基-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合 物2(1-111))的制备
AICA核苷(50g)溶于吡啶(450ml)，冰浴冷却。加入醋酸酐(80ml)后去除冰浴。将反应混合物搅拌3小时。行硅胶TLC，以9∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱，显示反应结束。加入甲醇(5ml)中和未反应的醋酸酐。在高真空下蒸发去除溶剂(温度低于40℃)。残余物与二甲基甲酰胺共蒸发(3×150ml)。残余物利用晶种从乙醇中结晶。得到白色固体的三乙酸盐产物62g；熔点128℃-129℃。
NMR(DMSO-D6)δppm 2.05-2.15(2s，9H，--CH3)，4.3(br.s，3H，4’-CH，5’-CH2)，5.3(m，1H，3’-CH)5.55(t，1H，2’-CH)，5.87(d，1H，1’-CH)，5.9(s，2H，5-NH2)，6.7-6.9(br.d，2H，4-NH2)，7.4(s，1H，2-CH)。
该化合物的制备方法在授予K.Suzuki和I.Kumoshiro的美国专利No.3450693(1969)中也有描述；还可参见Chem.Abs.71：816982(1969)。
实施例B
N5-二甲基氨基亚甲基氨基-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺(化合物7(1-164))的制备
2’，3’，5’-三-O-乙酰基AICA核苷(10g)溶于二甲基甲酰胺(30ml)和二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(20ml)中。反应混合物搅拌过夜。行硅胶TLC，以9∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱，无起始物存在即表示反应结束。在高真空下蒸发去除溶剂(温度低于40℃)。残余物溶于环己胺并搅拌过夜。通过减压蒸发去除溶剂，残余物从乙醇中结晶。得到白色产物4.6g，熔点173℃-175℃。
NMR(MeOH-d4)，δppm 3.0-3.05(2s，6H，N(CH3)2)，3.75(m，2H，5’-CH2)，4.0(g，1H，4’-CH)，4.2(t，1H，3’-CH)，4.35(t，1H，2’-CH)，5.8(d，1H，1’-CH)，7.7(s，1H，2-CH)，8.25(s，1H，5-N＝CH--N)。
实施例C
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-(环戊基)甲酰胺(化合物10 (1-186))的制备
根据P.O.Srivastava，R.W.Mancuso，R.J.Rosseau和R.K.Robins，J.Med.Chem.17(11)，1207(1977)所述步骤合成N-琥珀酰亚胺基-5-氨基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(“中间产物4”)。中间产物4(3.9g)溶于二氯甲烷(60ml)。加入环戊胺(0.8ml)并搅拌过夜。行硅胶TLC，以9∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱，无起始物存在即表示反应结束。溶剂混合物用5％盐酸溶液(100ml)饱和碳酸钠溶液(100ml)和水(200ml)提取。有机层在硫酸钠上干燥，并减压蒸发得到3.1g黄色泡沫状物。为去除乙酰基，将3.1g泡沫状物溶于甲醇(70ml)并用冰浴冷却。加入氢氧化铵(60ml)并去掉冰浴。搅拌21/2小时后，行硅胶TLC，以9∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱，显示不含任何起始物质。减压蒸发溶剂得到残余物，过硅胶柱纯化，以9∶1和6∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱。合并TLC类似的级分，减压蒸发得到1.1g白色泡沫状物，从甲醇-乙酸乙酯中结晶，熔点158℃-160℃。
NMR(DMSO-d6)，δppm1.4-1.9(m，8H，--CH2--CH2--)，3.6(m，2H，5’-CH2)，3.9(d，1H，NH--CH)，4.0-4.35(m，3H，2’，3’，4’-CH)，5.15-5.4(m，3H，2’，3’，5’-OH)，5.45(d，1H，1’-CH)，5.9(br.s，2H，--NH2)，7.1(d，1H，--NH--)，7.3(s，1H，2--CH)。
实施例D
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-(环戊基)甲酰胺(化合物12(1-232))的制备
本化合物的制备按实施例C描述的步骤进行，不同之处是将环丙胺(0.5ml)替换为环戊胺(0.8ml)。从6.2g中间产物4(琥珀酸酯)起始反应最后得到产物2.3g。
NMR(DMSO-d6)δppm 0.5(m，4H，CH2--CH2)2.7(m，1H，N--CH)，3.6(m，2H，5’-CH2)，3.8-4.3(m，3H，2’，3’，4’-CH)，5.15-5.4(m，3H，2’，3’，5’-OH)，5.45(d，1H，1’-CH)，5.9(s，2H，NH2)，7.2(s，1H，2-CH) 7.4(d，1H，4-NH)。
实施例E
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-(苄基)甲酰胺(化合物11(1-226))的制备
肌苷(10g)混悬于二甲基甲酰胺(100ml)和二甲基甲酰胺二苄基乙缩醛(25ml)中。所得混合物70℃搅拌过夜。行硅胶TLC，以6∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱，显示反应结束。溶剂经减压蒸发去除。剩余物溶于氢氧化铵(130ml)。混合物搅拌过夜，再减压蒸发。向残余物加入乙醇(80ml)并加热所得混合物。过滤后收集固体物质。1-苄基肌苷的产量为10.5g，通过NMR表征。
中间产物1-苄基腺苷(10.5g)溶于乙醇(1.0L)和3M氢氧化钠溶液(140ml)中。该溶液回流3小时。硅胶TLC显示反应结束。溶剂经减压蒸发去除。残余物过硅胶柱层析，以6∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱。合并TLC相似的级分，浓缩至有晶体析出。得到7.4 g上述化合物，其为白色固体，熔点178℃-179℃。
NMR(DMSO-d6)δppm 3.6(m，2H，5’-CH2)3.85-4.35(m，3H，2’，1’，3’，4’-CH)，4.4(d，2H，N--CH2)，5.15-5.4(m，3H，2’，3’，5’-OH)，5.9(br.s，2H，5-NH2)，7.2-7.4(m，6H，2-CH，C6H5)，7.95(t，1H，NH)。还可参见E.Shaw，J.A.C.S.80：3899(1958)。
实施例F
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-羧酸甲酯(化合物14(1-260))的制备
5-氨基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-羧酸(3.85g，10mmol)溶于40ml四氢呋喃中并冷却至0℃。加入过量的重氮甲烷的乙醚溶液后加热到室温。加入乙酸破坏过量的重氮甲烷，所得混合物蒸发干燥。残余物采用硅胶色谱纯化，以7∶3的乙酸乙酯∶己烷洗脱。采用上述系统进行硅胶薄层层析判断主要产物级分，合并， 蒸发，得到1.2g白色泡沫状物。将该产物溶于40ml含20mg甲醇钠的甲醇溶液中，搅拌30分钟。行硅胶TLC，以6∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱，显示无残余起始物，出现一个移动较慢的新产物点。采用Dowex 50(H+)树脂中和反应，蒸发后得到0.64g所需的产物，其为白色泡沫状。IR(KBr)：1725cm-1(--CO--OCH3)。
NMR(DMSO-d6)：δppm，3.65(s，3H，CH3)，3.8(m，3H，4’-CH和5’-CH2)，4.1(m，1H，3’-CH)，4.2(m，1H，2’-CH)，5.5(d，1H，1’-CH)，8.0(s，1H，2-CH)。
实施例G
5-氨基-5’-氨磺酰基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-甲酰胺(化合物15(1-261))的制备
A.5-氨基-2’，3’-异亚丙基-1-β-呋喃核糖基-5-氨磺酰基咪唑-4-甲酰胺的制备
在10min内向2’，3’-异亚丙基-AICA核苷(2.98g，10mmol)的无水N，N-二甲基甲酰胺(25ml)溶液中加入氢化钠(300mg，80％，分散于油中)。待氢气释放停止，将烧瓶浸入冰浴中并搅拌30min。缓慢加入氨磺酰氯(1.3g，11mmol)的无水四氢呋喃(20ml)溶液。反应混合物的TLC(硅胶，溶剂为9∶1的二氯甲烷∶甲醇)结果显示存在一些起始物。再加入200mg氨磺酰氯的四氢呋喃(10ml)溶液，所得混合液搅拌1小时。加入甲醇(1ml)后，高真空蒸发溶剂。残余物进行硅胶层析，用二氯甲烷∶甲醇(9∶1)混合液洗脱。收集几个级分。将显示相同TLC模式的级分合并一起，蒸发后得到玻璃状产物。产量为1.5g。
1H-NMR(DMSO-d6)δppm，1.25和1.55(2s，6H，C(CH3)2)，4.1(d，2H，5’-CH2)4.25-4.35(m，1H，4’-CH)，4.8-4.9和5.1-5.2(2m，2H，2’-CH和3’-CH)，5.8(d，1H，1’-CH)，5.9(s，2H，5-NH2)，6.65-6.95(br.d，2H，CONH2)，7.35(s，1H，2-CH)，7.7(s，2H，SO2NH)。NMR数据符合5-氨基-2’，3’-异亚丙基-1-β-呋喃核糖基-5’-氨磺酰基咪唑-4-甲酰胺的结构。 该中间产物可直接用于下述脱保护基步骤而不需进一步纯化或分离。
B.5-氨基-5’-氨磺酰基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-甲酰胺(化合物15(1-261))的制备
前面制备的化合物溶于60％甲酸(20ml)中，所得溶液室温搅拌48小时。高真空蒸发去除溶剂。残余物与水共蒸发。产物从乙醇水溶液中结晶。得到1.0g上述产物，熔点为174℃-175℃。
1H-NMR(DMSO-d6)δppm 3.9-4.3(m，5H，2’-CH，3’-CH，4’-CH和5’-CH2)，5.4和5.5(2d，2H，2’-OH和3’-OH)，5.5(d，1H，1’-CH)，5.8(br.s，2H，5-NH2)，6.6-6.9(br.d，2H，CONH2)，7.3(s，1H，2-CH)和7.6(s，2H，SO2NH2)。
实施例H
5’-氨基-5’-脱氧-AICA-核苷(化合物21(1-227))的制备
A.5’-叠氮基-5’-脱氧-AICA-核苷的制备
5’-脱氧-5’-吲哚基-2’，3’-异亚丙基-AICA核苷(8.0g)(参考文献：P.C.Srivastava，A.R.Newman，T.R.Mathews和R.K.Robins，J.Med.Chem.181237(1975))、叠氮锂(4.0g)和N，N-二甲基亚砜的混合物加热至80℃-90℃5小时。挥发干燥后得到残余物进行硅胶柱色谱分离，二氯甲烷洗脱。将快速移动产物组分合并，蒸发得到7.2g产物，加入60％甲酸(100ml)室温反应48小时进行脱保护基。过量甲酸在高真空下蒸发去除。残余物再与水(3×25ml)共蒸发得到半固体产物。该产物经乙醇水溶液结晶。得到5.0g前已鉴定的产物，熔点138℃-139℃。1H-NMR(DMSO-d6)δppm 3.5 5(d，2H，5’-CH2)，3.95和5.5(br.s，2H，3’-CH和4’-CH)，4.2-4.4(m，1H，2’-CH)，5.35和5.50(2d，2H，2’-OH和3’-OH)，5.55(d，1H，1’-CH)，5.75-5.9(br.s，2H，，5-NH2)，6.6-6.9(br.d，2H，CONH2)和7.35(s，1H，2-CH)。IR(KBr)cm-1：3400-3000(br.NH2，CONH2，OH，etc)，2150(S，N3)1640(CONH2)。
B.5’-氨基5’-脱氧-AICA-核苷的制备
将5’-叠氮基-5’-脱氧-AICA核苷(800mg)(步骤(A)所得产物) 的甲醇(40ml)溶液在Parr装置中在40psi下用碳载钯(5％)(100mg)作为氢化催化剂氢化60min。反应混合物经celite垫过滤去除催化剂。澄清滤液蒸发至干燥。产物从煮沸的乙醇中结晶。得到650 mg上述产物，熔点为188℃-189℃。1H-NMR(D2O)δppm，2.7(d，2H，5’-CH2)，3.8-4.4(3m，3H，2’-CH，3’-CH和4’-CH)，5.4(d，1H，1’-CH)和7.3(s，1H，2-CH)。IR(KBr)cm-1：3500-3000(br.OH，NH2，CONH2，等)，1640-1645(br.s.CONH2)。
实施例I
5-氨基-1-(2-O-甲基-β-D-呋喃核糖基)-咪唑-4-甲酰胺(化合物20(1-188))和5-氨基-1-(3-O-甲基-β-D-呋喃核糖基)-咪唑-4-甲酰胺(化合物22(1-243))的制备
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺(5.2g，20mmol)溶于40ml热二甲基甲酰胺，用70ml含35mg氯化锡(II)二水合物的甲醇进行稀释。在45min内分次加入0.1mol重氮甲烷在200ml乙醚中的溶液。每次加液后，再加入20mg氯化锡(II)二水合物。所得混合物过滤后蒸发得到浆状物。将其溶于25ml甲醇，通过冷却得到结晶5-氨基-1-(2-O-甲基-β-D-呋喃核糖基)-咪唑-4-甲酰胺，过滤收集并干燥。产量1.2g，熔点114℃-117℃。1H NMR(DMSO-d6)(化合物20)：δppm 3.3(s，3H，CH3)，3.6(m，2H，5’-CH2)，3.9(m，1H，4’-CH)，4.1(m，1H，2’-CH)，4.2(m，1H，3’-CH)，5.2(d，1H，3’-OH)，5.3(t，1H，5’-OH)，5.6(d，1H，1’-CH)，6.0(br.s，2H，5-NH2)，6.7(br.d，2H，4-CONH2)，7.3(s，1H，2-CH)。
将上述结晶化后的上清液浓缩，上样到200ml硅胶柱上。用10∶1的二氯甲烷∶甲醇(1L)、8∶1的二氯甲烷∶甲醇(500ml)和5∶1的二氯甲烷∶甲醇(500ml)洗脱。5∶1洗脱液中含有主产物，蒸发后将残余物溶于10ml甲醇中。冷却后得到结晶产物，收集并干燥。产量为1.4克。通过NMR去耦和交换实验检测，显示产物为5-氨基-1-(3-O-甲基-β-D-呋喃核糖基)-咪唑-4-甲酰胺。1H NMR(DMSO-d6) (化合物18)：δppm：3.3(s，3H，CH3)，3.6(m，2H，5’-CH2)，3.7(m，1H，4’-CH)，4.0(m，1H，3’-CH)，4.4(m，1H，2’-CH)，5.3(t，1H，5’-OH)，5.4(2d，2H，2’-CH和1’-CH)，5.9(br.s，2H，5-NH2)，6.7(br.d，2H，CO--NH2)，7.7(s，1H，2-CH)。
实施例J
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-N-[(4-硝基苯基)甲基]甲酰胺(化合物23(1-343))的制备
将N-琥珀酰亚胺基-5-氨基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-羧酸酯3(0.5g)、4-硝基苯甲胺盐酸盐(210mg)和三乙胺(0.16ml)加入氯仿(30ml)中室温搅拌过夜。用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤该溶液，再经减压蒸发。得到黄色焦油状物经硅胶层析，以9∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱。通过TLC监测收集的级分。将相似的级分合并在一起，减压浓缩后得到黄色泡沫状物(0.38g)。将泡沫状物溶于甲醇(20ml)中，加入甲醇钠的甲醇溶液(0.3ml 0.25M溶液)。溶液在氩气氛下搅拌15min。TLC显示反应结束。用离子交换树脂将溶液中和为pH6。之后过滤树脂，在高真空下浓缩溶液，得到黄色泡沫状产物(0.23g)。3Srivastava，P.C.，J.Med.Chem.17：1207(1974)。
1H NMR(DMSO-d6)δppm，3.6(m，2H，5’-CH2)3.9-4.3(m，3H，2’-CH，3’-CH，4’-CH)，4.5(d，2H，--CH2--C6H4--NO2)，5.2-5.4(br.，3H，2’-OH，3’-OH，5’-OH)，5.5(d，1H，1’-CH)，6.10(br.s，2H，5-NH2)，7.3(s，1H，2-CH)，7.4-8.2(ABq，4H，--C6H4--NO2)，8.3(t，1H，4-CONH)。
实施例K
5-氨基-1-α-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-[(3-氯化苯基)甲基]甲酰胺(化合物24(1-354))的制备
本化合物按照实施例J中合成4-对-硝基苄基衍生物的步骤制备，把其中的4-硝基苄胺盐酸盐替换为2-氯化苄胺。1H NMR(DMSO-d6) δppm，3.6(m，2H，5’-CH2)，3.9-4.3(m，3H，2’-CH，3’-CH，4’-CH)，4.4(d，2H，--CH2--O--Cl)，5.1-5.4(br.，3H，2’-OH，3’-OH，5’-OH)，5.5(d，1H，1’-CH)，6.0(br.s，2H，5-NH2)，7.2-7.4(m，4H，--C6H4--Cl)，8.0(t，1H，4-CONH)。
实施例L
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-[(2，4-二氯苯基)甲基]甲酰胺(化合物25(1-360))的制备
本化合物按照实施例J中合成4-对-硝基苄基衍生物的步骤制备，把其中的4-硝基苄胺盐酸盐替换为2，4-二氯苄胺。1H NMR(DMSO-d6)，δppm，3.6(m，2H，5’-CH2)，3.9-4.3(m，3H，2’-CH，3’-CH，4’-CH)，4.4(d，2H，--CH2--C6H3--Cl2)，5.2-5.4(m.，3H，2’-OH，3’-OH，5’-OH)，5.5(d，1H，1’-CH)，6.0(br.s，2H，5-NH2)，7.2-7.6(m，3H，--C6H3--Cl2)，8.1(t，1H，4-CONH--)。
实施例M
5-氨基-2-硫代-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺(化合物27(1-395-0))的制备
将400mg 5-氨基-2-硫代-1-(2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-甲酰胺4加入10ml80％甲酸中。得到的混合物室温搅拌1小时。以4∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱的硅胶TLC显示起始物转化为一种主产物。将混合物蒸发干燥，再溶于5ml甲醇，过50ml硅胶柱。用二氯甲烷∶甲醇(5∶1)洗脱柱。收集经TLC鉴定的主要产物并蒸发干燥。残余物溶于3ml热甲醇中，冷却结晶。得到150mg上述产物，熔点205℃-208℃。4制备方法见T.Miyoshi，S.Suzaki，A.Yamazaki，Chem.Pharm.Bull.，24(9)：2089-2093(1976)。
1H NMR(DMSO-d6)，δppm，3.6(m，2H，5’-CH2)，3.8(m，1H，4’-CH)，4.1(m，1H，3’-CH)，4.5(m，1H，2’-CH)，5.1(d，1H，2’或3’-OH)，5.2(d，1H，2’或3’-OH)，5.7(t，1H，5’-OH)，6.3(d，1H，1’-CH)，6.4(br.s，2H， 5-NH2)，6.9(br.s，2H，4-CONH2)，11.1(br.s，1H，5’-SH-)。
实施例N
5-氨基-1-(5-氯-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物26(1-332))的制备
将AICA核苷(1.00g)、三苯基膦(3.05g)和四氯化碳(1.15ml)加入二甲基甲酰胺(38ml)中室温搅拌3小时。溶液用甲醇(15ml)稀释后，减压浓缩。所得黄色焦油状物经硅胶层析，以4∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱。将相近的级分合并，经减压浓缩后得到紫色泡沫状物。1H NMR确定存在三苯基膦氧化物，需再次进行上述层析步骤。产物为0.43g白色泡沫状物。
1H NMR(DMSO-d6)，δppm 3.7-3.9(m，2H，5’CH2)，4.0-4.4(m，3H，2’CH，3’CH，4’-CH)，5.4-5.5(m，2H，2’OH，3’-OH)，5.6(d，1H，1’-CH)，5.9(br.s，2H，5-NH2)，6.7-6.9(br.d，2H，4-CONH2)，7.3(s，1H，2-CH)。
实施例O
5-氨基-1-(2-O-乙基-β-D-呋喃核糖基)-4-咪唑甲酰胺(化合物34(1-250))和5-氨基-1-(3-O-乙基-β-D-呋喃核糖基)-4-咪唑甲酰胺(化合物31(1-251))的制备
向8g氢氧化钾、9ml水和60ml乙醚的混合液中缓慢加入7g(44mmol)1-乙基-3-硝基-1-亚硝基胍，随后蒸馏，制备约30mmol重氮乙烷在40ml乙醚中的溶液。再将所得溶液缓慢加入3.2g(12mmol)5氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺(AICA核苷)溶于含50mg氯化锡(II)二水合物的35ml二甲基甲酰胺的溶液中。加液过程中还需加入约20ml甲醇以保持可溶性。将反应物过滤以去除微量沉淀物，蒸发得到黄色浆状物。行硅胶薄层层析，用二氯甲烷/甲醇(3∶1)洗脱，显示有一个移动速度快于AICA核苷的主产物点。浆状物经硅胶层析，用二氯甲烷/甲醇(8∶1)收集根据TLC确定的主产物。将适当的级分蒸发得到白色泡沫状物。将其再溶于7ml甲醇中。冷 却至4℃，混合物结晶得到160mg产物，经NMR去耦和交换实验确定为5-氨基-1-(2-O-乙基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物34(1-250))。
1H NMR(DMSO-d6)(化合物34)δppm，1.05(t，3H，CH3)，3.3-3.6(m，4H，2’-OCH2--，5’-CH2)，3.9(m，1H，4’-CH)，4.1-4.3(m，2H，2’-CH，3’-CH)，5.15(d，1H，3-OH)，5.25(t，1H，5’-OH)，5.55(d，1H，1’-CH)，6.0(br.s，2H，5-NH2)，6.6-6.9(br.d，2H，4-CONH2)，7.3(s，1H，7-CH)。
上述结晶步骤得到的上清液冷却至-12℃过夜，得到第二批晶体0.58g，NMR去耦和交换实验显示主要为5-氨基-1-(3-O-乙基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物31(1-251))。
1H NMR(DMSO-d6)(化合物31)：δppm，1.1(t，3H，CH3)，3.4-3.7(m，4H，3’-OCH2--，5’-CH2)，3.85(m，1H，4’-CH)，4.0(m，1H，3’-CH)，4.4(q，1H，2-CH)，5.25(t，1H，5’-OH)，5.35(d，1H，2’-OH)，5.45(d，1H，1’-CH)，5.9(br.s，2H，5-NH2)，6.6-6.9(br.d，2H，4-CONH2)，7.3(s，1H，1-CH)。主要杂质经鉴定为2’-O-乙基异构体。
实施例P
5-氨基-1-(2-O-正-丁基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺和5-氨基-1-(3-O-正-丁基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物32(1-262)和33(1-263))的制备
将5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺(2.50g，10.0mmol)和氯化锡(II)水合物(35mg)溶于二甲基甲酰胺(40ml)和甲醇(30ml)中。向其中分批加入0.1ml叠氮丁烷5的150ml乙醚溶液。加液中间，加入更多氯化锡(II)水合物(35mg)。根据需要加入甲醇以确保起始物始终处于溶液中。混合物搅拌1小时，经减压浓缩后得到油状物。1H NMR检测油状物大部分为N-丁乙基氨基甲酸酯。油状物与己烷一起搅拌并倾析，以去除N-丁乙基氨基甲酸酯。所得焦油状物经硅胶层析，以6∶1的二氯甲烷∶甲醇作为洗脱溶剂。合并适当级分，减压浓缩，得到粉红色泡沫状物。1H NMR分析显示为2’ 和3’丁基醚的混合物。HPLC分析显示为56∶28的混合物。该固体溶于异丙醇(2ml)中并冷却。将得到的固体过滤并干燥，得到63mg。HPLC分析显示为77∶18的混合物。1H NMR去耦和交换实验显示主产物为2’-O-正-丁醚。
5重氮丁烷的制备方法是，将16.5gN-亚硝基-N-正-丁基甲烷[Wilds，A.L.和Meeder，A.L.，SOC13(1948)]在乙基醚(100ml)中用氢氧化钾(55g)的水(60ml)溶液处理。含醚重氮丁烷不需蒸馏直接使用。
1H NMR(DMSO-d6)(化合物32)：δppm，0.8-1.5(m，7H，--CH2CH2CH3)，3.3-4.2(m，7H，2’-OCH2--，2’-CH，3’-CH，4’-CH，5’-CH2)，5.1(d，1H，3’-OH)，5.3(t，1H，5’-OH)，5.6(d，1H，1’-CH)，6.0(br.s，2H，5-NH2)，7.6-7.8(br.d，2N，4-CONH2)，7.3(s，1H，2-CH)。
上述结晶步骤产生的上清液经减压浓缩，得到125mg粉红色泡沫状物。HPLC分析显示为14/71的混合物。1H NMR去耦和交换实验显示主产物为3’-O-正-丁醚。
1H NMR(DMSO-d6)(化合物33)：δppm，0.8-1.6(m，7H，--CH2CH2CH3)，3.4-4.4(m，7H，3’-OCH2--，2’-CH，3’-CH，4’-CH，5’-CH2)，5.2(t，1H，5’-OH)，5.3(d，1H，2’-OH)，5.4(d，1H，1’-CH)，5.9(br.s，2H，5-NH2)，6.6-6.8(br.d，2N，4-CONH2)，7.3(s，1N，7-CH)。
实施例O
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-[(3-硝基苯基)甲基]甲酰胺(化合物28(1-348))的制备
本化合物按照实施例J中合成4-对-硝基苄基衍生物的步骤制备，把其中的4-硝基苄胺盐酸盐替换为3-硝基苄胺。
1H NMR(DMSO-d6)δppm，3.6(m，2H，5’-CH2)，3.9-4.3(m，3H，2’-CH，3’-CH，4’-CH)，4.4(d，2H，--CH2--NO2)，5.2-5.4(br.，3H，2’-OH，3’-OH，5’-O)，5.5(d，1H，1’-CH)，6.0(br.s，2H，5-NH2)，7.4(s，1H，7-CH)，7.6-8.2(m，4H，--C6H4Cl)，8.3(t，1H，4-CONH)。
实施例R
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺(化合物29(1-349))的制备
本化合物按照实施例J中合成4-对-硝基苄基衍生物的步骤制备，把其中的4-硝基苄胺盐酸盐替换为4-氯苯酰胺。
1H NMR(DMSO-d6)δppm，3.6(m，2H，5’-CH2)，3.9-4.3(m，3H，2’-CH，3’-CH，4’-CH)，4.4(d，2H，--CH2--C6H4--Cl)，5.2-5.4(br.，3H，2’-OH，3’-OH，5’-OH)，5.15(d，1H，1’-CH)，5.9(br.s，2H，5-NH2)，7.3-7.4(m，5N，--C6H4C1)，7-CH)，8.1(t，1H，4-CONH)。
实施例S
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-[(4-甲基苯基)甲基]甲酰胺(化合物30(1-388))的制备
本化合物按照实施例J中合成4-对-硝基苄基衍生物的步骤制备，把其中的4-硝基苄胺盐酸盐替换为4-甲基苄胺。
1H NMR(DMSO-d6)δppm，2.2(s，3H，--C6H4--CH3)，3.6(m，2H，5’-CH2)，3.9-4.3(m，5H，2’-CH，3’-CH，4’-CH，--CH2-- --C6H4--CH3)，5.2-5.4(br.，3H，2’-OH，3’-OH，5’-OH)，5.5(d，1H，1’-CH)，5.9(br.s，2H，5-NH2)，7.1-7.2(m，4H，--C6H4--CH3)，7.3(s，1H，7-CH)，7.9(t，1H，4-CONH)。
实施例T
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-N-[(3-氯苯基)甲基]甲酰胺(化合物35(1-355))的制备
本化合物按照实施例J中合成4-对-硝基苄基衍生物的步骤制备，把其中的4-硝基苄胺盐酸盐替换为3-氯苄胺。
1H NMR(DMSO-d6)δppm，3.6(m，2H，5’-CH2)，3.9-4.3(m，3H，2’-CH，3’-CH，4’-CH)，4.3(d，2H，--CH2--C6H4--Cl)，5.1-5.4(br.，3H，2’-OH，3’-OH，5’-OH)，5.5(d，1H，1’-CH)，6.0(br.s，2H，5-NH2)， 7.2-7.4(m，4H，--C6H4C1--Cl)，7.4(s，1H，7-CH)，8.1(t，1H，4-CONH)。
实施例U
5-氨基-4-(1-哌啶氨甲酰基)-1-β-D-呋喃核糖基咪唑(化合物36(1-207))的制备
本化合物按照实施例J中合成4-对-硝基苄基衍生物的步骤制备，将其中的4-硝基苄胺盐酸盐替换为哌啶。产物从乙醇中结晶，得到上述产物，熔点190℃-192℃。
1H NMR(DMSO-d6)δppm，1.4-1.7(M，GH，3，4，5-哌啶环的CH2)，3.55(m，2H，5’-CH2)，3.8-3.95(m，5H，哌啶环的2-和6-CH2，和4’-CH)，4.0-4.1(m，1H，3’-CH)，4.25-4.35(m，7H，2-CH)5.15(d，1H，2’或3’-OH)，5.2(t，1H，5’-OH)。
实施例V
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-N-[对-甲氧基苄基]甲酰胺(化合物39(1-390))的制备
活化琥珀酸酯(0.5g)(依照实施例J制备)、4-甲氧苄胺(0.15ml)和二氯甲烷(20ml)的混合液搅拌过夜。TLC显示反应结束。蒸发溶剂，残余物经硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇(9∶1)洗脱。将含产物的洗脱级分合并蒸发。所得残余物溶于甲醇(20ml)，通过滴加甲醇钠调节至pH10左右。反应混合物室温搅拌45分钟后，加入Dowex 50H+-树脂(约pH6.0)进行中和。过滤除去树脂，用甲醇(2×2ml)洗涤。滤液和洗液合并后进行蒸发，残余物从乙醇中结晶。产量为100mg，熔点187℃-188℃。
1H NMR(DMSO-d6)：δppm，3.55(m，2H，5’-CH2)，3.7(s，3H，--OCH3)，3.7-4.1(m，3H，2’-CH，3’-CH和4’-CH)，4.35-4.2(dd，2H，--CH2--N--)，5.1-5.4(3，m，3H，2’-OH，3’-OH和5’-OH)，5.45(d，1H，1-CH)，5.9(br.2H，NH2)，6.8-7.2(m，4H，芳香苯基)，7.3(s，17H，C2-H)，和7.85(t，1H，C-NH)。
实施例W
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-(4-二甲基氨基苄基)-甲酰胺(化合物41(1-396-3))的制备
向4-二甲基氨基苄胺盐酸盐(245mg，2mmol)的二氯甲烷(25ml)混悬液中加入三乙胺(222mg，2mmol)，搅拌45分钟，再向其中加入按实施例J所述制备的活化琥珀酸酯(500mg)；所得混合物室温搅拌过夜。TLC显示反应结束。反应混合物蒸发，残余物经短硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇(9∶1)洗脱。将含有主产物的级分合并再蒸发干燥。将残余物溶于甲醇(15ml)中，采用甲醇钠溶液调节至pH10左右。室温搅拌45分钟后，用Dowex50树脂中和溶液。过滤除去树脂，用甲醇(2×5ml)洗涤。滤液和洗液合并后进行蒸发。所得泡沫状残余物溶于无水乙醇(10ml)。用乙醇-HCl溶液调节溶液至pH5左右。溶剂蒸发干燥，残余物用无水乙醚处理。过滤收集无定形固体，用乙醚(2×10ml)洗涤，高真空干燥得到250mg产物。所得化合物具有高吸湿性；无法测定熔点。
1H NMR(D2O)δppm，3.05(s，6H，N(CH3)2)，3.6(m，2H，5’-CH)，3.8-4.3(3m，3H，2’-CH，3’-CH和4’-CH)，4.4(s，2H，CH2--N--)，5.5(d，1H，1’-CH)，7.3-7.4(m，4H，苯基)，和7.9(s，1H，2-CH)。
实施例X
(R)-5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-[2-羟基-2-(3，4-二羟苯基)-乙基]甲酰胺(化合物42(1-431))的制备
该化合物依照实施例J所述方法制备，将其中的4-硝基苄胺盐酸盐替换为(R)-去甲肾上腺素，反应溶剂氯仿替换为二甲基甲酰胺。
1H NMR(DMSO-d6)：δppm，3.1-3.3(m，2H，--CH2--N)，3.5-3.6(m，2H，5’-CH2)，3.8-3.9(m，1H，4’-CH)4.0-4.1(m，1H，3’-CH)4.2-4.3(m，1H，2’-CH)，4.4-4.5(m，1H，苯基-CH-OH)，5.2-5.2(m，1H，2’或3’-OH)，5.2-5.3(t，1H，5’-OH)5.3-5.4(m，1H，2’或3’-OH)，5.4-5.5(d，1H，1’-CH)，5.9(br.s，2H，5-NH2)，6.5-6.8(m，3H，芳基或儿茶酚)，7.1(t，1H， 4-CONH)，7.3(s，1H，2-CH)，7.2-7.8(br.s，2H，儿茶酚-OH)。
实施例Y
5-氨基-2-硫代苯基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺(化合物43(1-432))的制备
5-氨基-2-溴-1-(2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺1 (1.1g)、硫代苯酚(1.3g)和三乙胺(0.61g)在25ml甲醇和3ml1N氢氧化钠的混合液中回流18小时。浓缩反应混合物，残余物与40ml二氯甲烷混合。二氯甲烷混合液用水和饱和碳酸氢钠洗涤，在硫酸镁上干燥。二氯甲烷蒸发后经200ml硅胶层析纯化剩余残余物，以二氯甲烷和甲醇的混合液(95∶5)洗脱，得到0.5g5-氨基-2-硫代苯基-1-(2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺。该化合物采用80％甲酸室温处理3小时以去除异亚丙基，然后蒸发，采用二氯甲烷∶甲醇(9∶1)经硅胶层析纯化，得到250mg白色泡沫状标题化合物。
1Miyosi T.，Chem.Pharm.Bull.24：2089(1976).
1H NMR(DMSO-d6)：δppm，3.3-3.5(m，2H，5’-CH2)，3.8-3.9(m，1H，4’-CH)4.0-4.1(m，1H，3’-CH)，4.5(q，1H，2’-CH)5.1(d，1H，2’-或3’-OH)，5.3(d，1H，2’-或3’-OH)，5.7(t，1H，5’-OH)，5.9(d，1H，1’-CH)7.5(br.s，2H，4-NH2)，6.7和7.1(br.s，2H，CONH2)7.1-7.5(m，5H，苯)。
实施例Z
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-(2-内-降冰片基)甲酰胺(化合物45(1-438)的制备
(±)内-2-氨基降莰烷盐酸盐(240mg)、三乙胺(160mg)和二氯甲烷的混合物在氩气中室温搅拌45分钟。向其中加入活化琥珀酸酯(见实施例J)(750mg)继续搅拌过夜。TLC显示反应结束。蒸发溶剂，残余物采用二氯甲烷∶甲醇(9∶1)混合液经硅胶柱层析。将含产物的级分合并并蒸发。残余物溶于甲醇(25ml)，用甲醇钠溶液 调节至pH10左右。室温搅拌45分钟后，溶液用H+树脂(约pH6)中和。过滤除去树脂，用甲醇洗涤。洗液和滤液合并后进行蒸发，残余物置于高真空下得到固体玻璃状产物。产量为280mg。
1H NMR(DMSO-d6)δppm，1.1-2.4(m，10H，降冰片基)，3.6(br.M，2H，5’-CH2)，3.9(m，1H，--N--CH)，4-4.4(2m，3H，3’-CH和4’-CH)，5.05和5.35(2-d，2H，2’-OH和3’-OH)，5.25(t，1H，5’-OH)，5.5(d，1H，1’-CH)，5.9(br.2H，NH2)，6.8(d，1H，--NH--CO)，7.25(S，1H，2CH)。
实施例AA
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-N-[(3-碘苯基)甲基]甲酰胺(化合物44(1-434)的制备
该化合物按照实施例J对于4-对硝基苄基衍生物所述的步骤制备，用3-碘苄胺盐酸盐代替4-硝基苄胺盐酸盐。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.6(m，2H，5′CH2)，3.9-4.3(m，3H，2′CH，3′CH，4′-CH)，4.3(d，2H，--CH2--C6H4--I)，5.2-5.4(m，3H，2′OH，3′OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，5.9(br.s.，2H，5-NH2)，7.1-7.7(m，4H，--C6H4)，7.3(s，1H，2-CH)，8.1(t，1H，4-CONH--)
实施例AB
5-氨基-1-(5-碘-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-硝基苯基)甲基]甲酰胺(化合物46(1-44)的制备
在该过程中使用的化合物，5-氨基-1-(5-碘-5-脱氧-2，3-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-硝基苯基)甲基]甲酰胺，用实施例AH对于化合物53(1-468)所述的相同的反应顺序制备(在步骤B处停止)，用4-对-硝基苄基酰胺(化合物23(1-343))代替4-对-氯苄基酰胺(化合物29(1-349))。
将5-氨基-1-(5-碘-5-脱氧-2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-硝基苯基)甲基]甲酰胺(200mg)溶解在10ml80％甲酸中。该溶解在45℃下搅拌2小时。减压蒸发溶剂，得到的残余物与水共蒸 发两次，与甲醇共蒸发两次。将残余物在硅胶上层析，使用6/1二氯甲烷/甲醇作为洗脱溶剂。混合适当的级分，减压浓缩，得到60mg上述化合物，其为黄色泡沫状物。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.3-3.6(m，2H，5′-CH2)，3.8-4.4(m，3H，2′-CH，3′-CH4′-CH)，4.5(d，2H，CH2-C6H4 NO2)，5.4-5.5(m，2H，2′OH，3′-OH)，5.6(d，2H，1′-CH)，5.9(br.s.，2H，5-NH2)，7.4(S，1H，2-CH)，7.5-8.2(m，4H，C6H4-NO2)，8.3(4，1H，4-CONH-)。
实施例AC
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-羧酸对硝基苄硫酯(化合物47(1-450)的制备
5-氨基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-羧酸1 (1.0g)在氩气下和搅拌10分钟条件下溶解在8ml亚硫酰氯中。该混合物在真空下蒸发，将残余物溶解在含有2.0g对硝基苄基硫醇的15ml四氢呋喃中。加入三乙胺(1.5ml)，混合物在氩气下搅拌20分钟。反应物蒸发为胶状物，残余物与50ml二氯甲烷混合，用25ml水洗涤两次。二氯甲烷相在硫酸镁上干燥，蒸发为浆状物，使用乙酸乙酯和二氯甲烷(1∶1)的混合物通过硅胶层析纯化，产生500mg 5-氨基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-羧酸对硝基苄硫酯。用30ml无水甲醇中的甲醇钠处理以保持微碱性pH直到完成脱乙酰基化(通过薄层层析测定)，然后用Dowex 50(H+)中和，蒸发，产生所需的化合物，其中掺杂有推测为甲酯的产物。使用二氯甲烷和甲醇(9∶1)的混合物通过硅胶层析纯化得到38mg所需化合物，其为黄色泡沫状物。
1Srivastava，P.C，J.Med.Chem.17：1207(1974)。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.5-3.7(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.0(m，1H，4′-CH)，4.2-4.4(m，2H，2′-和3′-CH)，5.2(d，1H，21-或3′-OH)，5.3-5.5(m，2H，5′和2′-或3′-OH)，5.6(d，1H，1′-CH)，6.9(br.s，2H，5-NH2)，7.4(s，1h，2-CH)，7.6和8.2(d，2H，苯基)。
实施例AD
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-N-茚满基甲酰胺(化合物48(1-452)的制备
该化合物按照实施例J对于4-对-硝基苄基衍生物所述的步骤制备，用二氢吲哚代替4-硝基苄胺盐酸盐。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.1(t，2H，茚满基-CH2)，3.6(m，2H，5′-CH2--)，5.2-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，6.4(br.s.，2H，5-NH2)，6.9-8.1(m，4H，茚满基芳族)，7.4(S，1H，2-CH)。
实施例AE
(R)-5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-[(1-4-硝基苯基)乙基]甲酰胺(化合物49(1-453)的制备
该化合物按照实施例J对于4-对-硝基苄基衍生物所述的步骤制备，用(R)-4-硝基-α-甲基苄胺盐酸盐代替4-硝基苄胺盐酸盐。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，1.5(d，3H，N4-苄基甲酰胺上的α-甲基)，3.6(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.1(m，1H，N4-苄基甲酰胺上的次甲基质子)，5.1-5.4(m，3H，2′-OH 3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，7.3(s，1H，2-CH)，7.6-8.2(m，4H5C6H4-NO2)，8.0(d，1H，4-CONH-)。
实施例AF
(S)-5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-[(4-硝基苯基)乙基]甲酰胺(化合物50(1-459)的制备
该化合物按照实施例J对于4-对-硝基苄基衍生物所述的步骤制备，用(S)-4-硝基-α-甲基苄胺盐酸盐代替4-硝基苄胺盐酸盐。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，1.5(d，3H，N4-苄基甲酰胺上的α-甲基)，3.6(m，2H，5-CH2)，3.9-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.1(m，1H，N4-苄基甲酰胺上的次甲基质子)，5.1-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH1 5.9(br.s.，2H，5-NH2)，7.4(s，1H，2-CH)， 7.6-8.2(m，4H，C6H4 NO2)8.0(d，1H，4-CONH-)。
实施例AG
5-氨基-1-(5-氯-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-硝基苯基)甲基乙基]甲酰胺(化合物51(1-466)的制备
将5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-N-[(4-硝基苯基)甲基]甲酰胺(化合物23(1-343)(0.5g)、三苯基膦(1.00g)、四氯化碳(0.37ml)和THF(25ml)混合，在室温和氩气下搅拌过夜。形成白色沉淀物。加入二甲基甲酰胺(8ml)，将溶液在室温和氩气下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，得到的油状物与甲醇共蒸发(3×20ml)。得到的粘稠油状物在硅胶上层析，使用7∶1的二氯甲烷∶甲醇作为洗脱溶剂。混合适当的级分，在真空下浓缩，得到黄色泡沫状物(0.28g)。该泡沫状物从冷甲醇中结晶，得到黄色晶体(200mg)，mp＝174℃-176℃。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm3.7-3.9(m，2H，5′CH2)，4.0-4.4(m，3H，2′CH，3′CH，4′-CH)，4.5(d，2H，-CH2-C6H4 NO2)，5.4-5.6(m，2H，2′-OH，3′-OH)，5.6(d，1H，1′-CH)，5.9(br.s.，2H，5-NH2)，7.4(s，1H，2-CH)，7.5-8.2(m，4H，-C6H4 NO2)，8.3(t，1H，4-CONH-)。
实施例AH
5-氨基-1-(5-叠氮基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺(化合物52(1-467)和5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺盐酸盐(化合物53(1-468)的制备
A.5-氨基-1-(2，3-异亚丙基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺的制备
化合物29(1-349)(6.8g，17.8mmol)溶解在100ml DMF、15ml丙酮和15ml 2，2-二甲氧基丙烷的混合物中。加入氯化氢气体(大约1.0g)，将混合物在氩气下搅拌4小时。将混合物倾倒到50ml饱和碳酸氢钠中，在45℃下真空蒸发。将残余物溶解在100ml乙酸乙酯 和25ml水的混合物中。分离乙酸乙酯相，用25ml水洗涤，在硫酸镁上干燥，浓缩成泡沫状物。TLC(硅胶，9∶1的二氯甲烷∶甲醇)显示在产物中有移动明显较快的杂质，其被鉴定为5’-(2-甲氧基丙烷)混合的上述化合物的缩酮。通过将泡沫状物溶解在100ml甲醇中并用书本氯化氢将pH调节为2.5，由此将其转化为上述化合物。30分钟后，用饱和碳酸氢钠中和该混合物，并浓缩为浆状物。将其溶解在100ml二氯甲烷中，用25ml水洗涤。二氯甲烷相在硫酸镁上干燥，浓缩为泡沫状物。在45℃下真空干燥18小时产生7.2g(96％)上述化合物。
B.5-氨基-1-(5-碘-5-脱氧-2，3-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺的制备
步骤A的产物(25g，59mmol)和甲基三苯氧基磷碘化磷(76g，166mmol)在500ml二氯甲烷中的混合物在室温和氩气下搅拌30分钟。得到的溶液用150ml水、150ml 5％硫代硫酸钠、150ml 1N氢氧化钠、100ml水提取，在硫酸镁上干燥。在真空下除去溶剂，将得到的油状物加到在2∶1己烷∶乙酸乙酯中制备的急骤级硅胶1.31柱上。该柱用相同的溶剂洗脱，以除去杂质，然后用1∶1的己烷∶乙酸乙酯洗脱，以洗脱所需产物。混合适当的级分，并蒸发，产生24.4g上述化合物，其为胶状固体。将不纯的级分再进行层析，产生另外2.3g上述产物。总产率为26.7％(85％).
C.5-氨基-1-(5-叠氮基-5-脱氧-2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺的制备
步骤B的产物(26.7g，50mmol)、叠氮化锂(14g，285mmol)和100mg18-冠醚-6在350ml DMF中的混合物在室温和氩气下搅拌8小时。浓缩该浆状物，除去溶剂，并将残余物溶解在500ml乙酸乙酯和100ml水的混合物中。分离乙酸乙酯相，用水和饱和氯化钠洗涤，然后在硫酸镁上干燥。蒸发溶剂获得25g上述化合物，其为黄色胶状物，仍然含有溶剂。其不需进一步纯化用于下一步骤。
D.5-氨基-1-(5-叠氮基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺(化合物52(1-467)的制备
将获得的步骤C的产物溶解在150ml 80％三氟乙酸中，加热到50℃30分钟。将溶液在40℃下真空蒸发为浆状物，残余物从25ml水中蒸发两次。浆状物残余物溶解在100ml乙酸乙酯中，在100ml饱和碳酸氢钠上轻轻搅拌。在乙酸乙酯相开始结晶，1小时后通过过滤收集晶体。这些晶体与通过浓缩乙酸乙酯相获得的另外两批收获物或晶体混合，得到15.7g(产率为77％，基于步骤B的产物)。分析样品的熔点为182℃-183℃。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.6(M，2H，5′CH2)，4.0-4.3(m，3H，2′CH，3′CH，4′-CH)，4.3(d，2H，-CH2 C6H4Cl)，5.4-5.5(m，2H，2′OH，3′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，5.9(br.s.，2H，5-NH2)，7.3-7.4(m，4H，C6H4Cl)，7.4(s，1H，2-CH)，8.1(t，1H，4-CONH-)。IR(KBr)cm-1，2110。
E.5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺的制备
化合物52(1-467)(6.5g，159mmol)溶解在500ml煮沸的乙醇中。在冷却到40℃后，溶液用氩饱和，加入0.5g10％碳碳载钯。该混合物在氩气氛下搅拌8小时。该混合物用氩饱和，通过Celite 505过滤，浓缩为浆状物，该浆状物不需进一步纯化用于下一步。
F.5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺盐酸盐(化合物53(1-468)的制备
步骤E的产物(理论上为159mmol)溶解在100ml乙醇中，加入3.5ml 6N盐酸(pH至湿pH纸大约为3)。溶解蒸发为硬浆。将其溶解在50ml热乙醇中，用150ml乙醚稀释。得到的胶状沉淀物密封搅拌12小时，过滤收集产生的白色沉淀物，用醚洗涤。在40℃下真空干燥产生6.0g上述化合物(产率为90％，基于步骤D的化合物)。
1HNMR(DMSO d6)δ，ppm，3.0-3.2(m，2H，5′-CH2)，4.0-4.4(M，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，4.4(d，2H，-CH2-C6H4Cl)，5.8-6.2(br.，2H， 2′-OH，3′-OH)，7.2-7.4(m，4H，C6H4Cl)，7.8(s，1H，2-CH)，8.3(br.，3H，NH2.HCl)。
实施例AI
5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-(环戊基)甲酰胺盐酸盐(化合物37(1-270))的制备
该化合物用实施例AH对于化合物53(1-468)所述相同的反应顺序制备，用4-N-环戊基酰胺(表XII的化合物10(1-186))代替4-N-对-氢苄基酰胺(表XII的化合物29(1-349))。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，1.4-1.9(m，9H，环戊基脂族质子)，3.0-3.2(m，2H，5′-CH2)，4.0-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.5(d，1H，1′-CH)，5.9(br.s，2H，5-NH2)，7.1(d，1H，4-CONH-)，7.4(s，1H，2-CH)。
实施例AJ
5-氨基-1-(5-脱氧-5-甲醇硫代-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物54(1-483))的制备
中间体5-氨基-1-(5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺按照实施例AI对于化合物5(1-466)所述的步骤制备，用5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-甲酰胺代替5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-(4-硝基苯基甲基)甲酰胺。
在0℃和氩气下向0.1N甲醇钠/甲醇溶液中鼓泡甲基硫醇。向得到的0.1N甲基硫醇钠/甲醇溶液中加入5-氨基-1-(5-氯-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(0.40g)。该溶液回流加热过夜。将该溶液冷却，并用Dowex 50强酸离子交换树脂中和。过滤混合物，减压浓缩。得到的残余物在硅胶上层析，用4∶1二氯甲烷∶甲醇作为洗脱溶剂。混合适当的级分，减压浓缩，真空干燥，得到上述化合物，为白色泡沫状物(0.28g)。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，2.1(s，3H，-S-CH3)，3.7-3.9(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.4(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.3-5.4(m，2H，2′-OH， 3′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，5.8(br.s.，2H，5-NH2)，6.6-6.9(br.m，2H，4-CONH2)，7.3(s，1H，2-CH)。
实施例AK
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-(4-溴苯基)甲酰胺(化合物55(1-484))的制备
5-氨基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-羧酸(Srivastava，P.C.等，J.Med.Chem.171207，(1974)，(0.75g)和亚硫酰氯(7ml)在室温下在干燥管下搅拌15分钟。减压蒸发过量的亚硫酰氯，得到的残余物与二氯甲烷共蒸发(3×20ml)。将产生的黄色泡沫状物溶解在二氯甲烷(40ml)中，加入4-溴苯胺(0.35g)。加入三乙胺(大约0.75ml)直到溶液为碱性。溶液在室温下在干燥管下搅拌2小时。溶液用水洗涤，用硫酸镁干燥，减压浓缩，得到黄色泡沫状物。将泡沫状物溶解在甲醇(35ml)中。加入甲醇钠甲醇溶液(约0.75ml 0.5N溶液)，得到的溶液在室温下在干燥管下搅拌30分钟。溶液用甲醇洗涤的Dowex 50(强酸性离子交换树脂)中和。过滤混合物，减压浓缩，得到浅黄色残余物。该残余物从甲醇(15ml)/二氯甲烷(10ml)中结晶，得到棕褐色晶体(0.23g)。该晶体重结晶，得到乳白色晶体(90mg)。Mp：214℃-216℃(分解)。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.6(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.3(m，3H，1′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.2-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，6.2(br.s.，2H，5-NH2)，7.4-7.8(m，4H，-C6H4Br)，7.4(s，1H，2-CH)，9.5(s，7H，4-CONH)。
实施例AL
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-N-[(4-溴苯基)甲基]甲酰胺(化合物56(1-487))的制备
该化合物按照实施例J对于4-对-硝基苄基衍生物所述的步骤制备，用4-溴苄胺盐酸盐代替4-硝基苄胺盐酸盐。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.5-3.6(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，4.3(d，2H，CH2-C6H4 Br)，5.1-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，5.9(br.s，2H，5-NH2)，7.2-7.5(m，4H，-C6H4 Br)，7.3(s，4H，2-CH)，8.0(t，1H，4-CONH--)。
实施例AM
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-N-(4-碘苯基)甲酰胺(化合物57(1-488))的制备
该化合物按照实施例AK对于4-对-溴苯基衍生物所述的步骤制备，用4-碘苯胺代替4-溴苯胺盐酸盐。终产物从乙醇中重结晶。Mp：227℃-229℃。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.5-3.6(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.4(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.2-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，6.2(br.s.，2H，5-NH2)，7.4(s，1H，2-CH)，7.6-7.7(m，4H，-C6H4I)，9.5(s，1H，4-CONH)。
实施例AN
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-(4-硝基苯基)甲酰胺(化合物58(1-489))的制备
该化合物按照实施例AK对于4-对-溴苯基衍生物所述的步骤制备，用4-硝基苯胺代替4-溴苯胺盐酸盐。终产物从甲醇中重结晶，得到黄色粉末。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.5-3.6(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.4(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.2-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH；5′-OH)，5.6(d，1H，1′-CH)，6.4(br.s.，2H，5-NH2)；7.5(s，1H，2-CH)，8.1-8.3(m，4H，C6H4NO2)，10.1(s，1H，4-CONH)。
实施例AO
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-N-(4-硝基苯基)乙基甲酰胺(化 合物59(1-506))的制备
该化合物按照实施例J对于4-对-硝基苄基衍生物所述的步骤制备，用4-硝基苯乙胺盐酸盐代替4-硝基苄胺盐酸盐。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，2.9-3.0(t，2H，-CH2-C2H4-NO2)，3.4-3.6(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，4.8-5.4(br.，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，5.9-6.2(br.，2H，5-NH2)，7.5-8.2(m，4H，-C6H4 NO2)，7.6(s，1H，2-CH)，7.7(t，1H，4-CONH)。
实施例AP
5-氨基-4-[1-[4-(4-硝基苯基)]哌嗪氨甲酰基]-1-β-D-呋喃核糖基咪唑(化合物60(1-508))的制备
该化合物按照实施例J对于4-对-硝基苄基衍生物所述的步骤制备，但是用1-(4-硝基苯基)哌嗪代替4-硝基苄胺盐酸盐。产物从冷甲醇中重结晶，mp为199℃-200℃。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.4-3.6(m，10H，3′-CH2，哌嗪酰亚甲基)，3.9-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.2-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，6.3(br.s.，2H，5-NH2)，7.0-8.1(m，4H，-C6H4 NO2)，7.3(s，1H，2-CH)。
实施例AQ
5-氨基-1-(5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺(化合物61(1-509))的制备
5-氨基-1-(5-碘-5-脱氧-2，3-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺(见实施例AH制备化合物53(1-468)的程序，步骤B)(0.64g)在30ml50％甲酸中搅拌过夜。减压蒸发过量的溶剂。得到的残余物与水(25ml)和甲醇(25ml)共蒸发。得到的黄色泡沫状物在硅胶上层析，使用9∶1的二氯甲烷∶甲醇作为洗脱溶剂。混合适当的级分，减压浓缩，得到0.47g的5-氨基-1-(5- 碘-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺。
将5-氨基-1-(5-碘-5-脱氧-β-O-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺(0.04g)、碳载钯10％(20mg)和乙醇(20ml)加入Parr瓶中。向瓶和内容物中充入45p.s.i.的氢气。反应进程通过HPLC(Waters C18，55％甲醇/45％0.1N乙酸，260nm，1.0ml/min)监测。24小时后，有34％的起始物。加入新鲜的催化剂(20mg)，向混合物中重新充入氢气(45p.s.i.)。混合物再摇动48小时。反应混合物含有30％的起始物。通过Celite过滤混合物，减压浓缩。得到的残余物在硅胶上层析，用乙酸乙酯(400ml)和溶于乙酸乙酯的5％甲醇(200ml)作为洗脱溶剂。混合适当的级分，减压浓缩，得到70mg白色泡沫状物。HPLC指示9％的起始物。这些材料在硅胶上层析，用乙酸乙酯作为洗脱溶剂。混合所有含有少于3％起始物的级分，减压浓缩，得到36mg上述化合物，其为粉红色泡沫状物。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，1.2-1.3(d，3H，5′-CH3)，3.7-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH2 4′-CH)，4.3(d，2H，CH2-C6H4Cl)，5.1-5.4(m，3H，2′-OH，3′OH，1′-CH)，5.8(br.s.，2H，5-NH2)，7.2-7.4(m，5H，C6H4Cl，2-CH)，8.1(t，1H，4-CONH)。
实施例AR
5-氨基-1-(5-脱氧-5-甲基亚磺酰基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物62(1-510))的制备
实施例AK的5-氨基-1-(5-脱氧-5-甲基硫代-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物54(1-483))(0.40g)溶解在水(20ml)中。加入30wt％过氧化氢(0.42ml)，搅拌溶液30分钟。TLC(6/1，二氯甲烷/甲醇)指示存在一些起始物。加入另外1.0ml过氧化氢，搅拌溶液15分钟。TLC指示没有起始物。减压蒸发溶剂，得到黄色泡沫状物。该泡沫状物在硅胶上层析，使用3/1二氯甲烷/甲醇作为洗脱溶剂。混合适当的级分，真空浓缩，得到75mg上述化合物，其为黄色泡沫状物。
HPLC(Waters C18，100％0.1N乙酸，1.0ml/min，260nm)指示2种等摩尔的产物。这符合产物氧化为亚砜的非对映异构体混合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，2.6(s，3H，CH3 S(O)--)，3.0-3.2(m，2H，5′-CH2)，4.0-4.4(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)5.4-5.6(m，3H，2′-OH，3′-OH，1′-CH)，5.9(br.s.，2H，5-NH2)，6.6-6.9(br.，2H，4-CONH6)，7.3(s，1H，2-CH)。
实施例AS
5-氨基-1-β-D-(5-脱氧-5-甲基氨基呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物63(1-517))的制备
将5’-脱氧-5’-碘-2’，3’-异亚丙基-AICA核苷(参见：P.C.Srivastava，A.R.Newman，T.R.Mathews，T.R.Mathews和R.K.Robins，J.Med.Chem.18，1237(1975))、40wt％的甲胺水溶液(3ml)和甲醇(30ml)混合，回流加热18小时。反应生成产物的混合物。将溶液冷却，减压蒸发溶剂。得到的残余物在硅胶上层析，使用6/1二氯甲烷/甲醇(400ml)和3/1二氯甲烷/甲醇(300ml)作为洗脱溶剂。混合含有为所需产物的慢洗脱成分的级分，减压蒸发，得到0.13g的5’-脱氧-5’-甲基氨基-2’，3’-异亚丙基-AICA核苷。
5’-脱氧-5’-甲基氨基-2’，3’-异亚丙基-AICA核苷(0.13g)在60℃下在75％甲酸(20ml)中加热1.5小时。将溶液冷却，减压蒸发溶剂，得到白色泡沫状物。将泡沫状物溶解在水(5ml)中，加到Dowex50强酸离子交换树脂短柱上。该柱用水洗涤，然后用20％甲醇/水中的1M NH4OH洗涤。减压蒸发溶剂，得到的残余物与甲醇共蒸发(3×20ml)，得到75mg上述化合物，其为乳白色泡沫状物。
1H NMR(D6-DMSO-d6)δ，ppm，2.3(s，3H，CH3N)，2.5-2.7(m，2H，5′-CH2)，3.3-3.4(br.，1H，MENH)，3.9-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.1-5.4(m，2H，2′-OH，3′-OH)，5.4(d，1H，1′-CH)，6.2(br.s，2H，5-NH2)，6.6-6.8(br.，2H，4-CONH)，7.2(s，1H，2-CH)。
实施例AT
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-(2-氯苯基)甲酰胺(化合物64(1-519))的制备
该化合物按照实施例AK对于化合物55(1-484)4-对-溴苯基衍生物所述的步骤制备，用2-氯苯胺代替4-溴苯胺盐酸盐。终产物从二氯甲烷(20ml)/甲醇(1ml)中重结晶，得到上述产物。Mp＝131℃-135℃。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.5-3.6(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.2-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，6.2(br.s.，2H，5-NH2)，7.0-8.4(m，5H，C6H4Br，2′-CH)，9.1(s，1H，4-CONH)。
实施例AU
5-氨基-1-β-D-(5-苄基氨基-5-脱氧呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物66(1-5311))的制备
5’-脱氧-5’-碘-2’，3’-异亚丙基-AICA核苷(1.00g)(参见：P.C.Srivastava，A.R.Newman，T.R.Mathews，T.R.Mathews和R.K.Robins，J.Med.Chem.18，1237(1975))、苄胺(2.0ml)和甲醇(40ml)混合，回流加热24小时。然后按照实施例AS对于化合物63(1-517)所述的步骤得到上述化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，2.7(d，2H，-CH2--C6H5)，3.3-3.4(br.，1H，-NH--CH2 C6H5)，3.9-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.1-5.4(m，2H，2′-OH，3′-OH)，5.4(d，1H，1-CH)，6.1(br.s.，2H，5-NH2)，6.6-6.8(br.，2H，4-CONH2)，7.2-7.4(m，6H，--C6H5，2-CH)。
实施例AV
5-氨基-2-硫-1-β-D-(5-脱氧呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物67(1-535))的制备
A.5’-脱氧-2’，3’-异亚丙基-2-溴-AICA核苷的制备
在20分钟内向5’-脱氧-2’，3’-异亚丙基-AICA核苷(2.90g)(参见：P.C.Srivastava，A.R.Newman，T.R.Mathews，T.R.Mathews和R.K.Robins，J.Med.Chem.18，1237(1975))在氯仿(100ml)中的溶液中加入少量N-溴琥珀酰亚胺。溶液在室温下搅拌30分钟。溶液用水洗涤，用盐水洗涤两次，然后在硫酸镁上干燥。真空蒸发溶剂，产生暗色泡沫状物。使泡沫状物通过硅胶柱，用9∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脱。混合含有产物的级分，减压浓缩，得到2.02g红棕色泡沫状物。
B.5’-脱氧-2’，3’-O-异亚丙基-2-硫-AICA核苷的制备
硫酸钾(3.7g)在乙醇(20ml)中回流加热15分钟。过滤混合物。向滤液中加入5’-脱氧-2’，3’-异亚丙基-2-溴-AICA核苷(来自步骤A)。将混合物在钢制反应釜中100℃加热5.5小时。冷却并过滤混合物。用乙酸将滤液的pH调节为大约5-6，减压蒸发溶剂。得到的残余物通过硅胶柱，用7/1的二氯甲烷/甲醇洗脱。混合含有产物的级分，减压浓缩，得到暗褐色泡沫状物。该泡沫状物在二氯甲烷(50ml)中搅拌，然后过滤，得到青莲色粉末。该粉末在冷甲醇中搅拌，然后过滤，真空干燥，得到0.52g浅黄色固体。Mp＝211＝214(分解)。
C.5-氨基-2-硫-1-(脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物67(1-535))的制备
5’-脱氧-2’，3’-异亚丙基-2-硫-AICA核苷(来自步骤B)在50％甲醇(30ml)中在30℃下搅拌1小时。减压蒸发溶剂。得到的残余物与甲醇共蒸发(2×20ml)。得到的固体在甲醇(25ml)中加温，然后在室温下搅拌过夜。将混合物过滤，滤液减压浓缩，得到浅绿色泡沫状物。该泡沫状物在硅胶上层析，使用5/1的二氯甲烷/甲醇作为洗脱溶剂。混合适当的级分，减压浓缩，得到黄色泡沫状物。将泡沫状物在冷甲醇中晶体，得到69mg上述化合物。mp＝201-203℃(分解)。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm 1.3(d，3H，5′-CH3)，3.6-4.5(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.0-5.2(m，2H，2′-OH，3′-OH)，5.6(br.s.，2H，5-NH2)，6.0(d，1H，1′-CH)，7.0(br.，2H，4-CONH)，12.0(br.s.，1H，--SH)。
实施例AW
N，N’-双-(5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-羰基)-1，6-二氨基己烷(化合物68(1-538))的制备
将N-琥珀酰亚胺基-5-氨基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-羧酸酯(2.50g)(参见：Srivastava，P.C.等，J.Med.Chem.17：1207(1974))、1，6-己烷二胺(0.300g)、三乙胺(0.5ml)和二氯甲烷(35ml)混合，在室温下搅拌18小时。标题化合物按照实施例J所述的步骤制备。终产物从甲醇中结晶，得到0.32g上述化合物。MP＝181℃-185℃。
1H NMR数据报告为对称二聚体的一半。1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，1.2-1.5(m，4H，N-己基二甲酰胺的β和δ亚甲基)，3.0-3.2(m，2H，N-己基二甲酰胺的α亚甲基)，3.5-3.6(m，2H，5′-CH2)，3.8-4.3(m，3H，2′-H，3′-CH，4′-CH)，5.1-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，5.9(br.s.，2H，5-NH2)，7.3(s，1H，2-Ch)，7.4(t，1H，4-CONH)。
实施例AX
N，N’-双-(5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-羰基)-1，4-二氨基环己烷(化合物69(1-549))的制备
该化合物按照实施例AW对于化合物68(1-538)所述的步骤制备，用1，4-二氨基环己烷代替1，6-己烷二胺。
1H NMR数据报告为对称二聚体的一半。1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm 1.3-1.8(m，4H，环己烷亚甲基质子)，3.5-3.7(m，3H，5′-CH2，环己烷次甲基)，3.8-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.1-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，5.9(br.s.，2H，5-NH2)，7.1(d，1H，4-CONH)7.3(s，1H，2-CH)。
实施例AY
5-氨基-2-硫-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物70(1-551))的制备
A.5-脱氧-5’-碘-2-溴-2’，3’-异亚丙基AICA核苷的制备
将5-脱氧-2’，3’-异亚丙基AICA核苷(4.50g)(参见：T.Miyoshi，S.Suzaki，A.Yamazaki，Chem.Pharm.Bull.，24(9)：2089-2093(1976))、甲基三苯氧基碘化磷(16.2g)和二氯甲烷(125ml)混合，在室温下搅拌16小时。混合物用水、0.5M NAOH(100ml)、5％NaS2O3 (150ml)和盐水洗涤，然后在硫酸镁上干燥。减压蒸发溶剂，得到橙色油状物。将油状物在冷二乙醚中磨碎。过滤得到的混合物，得到3.53g灰色粉末。将母液减压浓缩，得到橙色油状物。将油状物加到硅胶短柱上。该柱用二氯甲烷洗涤，然后用9/1的二氯甲烷/甲醇(250ml)洗脱产物。混合适当的级分，减压浓缩，得到橙色焦油。将该焦油状物在冷二乙醚中磨碎。过滤混合物，得到另外0.94g灰色粉末。混合的粉末(4.47g)在硅胶上层析，使用2/1的乙酸乙酯/己烷作为洗脱溶剂。混合适当的级分，减压浓缩，得到黄色泡沫状物(4.02g)。
B.5’-叠氮基-5’-脱氧-2-溴-2’，3’-异亚丙基AICA核苷的制备
将5-脱氧-5’-碘-2-溴-2’，3’-异亚丙基AICA核苷(4.02g)、叠氮锂(1.82g)和DMF(65ml)混合，在室温下搅拌2小时。减压蒸发溶剂，得到黄色油状物。将该油状物溶解在乙酸乙酯(200ml)中，用水和盐水洗涤，然后在硫酸镁上干燥。减压蒸发溶剂，得到黄色泡沫状物(3.01g)。
C.5’-氨基-5’-脱氧-2-溴-2’，3’-异亚丙基AICA核苷的制备
将5’-叠氮基-5’-脱氧-2-溴-2’，3’-异亚丙基AICA核苷(2.00g)、三苯基膦(1.83g)和THF(100g)混合，在室温下搅拌16小时。加入浓NH4OH(15ml)，将溶液回流加热6小时。冷却溶液，减压蒸发溶剂。得到的残余物与甲醇共蒸发(2×30ml)。得到的残余物在冷甲醇(25ml)中搅拌30分钟。过滤混合物，得到乳白色粉末。固体从甲醇中重结晶，得到白色粉末(0.73g)。
D.5-氨基-2-硫-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物70(1-551))的制备
硫化钾(1.0g)在乙醇(10ml)中回流加热15分钟。过滤混合 物，向滤液中加入5’-氨基-5’-脱氧-2-溴-2’，3’-异亚丙基AICA核苷(0.50g)。混合物在钢制反应釜中110℃加热5小时。冷却并过滤混合物。再次过滤滤液，然后减压浓缩，得到黄色焦油状物。将该焦油状物在硅胶上层析，使用3/1的二氯甲烷/甲醇作为洗脱溶剂。混合适当的级分，减压浓缩，得到黄色玻璃状物(0.12g)。将该玻璃状物溶解在80％三氟乙酸(8ml)中，室温搅拌1小时。减压蒸发溶剂，得到黄色固体。将该固体在二乙醚/乙醇(10ml，95/5)中搅拌，然后过滤，干燥，得到黄色固体(55mg)。
1H NMR(DMSO-d6+D2O)δ，ppm，2.6-2.9(m，2H，5′-CH2-)，3.8-4.5(m，3H，2′CH，3′CH，4′-CH)，6.2(d，1H，1′-CH)。
实施例AZ
5-氨基-1-(5-叠氮基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-硝基苯基)甲基]甲酰胺(化合物71(1-562))的制备
该化合物按照实施例AH对于化合物52(1-467)所述的步骤制备，用化合物23(1-343)(对-硝基苄基衍生物)代替化合物29(1-349)(对-氯苄基衍生物)。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.5-3.7(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.4(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，4.4-4.5(d，2H，-CH2-PhNO2)，5.4-5.5(m，2H，2′-OH，3′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，5.9(br.s.，2H，5-NH2)，7.4(s，1H，2-CH)，6.5-8.2(m，4H，-C6H4 NO2)，8.3(4，1H，CONH-)。
实施例BA
5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-硝基苯基)甲基]甲酰胺(化合物72(1-563))的制备
该化合物按照实施例AH对于化合物53(1-468)所述的步骤制备，用对-硝基苄基酰胺衍生物(化合物23(1-343))代替对-氯苄基酰胺衍生物(化合物29(1-349))。
1H NMR(DMSO+D2O)δ，ppm2.6-2.8(m，2H，5′-CH2--)，3.8-4.3(m， 3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，4.4-4.5(m，2H，-CH2-C6H4 NO2)，5.4(d，1H，1′-CH)，7.3(s，1H，2-CH)，7.5-8.3(m，5H，CH2 C6H4 NO2，4-CONH)。
实施例BB
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基-咪唑-4-N-[(4-三氟甲基苯基)甲基]甲酰胺(化合物74(1-572))的制备
该化合物按照实施例J对于对-硝基苄基衍生物所述的步骤制备，用4-(三氟甲基)苄基胺代替4-硝基苄基胺盐酸盐。终产物从二氯甲烷/甲醇中重结晶。Mp＝137-140。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm 3.5-3.7(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.4(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，4.4-4.5(d，2H，-CH2-PhCF3)，5.2-5.5(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，5.9(br.s.，2H，5-NH2)，7.3(S，1H，2-CH)，7.4-7.7(m，4H，-C6H4 CF3)，8.2(t，1H，4-CONH)。
实施例BC
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-[(4-氨磺酰基苯基)甲基]甲酰胺(化合物75(1-577))的制备
该化合物按照实施例J对于对-硝基苄基衍生物所述的步骤制备，用4-(氨基甲基)苯磺酰胺盐酸盐代替4-硝基苄基胺盐酸盐。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm，3.5-3.7(m，2H，5′-CH2-)，3.9-4.4(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，4.4-4.5(d，2H，-CH2-C6H4SO2)，5.2-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，1H，1′-CH)，6.0(br.s.，2H，5-NH2)，7.3(br.s.，2H，-SO2 NH2)，7.4(s，1H，2-CH)，7.4-7.8(m，4H，-C6H4--)，8.2(t，1H，4-CONH--)。
实施例BD
5-氨基-1-(5-(4-氯苄基-氨基)-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物76(1-578))的制备
将表VIII的5’-氨基-5’-脱氧-AICA-核苷(0.50g)(化合物21 (1-227))、4-氯苄基碘化物(0.50g)、碳酸钾(0.26g)和DMF(15ml)混合，在室温下搅拌16小时。减压蒸发溶剂，得到的残余物在温乙醇(35ml)中搅拌。过滤除去不溶物，减压浓缩滤液。得到的残余物在硅胶上层析，使用3∶1的二氯甲烷∶甲醇作为洗脱溶剂。混合含有较慢移动的两种产物的级分，减压浓缩，得到棕褐色泡沫状物(0.21g)。
1H NMR(DMSO-d6+D2)δ，ppm2.9-3.0(m，2H，5′-CH2-)，3.9(s，2H，-CH2--C6H4)，3.9-4.3(m，3H，2′CH，3′-CH，4′-CH)，5.5(d，1H，1′-CH)，7.3(s，1H，2-CH)，7.4(m，4H，-C6H4 Cl)。
实施例BE
5-氨基-1-(5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑(化合物77(1-588))的制备
将5’-脱氧AICA核苷(1.00g)(参见：P.C.Srivastava，A.R.Newman，T.R.Mathews和R.F.Robins，J.Med.Chem.18：1237(1975))在N氢氧化钾(4.0ml)中回流加热5小时。减压蒸发溶剂，得到的残余物与乙醇共蒸发(4×10ml)。得到的残余物用乙醇(15ml)稀释，过滤细沉淀物。在放置几天后，滤液得到另外的沉淀物。收集微小的固体，将混合的固体材料溶解在水(20ml)中，用Dowex 50W强酸离子交换树脂中和。减压蒸发溶剂，得到暗色焦油状物。将该焦油状物溶解在80％乙酸(20ml)中，缓慢加热(60℃)。减压蒸发溶剂，得到暗色焦油状物。将该焦油状物与甲醇共蒸发(2×15ml)。得到的残余物在硅胶上层析，使用3/1的二氯甲烷/甲醇作为洗脱溶剂。混合适当的级分，减压浓缩，得到暗色焦油状物。将该焦油状物与甲苯共蒸发(3×20ml)，然后真空干燥，得到暗褐色的吸湿泡沫状物(110mg)。
1H NMR(D2)δ，ppm，1.3(d，3H，5′-CH3)，4.0-4.5(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.6(d，1H，1′-CH)，6.4(s，1H，4-CH)，7.7(s，1H，2-CH)。
实施例BF
5-氨基-1-(5-脱氧-5-二乙基氨基核糖-β-D-呋喃基)咪唑-4-甲酰胺(化合物65(1-522))的制备
将5’-脱氧-5’-碘-2’，3’-异亚丙基AICA核苷(1.00g)(参见：P.C.Srivastava，A.R.Newman，T.R.Mathews和R.F.Robins，J.Med.Chem.18：1237(1975))、二乙胺(2.5ml40wt％，在水中)和甲醇(30ml)混合，回流加热18小时。按照实施例AS对于化合物63(1-519)所述的步骤得到上述化合物。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm0.9(t，6H，5′-二乙胺上的甲基)，2.4-2.7(m，6H，5′-CH2，5′-二乙胺上的亚甲基)，3.3-4.2(m，3H，2′-CH，3′-CH，4 ′-CH)，5.2(br.，2H，2′-OH，3′-OH)，5.4(d，1H，1′-CH)，5.9(br.s.，2H，5-NH2)，5.7-5.9(br.，2H，4-CONH2)，7.3(s，1H，2-CH)。
实施例BG
5-氨基-1-β-D-呋喃核糖基咪唑-4-N-[(3-4-硝基苯基)丙基]甲酰胺(化合物73(1-566))的制备
该化合物按照实施例J对于对-硝基苯基衍生物所述的步骤制备，用3-(4-硝基苯基)丙胺(参见：G.W.Hardy等，J.Med.Chem.32：1108(1989))代替4-硝基苄胺盐酸盐。
1H NMR(DMSO-d6)δ，ppm1.7-3.2(m，6H，-CH2 CH2--)，3.5-3.6(m，2H，5′-CH2)，3.9-4.3(m，3H，2′-CH，3′-CH，4′-CH)，5.2-5.4(m，3H，2′-OH，3′-OH，5′-OH)，5.5(d，2H，1′-CH)，5.9(br.s.，2H，5-NH2)，7.3(s，1H，2-CH)，7.5-8.2(m，5H，--C6H4NO2，4-CONH-)。
实施例BH
5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-2，3-二-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺(化合物78(1-599))的制备
A.5-氨基-1-(5-叠氮基-5-脱氧-2，3-二-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺的制备
化合物52(实施例AH)2.4g(5.8mmol)溶解在20ml二甲基甲酰胺和20ml吡啶的混合物中。将溶液在氩气下冷却到30℃，加入乙酸酐1.5g(14mmol)。使混合物加温至室温18小时，然后浓缩为浆状物。该浆状物溶解在25ml二氯甲烷中，用水洗涤3次各15ml，在硫酸镁上干燥，蒸发，产生3.0g白色泡沫状物。进一步使用二氯甲烷和甲醇(95∶5)的混合物在200ml硅胶上层析，得到2.5g所需产物，其为白色泡沫状物。
B.5-氨基-(5-氨基-5-脱氧-2，3-二-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-(4-氯苯基)甲基甲酰胺(化合物78(1-599))的制备
将步骤A的产物400mg溶解在10ml乙醇中，加入50mg10％碳载钯。该混合物在氢气氛下搅拌30分钟，过滤，蒸发滤液，得到300mg所需产物，其为白色泡沫状物。
1H NMR(DMSO-d6)δ.2.0(s，3H，CH3 CO-)，2.1(s，3H，CH3 CO-)，2.9(m，2H，5′-CH2)，4.1(m，1H，4′-CH)，3.4(br.s，2H，5′-NH2)4.4(d，2H，-CH2-C6H4-Cl)，5.3(m，1H，3′-CH)5.6(m，1H，3′-CH)，5.8(d，1H，1′-CH)，6.4(br.s，2H，5-NH2)，7.3(m，4H，-C6H4-Cl)，7.4(s，1H，2-CH)，8.1(t，1H，4-CONH-)。
实施例BI
本发明的前药也可以在适当条件下制备并施用。在一个优选实施方案中，本发明的前药增强了口服生物利用度，尤其包括2’和3’羟基的羧酸酯。
本发明的前药酯可以通过包括保护和脱保护步骤的标准乙酰化方法制备。例如，系列III化合物的5’基团可能需要保护(例如，化合物66的5’-苄基氨基可以用苄氧羰基保护)。
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-特戊酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(化合物66的前药)的制备
将1-(5-N-苄基氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺的酒石酸盐(8.8g，16.77mmol)水(60ml)溶液、碳酸钾(8.5g)和四 氢呋喃(120ml)加入装有机械搅拌器、额外的漏斗和氮气入口的三颈圆底烧瓶中。将该烧瓶在冰水浴中冷却。在15分钟内加入氯甲酸苄酯(3.4ml，20mmol)在THF(15ml)中的溶液。除去冷却浴，继续搅拌2小时，此时TLC(SiO2，6∶1的CH2Cl2-甲醇)指示起始物被完全消耗。将反应混合物转移到分液漏斗中，分离有机层。水层用乙酸乙酯洗涤(3×30ml)。合并有机层，在无水硫酸镁上干燥，蒸发，获得浆状残余物。使用9∶1的CH2Cl2-甲醇作为洗脱体系，通过柱层析进一步纯化产物。合并含有产物的级分，蒸发，获得以下化合物：
A.5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-N-苄氧基羰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺，其为玻璃状固体。产量：5.5g。Rf：0.5 SiO2，6∶1的CH2Cl2-甲醇。
化合物A(2.0g，4.15mmol)和4-N，N-二甲基氨基吡啶(100mg)在无水吡啶(20ml)中的溶液在冰水浴中冷却，用特戊酸酐(3.3ml)处理。除去冰浴，反应混合物在室温下搅拌16小时。TLC(SiO2，9∶1的CH2Cl2-甲醇)指示起始物被完全消耗。加入甲醇(1.5ml)，再搅拌半小时，减压蒸发挥发物。残余物溶解在乙酸乙酯(50ml)中，用水(1次，50ml)和碳酸氢钠溶液(1次，20ml)提取。有机层在无水硫酸镁上干燥，蒸发，获得浆状残余物。使用19∶1的CH2Cl2-甲醇作为洗脱体系，通过柱层析进一步纯化产物。合并含有产物的级分，蒸发，获得以下化合物：
B.5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-N-苄氧基羰基-2，3-二-O-特戊酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺，其为玻璃状固体。产量：5.5g。Rf：0.6SiO2，9∶1的CH2Cl2-甲醇。HNMR，DMSC-d6δppm。
向化合物B(1.1g)在乙酸乙酯(30.0ml)和乙酸(6.0ml)中的溶液中加入催化剂碳载Pd(OH)2(100mg)，用氮气净化。使用氢气球进行氢化。在TLC(SiO2，9∶1的CH2Cl2-甲醇)上不存在起始物证明反应完成。通过celite垫过滤除去催化剂，用乙酸乙酯洗涤。减压蒸发滤液，将残余物溶解在乙酸乙酯(50ml)中，用饱和碳酸氢钠溶液提取(1次，20ml)。有机层在无水硫酸镁上干燥，蒸发，获 得残余物，使用19∶1的CH2Cl2-甲醇作为洗脱体系，将其进一步在硅胶柱上纯化。合并含有产物的级分，蒸发，获得以下化合物：
C.5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-N-苄基氨基-2，3-二-O-特戊酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺，其为玻璃状固体。产量：800mg。Rf：0.55SiO2，9∶1的CH2Cl2-甲醇。
为了获得标题化合物的相应的盐酸盐，将上述游离碱(200mg)溶解于甲醇中，并用1N HCl水溶液稀释。减压蒸发得到的溶液(水浴温度30℃)。残余物溶解在双蒸水(15ml)中，通过45μm膜滤器过滤。滤液在冻干罐中冷冻，反复冻干直到获得恒定的重量。获得作为白色固体的终产物5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-N-苄基氨基-2，3-二-O-特戊酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺盐酸盐，在高真空下干燥，贮存在冷冻器中。产量：180mg，m.p.172℃-175℃。
下列前药可以用类似的方法制备：
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-乙酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-丙酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-丁酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-异丁酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-戊酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-苯甲酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-(4-甲基苯甲酰基)-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-苯基乙基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-棕榈酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-油酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺
5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-5-脱氧基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺-2’，3’-环碳酸酯
实施例BJ
研究了化合物66(1-531)及其前药之一(实施例BH)的口服生物利用度，该研究基于化合物66给药后和前药给药后的尿排泄。利用化合物66的静脉推注作为100％生物利用度对照。
每种药物和每种给药途径使用4只大鼠。在给药前2小时和给药后2小时取出食物；允许获取水。第一组大鼠通过尾静脉推注接受化合物66酒石酸盐(20mg/kg当量的游离碱)的水溶液。第二组通过经口管饲接受化合物66酒石酸盐(20mg/kg当量的游离碱)的水溶液。第三组大鼠通过经口管饲接受前药5-氨基-1-(5-N-苄基氨基-2，3-二-O-特戊酰基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺(20mg/kg当量的化合物66游离碱)的溶液。
大鼠饲养在代谢笼中，在以下间隔采集尿：-15-0(对照)、0-24和24-48小时。记录每次收集的体积，将5ml等份在-20℃下冷冻。然后对静脉和经口给药测定化合物66的尿浓度。
通过HPLC测定样品的完整化合物66。每个样品在HPLC分析之前用水1∶10稀释，HPLC分析在Beckman Ultrasphere C18反相柱上进行(4.6次，150mm，5微米)，在室温下用40％甲醇和20mM庚烷磺酸(钠盐)的流动相以1.5ml/min的流速等度洗脱。通过259nm处的紫外吸光度监测洗脱液。
通过比较静脉给药和口服给药后排泄的化合物66游离碱的量(剂量百分比)来确定口服生物利用度。估计前药的生物利用度为大约48％，酒石酸盐为14％。
Figure S2006800187562D01521
Figure S2006800187562D01531
Figure S2006800187562D01541
Figure S2006800187562D01551
Figure S2006800187562D01561
Figure S2006800187562D01571
Figure S2006800187562D01581
Figure S2006800187562D01591
Figure S2006800187562D01601
实施例：阿司匹林给药降低了心脏手术后的发病率和死亡率
以下实施例描述了本发明的特定方面以说明本发明，并且提供了用来降低心脏手术后的发病率和死亡率的方法的描述。该实施例不应被视为限制本发明，因为该实施例只是提供在理解和实施本发明中有用的特定方法。
1.材料与方法
a.患者群体和方法
一个预期的纵向研究包括5436名患者。合格的患者包括患有医学上难治的冠状动脉疾病并且在北美和南美、欧洲、中东和亚洲17个国家的70家医疗机构中安排了冠状动脉搭桥手术的患者。在每个医疗机构，预期有100名患者参加，基于允许在该医疗机构经历手术的所有患者之间随机采样的系统采样方案。
在参加的5436名患者中，有5065名完成了该研究，包括在最后的分析中。在排除的371名患者中，32名由于患者退出而排除，2名由于手术前死亡而退出，97名由于取消或重新安排手术而退出，132名由于程序改变而退出，11名由于不慎参加其他研究而退出，86名由于数据不完整而退出，11名由于采血、运输或贮存不全而退出。
在血管重建的48小时内给3001名患者施用剂量为160mg至650mg的阿司匹林。由不知情的研究人员每天记录与使用阿司匹林有关的所有潜在的副作用。独立的研究人员按入院治疗的整个天数以及入院、出院或者直至死亡时给包括促血栓和抗血栓药物以及促凝和抗凝药物和血液产品的所有药物编号。
b.研究数据
对于参加的每名患者，在患者从入院到出院的入院治疗期间由独立的研究人员采集大约7500组数据；主治医生不知道所有研究数据。数据包括人口统计、病史、临床、实验室、心电图、专科检验、资源利用和不良结果。在最后一名患者加入后，为了完整和准确，集中查询每名患者的所有数据组，在数据库关闭前记录所有变化。
c.结果测量
所有结果预先制定、通过方案定义、以及由不知道治疗组的研究人员辨别。致死的和非致死的结果分类为心脏(心肌梗塞、充血性心力衰竭和心源性死亡)、大脑(中风、脑病和脑死亡)、肾(功能障碍、衰竭和肾死亡)、胃肠(缺血、梗塞和胃肠死亡)或其他(如感染、肺病)。心肌梗塞的诊断需要：出现新的Q波(由明尼苏达编码1-1-1I或1I-2-7定义)；或与CK-MB同工酶值升高有关的新的持续ST段或T波变化(明尼苏达编码4-1、4-2、5-1或5-2)；或急性心肌梗塞的尸检证据。心力衰竭的诊断需要：使用心室辅助装置；或者使用连续变力支持至少24小时；或者心力衰竭的尸检证据。大脑结果分类为：临床上诊断的中风或脑病；或局部或全面缺陷的CT、MRI或尸检证据。肾功能障碍定义为：血清肌酐≥177μmol/L，伴有高于基线≥62μmol/L的升高；定义为需要透析的功能障碍，或肾衰竭的尸检证据。胃肠缺血定义为诊断为肠缺血或在研究时检测到的腹痛；梗塞需要肠切除术或肠梗塞的尸检证据。
d.统计学分析
使用卡方检验比较了服用阿司匹林与对照人群相比的死亡危险。与心脏、大脑、肾和胃肠道有关的各个缺血结果以及组合的缺血结果适当地使用Fisher精确概率检验或卡方检验比较。比值比和95％置信区间以相关的P值给出。在单变量分析中在双侧标称P值＜0.15时显著性的所有预测变量随后都输入多变量logistic模型。进行逐步logistic回归，保留在双侧标称P值＜0.15时显著性的变量。所有统计学分析都用SAS8.12版软件(SAS Institute，Cary，N.C.)进行。
e.结果
研究组之间存在较小的差异，接受阿司匹林的患者明显更可能具有不稳定型心绞痛、先前的PTCA以及用β-阻断剂、钙通道阻滞剂和抗血小板疗法治疗，具有心力衰竭史以及用ACE抑制剂治疗的可能性较低(表1)。任何医学或手术特征没有其他重要的差异。大多数心脏药物继续使用到手术时，然而，在入院时已经接受抗血小板治疗的患者中有50％在手术前中断抗血小板药物。
在血管重建48小时内接受阿司匹林的患者在入院治疗期间死亡的危险为1/4(1.4％对比5.9％；P＜0.0001)。接受阿司匹林的患者与心脏、脑、肾或胃肠道有关的非致死性缺血并发症的危险为1/2(13.6％对比24.5％；P＜0.0001)。图24。在接受阿司匹林的患者中，没有一例在手术后12小时内死亡(对照组为25名患者)，一人在手术后48小时内死亡(对照组为42名患者)。图25。
在手术后前30天提高的存活率只与早期使用阿司匹林有关，这与其他可逆的因素不同。(图25)。手术48小时后第一次使用阿司匹林与死亡率的显著降低无关(15％；P＝.534)。阿司匹林对致死性结果的有效效果在包括性别、年龄、地区和保险类型的所有亚组中是显著的。在接受阿司匹林者中入院治疗的时间长度减少(9.57±7.14对比11.32±9.44；P＜0.0001)。与再灌注后血小板输注和预防性抗纤溶剂有关的危险与死亡和缺血并发症危险的增加有关。阿司匹林使用基本上减少了、但是没有消除这些危险。图26。除了根据本方法使用阿司匹林的预料之外的益处以外，阿司匹林的使用也是安全的。表2。
已经描述了本发明的各种实施方案。说明书和实施例意在说明而不是限制本发明。实际上，本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神或权利要求书的范围的条件下，可以对所述的本发明的各种实施方案进行改变。
表1.在5065名研究患者中人口统计学和医学特征的基线
*包括非洲裔美国人、美洲印第安人或西班牙人种族的患者。
表2.在5065名研究患者中的阿司匹林使用和不利的安全性事件
表3A.死亡率的多变量分析
Figure 2006800187562A00801662
*包括非洲裔美国人、美洲印第安人或西班牙人。
*在血管重建之前一周。
表3B.死亡率的多变量分析
Figure 2006800187562A00801671
趋势分析(Meta study)
实施例：阿卡地新对心肌梗塞、中风和手术死亡的影响
目的：确定嘌呤核苷阿卡地新对冠状动脉搭桥(CABG)手术后的致死性和非致死性心血管和脑血管并发症的影响。
数据来源：各患者数据来自5个随机化的、安慰剂作为对照的、双盲临床试验，包括美国、加拿大和欧洲的81家国际医疗中心。
研究选择：包括来自所有临床试验的所有患者：总共4043名患者接受CABG手术，可评价有效性，随机化为通过连续7小时静脉输液以及通过心脏麻痹液接受安慰剂(n＝2301)或阿卡地新(0.1mg·kg-1·min-1；n＝2012)。
数据提取：预期使用标准化形式和方法和双数据录入采集各患者的数据。使用普通参数法和按患者分析的趋势分析，包括固定效果和随机效应模型。对于所有试验，接纳和排除标准、普通方法和结果评价技术均相似。
数据合成：阿卡地新使主要后果-围手术期心肌梗塞(MI)的发病率降低了27％(比值比[OR]，0.69；95％置信区间[CI]，0.51-0.95；P＝.02)，使手术后4天心源性死亡的发生率降低了50％(OR，0.52；95％CI，0.27-0.98；P＝.04)，使组合后果(MI、中风或心源性死亡)的发生率降低了26％(OR，0.73；95％CI，0.57-0.93；P＝.01)。这些后果的随机效应模型也产生显著性的结果。阿卡地新没有显著降低脑 血管意外的发生率(OR，0.69；95％CI，0.44-1.08；P＝.10)。到手术后第4天MI后心源性死亡的二次分析证明阿卡地新使死亡数降低了89％，从安慰剂组的13.3％(13例死亡/98例MI)降低到阿卡地新治疗组的1.4％(1例死亡/71例MI)(P＝.003)。阿卡地新还使用于严重手术后心力衰竭的心室辅助装置的使用减少了1/3(P＝.05)。最后，关于安全性，阿卡地新和安慰剂组的不良事件发生率相似，例外的是阿卡地新组的血清尿酸短暂升高。
结论：该趋势分析的研究表明，在经历CABG手术的患者中，在手术之前和过程中用阿卡地新治疗可以减少早期心源性死亡、MI和组合的心血管不良后果。JAMA1996；277：325-332。
在过去20年里，全世界接受冠状动脉搭桥(CABG)术的患者数已经显著增加到每年超过800,000人，相关的医疗保健支出超过200亿美元。死亡率目前为不到1％至8％以上，发病率为1％至28％-由于人群持续老化以及选择高危患者用于该程序，发病率可能更糟。因此，预期这些不良心血管后果的花费将会继续升高，现在估计为每年40亿美元。
尽管已经提出几种治疗方法来减少心脏手术后的不良后果，但是只有一种药物进行了大规模临床试验研究-阿卡地新，一种在缺血状况中选择性升高组织腺苷水平的嘌呤核苷类似物。在81家国际中心，已经对美国、加拿大和欧洲的超过4000名CABG患者使用类似的方法进行了5项多中心试验，采用心肌梗塞(MI)、心源性死亡和中风作为后果研究了阿卡地新的安全性和有效性。然而，由5项试验中的任一项的结果难以评价阿卡地新在CABG患者中的效果的真实程度，因为这些试验只能检测50％或以上的效应大小。较小的效应尽管具有潜在的治疗性，但是不能被此设计鉴别。因此，我们(缺血研究和教育基金会[IREF]和围手术期缺血多中心研究[McSPI])决定将所有5项试验的数据结合起来，利用公知的标准和方法进行按患者分析趋势分析，以获得检测真实效应大小的适当能力，并可靠地报告阿卡地新的有效性和安全性。也就是说，我们利用阿卡地新在超过4000名 CABG患者中的完整临床数据来确定该药物对预先确定的MI、中风和心源性死亡的围手术期后果的效果。
表1.研究设计*
Figure 2006800187562A00801691
*试验均为随机化、安慰剂对照、双盲。所有患者都经历冠状动脉搭桥(CABG)术。
+LD表示低剂量(0.05mg·kg-1的阿卡地新)；HD，高剂量(0.01mg·kg-1·min-1 的阿卡地新)；VHD，极高剂量(0.19-0.38mg·kg-1·min-1的阿卡地新)。
±排除接受重复CABG、急性经皮腔内冠状动脉成形术失败、不稳定型心绞痛、左心室功能不良。
§组合的后果包括MI、心源性死亡、中风、重度充血性心力衰竭、危及生命的节律障碍。
1.方法
a.各试验的一般结构
趋势分析包括在美国、加拿大和欧洲经历CAGB手术的所有患者，他们接受剂量为0.1mg·kg-1·min-1的阿卡地新。不排除满足这些 标准的患者。所有5项研究都是随机化的、安慰剂对照的、双盲的，在81家参与的McSPI机构的批准下和患者的知情同意下进行。接纳和排除标准、普通方法和后果评价技术对于所有试验都是相似的，但有几个例外(表1)。值得注意的是2期试验1013和3期试验1016包括3个试验组：安慰剂组、低剂量阿卡地新组(0.05mg·kg-1·min-1)和高剂量阿卡地新组(0.1mg·kg-1·min-1)，但是结果证明，低剂量阿卡地新尽管是安全的，但是在减少后果方面似乎无效，我们从趋势分析中排除了低剂量数据(试验1013中的n＝41；试验1016中的n＝214)。对于所有患者，盲试药物(阿卡地新或安慰剂)静脉内施用，在诱导麻醉前大约15分钟开始，持续总共7小时，以包括围手术期(搭桥前和搭桥后)和直接手术后(进入重症监护室)期。对于所有研究(除了试验1023[n＝38]，它不采用心脏麻痹)，在心肺旁路术过程中使用心脏麻痹液保护心肌，对于随机化为接受阿卡地新的患者，心脏麻痹液中含有浓度为5pg/ml的阿卡地新，或者对于随机化为接受安慰剂的患者，含有安慰剂(无菌注射用水)。
b.研究方案
在手术之前，研究人员确定心脏病史并且记录心脏插管信息。限制使用潜在影响内源性腺苷浓度的药物(其可使有效性分析复杂化)，包括双嘧达莫、茶碱、腺苷和己酮可可碱。继续使用所有长期心血管药物，包括硝酸盐、β-阻断剂、钙通道阻滞剂，直到手术时。在手术过程中，但是在搭桥之前，施加常用的监测仪，将麻醉技术标准化，使血液动力学变量(血压、心率)保持在试验1013、1016和1023的特定界限内；对于试验1023和1017，推荐麻醉剂应用和血液动力学控制的指导。对于所有研究，特别排除预防性使用具有潜在抗缺血性质的心血管药物(硝酸盐、钙通道阻滞剂)，以避免复杂的数据解释。在心肺旁路过程中，对于3期试验，不控制手术技术和旁路方法(包括应用心脏麻痹)，一般使用膜式氧合器和动脉过滤器，通过血液稀释和中度全身低温进行旁路。旁路后，不控制使用正性肌力药和血管扩张剂(不包括预防性使用抗缺血药物)和治疗临床上检测到的缺血； 记录施用的所有药物。
c.后果
对于所有研究，由不知道患者身份和分组的IREF协调中心研究人员确定并验证主要后果MI和其他次要后果。次要后果包括心源性死亡、中风、危及生命的节律障碍和重度心力衰竭(表1)。对于MI，重复心电图(ECG)由核心研究人员使用明尼苏达编码标准进行中心编号。肌酐激酶-MB(CK-M13)浓度在手术后前4天大约采样18次，对于3期研究，使用免疫酶测定(Hydritech Tandem-E CK-MB II，SmithKline Beecham，Van Nuys，Calif.)进行中心分析。尸检中存在梗塞基于来自相应机构的病理学数据，并且由终点委员会(EndpointCommitte)集中确认。脑血管意外(CVA)由相应机构的神经学家诊断，并且需要明显病灶缺陷的指征和症状在手术后持续24小时以上。在存在非病灶临床指征的情况下CVA的诊断需要与新的脑梗塞一致的计算机体层摄影扫描或磁共振成像结果。心源性死亡和CVA的后果由2名独立的不知道患者分组的IREF研究人员确认，不一致的情况由第三名研究人员解决，以多数人的观点为准。独立的安全性和数据监测小组持续检查每个3期试验的所有安全性数据，监督每个试验的预定终止原则。
Figure 2006800187562A00801721
*MI表示心肌梗塞；CHF，冠脉动脉心力衰竭；CABG，冠脉动脉搭桥术；PTCA，经皮经皮腔内冠状动脉成形术；圆点，数据未获得；EF，射血分数。
！左主动脉狭窄50％或以上的患者的百分比。
#2根或更多血管狭窄70％或以上的患者的百分比
d.数据和统计学分析
趋势分析的终点在分析之前预先确定，主要后果是MI，次要后果是心源性死亡、中风和MI、心源性死亡或中风的组合不良心血管后果。对于每个试验，基于EGG上出现新的Q波和满足方案确定的CK-MB标准或者存在梗塞的尸检证据诊断MI11，13-16。用于试验的肌酐激酶-MB标准通常是(1)任何时间CK-MB浓度为100ng/ml或更高，边界值为50％或更高；(2)手术12小时后任何时间CK-MB浓度为70ng/ml或更高，边界值为50％或更高；或(3)24小时后CK-MB浓度为12ng/ml或更高，边界值为10％或更高(对于试验1013，标准为CK-MB大于50U/L11；对于试验1024，15不使用第三个条件)。也评价一系列其他预定的后果，包括MI后的心源性死亡、晚期心源性死亡(到手术后第28天)、所有原因的死亡(到手术后第4天和手术后第28天)以及使用晚期心源性死亡和所有原因死亡的组合终点。
在5个临床试验的4311名患者中，从趋势分析中排除了265名：255名在试验1013和1016中接受低剂量阿卡地新(0.05mg·kg-1·min-1)，5名在试验1013中接受极高剂量阿卡地新(0.19-0.38mg·kg-1·min-1)，5名在试验1016中无法评价MI(1名安慰剂患者和4名高剂量阿卡地新患者)(表1)。根据患者的趋势分析使用Whitehead19和Yusuf等20所述的方法进行。对于每项研究，考虑每名患者的危险组和治疗中心的信息，计算比较阿卡地新组与安慰剂组的后果事件率的对数比值比的估值。然后使用估计的方差的倒数计算对数比值比的加权平均值。对于所有情况，使用固定效应模型，当研究之间的不均一性明显时，增加有机效应模型。因为试验1024使用连续设计分析MI，对数比值比的估值偏移，需要(使用PEST3.0软件 包21)计算说明终止程序的调整的估值。研究之间治疗效果的均一性使用Whitehead和Whitehead所述的Q统计方法19来检验，其中发现显著性P值指示治疗效果在研究之间不是不变的。此时，我们应用随机效应模型使用矩量法推导方差的研究之间组分的估值19。对于存活数据分析，使用Kaplan-Meier乘积极限法22比较2种(阿卡地新与安慰剂)存活率分布。
2.结果
趋势分析中总共包括4043名患者，其中2031名接受安慰剂，2012名接受阿卡地新(0.1mg·kg-1·min-1)。安慰剂组和阿卡地新组患者具有相似的心脏病史、手术前心脏插管、心脏麻痹类型和安慰剂和阿卡地新输注平均持续时间(表2)。
a.有效性
心肌梗塞：心肌梗塞是主要的有效性后果，根据新Q波的出现和CK-MB浓度超过方案定义的限值或者MI的尸检证据来确定。在5个临床试验中的每一个中，阿卡地新组比安慰剂组的MI发病率低(图1)，但是这种差异只在3期试验1016中是显著性的14。研究之间均一性的检验显示没有显著的不均一性(P＝.39)，因此只使用固定效应模型来分析组合MI结果。阿卡地新使梗塞发病率降低了27％，从4.9％降至3.6％(比值比[OR]，0.69；95％置信区间[CI]，0.51-0.95；P＝.02)，如图1所示，CI基于逐个患者分析(并非基于组合数据)。同样，尸检确定的MI的发病率在阿卡地新治疗组中较低(16/19安慰剂组患者，2/11阿卡地新组患者，P＝.001)。
Figure 2006800187562A00801751
图1.各试验和逐个患者趋势分析的心肌梗塞(MI)结果。线段表示比值比的95％置信区间。
心源性死亡：在每项研究中，到术后第4天心源性死亡的发生率在阿卡地新治疗组患者中较低(除了2期试验1013，其中没有心源性死亡)，在总人群中降低50％，从26例死亡降至13例(OR，0.52；95％CI，0.27-0.98；P＝.04)。均一性检验不是显著性的(P＝.76)，因此仅使用固定效应模型。
Figure 2006800187562A00801752
图2.各试验和逐个患者趋势分析的组合不良心脏后果(心肌梗塞、心源性死亡或中风/脑血管意外)。线段表示比值比的95％置信区间。
中风(CVA)：对于每项试验，患有CVA的患者数在阿卡地新组中低于安慰剂组，除了试验1013，其中未报告有任何中风。研究之间 的均一性的检验获得介于边缘的结果(P＝.18)；因此，使用随机和固定效应模型两者来分析该结果。CVA的发病率在安慰剂组中为2.3％(47/2031)，在阿卡地新组中为1.6％(32/2012)，使用固定效应模型(P＝.10)或随机效应模型(P＝.12)都没有统计学显著性。
组合不良心血管后果(MI、CVA或心源性死亡)：在每一试验中，到术后第4天具有1种或多种不良心血管后果的患者数在阿卡地新组中始终低于安慰剂组(图2)。均一性检验是统计学显著性的(P＝.02)，按照研究设计和方案预先指定的，使用固定和随机效应模型两者。阿卡地新治疗使组合后果降低26％，从7.6％降至5.6％(固定效应模型，P＝.01；随机效应模型，P＝.04)，如图2所示。对于主要和次要后果变量的趋势分析结果总结在图3中。
b.其他后果
MI后死亡：在71名施用阿卡地新的患者和98名施用安慰剂的患者中发生心肌梗塞(表3)。在阿卡地新组的71名发生MI的患者中，1名患者(1.4％)在术后前4天发生心源性死亡，在安慰剂组中为13名患者(13.3％)(降低89％；P＝.003)。在两组中，术后前4天心源性死亡的发生率在没有MI的患者中类似，或者无法评价MI；在阿卡地新治疗组中为0.6％，在安慰剂组中为0.7％。
Figure 2006800187562A00801761
图3.逐个患者趋势分析中方案指定事件的概况。线段表示比值比的95％置信区间。星号表示P值是采用固定效应模型计算的；短剑符号表示P值是采用随机效应模型计算的；双短剑符号表示对于心源性死亡，研究之间的方差估值是阴性的；因此，不能估计随机效应模型的检验统计值。组合是指分别地或者任意组合地发生任意事件(心肌梗塞、心源性死亡或中风/脑血管意外)。
表3.心肌梗塞后死亡
Figure 2006800187562A00801771
*P值利用Cochran-Mantel-Haenszel检验确定。
存活率：阿卡地新组患者的存活率在整个观察期间降低(图4)，两个治疗组中的大多数死亡发生在术后前4天。阿卡地新的主要存活效果似乎是作用于MI后死亡(13名安慰剂组患者，1名阿卡地新组患者)和术后前4天内的心源性死亡(26名安慰剂组患者，13名阿卡地新组患者)。在28天的心源性死亡也减少(34名安慰剂组患者，20名阿卡地新组患者)；阿卡地新对非心源性死亡没有影响。
Figure S2006800187562D01771
图4.比较阿卡地新治疗患者和接受安慰剂的患者的存活率分析
安全性：在各项研究中和所有研究之间，阿卡地新和安慰剂组的严重不良事件的发生率通常相似，即，阿卡地新组为9.1％(n＝184/2014)，安慰剂组为9.0％(n＝182/2032)。(注意在安全性分析中包括3名患者[总共4046名患者]，4043名患者用于评价有效性。)然而，直接危及生命或者延长住院时间的心力衰竭降低了大约1/3(安慰剂，3.2％[66/2032]；阿卡地新，2.1％[43/2014]；P＝.03)，主动脉内球囊泵的使用从安慰剂组的3.5％(70/2025可评价该终点)减少至阿卡地新治疗组的2.4％(48/2006)(P＝.049)。
3.评论
我们对迄今为止阿卡地新在经历CABG手术患者中的全部临床数据的趋势分析支持阿卡地新降低围手术期MI、早期心源性死亡和组合不良心血管后果(MI、心源性死亡、中风)的发生率。具体来说，阿卡地新治疗使MI显著降低27％，使组合后果显著降低26％，使心源性死亡显著降低50％。这些结果第一次证明了与搭桥术和冠脉再灌注有关的严重心肌操作可以被预防，另外，提出了一种新的药学方法-天然核苷阿卡地新的调节。
a.问题和试验结果的显著性
尽管手术和麻醉技术具有进展，但是与CABG手术有关的发病率和死亡率仍然提高，这是由于患者的人口统计学数据发生变化，即，患者现在更年老和更加不健康，通常先前进行过CABG手术或严重失败的血管成形术1-7，26-28。报告的围手术期MI率为1％-15％或更高，心源性死亡率为0.5％-8.0％，中风率为2％-6％。1，2-7，26-28目的在于缓解与CABG手术有关的不良后果的药物干预已经在一系列较小的试验中进行了研究，主要集中将这些后果替换为主要终点。硝酸盐、β-阻断剂、钙通道阻滞剂已经被推荐，但是还没有被广泛接受，因为初步的发现还未得到证实。1，7，8也已提出各种心肌预防技术来减少这些后果；然而，这些发现基于相对较小的生理学研究，29-31没有在大规模后果试验中得到证实。
对用于缓解缺血的腺苷32和腺苷调节剂(阿卡地新)9-11，13-15，38，35 的兴趣，与阿卡地新在旁路条件下治疗的动物中具有有效性的发现相结合，使我们发展了2期和3期临床试验系列。综合起来，趋势分析涉及4043名患者，其中2031名接受安慰剂，2012名接受高剂量(0.1mg·kg-1·min-1)的阿卡地新。迄今为止，该计划为最大的一组试验，其目的在于降低心脏手术后的心血管发病率和死亡率。
各项试验：2期试验1013证明阿卡地新降低了围手术期缺血的发病率和标记的严重程度，并且基于这些发现，我们发展了2个3期试验(1016和1017)，以研究高剂量阿卡地新在预防围手术期MI中的效力。13，14两项研究都设计为检测50％的效应大小(基于2期试验1013所示的效应大小)，具有80％的能力(b＝0.2)和0.05的显著性水平，为多重比较而调整。尽管两项试验都没有证明阿卡地新显著降低方案确定的MI的发病率，但是这些试验提供了对非Q波梗塞的生化标记的独特理解，发现这些患者中实际释放CK-MB(17％的患者在术后的CK-MB浓度大于100ng/ml13，14，27)，也许代表与手术有关的机械和其他损伤，而不是不可逆的缺血损伤。因此，选择更更特异和保守的MI的定义将减少“CK-MB噪音”的分布。因此对于试验1016发展的MI定义包括心电图Q波和预定限度的CK-MB释放的出现或者梗塞的尸检证据。14利用该定义，分析揭示了在施用阿卡地新的患者中梗塞率(1.5％)显著低于安慰剂组(5.2％；P＝.02)，以及较低的中风率(0.5％对4.2％；P＝.02)和组合的不良心血管后果(MI、CVA或心源性死亡)(1.9％对9.9％；P＝.004)。最后，在38名CABG患者中进行了小规模的研究(试验1023)，证明阿卡地新改善了搭桥术后的心室功能16。因此，我们建立了较大规模的第三个3期试验(1024)，该试验在来自54个中心的2698名患者中进行。基于在试验1016中发现的效应大小，试验1024在统计学上能够检测50％的效应大小，在0.05的显著性水平上具有95％的能力15。结果揭示阿卡地新降低了MI、中风或心源性死亡和组合后果的发生率，但是并不显著(图1、2)。
趋势分析的原理：3期试验的发现可信地证明了开始时涉及50％ 效应大小的研究设计尽管是基于以前的较小规模试验，但是高估了效应大小。如果试验1016(n＝414)的MI的效应大小为73％14，试验1017(n＝821)为23％13，试验1024(n＝2698)为22％15，则效应大小的更合理的估值可能是20％-25％。例如，尽管有2698名患者参加，但是试验1024检测低于35％的效应大小的能力较小(β＞0.4)38，在该试验中检测25％的效应大约需要所参加患者数的3倍(8757名患者)21。3项主要的3期试验(1016、1017、1024)的检查揭示了另一个重要发现：在3项试验中评价的3个后果变量(MI、CVA、死亡)中，这9个后果的发生率在阿卡地新治疗的患者中一致性地较低(11％-89％)，尽管样本容量有限，但是大多数比较都具有统计学显著性。
b.趋势分析发现
心肌梗塞：以前的几项研究针对于抗缺血剂和心肌保护技术的有效性；但是，大多数研究只包括数量有限的患者，并且只测定后果的替代项1，7，8，20，31。以前没有研究大到足以检测对MI的效应，因此本发明是独特的。另外，该趋势分析的可能的发现以及各试验中的支持数据11，13-16证明了药物干预可以预防与CABG术相关的MI。这一发现是重要的，因为在CABG过程中由持续45分钟或更长的严重缺血损伤(完全阻塞冠脉血流)诱发损伤和梗塞，药物治疗减轻这种显著机械损伤的效果的可能性允许进一步探索针对这种损伤的新方法 8。这些结果也提示不仅特定药物阿卡地新可以减轻损伤，而且在缺血组织中保持腺苷的一类药物在这种重要的临床条件中可能具有特别的优点32。这些发现与实验室和动物实验数据一致，提示对再灌注后心室功能39，40、心室节律障碍9，41、血小板粘附42-48、粒细胞积累 9，44和其他现象具有有益的效果。然而，这些结果无法使我们判断哪些机制(如果有的话)适用于人类。最后，应当认识到，该计划中MI的定义非常具体，涉及Q波的出现和实际的CK-MR释放。假如CABG术后的这些梗塞与较差的长期预后有关(即，死亡和复发MI增加)46，47，则可以推断阿卡地新可能具有有益的长期效果，需要进 一步研究。
死亡率：在阿卡地新治疗结果中存活率提高(图4)，主要的效果是对早期(≤4天)的心源性死亡(26名对13名患者)。此外，确定阿卡地新对MI后死亡的影响的二级分析结果证明这种死亡降低74％(4/71阿卡地新治疗的患者，21/98安慰剂组；P＝.003)，支持阿卡地新降低MI死亡发生率的说法。这提示阿卡地新不仅降低梗塞的发生率而且降低其程度，并且或许降低搭桥后心肌顿抑的影响，这是通过生化标记(CK-MB释放)或MI后死亡率而确定的。最后，阿卡地新对非心源性死亡似乎没有实际性的作用。
组合的心血管后果：趋势分析证明阿卡地新使MI、心源性死亡和中风的组合心血管后果降低了26％；也就是说，阿卡地新组较少的41名患者具有不良后果(表3)。组合后果从7.6％降至5.6％，提示使用阿卡地新将预防每1000名经历CABG手术的患者中大约20名的不良后果，或者说每年16000名患者，由此也降低了资源利用和相关的住院费用1，7。
其他发现：基于安全性数据，给经历CABG手术的患者施用剂量为0.1mg·kg-1·min-1的阿卡地新7小时是安全的，例外是在输注结束时达到峰值的短暂的高尿酸血症，但是在住院期间解决，而没有临床后遗症14。不同于腺苷32，阿卡地新不影响血压或心电传导。另一个安全性发现是使用阿卡地新使主动脉内球囊泵的使用率和严重心脏衰竭的发生率较低，这与最近的发现相一致，最近的发现证明了阿卡地新治疗患者在直接搭桥后期的左心室功能改善。改善的搭桥后心室功能可能是阿卡地新提高MI后存活率的机制。最后，我们还发现输注低剂量阿卡地新(0.05mg·kg-1·min-1)尽管是安全的，但是对任何后果没有显著地影响。
趋势分析强度和限制因素：对超过4000名患者的5项试验的结果提示阿卡地新对MI、心源性死亡和中风具有真正的影响。我们决定将来自所有试验的数据结合起来，并应用趋势分析方法评价阿卡地新在CABG患者中的抗缺血或心肌保护作用，这一决定是基于观察结 果和随后在所有3期试验设计中克服需要50％效应大小的标准的需要。支持趋势分析的有效使用的因素包括研究之间的均一性，如患者群体、接纳和排除标准、临床设计、药物输注技术、后果可变测量、研究的时间段19，48-50。而且，曾经接受阿卡地新(0.1mg·kg-1·min-1)的经历CABG手术的各个患者的数据是变化的；因此，可以包括所有试验，无论是阳性的还是阴性的。同样，可以进行逐个患者的分析，这种分析被认为是更准确的17，18。最后，所有试验都在相对较短的4年时间内完成。
然而，趋势分析可能有大量限制因素19，20，48-54。第一个是研究的非随机选择19，49-52，这与本分析无关，因为我们包括了所有已经接受阿卡地新并且经历CABG手术的患者。第二个是同一数据的多次检验 19，52，存在这一情况，因为我们先是单个分析了5个试验中的每一个的数据，然后再次使用趋势分析进行分析，但是我们使用的标准参数统计学方法足以克服这一限制因素。第三个是选择偏性53，由于我们包括所有患者，因此排除了这种可能。第四个是研究之间的差异性或不均一性19，49，52，这与本分析有关(表1)。然而，还不清楚这些差异中的哪些影响观察结果。我们发现诸如麻醉技术或心脏麻痹等因素对分析的潜在混杂影响是最小的；这些试验之间后果均一性的正式统计学研究揭示只有组合不良后果存在不均一性，在该情况中，随机和固定效应模型产生类似的结果。
4.结论
我们检查了阿卡地新在CABG手术中的全部临床资料，包括使用相当类似方法的5项多中心试验。对超过4000名患者的趋势分析结果表明用阿卡地新治疗(在手术之前和过程中随固定浓度的5μg/ml心脏麻痹液静脉施用0.01mg·kg-1·min-1)可以减少围手术期MI、心源性死亡和组合不良心血管后果。
需要继续研究腺苷相关化合物来定义可能特别受益于这种治疗的经历心肌血管重建的患者亚群，由此允许适当的医疗支出；也可以 对再灌注损伤的其他临床情况进行研究。
缺血研究和教育基金会(IREF)和Gensia Pharmaceuticals，Inc.对该趋势分析和相关的发表给予了大力支持。研究者、中心分析单位(IREF)和Gensia Pharmaceuticals，Inc.之间没有其他经济关系。该趋势分析的结果及对它的解释只是由研究人员和IREF做出的，GensiaPharmaceuticals，Inc.并没有解释或认可该结果。
围手术期缺血多中心研究(McSPI)小组是由来自世界上大约150个医疗中心的研究人员组成的团体，集中研究围手术期心肌梗塞、中风、肾功能障碍以及其他器官功能障碍和这些疾病的卫生经济学的问题。缺血研究和教育基金会是致力于这些领域的多中心研究的非盈利性基金会，与McSPI研究人员和他们的机构有密切联系。
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本文引用的所有参考文献都全文引入作为参考。
应当指出，在全文中出现术语“AICA核苷”或“阿卡地新”时，均可解释为表示阿卡地新、其前药、类似物或盐。
上述实施例决非限制本发明的范围。此外，本领域技术人员应当理解，可以在不背离权利要求书的精神或范围的情况下进行许多改变和修改，这些改变和修改包括在本发明的范围内。

Claims (8)

1.5-氨基-1-β-D-(5-苄基氨基-5-脱氧-1-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺、5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺或其盐在制备用于降低需要其的患者的死亡率的药物中的用途，其中所述患者具有左心室功能降低并且射血分数小于30％。
2.5-氨基-1-β-D-(5-苄基氨基-5-脱氧-1-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺、5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺或其盐在制备用于治疗左心室功能降低并且射血分数小于30％的患者的药物中的用途。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中5-氨基-1-β-D-(5-苄基氨基-5-脱氧-1-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺、5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺或其盐的施用提供了大约1μg/ml到大约20μg/ml的血浆浓度。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中所述化合物为5-氨基-1-β-D-(5-苄基氨基-5-脱氧-1-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺或其盐。
5.如权利要求1或2所述的用途，其中所述化合物为5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺或其盐。
6.如权利要求1或2所述的用途，其中5-氨基-1-β-D-(5-苄基氨基-5-脱氧-1-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-甲酰胺、5-氨基-1-(5-氨基-5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)咪唑-4-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺或其盐以0.1mg/kg/分钟施用。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述死亡是由心血管事件引起的。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述心血管事件是心肌梗塞、节律障碍或心室障碍。
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