CN101182563B - 一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法 - Google Patents

Abstract

一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法，属于食品生物技术领域。本发明是利用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶为催化剂，以乳糖为单一底物，在温和的反应条件下转化乳糖制备乳果糖。本发明的独特之处是以乳糖作为底物，在反应过程中利用乳糖酶和葡萄糖异构酶的协同作用，提高制备乳果糖的反应效率，减少副产物，简化下游分离步骤。本发明思路新颖，环境友好，实用性强，是化学法和游离酶法制备乳果糖的良好替代。

Description

一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法

技术领域

本发明涉及一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法，具体涉及以共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶为催化剂，以乳糖为单一底物，在温和的反应条件下制备乳果糖，属于食品生物技术领域。

背景技术

乳果糖是一种由半乳糖和果糖以β-1，4糖苷键结合而成的新型功能性低聚糖。它具有促进双歧杆菌增殖，调整肠道菌群平衡；治疗肝性脑病，降低内毒素；监视肠壁的通透性；预防结肠息肉术后复发等许多重要的生理功能，被广泛应用于便秘、肝性脑病等临床治疗，以及添加到奶粉、面包、婴儿食品、和饮料等中。目前市面上已有出售治疗慢性功能性便秘和肝性脑病的乳果糖口服溶液，但纯度很低。

工业上生产乳果糖主要采用化学催化法进行，即以NaOH和硼酸为催化剂，通过乳糖异构化反应获得。曾研究过的催化剂有强碱性试剂、镁的化合物、碱金属的铝酸盐、蛋壳等，但化学法制备乳果糖条件比较激烈，得到的产品色泽深，副产物多，催化剂分离困难，给糖浆的进一步纯化及制取结晶带来困难。采用游离酶法生产乳果糖尽管催化剂专一性强、副产物少、产品色泽浅，但酶的成本较高。因此寻找一种酶可以反复回收利用，反应条件温和的高效率制备乳果糖的途径是很有意义的。

发明内容

本发明原理：在一定的条件下，以乳糖为底物，通过乳糖酶水解活力的作用，使乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，再通过葡萄糖异构酶作用葡萄糖将其异构化为果糖，最后通过乳糖酶的转半乳糖苷作用，将半乳糖通过β-1，4糖苷键连接到果糖上，得到产物乳果糖。

本发明的目的：提供一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂，在温和的反应条件下制备乳果糖的方法。通过对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的工艺条件进行研究，以期得到一条在反应过程中能够发挥乳糖酶和葡萄糖异构酶之间的协同作用，催化效率高，副反应少，乳果糖产品质量较好的生产工艺。

本发明的技术方案：一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法，用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶为催化剂，以乳糖为单一底物制备乳果糖；

(A)共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂的间歇式乳糖转化反应：

用pH4-9的磷酸盐缓冲液配制5％-40％(w/w)的乳糖溶液，稍加热使乳糖溶解，添加1.5-10U/mL的共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶，在25-60℃温度下反应12-48h，并回收共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；

或(B)共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂的连续式乳糖转化反应：

用pH4-9的磷酸盐缓冲液配制5％-40％(w/w)的乳糖溶液，稍加热使乳糖溶解，自上而下进料反应，按0.02-0.3mL/min的流速使乳糖溶液匀速通过装载共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的恒温酶反应柱，温度为25-70℃，单程操作。

所用的共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法，是以明胶、海藻酸钠或卡拉胶中的一种或几种为载体，采用先包埋后交联的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；或以尼龙网为载体采用先交联后共价结合的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；

(1)用明胶、海藻酸钠或卡拉胶中的一种或几种为载体，采用先包埋后交联的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶：

a)配制pH4-9的质量浓度5％-27％的20g胶溶液，在30℃水浴中使胶完全溶解；

b)按照活力比2∶1-1∶5将乳糖酶和葡萄糖异构酶溶于2mL去离子水中；

c)将b)配制的乳糖酶和葡萄糖异构酶的混合酶液添加到胶溶液中，使两种酶的添加量为1-30U/g胶溶液，搅拌混匀；

d)在c)所得的胶溶液中加入2mL体积分数0.05％-5％的戊二醛，搅拌后立即倒入培养皿中，4℃硬化过夜，得凝胶；

e)次日将凝胶浸入到体积分数0.05％-5％的戊二醛中，在4℃-30℃交联10min-60min，然后用去离子水清洗凝胶若干次，滤纸吸干表面水，最后切成2mm见方的小方块，即为共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶。

或(2)采用尼龙网为载体共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶：

a)尼龙网的预处理：将60目的尼龙网裁成边长2cm的小片，先用1mol/LNaOH浸洗10min，水洗至中性，再用1mol/L HCl浸洗10min，再水洗至中性，然后用乙醇洗去水分，丙酮浸洗20min除去脂溶性杂质，再用乙醇除去丙酮，晾干，接着将尼龙网浸泡在含18.6％CaCl₂和18.6％水的甲醇溶液中，50℃保温20min，将尼龙网滤出并彻底水洗，乙醇脱水，晾干；

b)尼龙网的活化：将预处理后的尼龙网浸入到3-二甲氨基丙胺中，70℃活化5h-15h，彻底水洗；

c)载体的交联：将活化后的尼龙网浸入体积分数0.05％-5％、pH4-9的戊二醛中，4℃-30℃浸泡10min-60min，接着用pH 7的磷酸盐缓冲液反复清洗尼龙网；

d)酶与载体的结合：配制浓度为1-30U/mL的乳糖酶溶液，按照5g/100mL酶液-30g/100mL酶液的量将尼龙网添加到乳糖酶液中，4℃-30℃下不断搅拌浸泡5-20h，滤出尼龙网，水洗至水洗液中无蛋白之后再将尼龙网浸泡到1-30U/mL的葡萄糖异构酶溶液中，尼龙网的添加量在5g/100mL酶液-30g/100mL酶液之间，4℃-30℃不停缓慢搅拌浸泡5-20h，最后用去离子水多次清洗尼龙网表面至水洗液中无蛋白，用冷风吹干即得共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶。

所用的游离乳糖酶的比活力为3000U/g，游离葡萄糖异构酶的比活力为2000U/g。

共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的连续式反应中使用恒温酶反应柱。

所制备的乳果糖在食品添加剂和医药领域中均有广泛应用。

本发明所述的间歇式乳糖转化反应，具体内容涉及以明胶、海藻酸钠或/和卡拉胶为载体。

本发明所述的连续式乳糖转化反应，具体内容涉及以尼龙网为载体。

本发明的有益效果：

1、与目前的化学催化法制备乳果糖相比，酶法生产乳果糖反应条件温和，催化剂专一性强，产品色泽浅，对设备没有较大损耗，且不产生高碱性废水，不会对环境造成污染。

2、与液态酶相比，共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶能够回收利用，使生产过程中酶的成本大大下降，简化反应产物的提纯，提高产物乳果糖的收率。

3、与单独固定化一种酶相比，共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶在制备乳果糖的过程中更能发挥两种酶之间的协同作用，实现底物到产物的一步转化，转化效率高，副产物少。

附图说明

图1不同温度对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。

图2不同pH对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。

图3不同乳糖浓度对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。

图4不同反应时间对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。

具体实施方式

实施例1：配制20mL乳糖溶液，稍加热使乳糖溶解，添加100U共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶进行间歇式反应，在一定温度、pH和时间下反应，反应结束后回收共固定化酶凝胶颗粒。

图1显示了温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。如图所示，最适温度为45℃。

图2显示了pH分别为4、5、6、7.5、8和9对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。如图所示，最适pH为7.5。

图3显示了乳糖浓度分别为10％、20％、30％和40％对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。如图所示，最适乳糖浓度为40％。

图4显示了反应时间分别为6h、10h、15h、24h、36h和48h对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。如图所示，最适反应时间为24h。

实施例2：先将自由状态的乳糖酶和葡萄糖异构酶经60目的尼龙网固定，再制成固定化酶柱。所使用的恒温酶反应柱直径26mm，高200mm。共固定化酶的装柱体积为40mL，总活力为2580U。将乳糖配成30％(w/w)的溶液，调节pH 7，自上而下进料反应，恒温50±1℃，按0.06mL/min匀速通过共固定化酶反应柱，单程操作并收集反应液，得到产物乳果糖溶液。

Claims (2)

1.一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法，其特征是用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶为催化剂，以乳糖为单一底物制备乳果糖；

(A)共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂的间歇式乳糖转化反应：

用pH4-9的磷酸盐缓冲液配制5％-40％(w/w)的乳糖溶液，稍加热使乳糖溶解，添加1.5-10U/mL的共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶，在25-60℃温度下反应12-48h，并回收共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶；

或(B)共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂的连续式乳糖转化反应：

用pH4-9的磷酸盐缓冲液配制5％-40％(w/w)的乳糖溶液，稍加热使乳糖溶解，自上而下进料反应，按0.02-0.3mL/min的流速使乳糖溶液匀速通过装载共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的恒温酶反应柱，温度为25-55℃，单程操作。

2.根据权利要求1所述的一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法，其特征是连续式反应中使用恒温酶反应柱。

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