JP7137225B2 - 非ヒト哺乳類の脳梗塞モデルによる観察方法及び非ヒト哺乳類の脳梗塞モデルによる観察装置 - Google Patents
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Description
そこで、網羅的観察を行える脳梗塞モデルと観察方法の新たな開発が必要である。網羅的観察を行える脳梗塞モデルと観察方法を確立することにより、従来の観察方法では捉えることのできなかった新規病態の発見や、より確実な薬効判定など脳梗塞の病態解明、治療法の確立に大いに役立つことが期待される(特許文献1,2)。
本発明者は、上記モデルを用いた観察で、脳虚血に伴い脳血管の異常収縮(spasm)が起きること及びこの異常収縮が脳虚血時の循環障害の大きな原因となるため、当該異常収縮の予防薬が脳梗塞治療薬になることを見出した。さらに、異常収縮の発生機序が、αアドレナリンレセプターを介する交感神経の活性化であること、及びカルシウム・チャンネルを介したカルシウムの細胞外からの流入であることを見出した。こうして、本発明は、異常収縮予防薬/治療薬及び異常収縮予防/治療の為の薬効スクリーニング方法などを提供する。
当該モデルを用いることにより、狭窄前の正常状態から血管閉塞時、血管再開通時を含めて、その全経過を途切れずに観察することができる。当該方法にて、従来の研究方法では、捉えることができなかった脳梗塞発症直後や再開通時に起こる一過性の変化を確実に捉えることができる。
当該モデルと当該観察方法を用いた新たな薬効判定方法を提供する。従来の方法では、脳梗塞薬の効果を、梗塞巣の大きさなどから判定を行ってきた。しかしながら、脳梗塞巣の形成には個体差などの影響が大きく正確な薬効判定には、より確実な判定方法が必要である。当該方法では、薬剤投与による形態学的変化を直接観察することが可能であり、従来の方法にくらべ格段に正確にその薬効判定を行うことができる。
本発明は、上記した課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、非ヒト哺乳類の脳梗塞モデルによる観察方法及び非ヒト哺乳類の脳梗塞モデルによる観察装置等を提供することである。
上記発明において、前記非ヒト哺乳類が、マウス、ラット、ウサギ及びサルからなる群から選択される一つであることが好ましい。このとき、前記非ヒト哺乳類が、全身に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現したGFP非ヒト哺乳類であることが好ましい。
また、別の発明に係る脳梗塞病態非ヒト哺乳類観察装置は、非ヒト哺乳類と、非ヒト哺乳類の頭部頭蓋骨を麻酔下で固定する固定台と、前記非ヒト哺乳類の頸動脈の血流を遠隔的に開閉する頸動脈開閉装置と、前記ヒト哺乳類の脳を観察する二光子レーザー顕微鏡、二次元レーザー血流計、実体顕微鏡のうちの少なくとも一つ、およびその動画を撮影可能な撮影装置とを備えたことを特徴とする。このとき、前記非ヒト哺乳類が、マウスであることが好ましい。
また、別の発明に係る皮質梗塞モデルは、非ヒト哺乳類の一過性前脳虚血及び一側頸動脈狭窄によることを特徴とする。このとき、この皮質梗塞モデルを用いて、皮質脳梗塞を形成した脳を観察できるように処置し、二光子レーザー顕微鏡によって、脳血管の梗塞発症前から虚血・異常収縮・再灌流までの急性期脳梗塞病態および脳梗塞境界領域の亜急性期脳梗塞病態を時間的・空間的にリアルタイムに観察する脳梗塞病態非ヒト哺乳類の観察方法を提供できる。
<頸動脈開閉装置>
図1には、頸動脈遠隔閉塞モデルを作製するために用いた頸動脈開閉装置を示した。当該デバイスは、市販のカニューレ(20-G; inner diameter, 0.95 mm; length, 4 cm; テルモ社製)とナイロン糸(3-0 polypropylene suture [PROLIN], length 12 cm, ETHICON, USA)を用いて作製した(図1(A),(B))。図1(B),(C)に示す矢頭の部分に頸動脈を挟み込み、矢印の方向にナイロン糸を引っ張り上げることにより、頚動脈がカニューレの中に二つ折りに引き込まれ、ヘルニア嵌頓様状態となり、血流を遮断することができる(図1(D),(E))。
図2には、図1で示した遠隔閉塞用の頸動脈開閉装置をマウス頸動脈に装着させ、実際に総頸動脈を閉塞及び再開通させた様子を示した。麻酔下にマウスの頚動脈に正中切開を加え、実体顕微鏡下で、両側の総頸動脈を周りの結合組織から剥離し、ナイロン糸を頸動脈の下をくぐらせた。断端側を、二つ合わせてカニューレに挿入し、反対側にナイロン糸の断端が出るまで進めた。カニューレを6-0シルク縫合(silk suture)を用いて固定し、術創をカニューレが皮膚から出る形で閉創した。皮膚外にあるナイロン糸の断端側を軽い抵抗があるところまでゆっくりと引っ張ることにより、頚動脈がカニューレ内に引き込まれ、血流は停止する。図2(A)は、装着後の全体像、図2(B)~図2(E)は、総頚動脈がカニューレに二つ折りに引き込まれて閉塞され、その後ナイロン糸が押し戻すことにより、再開通させる状態を示した。図2(C),(D)中の矢印は、ナイロン糸に引っ張られ、カニューレ内に二つ折りに引き込まれた頸動脈を示した。
Blood Flow imager, Omegawave)を用いて、血流変化を測定した。麻酔後にマウス頭部を、カスタムメイド定位固定装置(custom-made stereotactic device)を用いて固定し、頭部を正中切開することにより、頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨上から、二次元レーザー血流計を用いて毎秒1枚の撮影にて血流の測定を行った。遠隔閉塞のタイムコースとしては、図3(A)に示す如く、閉塞前の正常状態(Pre)を5分撮影後に、左総頸動脈を閉塞(Left occlusion)、その5分後に右総頸動脈を閉塞し(Bilateral occlusion:BCARO)、20分間両側閉塞の状態を持続させ、その後両側再開通させ(Recanalization)、再開通後1時間までを頭部観察野をまったく動かすことなく連続して行った。図3(B)には、両側の頭頂葉に関心領域を設定して、その血流変化の全経過を示したデータを示した(n=20)。二次元レーザー血流計を用いた観察結果からは、遠隔閉塞を行うことにより初めて捉えることが可能となった特異的な血流変化を2点捉えることができた(図3(B)中の実線矢印と点線矢印を参照)。
decrease during BCARO)。両側総頸動脈閉塞直後に最初の急激な血流低下が認められたが(イニシャル脳血流減少(initial CBF decrease):1段階目の血流低下)、その数分後に、もう一段回の血流低下が起きることが認められた(セカンダリ脳血流減少(secondary CBF decrease):2段階目の血流低下, n=18/20)。図4には、両側総頸動脈閉塞直後から、再開通直前までの間の関心領域における血流変化を拡大表示したものである。18の大脳半球の内、15大脳半球でセカンダリー脳血流減少が6分以内(図4中の点線と点線矢印)に発生した。矢印は、閉塞後6分を超えて起きた2段階目の血流低下を起こした3例のマウスを示す。
2点目の特異的な血流変化としては、再開通後に、一旦回復した血流が、徐々に再度低下していく現象である(re-CBF decrease in the late recanalization period、図3(B)中の右側の点線矢印及び図7)。この再血流低下までの時間は、再開通後の最大血流量との間に有意な相関関係があり再開通後に血流回復が良好な大脳ほど、早期に血流の再低下が起きることが有意(p<0.05)に認められた(図8)。
二光子顕微鏡下を用いた観察を行う為には、脳組織を蛍光色素にてラベリングする必要がある。本方法では、網羅的に脳組織の観察を行う為に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現した組換えGFP雄性マウス(Male green fluorescence protein transgenic mice [GFP-Tg mice; C57BL/6 TgN (b-act-EGFP) Osb]、9週齢~13週齢(日本SLC株式会社)を用いた。また、生理食塩水に溶解した0.01M スルホローダミン101(Sulforhodamine 101 (SR101, Molecular Probes Life Technologies, USA))を腹腔内投与(8μL/kg body weight)することにより、血管内のプラズマ(Plasma)染色を行った。この方法により、脳実質ではアストロサイト(astrocyte)、周皮細胞(pericyte)がGFP陽性の細胞として、また神経網(neuropil)はGFP弱陽性、神経細胞は神経網の中の陰影欠損細胞として確認することができる。また、SR101でプラズマ染色させることにより、その血管径を、また血管内では血小板(platelet)、白血球(leukocyte)がGFP陽性細胞として、赤血球がSR101 plasam染色の中の蛍光陰影として確認できる。
上述したVOIの撮影を連続して繰り返すことにより、3次元に時間軸を加えた4次元での観察が可能となった。この方法により、VOI内の全ての領域の経時的変化をより細かく網羅的に捉えることができた。両側頸動脈遠隔閉塞マウスモデルを用いて、閉塞前から、再開通後までを連続させて当方法を用いて撮影を行なった(n=5)。本方法を用いることにより、VOI内で起こる脳梗塞に伴う病的変化をほぼ余すことなく観察できた。遠隔閉塞のタイムコースとしては、二次元レーザー血流計を用いた血流観察と同様なタイムコースで観察を行った。図3(A)に示すように、二光子顕微鏡を用いた一回当たりのボリュームセット(volume set)の撮影時間は78.2秒必要であり、閉塞・再開通は、ボリュームセット撮影のタイミングに合わせて行った。脳梗塞前から再開通まで91.3分の経過を連続して70回のボリュームセットの撮影を繰り返した。レーザードップラー血流計を用いた血流変化に対応する形で、脳血管に異常収縮が起きることを認めた。
動脈の第1異常収縮の特徴を詳細に観察する為に、脳表動脈に目標を絞り、倍率を変えて、またスキャンシークエンス(Scan sequence)を変更して高フレームレートで撮影を行った(interval depth, 5μm; thickness, 20μm; slice number, 5; individual volume set scanning duration, 6.6 s)。図11(A)には、高倍率・高フレームレートの観察結果を示した。
図11(B)には、開頭部全体の低倍率・高フレームレートの観察結果を示した。第1異常収縮は、前大脳動脈と、中大脳動脈の境界領域の小血管から起こり、spasmが前大脳動脈、中大脳動脈の中枢側に逆行性に伝播するという方向性を持つことが分かった。図11(B)左図の、点線矢印は前大脳動脈、実線矢印は中大脳動脈、点線四角は、二つの動脈の境界領域を示した。中央図の白矢印は、境界領域内の異常収縮の起点となった中大脳動脈の最末梢枝、右側の矢頭は、異常収縮が前大脳動脈、中大脳動脈中枢側へ伝播した状態を示した。図11(C)は中倍率・高フレームレートでの観察結果を示した。境界領域内の中大脳動脈の最末梢枝から起きた第1異常収縮が中枢側に伝播していく様子を示した。矢印は、伝播していく第1異常収縮点を示した。各秒は、第1異常収縮開始後の秒数を表している。
動脈系に起きた異常収縮(Spasm)は毛細血管にも伝播することを認めた。図13(A)には、VOIの中の深度200-300μmまでを最大強度投影した画像の経時的変化を示した。図中の矢印は、穿通細動脈を示す。穿通細動脈の第1異常収縮に同期して、毛細血管にも著明な異常収縮がおきること、動脈では第1異常収縮は一過性で部分再拡張を来すが、毛細血管では頚動脈閉塞中持続して再開通まで異常収縮状態が持続することが認められた。図13(B)には、VOIの中の毛細血管の拡大像を示した。図13(B)は、SR101とGFPの合成画像(Merge)を示し、上側の矢印は、毛細血管壁に存在する周皮細胞(ペリサイト:GFP蛍光陽性)を示す。第1異常収縮に伴い、周皮細胞存在部位近傍で毛細血管腔の完全閉塞が認められた(図13(B)下側の矢頭)。第2異常収縮は、第1異常収縮と比較して程度は軽いものであり、周皮細胞存在部位で毛細血管腔の完全閉塞は認められなかった。
図16に示すように、VOI内全体の蛍光強度(GFP及びSR101共)が、両側頸動脈閉塞・再灌流に伴い劇的に変化することが認められた。信号変化には、大きく3つのポイントがあり、第1異常収縮、再開通、第2異常収縮の前後で劇的に信号強度が変化すること、及び脳深部ほど大きく変化することが認められた。図16(A)には、深度200~300μmのスライスを最大強度投影処理したものの経時的変化を示した(矢印は穿通動脈を示す)。図16(B)には、VOIを深度0~100μm、100~200μm、200~300μmに分けて、それぞれの深度における画面全体のGFP蛍光信号強度の変化を示した。脳深部ほど、蛍光信号強度の変化が大きいことが認められた。
蛍光強度の経時的変化を詳細に捉える為、深度200~300μmの部位で信号強度の変化と穿通動脈の血管径の変化を詳細に検討した。両側頸動脈閉塞直後には、蛍光信号は著明に増大し、第1異常収縮に同期して著明に減少した(first point)。
両側頸動脈閉塞20分では、虚血負荷としては軽度であり、主に大脳基底核領域や海馬などに障害が起こる。その為、二光顕微鏡を用いたい観察では、脳組織自体の障害を直接は捉えがたい。そこで、さらなる虚血負荷を加えた両側総頚動脈遠隔閉塞50分モデルの観察を行なった。蛍光ラベリング、開頭方法、遠隔閉塞方法などは20分閉塞と同様な方法を用いた。図18(A)には、頚動脈閉塞・再開通と撮影のタイムコースを示した。閉塞前の正常状態の観察を5分、左総頸動脈遠隔閉塞5分後に右総頸動脈閉塞を行った。両側総頚動脈閉塞50分後に再開通を行い、再開通後15分の観察を行なった。
両側総頸動脈閉塞後、20分閉塞モデルと同様に第1異常収縮を来した(n=6/6)。その後、動脈は不完全再拡張を来たし、血管内の流速は著名に低下するが完全停止に陥ることはなく血流はしばらく維持される。6例中4例で、両側総頸動脈閉塞後23.8±4.2 min に完全血流停止が認められ、その後に36.7±11.1 min後に20分閉塞とは異なる形で異常収縮(第2異常収縮)が認められた。
上述した通り、本発明者は、脳梗塞病態において脳血管の異常収縮が大きな役割を演じていることを発見した。脳血管の異常収縮病態をより簡便な方法また脳表全体の血管を観察する為に実体顕微鏡を用いた観察を行った。図19(A)に示すように、麻酔後にマウス頭部を正中切開して、カスタムメイド定位固定装置(custom-made stereotactic device)を用いて固定を行い、頭蓋骨全体を歯科用ドリルを用いて薄く削ることにより、実体顕微鏡での脳表血管の観察を可能とした。両側頸動脈遠隔閉塞50分モデルを実体顕微鏡を用いて毎秒1フレームで撮影を行った(図19(B))。実体顕微鏡を用いた観察からも、脳表大血管の第1異常収縮(矢印)、第2異常収縮(矢頭)を捉えることが可能であった。また、第1異常収縮、第2異常収縮に伴い脳組織全体が段階的に蒼白様の色調変化が認められ、血流低下の状態も同時に捉えること可能であった。このように、実体顕微鏡を用いて、頭蓋内の脳血管の異常収縮を観察できた。
血管の異常収縮に伴い血液脳関門の破綻がおこるのかどうかを、血管内に投与した低分子デキストランの血管外漏出の程度から評価を行った。低分子デキストラン(Texas Red conjugated 3000MW)をマウス尾静脈より投与して、デキストランの血管外漏出の程度を二光子顕微鏡を用いて観察を行った。脳表の軟膜血管では、第1異常収縮に伴い、血管外にデキストランが漏出することが認められた(図20(A),(B),(D)。図中の矢印は、第1異常収縮後に血管外に漏出したデキストランを示す)。一方、脳深部の毛細血管周囲では、二光子顕微鏡で捉えられる様なデキストランの血管外漏出は認められなかった(図20(C),(D))。
上述した様に、脳梗塞中に起こる第1異常収縮により、毛細血管での虫食い状の血流停止が起こり、第2異常収縮により完全な血流停止し、死亡すると考えられた。治療の観点からは、この異常収縮予防が大きな治療のターゲットとなることが期待された。脳血管は、その血管径を拡大、縮小させることにより脳血流量を調節し、需要と代謝のバランスを保っている。血管収縮の最終段階は、ミオシン軽鎖(myosin light chain)のリン酸化、アクチン・ミオシン相互作用(Actin-myosin interaction)による血管の平滑筋の収縮と繋がる。ミオシン軽鎖のリン酸化の調節機構としては、大きく分けて3つに分類される。
kinase (ROCK))がミオシン軽鎖ホスファターゼ(myosin light chain phosphatase)の活性を抑制してミオシン軽鎖の脱リン酸化を抑制する経路がある。
本実施形態では、このうち第二及び第三の経路に着目し、α-アドレナリン受容体アンタゴニスト(α-adrenergic receptor antagonist)であるフェントラミン・メシレート(phentolamine mesylate)と、ROCKインヒビター(ROCK inhibitor)である塩酸ファスジル(fasudil hydrochloride)を用い、その異常収縮抑制効果を検討した。
第一段階として、薬物の全身投与による脳血流の変化、血管径の変化、第1異常収縮の抑制効果を二次元レーザー血流計、二光子レーザー顕微鏡、実体顕微鏡を用いて検討した(各n=4 , 塩酸ファスジル (10 mg/kg, i.p.)、フェントラミン・メシレート (1 mg/kg, i.m.))。2剤とも、投与前後の血流・血管径には変化が認められなかった。また、第1異常収縮の抑制効果も認められなかった。
第二段階として、薬物の脳表からの直接投与を行い、二光子顕微鏡を用いて直接観察を行なった。開頭部の作製時に、開頭部分から直接脳表に各薬剤を投与してカバーガラスで封入した(塩酸ファスジル 4 mg/mL PBS溶液(n = 2)、フェントラミン・メシレート 5 mg/mL PBS溶液(n = 6))。投与後1時間後に血管閉塞前から両側頸動脈遠隔閉塞20分後までの血管の状態を連続して観察を行い第一次異常収縮に対する各薬剤の予防効果を確認した。塩酸ファスジル投与群では、コントロール群(未処理。図21上段)と同様の第一次異常収縮が認められた(図21中段)。一方、フェントラミン・メシレート投与群では、20分の閉塞中に第一次異常収縮は、完全に抑制できることが確認された(図21下段)。
両側頚動脈閉塞50分における各薬剤の治療効果を確かめた。開頭部の作製時に、開頭部分から直接脳表に各薬剤を投与してカバーガラスで封入した(塩酸ファスジル 4 mg/mL PBS溶液(n = 2)、フェントラミン・メシレート 5 mg/mL PBS溶液(n = 6))。投与後1時間に両側頸動脈遠隔閉塞50分閉塞の時間経過に基づき観察を行い、第1異常収縮および第2異常収縮の抑制効果と死亡率を検討した。塩酸ファスジルでは異常収縮抑制効果はなく2例とも死亡した。
一方、フェントラミン・メシレートでは全例で第1異常収縮および第2異常収縮の抑制を認め、麻酔からの覚醒を認めた。図22に示すように、フェントラミン・メシレート投与群では、第1異常収縮及び第2異常収縮は共に抑制され、再開通直前まで血流は維持された。また、再開通に伴い、良好な血管拡張、血流回復が認められた。
以上より、異常収縮の予防が脳梗塞の新たな治療方法となり得ること、α-アドレナリン受容体をブロックすることにより異常収縮を抑制可能であること、その薬剤の一つとしてフェントラミン・メシレートが異常収縮を予防させることができること、本実施形態の観察方法は異常収縮予防/治療薬の薬効判定方法としては有効な方法であること、が確認された。
両側頸動脈閉塞モデルでは、一般的な脳梗塞のタイプである脳塞栓症や血栓性脳梗塞時に認められる皮質領域での梗塞はほとんど認められない。短時間閉塞(20分)程度では、主に基底核や海馬などの領域に主に障害が出現した。また、長時間閉塞では(50分)では、前脳広範に渡る脳虚血である為、皮質領域に脳梗塞が形成される前に死亡した。そこで皮質梗塞を簡便に作製する方法を確立した。
頸動脈一側のみの閉塞では、軽度血流低下を認める程度である。両側頸動脈閉塞による20分程度の短時間の閉塞では、再開通に伴い、両側とも速やかな血流回復を認める。いずれの方法を用いても皮質梗塞は作製できない。一側大脳のみ持続的に血流を低下させれば、皮質梗塞が作製されると考えられる。そこで、一過性前脳虚血と再灌流後の一側頸動脈狭窄を組み合わせたモデルを作製した。
本実施形態の総頸動脈遠隔閉塞モデルでは、頚動脈血管をカニューレ内に嵌頓させて血流遮断させることが必要となる。ここで、どの程度まで血管をカニューレ内に嵌頓させるのかは、勘に頼ることになり、難しい手法であった。そこで、カニューレの先端から2~5mmの任意の位置に、ストッパーを作成し(ストッパーの作成位置は、実験者の設定により調節可能)、常に血管がカニューレ内に一定の長さで嵌頓させられる様に改良した。
図27には、本実施形態のカニューレ100を示した。カニューレ100の先端から任意の位置(本実施形態では3mm)に、カニューレ100を構成する壁面を貫通する貫通孔101が形成されている(図27(A))。図示では、貫通孔101は、カニューレ100の上下方向に設けられている。両貫通孔101を通すようにして、絹糸102を挿通する(図27(B))。この絹糸102を結び、余分なところを切除することによってストッパー103が構成される(図27(C))。
ここで、ナイロン糸104の両端部分をカニューレ100の他の開口側から引っ張ることにより、係止輪105の飛び出し位置をカニューレ100側に引き込む(図27(E))。係止輪105の飛び出し位置は、ストッパー103の位置によって規制されるので、所定のところで血管の血流の遮断状態が規定されることになる(図27(F))。
このように、本実施形態によれば、頚動脈血管の血流遮断状態を予め規定しておき、この状態を再現性良く実施できるので、条件を一定とした実験を行えるカニューレを提供できた。
VOIを取得するときの問題点として撮影速度がある。より高解像度の画像を取得するには、より長時間の撮影時間が必要となる。スキャナーとしてガルバノモーターで操作するガルバノスキャナー、検出器としてアルカリ検出器(アルカリ金属の光電子増倍管(フォトマルチプライヤー(PMT))を用いた検出器)を用いた場合には、表面から300μmの脳深部まで5μm間隔でスライスして61枚の撮影を行うために、82秒の撮影時間が必要であった。取得された画像に基づき3D再合成を行うと、撮影スライス間隔が5μmであるため、スライス間の毛細血管などは一部の信号が抜けた状態となった(図28(A))。
取得されたボリュームデータには、多量の画像が含まれる。特に、レゾナントスキャナーと冷却高感度ガリウム砒素リン(GaAsP)外部検出器を用いた撮影方法では、75分の連続撮影では、2万枚近くの画像となり、単純に目視のみで、すべての変化を同定することは、不可能である。そこで、効率よく、軽微な形態変化を捉える為の解析方法を確立した。
Initial Spasm前後で血管にどの様な変化があるのかをボリュームデータ内の二次元画像を用いて網羅的に検討した。図31(A)は、Spasm前と後の脳深部の二次元画像を示す(実線矢印は、動脈を示す、点線矢印は静脈を示す)。二つの画像を個別の色づけをして(例:一方を赤色、もう片方を緑色)、この二つの画像の重ね合わせ合成画像を作成することにより、変化のない部位は、二つの色が重なり合った色(例:赤と緑とすれば黄色)となり、変化のあった部位は単色(例:赤、または緑の単色)となり、容易に変化部位を同定できる。頭蓋内で脳自体が移動する為、二つの画像にズレが生じた場合は、前もって位置合わせを行う必要がある。位置合わせの方法としては、オープンソースソフトウェアのImage J(National Institutes of Health(http://imagej.nih.gov/ij/))を用いて、剛体位置合わせを行った。
Initial Spasm前後で血管にどの様な変化があるのかをボリュームデータを用いて網羅的に検討した。図32(A)は、Spasm前と後のボリュームデータの3次元再構成画像を示す。脳が動くことにより、ボリュームデータ間でズレが生じた場合は、オープンソースソフトウェアのImage J(National Institutes of Health(http://imagej.nih.gov/ij/))を用いて、ボリューム同士の位置合わせを行った。二次元画像と同様な方法で、二つのボリュームデータの合成データを作成することにより、ボリューム内を3次元的に、任意の方向から観察することが可能であった。図32(B)は、位置合わせの有無による重ね合わせボリュームデータの三次元再構成画像を示す(左側は「位置合わせなし」、右側は「位置合わせあり」を示す(図32(C)においても同じ)。)。図32(C)は、位置合わせの有無の脳深部の拡大像を示す(矢印は動脈を示す)。位置合わせにより、ズレが補正され、Initial Spasm後にも脳深部の動脈に狭窄が持続していることが認められた。二次元的解析方法は、短時間で簡便に行うことができる点を特徴としている、三次元的解析方法は、膨大なボリュームデータ処理となる為、処理に時間がかかるが、VOI内すべての変化を網羅的に観察できる点が特徴である。
Initial Spasmに伴う毛細血管での微小循環の変化を詳細に検討した。SR101によって血清をラベリングすることによって(Plasm Labeling)、血管内を赤色蛍光に染色できる。その中に存在する血球は無蛍光陰影として観察できる。図33に示すように、Initial Spasm前は、毛細血管内に血球の蛍光陰影はほとんど確認できなかった。Initial spasm後は、狭窄を来した毛細血管に多数の血球がPluggingを起こしていることが認められた。特に、静脈につながる直前の毛細血管での狭窄が強くこの部分に、Pluggingが多数認められた。
Initial Spasmに伴い血流低下のメカニズムとして、動脈、静脈、毛細血管での血管収縮のみではなく、異常収縮を起こした血管に血球が栓(Plugging)をしてしまうことが、血流低下持続の大きな原因であることが分かった。
薬剤を開頭部から滴下などで投与すると、脳表全体に薬物が行きわたらない可能性がある。このため、薬物を脳全体に行きわたらせる為に、脳室内への薬剤投与方法を確立した。二光子観察用に作成した頭蓋開頭部(左大脳)の対側の側脳室(右大脳)にステンレスカニューレ(0.51mm×20mm)を留置した。定位脳手術装置(stereotaxic instrument)を用いて、カニューレ先端をブレグマから0.5mm後方、1.0mm外側、脳表から2.0mmの深さに留置し、デンタルセメントを用いて固定した。このカニューレの位置は、二光子顕微鏡を用いた観察の際に障害となることはなかった。
本実施形態によれば、観察の際に障害となることなく、脳室内に薬剤を投与する方法を提供できた。
1.中大脳動脈の直接閉塞モデルの観察
一過性前脳虚血+一側狭窄モデルは、作成手技が非常に簡単ではあるが、一過性に前脳虚血負荷をかける為、前脳虚血病態と局所脳虚血病態が混在したものとなっている。そこで、より局所脳虚血病態に近い中大脳動脈の直接閉塞モデルを作成し観察を行った。
観察部位である左頭頂葉の中大脳動脈の中枢側を閉塞させる為、左側頭部に皮膚切開を行い、頭蓋骨上から、中大脳動脈を確認しながら、直上に1.5mm程度の開頭を行い、脳実質から中大脳動脈を剥離し、8-0ナイロン糸を用いて閉塞させた。この方法では、遠隔操作による動脈閉塞は困難であったため、閉塞操作後から早期に観察を開始した。動脈閉塞後20分以内に全例(n=3)でInitial Spasmと蛍光強度の低下が認められた。1時間の観察では、Secondary Spasmは認められなかった。
抱水クロラールの過剰投与(40mg)により呼吸停止モデルを作成した。すべてのマウス(n=3)で20分以内に呼吸停止が起こり、Initial Spasmとその後に呼吸停止とほぼ同期してSecondary Spasmの出現が認められた。
原因にかかわらず、脳灌流圧が低下を来す病態や低酸素を来す病態の全てにおいて、Spasmが大きくかかわっていると考えられた。障害の程度が軽い場合(早期血流改善や局所脳虚血など)には、initial spasmのみが起こり、呼吸不全など致死的に近い場合(遷延性前脳虚血や、呼吸停止など)には、secondary spasmまでが起こると考えられた。
In vivoのカルシウムイメージングとしては、アストロサイトのイメージングが広く行われている。血管平滑筋に対するカルシウムイメージング方法は確立されていない。血管収縮のメカニズムとしては、細胞外からのCaの流入、細胞内小胞体からの貯蔵Caの細胞内流出、Ca感受性の増加など、多種類のメカニズムの存在が報告されている。カルシウムインデイケーターであるFluo4-AMと二光子顕微鏡を用いた血管平滑筋のカルシウムイメージングの方法を確立した。
このことから、前脳虚血状態では、Initial Spasmと同期して、脳表細動脈から穿通枝動脈、毛細血管前の細動脈、静脈において著明に細胞内Caが増加することを確認した。Spasm発症と同期して細胞内Caは増加した状態が持続し、Secondary Spasmに伴いさらにCaが増加することを認めた。Spasm発症抑制の為には、細胞内カルシウム増加抑制がターゲットとなることを確認した。
カルシウムイメージングの結果から、細胞内カルシウム増加がSpasmの大きな原因であることを確認した。細胞外からのカルシウム流入メカニズムとしては、電位依存性のカルシウム・チャンネルが大きな役割を担っていることが報告されている。そこで、電位依存性カルシウム・チャンネル・ブロッカーの阻害薬(ニカルジピン)が、血管収縮を抑制することを確かめた。
両側頚動脈遠隔閉塞50分モデルを用いて、観察対側の右側脳室にステンレスカニューレを挿入して、ニカルジピン(10μL、濃度1mg/mL)を血管閉塞前に投与した(n=5)。血管閉塞前の5分間、左総頚動脈の閉塞から5分間、右総頚動脈の閉塞から50分間及び再開通から15分間を連続して観察を行った。
図35に示すように、未治療群では、全例でInitial Spasmは蛍光強度低下を伴いながら、脳深部から脳表血管へと伝播した(図中の点線矢印)。これに対し、ニカルジピン投与群では、蛍光強度の低下が脳深部から脳表まで伝播したが、全例で血管のInitial Spasmは認められなかった。未治療群では、全例にSecondary spasmが認められたが、ニカルジピン投与群では2例に認められるのみであった。未治療群では5例中4例が死亡し、ニカルジピン群では、5例中2例のみの死亡であり、有意に死亡率を抑制した。
二光子顕微鏡撮影は蛍光信号を観察するため、暗所で行う必要がある。しかし、遠隔閉塞や薬剤投与などの操作は、完全な暗所で行うことが困難である。そこで、レンズと観察部位を覆うことができる円柱状の遮光デバイスを作成した。図36を参照しつつ、遮光デバイス201について説明する。遮光デバイス201は、例えば黒色のプラスチックによって、上下方向に連通する円筒形状に形成されている。遮光デバイス201は、側方からの外部光を円筒内に漏らさないように遮断する。遮光デバイス201の開口202の内周径は、顕微鏡の対物レンズ204の外周径とほぼ同等に設定されている。また、遮光デバイス201の下端縁203は、対象物に遮光状態で接触した状態で顕微鏡下での観察を行うことができる。図37に示すように、顕微鏡の対物レンズ204の下端側に遮光デバイス201を装着し、下端縁203を対象物に密着した状態で顕微鏡による観察を行う。
デバイス装着状態(図38(A)及び(C)の右側)では、ほぼ薄明りまで、画像の劣化なく撮影が可能であった。デバイスを装着していない状態(図38(B)及び(C)の左側)では、一般環境環境の画像を拡大すると、等間隔の細かな線状ノイズがあるのが確認できた(図38(C)左側 矢印)。また、薄明り環境では、デバイスを装着しない状態では、全体に蛍光信号が増大してコントラストの悪い画像となった(図38(B)左側)。
このように、本実施形態によれば、脳梗塞病態非ヒト哺乳類の観察方法、脳梗塞病態非ヒト哺乳類観察装置、脳梗塞の予防及び/または治療剤等を提供できた。
Claims (16)
- 非ヒト哺乳類の両側総頸動脈遠隔閉塞モデルを用いて、非ヒト哺乳類の脳を観察できるように処置し、二光子レーザー顕微鏡によって、脳梗塞発症前から虚血・異常収縮・再灌流までの脳梗塞病態を時間的・空間的にリアルタイムに観察する脳梗塞病態非ヒト哺乳類の観察方法。
- 前記非ヒト哺乳類が、マウス、ラット、ウサギ及びサルからなる群から選択される一つである請求項1に記載の脳梗塞病態非ヒト哺乳類の観察方法。
- 前記非ヒト哺乳類が、全身に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現したGFP非ヒト哺乳類である請求項2に記載の脳梗塞病態非ヒト哺乳類の観察方法。
- 非ヒト哺乳類の両側総頸動脈遠隔閉塞モデルを用いて、非ヒト哺乳類の脳を観察できるように処置し、二次元レーザー血流計によって、梗塞発症前から虚血・異常収縮・再灌流までの脳血流変化を観察する脳梗塞病態非ヒト哺乳類の観察方法。
- 非ヒト哺乳類の両側総頸動脈遠隔閉塞モデルを用いて、非ヒト哺乳類の脳を観察できるように処置し、実体顕微鏡によって、梗塞発症前から虚血・異常収縮・再灌流までの脳血管を含めた脳表形態を観察する脳梗塞病態非ヒト哺乳類の観察方法。
- 請求項1~5のいずれか一つに記載の観察方法を使用して、薬物の脳梗塞への影響を調べる脳梗塞薬の開発方法であって、脳虚血に伴う血管の異常収縮の抑制を指標とする脳梗塞薬の開発方法。
- 非ヒト哺乳類と、この非ヒト哺乳類を麻酔下で固定する固定台と、前記非ヒト哺乳類の頸動脈の血流を遠隔的に開閉する頸動脈開閉装置と、前記非ヒト哺乳類の脳の開頭部の動画を撮影可能な撮影装置と、前記非ヒト哺乳類の脳を観察する二光子レーザー顕微鏡とを備えた脳梗塞病態非ヒト哺乳類観察装置。
- 非ヒト哺乳類と、この非ヒト哺乳類を麻酔下で固定する固定台と、前記非ヒト哺乳類の頸動脈の血流を遠隔的に開閉する頸動脈開閉装置と、前記非ヒト哺乳類の脳表の動画を撮影可能な撮影装置と、前記非ヒト哺乳類の脳を観察する二次元レーザー血流計とを備えた脳梗塞病態非ヒト哺乳類観察装置。
- 前記非ヒト哺乳類が、マウス、ラット、ウサギ及びサルからなる群から選択される一つである請求項7に記載の脳梗塞病態非ヒト哺乳類観察装置。
- 非ヒト哺乳類と、この非ヒト哺乳類を麻酔下で固定する固定台と、前記非ヒト哺乳類の頸動脈の血流を遠隔的に開閉する頸動脈開閉装置と、前記非ヒト哺乳類の脳表の動画を撮影可能な撮影装置と、前記非ヒト哺乳類の脳を観察する実体顕微鏡とを備えた脳梗塞病態非ヒト哺乳類観察装置。
- 非ヒト哺乳類と、この非ヒト哺乳類を麻酔下で固定する固定台と、前記非ヒト哺乳類の脳表の動画を二光子レーザー顕微鏡で撮影可能な撮影装置とを備えたスクリーニング装置において、前記撮影装置により撮影された動画に基づき血液脳関門を通過する物資をリアルタイムでスクリーニングする方法。
- 非ヒト哺乳類の一過性前脳虚血及び一側頸動脈狭窄による、皮質梗塞モデル。
- 請求項12に記載の非ヒト哺乳類の皮質梗塞モデルを用いて、皮質脳梗塞を形成した脳を観察できるように処置し、二光子レーザー顕微鏡によって、脳血管の梗塞発症前から虚血・異常収縮・再灌流までの脳梗塞病態を時間的・空間的にリアルタイムに観察する脳梗塞病態非ヒト哺乳類の観察方法。
- 請求項7~10のいずれか一つに記載の脳梗塞病態非ヒト哺乳類観察装置であって、前記撮影装置は、スキャナーとしてレゾナントスキャナーと、検出器として冷却高感度ガリウム砒素リン(GaAsP)検出器を備えた脳梗塞病態非ヒト哺乳類観察装置。
- 非ヒト哺乳類の頭蓋に外方から観察可能な頭蓋開頭を設けた脳病態の非ヒト哺乳類観察用モデルを用いて、脳室内に薬剤を投与する方法であって、前記頭蓋開頭の対側の側脳室に薬剤投与用のカニューレを留置するときに、前記カニューレの開口位置をプレグマから0.5mm後方、1.0mm外側、脳表から2mmの深さとなる所定の位置に固定することを特徴とする顕微鏡観察に支障とならない脳室内への薬剤投与方法。
- 請求項7~10、14のいずれか一つに記載の脳梗塞病態非ヒト哺乳類観察装置によって撮影されたボリュームデータの網羅的解析方法であって下記ステップを備えた解析方法、(1)質的に異なる二種類の前記ボリュームデータを得るデータ取得ステップ、(2)前記データ取得ステップで得られた二種類のボリュームデータから画像を再構成する画像構成ステップ、(3)前記画像構成ステップで得られた画像について、前記質的に異なる二種類の画像が互いに異なる色となるように彩色処理を施す彩色ステップ、(4)前記彩色ステップで得られた二種類の画像を位置合わせ処理を行って重ね合わせる合成ステップ。
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