CN101171512B - 旋光异构体拆分用珠及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种分离效率良好的旋光异构体用珠的制造方法。在该旋光异构体拆分用珠的制造方法中，所述旋光异构体拆分用珠包含多糖衍生物，所述多糖衍生物在多糖结构单元的6位羟基中具有通过交联剂交联的结构，该制造方法包括：在搅拌的凝固浴中滴入所述多糖衍生物的有机溶剂溶液，从而产生珠的工序；在分离所述珠后，根据需要进行洗净、干燥的工序；通过在有机溶剂中使所述珠和交联剂反应，从而使所述多糖的结构单元中6位的羟基的至少一部分与交联剂反应，获得包含具有交联结构的珠的反应液的工序。

Description

旋光异构体拆分用珠及其制造方法
技术领域
本发明涉及适用作高效液相色谱(HPLC)用的填充剂的旋光异构体拆分用珠及其制造方法。
背景技术
近年来，光学活性化合物的重要性越来越大，无论是在药品，还是在功能材料的研究、开发方面，选择性地有效地制备纯粹的光学活性手性分子的方法是必要不可缺的。
根据HPLC的光学拆分作为可以在分离和微量分析两方面利用的方法发展，迄今为止，开发了各种手性填充剂。其中，将纤维素或直链淀粉等天然大量存在的多糖转化为苯基氨基甲酸酯衍生物的物质由于作为HPLC用手性固定相，对包括药品的宽范围的消旋体具有优异的光学拆分能力，因此是常用的。
使用这些多糖衍生物的手性固定相，以将衍生物物理吸附或化学键合在作为载体的硅胶上的物质的形式作为填充剂使用。然而，这样负载在硅胶上的填充剂无法使用能使多糖衍生物溶胀、溶解的溶剂作为洗脱液。此外，填充剂中包含的多糖衍生物的比例较小，实质上硅胶表面上的多糖衍生物仅能用于光学拆分，作为分取用的填充材料有改良的余地。
在JP-B 7-63622中，公开了将羟基的至少10％被氨基甲酰基取代的多糖衍生物粉碎、分级的7～13μm的粉末构成的分离剂。此外，在第2页第4栏中，记载了根据需要，还可以进行交联，但没有具体的描述。
发明内容
本发明提供了具有高光学拆分能力，分离效率良好的非粉碎型旋光异构体分割用珠及其制造方法。
本发明提供了一种旋光异构体拆分用珠，所述旋光异构体拆分用珠包含多糖衍生物，所述多糖衍生物在多糖的结构单元的6位具有羟基，在所述羟基中具有通过交联剂交联的结构。
本发明提供了一种旋光异构体拆分用珠，其包含多糖衍生物的旋光异构体拆分用珠，所述多糖衍生物在多糖的结构单元的2位、3位和6位的任一个上无规残留的羟基中具有通过交联剂交联的结构，所述多糖衍生物的全部结构单元中羟基的平均残留数为1个以下。
本发明提供了一种旋光异构体拆分用珠的制造方法，所述旋光异构体拆分用珠包含多糖衍生物，所述多糖衍生物在多糖的结构单元的6位上具有羟基，在所述羟基中具有通过交联剂交联的结构，所述方法包括：
在搅拌的凝固浴中滴入所述多糖衍生物的有机溶剂溶液，从而产生珠的工序；
在分离所述珠后，根据需要进行洗净、干燥的工序；
通过在有机溶剂中使所述珠和交联剂反应，从而使所述多糖的结构单元中6位的羟基的至少一部分与交联剂反应，获得包含具有交联结构的珠的反应液的工序。
本发明提供了一种旋光异构体拆分用珠的制造方法，所述旋光异构体拆分用珠包含多糖衍生物，所述多糖衍生物在多糖的结构单元的2位、3位和6位的任一个上无规残留的羟基中具有通过交联剂交联的结构，所述多糖衍生物的全部结构单元中羟基的平均残留数为1个以下，该方法包括：
使所述多糖的全部羟基中的66～95％的羟基与必要量的用于转化为氨基甲酸酯基的衍生物形成用化合物反应，获得多糖衍生物的工序；
在搅拌的凝固浴中滴入所述多糖衍生物的有机溶剂溶液，从而产生珠的工序；
在分离所述珠后，根据需要进行洗净、干燥的工序；
通过在有机溶剂中使所述珠和交联剂反应，从而使所述多糖的结构单元中6位羟基中的至少一部分与交联剂反应，获得包含具有交联结构的珠的反应液的工序。
本发明的旋光异构体拆分用珠无需像目前那样负载在硅胶等载体上，但具有与现有载体负载品相同的光学拆分能力。
此外，本发明的旋光异构体拆分用珠与现有的载体负载品相比，对于相同体积的柱，多糖衍生物的填充量得到增加，因此能提高分离效率(每单位量能拆分的消旋体量)，因而适用于大量分离。尤其是本发明的旋光异构体拆分用珠是球状的，因此如果与非球状的相比，对柱的填充效率良好。
此外，本发明的旋光异构体拆分用珠，可以使用在目前的载体负载品中不能够使用的溶解多糖衍生物的溶剂作为洗脱液，因此可以增加洗脱液的选择范围。
发明详述
<旋光异构体拆分用珠>
本发明的旋光异构体拆分用珠含有多糖衍生物，所述多糖衍生物在多糖结构单元的6位具有羟基，在所述羟基中具有通过交联剂交联的结构。
本发明的旋光异构体拆分用珠不用负载在载体上，且是非粉碎型(不通过粉碎装置调整粒径)的。
本发明的旋光异构体拆分用珠是球状或正球状，其粒径优选在0.1～100μm的范围内，进一步优选在1～30μm的范围内，更优选3～10μm的范围内。
本发明的旋光异构体拆分用珠任选具有与硅胶这样的多孔材料所具有的空孔类似的空孔。
<旋光异构体拆分用珠的制造方法>
以下，对本发明旋光异构体拆分用珠的制造方法进行说明。具体地说，可以通过实施例记载的方法制造。另外，以下各工序不是各自独立的工序，可以将1个工序分为2个以上，也可以将2个以上的工序集中为1个。此外，还可以适当增加其它工序。
首先，在最初的工序中制造多糖衍生物。作为衍生出该工序中制造的多糖衍生物的多糖，是合成多糖、天然多糖和天然物转化多糖的任一种，只要是光学活性的即可，期望优选为键合方式规则性高的物质。
作为多糖，可以列举β-1，4-葡聚糖(纤维素)、α-1，4-葡聚糖(直链淀粉、支链淀粉)、α-1，6-葡聚糖(右旋糖苷)、β-1，6-葡聚糖(石脐素(ブスツラン))、β-1，3-葡聚糖(例如热凝胶、裂褶多糖(シゾフイラン))、α-1，3-葡聚糖、β-1，2-葡聚糖(冠瘿(Crown Gall)多糖)、β-1，4-半乳聚糖、β-1，4-甘露聚糖、α-1，6-甘露聚糖、β-1，2-果聚糖(フラクタン)(菊粉(イヌリン))、β-2，6-果聚糖(左聚糖(レバン))、β-1，4-木聚糖、β-1，3-木聚糖、β-1，4-壳聚糖、α-1，4-乙酰基壳聚糖(壳多糖)、支链淀粉(プルラン)、琼脂糖、藻酸等，还包含含有直链淀粉的淀粉。
在这些物质中，优选能容易获得高纯度多糖的纤维素、直链淀粉、β-1，4-木聚糖、β-1，4-壳聚糖、几丁质、β-1，4-甘露聚糖、菊粉、热凝胶等，特别优选纤维素、直链淀粉。
多糖的数均聚合度(1分子中所含的吡喃糖或呋喃糖环的平均数)优选为5以上，更优选为10以上，对上限没有特别限制，在操作性的观点上，优选为1000以下，进一步优选为5～1000，更优选为10～1000，特别优选为10～500。
多糖衍生物可以使用将上述多糖羟基的一部分或全部与具有能与羟基反应的官能团的化合物通过酯键、尿烷键、醚键等而获得的物质。
在本发明中，通过将多糖6位的羟基通过保护基保护，在制造多糖衍生物后，通过脱保护反应将保护基脱离，在全部结构单元的6位的部分或全部中形成羟基的方法，能制造多糖衍生物。在全部结构单元中，优选6位的羟基残留15％以上，更优选残留30％以上。
此外，在本发明中，可以通过采用使多糖与规定量的衍生物形成用化合物反应，从而获得多糖衍生物的方法制造多糖衍生物。此时，衍生物形成用化合物的使用量是将多糖全部羟基的66～95％的羟基转化为氨基甲酯基所必要的量。在该反应中，多糖结构单元的2位、3位和6位的任一个上无规残留的羟基与交联剂反应，无需保护多糖特定的羟基。
通过该方法获得的多糖衍生物具有在多糖结构单元的2位、3位和6位的任一个上无规残留羟基的结构，多糖衍生物全部结构单元中羟基的平均残留数为1以下。
作为具有能与羟基反应的官能团的化合物(衍生物形成用化合物)，只要是异氰酸衍生物、羧酸、酯、酰卤化物、酰胺化合物、卤素化合物、醛、醇或其它具有脱离基团的化合物即可，还可以使用这些物质的脂肪族、脂环族、芳香族、杂芳香族化合物。
作为特别优选的多糖衍生物，可以列举多糖酯衍生物和多糖氨基甲酸酯衍生物。
在以下的工序中，将在以上工序中获得的多糖衍生物的有机溶剂溶液在根据需要滴入搅拌的凝固浴中，从而产生小珠。
作为多糖衍生物的有机溶剂溶液，可以将选自四氢呋喃(THF)、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、吡啶、碳原子数为1～22的醇(优选碳原子数为4～12的醇，特别优选为庚醇)等中的物质单独使用或以2种以上混合物的形式使用，优选使用醇以外的有机溶剂(优选THF)和碳原子数为1～22的醇(优选庚醇)的混合溶剂。
在醇以外的有机溶剂和碳原子数为1～22的醇的混合溶剂中，醇的含量优选为5体积％以上，进一步优选为10体积％以上，更优选为10～40体积％，特别优选为25～35体积％。
多糖衍生物的有机溶剂溶液中多糖衍生物的浓度优选为0.1～10质量％，进一步优选为0.3～5.0质量％，更优选为0.5～2.5质量％。
凝固浴只要是能凝固滴入的多糖衍生物即可，可以列举例如表面活性剂水溶液，特别优选阴离子表面活性剂水溶液。作为阴离子表面活性剂，可以使用脂肪酸盐、松脂酸盐(ロジン酸塩)、烷基硫酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基二苯基醚磺酸盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、磺基琥珀酸二酯盐、α-烯烃硫酸酯盐、α-烯烃磺酸盐等。
凝固浴的温度优选为50～100℃，进一步优选为60～90℃，更优选为75～80℃。
为了使所得珠为球状，期望为正球状，凝固浴在多糖衍生物的有机溶剂溶液的滴入中和滴入后进行搅拌。搅拌在体积为1升的容器内使用6根桨的搅拌机时，优选为100～3000r/m，进一步优选为500～2000r/m，更优选为800～1200r/m。
另外，在制造具有空孔的珠的情况下，可以采用在有机溶剂中溶解多糖衍生物和空孔形成用添加剂后，同样制备珠后，用仅能溶解珠中含有的空孔形成用添加剂的溶剂冲洗的方法。作为空孔形成用添加剂，可以使用聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等聚合物。
在接下来的工序中，分离上述工序中产生的珠后，根据需要进行洗净，干燥。另外，在上述工序中使用的有机溶剂期望在本工序前，通过蒸馏等方法除去。
珠在使用吸滤法这样公知的过滤法分离后，可以通过甲醇等洗净。然后，通过采用真空干燥等公知的干燥法干燥。在干燥后，根据需要，通过过滤器等区分所有珠的粒径，因此还能去除粒径过大或过小的珠。
在接下来的工序中，通过使上述工序中所得的珠与交联剂在有机溶剂中反应，从而使所述结构单元中6位羟基的至少一部分与交联剂反应，获得具有交联结构的珠。
作为交联剂，可以使用4，4-二苯基甲烷二异氰酸酯、甲代亚苯基二异氰酸酯、六亚甲基二异氰酸酯等在1分子中具有多个异氰酸酯基的异氰酸酯化合物、二羧酸及其卤化物、酰胺、酯等。
多糖衍生物与交联剂的反应在丙酮、甲苯、苯、吡啶、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、DMA、DMF等有机溶剂的存在下进行。
反应温度在80～90℃下为24～36小时。将反应过程中的生成物取样，将其溶解于THF中，只要不能溶解，则可以认为交联反应结束。
交联反应结束后，通过吸滤等回收珠，为了除去不需要物质，使用温甲醇等洗净，通过真空干燥等进行干燥。
本发明旋光异构体拆分用珠可以作为HPLC用的填充剂用于从消旋体分离旋光异构体。此外，还可以用于超临界流体色谱、柱色谱、薄层色谱、气相色谱、毛细管色谱等中。
附图说明
图1是各实施例中各阶段珠的SEM相片。图2是各实施例中各阶段珠的SEM相片。图3是实施例7的HPLC图。
实施例
以下的实施例对本发明的实施进行描述。实施例是就本发明的例示进行描述，但并不用于限定本发明。
实施例中使用的试剂等的详述如下所述。
(1)试剂
纤维素(Avicel)：MERCK制造，聚合度200
直链淀粉：Ajinoki制造，聚合度300
纤维素珠：チツソ制造的Celluflow C-25
硅胶：使用通过对Daiso gel SP-1000(粒径7μm，孔径100nm)进行表面处理，从而氨基丙基化的物质
三苯基氯甲烷(TrCl)：キシダ化学制造
3，5-二甲基苯基异氰酸酯：アルドリツチ社制造
4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯：东京化成制造
4，4’-二苄基二异氰酸酯：通过将4，4’-亚乙基二苯胺与三光气反应合成
4，4’-亚乙基二苯胺：东京化成制造
三光气：东京化成制造
六亚甲基二异氰酸酯：东京化成制造
间-亚二甲苯基二异氰酸酯：东京化成制造
甲代亚苯基-2，4-二异氰酸酯：东京化成制造
氯化锂(LiCL)：Wako制造
N，N-二甲基乙酰胺(DMA)(脱水)：关东化学制造
吡啶(脱水)：关东化学制造
甲苯(脱水)：关东化学制造
庚醇(脱水)：キシダ化学制造和Wako制造
消旋体：合成品或市售品
(2)装置
珠制备时使用的搅拌装置：SMT マルチデイスパ-サ-PB95
轴：PH-4(6桨叶型)
(3)测定机器
NMR：Varian Gemini-2000(1H-400MHz)
IR：JASCO FT/IR-620
HPLC：JASCO PU-980，UV-970，OR-990，MD-2010
SEM：JEOL JSM-5600
BET：名古屋大学大学院工学研究科·生物工学专业的萨摩研究室自制装置
实施例1
(1)6位具有部分羟基的纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯OD(6-OH)-20的合成
根据下述反应式，进行纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯的合成。
在10g干燥的纤维素(62mmol)中加入15g氯化锂和150ml N，N-二甲基乙酰胺，在氮气氛围下，在80℃下溶胀27小时后，加入32g(114mmol)三苯基氯甲烷和150ml吡啶，在80℃下反应24小时。在甲醇中滴入吡啶可溶部分，以不溶部分的形式回收后，进行真空干燥。
所得衍生物由于葡萄糖环的6位没有完全三苯甲基化，因此再次在该衍生物中加入15g氯化锂和150ml N，N-二甲基乙酰胺，在氮气氛围下，在80℃下溶胀24小时后，加入17g(62mmol)三苯基氯甲烷和150ml吡啶，在80℃下反应24小时。在甲醇中滴入吡啶可溶部分，以不溶部分的形式回收后，进行真空干燥，获得葡萄糖环6位的羟基被三苯甲基化的衍生物。
然后，在190ml吡啶中溶解21g所得衍生物，在氮气氛围下加入22g(150mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在80℃下反应30小时。将反应溶液取样，测定红外吸收光谱，在确认溶液中存在未反应的异氰酸酯后，将反应溶液滴入甲醇中，以不溶物的形式回收，获得纤维素2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酰基)-6-O-三苯甲基纤维素。
然后，在1500ml 1％HCl/甲醇中搅拌该衍生物24小时，进行脱保护，使6位恢复为羟基。用甲醇洗净后，进行真空干燥，获得24g纤维素2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
然后，将所得衍生物中的10g(22mmol)溶解在65ml吡啶中，在氮气氛围下，加入2.5g(17mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在80℃下反应18小时。将反应溶液滴入甲醇中，以不溶物的形式回收，进行真空干燥，获得9.5g在6位具有部分羟基的3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯。由通过NMR的分析，发现葡萄糖环6位的羟基残留20％左右。以下，将该衍生物称为OD(6-OH)-20。
(2)纤维素衍生物珠(OD(6-OH)-20珠)的制备
首先，在30ml四氢呋喃/庚醇(2/1，v/v)的混合溶剂中溶解0.25gOD(6-OH)-20。在分散器中，在以轴旋转数1100rpm搅拌下，将其滴入500ml用水浴加热至75℃的0.2％月桂基硫酸钠水溶液中。在滴入后，也将表面活性剂溶液加热至75℃，馏去四氢呋喃。
吸滤回收生成的珠，用甲醇洗净。洗净后，进行真空干燥，获得0.22gOD(6-OH)-20。此时的珠收率约为87％。通过20μm的过滤器分离重复该操作的的珠，从而回收粒径3～10μm左右的珠。在分散器的轴使用6根桨叶型，容器使用1升的烧杯。通过扫描型电子显微镜(SEM)观察所得珠。
(3)通过二异氰酸酯交联纤维素衍生物珠
为了在所得多糖衍生物珠中维持强度，使6-位的羟基与二异氰酸酯反应，在珠内进行交联。
在1.83g干燥的OD(6-OH)-20珠中，在氮气氛围下加入20ml甲苯，在80℃下加热4小时，使珠溶胀后，加入0.3g(1.2mmol)过量的4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯，在80℃下反应24小时。测定上清液的液体IR，确认存在未反应的异氰酸酯，此外，取样少量的珠，确认在四氢呋喃中是不溶的后，吸滤回收珠，为了去除由过量的异氰酸酯产生的尿素，边吸引边用温甲醇洗净。
通过固体IR确认没有尿素存在后，真空干燥，获得1.83g 6位羟基约20％交联的珠(以下称为“交联珠A”。粒径5～7μm)。
(4)HPLC用柱的填充
按照粒径分选所得交联珠A后，在30ml的己烷/石蜡液体＝2/1中分散，使用己烷/2-丙醇＝9/1，在压力30kg/cm2下，通过淤浆法在长25cm、内径0.2cm的不锈钢制的柱中填充(柱IK-1，图1)。此外，为了进行比较，按照以下方式制备现有的硅胶负载型柱。通过上述方法填充在氨基丙基化的硅胶(粒径7μm，孔径100nm)上负载21wt％的纤维素三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的填充剂。此时的压力在开始数分钟为400kg/cm2，此后为100kg/cm2。
(5)通过HPLC进行消旋体的光学拆分
使用所述操作获得的交联珠柱，光学拆分下述10种消旋体(3-12)。
Figure S2006800159420D00101
洗脱液使用己烷/2-丙醇＝90/10，己烷/氯仿/2-丙醇＝90/10/1，流速为0.1ml/min。另外，理论板数N由苯的图求出，在柱中没有保留的物质通过的时间t0由1，3，5-三叔丁基苯的洗脱时间求出。对柱IK-1光学拆分能力评价的结果在表1中示出。为了进行比较，还示出硅胶负载型的OD涂覆型的结果。
表1
Figure S2006800159420D00102
a)柱：25×0.20cm(i.d.)，流速：0.1ml/min.
b)柱：25×0.20cm(i.d.)，流速：0.15ml/min.
如果在珠型柱和现有的硅胶负载型柱中，对各种消旋体的α值进行比较，发现尽管存在一定的分散，但具有基本相同程度的光学拆分能力。这样的不同认为是由于在珠柱中使用的衍生物交联，与进行完全衍生化的衍生物相比，超级结构有一定不同。
此外，通过珠内交联能提高对溶剂的耐久性，可以在洗脱液中包含迄今为止无法使用的氯仿，因此通过具有包含氯仿的洗脱液进行光学拆分能力的评价。此外，其中没有记录结果的是由于消旋体与填充剂产生强烈的相互作用，无法洗脱，因此无法进行分析。
使用H/C/I＝90/10/1的洗脱液，发现光学拆分能力全部提高。象这样，通过改变洗脱液，具有能改善光学拆分结果，在分离时能提高试样洗脱液的溶解性等优点，因此可以使用各种溶剂而适当选择洗脱液，从而是非常有用的。
实施例2
(1)在6-位具有部分羟基的纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯OD(6-OH)-70的合成
在1.5g(9.3mmol)干燥的纤维素中加入45ml脱水N，N-二甲基乙酰胺，在氮气氛围下，在80℃下溶胀10小时后，冷却至室温，加入3.0g氯化锂，在室温下搅拌3小时，均匀溶解纤维素。
加入吡啶20ml和三苯基氯甲烷1.9g(6.9mmol)，80℃下反应40小时后，加入3，5-二甲基苯基异氰酸酯6.0g(41mmol)，80℃下再反应24小时。
对反应溶液取样，测定红外吸收光谱，确认在溶液中确认未反应的异氰酸酯后，将反应溶液滴入甲醇中，以不溶物的形式回收，获得纤维素2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酰基)-6-O-三苯甲基纤维素。
然后，在300ml 1％HCl/甲醇中搅拌该衍生物40小时，进行脱保护，使6位恢复至羟基。用甲醇洗净后，进行真空干燥，获得4.3g纤维素2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。通过NMR的分析，发现葡萄糖环6位的羟基残留70％左右。以下，将该衍生物称为OD(6-OH)-70。
(2)纤维素衍生物珠(OD(6-OH)-70珠)的制备
首先，在30ml四氢呋喃/庚醇(2/1，v/v)的混合溶剂中溶解0.75gOD(6-OH)-70。在分散器中，在以轴旋转数1100rpm搅拌下，将其滴入500ml用水浴加热至75℃的0.2％月桂基硫酸钠水溶液中。在滴入后，也将表面活性剂溶液加热至75℃，馏去四氢呋喃。
吸滤回收生成的珠，用甲醇洗净。洗净后，真空干燥用20μm的过滤器分离的物质，获得0.58g粒径3～10μm左右的OD(6-OH)-70珠。此时珠的收率约为77％。重复该操作，获得3.3gOD(6-OH)-70珠。分散器的轴使用6根桨叶型，容器使用1升的烧杯。
(3)交联后的处理(叔丁醇和甲醇)
在氮气氛围下，在1.0g干燥的OD(6-OH)-70珠中加入10ml甲苯，在80℃下加热4小时，使珠溶胀后，加入58mg(0.23mmol)过量的4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯，在80℃下反应18小时。
然后，加入290mg(2.0mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在85℃下反应22小时，测定上清液的液体IR，确认存在未反应的异氰酸酯，此外，取样少量的珠，确认在四氢呋喃中是不溶的后，将反应溶液中的大约一半加入甲醇中，以消耗残留的异氰酸酯。
吸滤该甲醇溶液以回收珠后，为了去除由异氰酸酯和甲醇产生的尿素，边进行吸引边用温甲醇洗净。通过固体IR确认没有尿素存在后，真空干燥，用甲醇进行处理，获得0.46g珠。将按照与3-1-4同样的方法填充了所得珠的珠柱称为柱IK-10。
此外，将反应溶液的另一半加入10ml过量的叔丁醇，反应3小时，测定上清液的液体IR，确认不存在异氰酸酯后，吸滤回收珠，为了去除由异氰酸酯和叔丁醇产生的尿素，边进行吸引边用温甲醇洗净。通过固体IR确认没有尿素存在后，用叔丁醇进行处理，获得1.0g珠。将按照与实施例1的(4)同样的方法填充了所得珠的珠柱称为柱IK-11。
(4)通过HPLC进行消旋体的光学拆分
使用由所述操作获得的交联珠柱，光学拆分实施例1的10种消旋体(3-12)。洗脱液为己烷/2-丙醇＝90/10，流速为0.1ml/min。另外，理论板数N由苯的图求出，在柱中没有保留的物质通过的时间t0由1，3，5-三叔丁基苯的洗脱时间求出。对柱IK-10和柱IK-11光学拆分能力评价的结果在表2中示出。为了进行比较，还示出硅胶负载型的OD涂覆型的结果。
表2
Figure S2006800159420D00131
柱：25×0.20cm(i.d.)，流速：0.1ml/min
由表2发现，IK-11与IK-10相比，所有的光学拆分能力均得到提高，用叔丁醇处理的珠获得了高的光学拆分能力。这认为是由于在柱IK-10中，交联剂之一的异氰酸酯与甲醇的反应生成的部位与消旋体非对映地选择相互作用，因此光学拆分能力降低。另一方面，认为是在柱IK-11中，通过用大量的叔丁醇进行处理，从而消旋体与交联剂的未反应部分不会产生非选择的相互作用，仅通过不对称识别位点进行相互作用，α值上升。
与柱IK-10用交联珠的制备不同，在柱IK-11中，将4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯的两个异氰酸酯中仅一个与衍生物反应的物质用大量的叔丁醇处理，因此珠与消旋体光学拆分的相互作用不会受其他相会作用的干扰，期待更有效的发挥作用。
实施例3
(1)交联剂4，4’-二苄基二异氰酸酯的合成
在500ml三口烧瓶中加入10g 4，4’-亚乙基二苯胺、200ml甲苯，在其中吹入由NaCl与硫酸产生的氯化氢气体，使4，4’-亚乙基二苯胺形成盐酸盐。在加热至80℃的烧瓶中，用滴入漏斗向其中缓慢加入在100ml甲苯中溶解11g三光气得到的溶液。4小时后，再用滴入漏斗缓慢加入在50ml甲苯中溶解7g三光气得到的溶液，在16小时后停止加热。
由于反应体系不均匀，分为甲苯可溶部分和不溶部分，因此仅甲苯可溶部分转移至300ml烧瓶中，通过真空泵吸引，除去甲苯，获得淡黄色的固体异氰酸酯。通过IR与NMR，确认为目标4，4’-二苄基二异氰酸酯。所得异氰酸酯沸点较高而无法蒸馏，无法生成(产量：6g，收率：50％)。
(2)在6-位具有三苯甲基的纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯OD(6-Tr)的合成
在10g(62mmol)干燥的纤维素中加入300ml脱水N，N-二甲基乙酰胺，在氮气氛围下，在80℃下溶胀20小时后，降低至室温，加入4g LiCl，在室温下搅拌3小时，溶解纤维素。在溶解后，加入150ml吡啶和23g(83mmol)三苯基氯甲烷，在105℃下反应36小时。再加入26g(177mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在80℃下反应24小时。
将反应溶液取样，测定红外吸收光谱，确认在溶液中存在未反应的异氰酸酯后，将反应溶液滴入甲醇中，以不溶物的形式回收，获得36g纤维素2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酰基)-6-O-三苯甲基纤维素OD(6-Tr)。
(3)3-3-3.OD(6-Tr)珠的制备
首先，在30ml四氢呋喃/庚醇(2/1，v/v)的混合溶剂中溶解0.75gOD(6-Tr)。在分散器中，在以轴旋转数1100rpm搅拌下，将其滴入500ml用水浴加热至75℃的0.2％月桂基硫酸钠水溶液中。在滴入后，也将表面活性剂溶液加热至75℃，馏去四氢呋喃。
吸滤回收生成的珠，用甲醇洗净。洗净后，进行真空干燥，获得0.42gOD(6-Tr)珠。此时珠的收率约为56％。使用20μm的过滤器分离重复该操作的珠，回收粒径3～10μm左右的珠。分散器的轴使用6根桨叶型，容器使用1升的烧杯。通过SEM观察所得珠。
(4)OD(6-OH)-100珠的制备
在300ml 1％HCl/甲醇中，在室温下搅拌上述(3)制备的OD(6-Tr)珠36小时，进行脱保护，将6位恢复至羟基。用甲醇洗净后，进行真空干燥，获得1.7g目标OD(6-OH)-100珠。由NMR与元素分析的结果，确认在6位导入的三苯甲基99％以上脱落。
(5)使用4，4’-DBDI的交联珠的制备(柱IK-14用)
在氮气氛围下，在610mg(1.48mmol)干燥的OD(6-OH)-100珠中加入7ml甲苯，在80℃下加热3小时，使珠溶胀后，加入90mg(0.34mmol)4，4’-二苄基二异氰酸酯(4，4’-DBDI)，在80℃下反应33小时。
测定上清液的液体IR，确认存在未反应的异氰酸酯，此外，取样少量的珠，确认在四氢呋喃中不溶后，加入646mg(4.39mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，反应24小时。为了用大量的醇处理4，4’-DBDI的二个异氰酸酯中仅有一个与衍生物反应的物质，加入5ml过量的叔丁醇，在80℃下反应6小时。
测定上清液的液体IR，确认没有异氰酸酯存在后，通过吸滤回收珠，为了除去由异氰酸酯与叔丁醇产生的尿素，边吸引边用温甲醇洗净。
通过固体IR确认没有尿素存在，真空干燥，获得用4，4’-DBDI将6位羟基交联的珠690mg。用THF将所得珠充分洗净，按照粒径分选在THF中不溶的珠后，将在100kg/cm2下填充的柱称为柱IK-14(图2)。
(6)使用4，4’-DBDI的交联珠的制备(柱IK-15用)，使用实施例3的(5)的2倍的4，4’-DBDI进行交联
在氮气氛围下，在595mg(1.44mmol)干燥的OD(6-OH)-100珠中加入7ml甲苯，在80℃下加热3小时，使珠溶胀后，加入174mg(0.66mmol)4，4’-DBDI，在80℃下反应33小时。
测定上清液的液体IR，确认存在未反应的异氰酸酯，此外，取样少量的珠，确认在四氢呋喃中不溶后，加入592mg(4.03mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在80℃下反应24小时。为了用大量的醇消耗4，4’-DBDI的二个异氰酸酯中仅有一个与衍生物反应的物质，加入5ml过量的叔丁醇，在80℃下反应6小时。
测定上清液的液体IR，确认没有异氰酸酯存在后，通过吸滤回收珠，为了除去由异氰酸酯与叔丁醇产生的尿素，边吸引边用温甲醇洗净。
通过固体IR确认没有尿素存在，真空干燥，获得用4，4’-DBDI将6位羟基交联的珠697mg。用THF将所得珠充分洗净，按照粒径分选在THF中不溶的珠后，将在100kg/cm2下填充的柱称为柱IK-15。
(7)交联珠的制备(柱IK-16用)
在氮气氛围下，在515mg(1.25mmol)干燥的OD(6-OH)-100珠中加入7ml甲苯，在80℃下加热3小时，使珠溶胀后，加入82mg(0.33mmol)4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)，在80℃下反应33小时。
测定上清液的液体IR，确认存在未反应的异氰酸酯，此外，取样少量的珠，确认在四氢呋喃中不溶后，加入356mg(2.42mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，反应24小时。为了用大量的醇处理MDI的二个异氰酸酯中仅有一个与衍生物反应的物质，加入5ml过量的叔丁醇反应6小时。
测定上清液的液体IR，确认没有异氰酸酯存在后，通过吸滤回收珠，为了除去由异氰酸酯与叔丁醇产生的尿素，边吸引边用温甲醇洗净。
通过固体IR确认没有尿素存在，真空干燥，获得583mg用MDI将6位的羟基交联的珠。用THF将所得珠充分洗净，按照粒径分选在THF中不溶的珠后，将在100kg/cm2下填充的柱称为柱IK-16。
(8)交联珠的制备(柱IK-17用)
在氮气氛围下，在595mg(1.44mmol)干燥的OD(6-OH)-100珠中加入7ml甲苯，在80℃下加热3小时，使珠溶胀后，加入77mg(0.44mmol)甲苯-2，4-二异氰酸酯(2，4-TDI)，在80℃下反应33小时。
测定上清液的液体IR，确认存在未反应的异氰酸酯，此外，取样少量的珠，确认在四氢呋喃中不溶后，加入393mg(2.67mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，反应24小时。为了用大量的醇处理2，4-TDI的二个异氰酸酯中仅有一个与衍生物反应的物质，加入5ml过量的叔丁醇反应6小时。
测定上清液的液体IR，确认没有异氰酸酯存在后，通过吸滤回收珠，为了除去由异氰酸酯与叔丁醇产生的尿素，边吸引边用温甲醇洗净。
通过固体IR确认没有尿素存在，真空干燥，获得633mg用2，4-TDI将6位的羟基交联的珠。用THF将所得珠充分洗净，按照粒径分选在THF中不溶的珠后，将在100kg/cm2下填充的柱称为柱IK-17(图2)。
(9)交联珠的制备(柱IK-19用)
在氮气氛围下，在609mg(1.48mmol)干燥的OD(6-OH)-100珠中加入7ml甲苯，在80℃下加热3小时，使珠溶胀后，加入过量的68mg(0.36mmol)间亚二甲苯基二异氰酸酯(XDI)，在80℃下反应33小时。
测定上清液的液体IR，确认存在未反应的异氰酸酯，此外，取样少量的珠，确认在四氢呋喃中不溶后，加入359mg(2.44mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，反应24小时。为了用大量的醇处理2，4-TDI的二个异氰酸酯中仅有一个与衍生物反应的物质，加入5ml过量的叔丁醇反应6小时。
测定上清液的液体IR，确认没有异氰酸酯存在后，通过吸滤回收珠，为了除去由异氰酸酯与叔丁醇产生的尿素，边吸引边用温甲醇洗净。
通过固体IR确认没有尿素存在，真空干燥，获得用XDI将6位的羟基交联的珠624mg。用THF将所得珠充分洗净，按照粒径分选在THF中不溶的珠后，将在100kg/cm2下填充的柱称为柱IK-19。
表3
Figure S2006800159420D00171
所述反应在表3中汇总。此外，使用六亚甲基二异氰酸酯进行交联，但反应性低，无法制备THF中不需要的填充剂。
(10)通过HPLC拆分消旋体
使用所述操作中获得的交联珠柱IK-14-19，光学拆分实施例1的10种消旋体(3-12)。洗脱液使用己烷/2-丙醇＝90/10，流速为0.2ml/min。另外，理论板数N由苯的图求出，在柱中没有保留的物质通过的时间t0由1，3，5-三叔丁基苯的洗脱时间求出。
对柱IK-14-17，19光学拆分能力评价的结果在表4，5中示出。为了进行比较，还示出在柱中填充实施例3的(4)中制备的交联前的OD(6-OH)-100珠的柱IK-18，硅胶负载型的OD涂覆型的结果。
表4
Figure S2006800159420D00181
柱：25×0.20cm(i.d.)，流速：0.2ml/min.
表5
Figure S2006800159420D00182
a)柱：25×0.20cm(i.d.)，流速：0.2ml/min.b)柱：25×0.20cm(id.)，流速：0.1ml/min.
首先，对通过改变反应的交联剂的比例制备的IK-14和IK-15的光学拆分能力进行比较。对根据交联度的不同，光学拆分能力与对溶剂的耐久性的变化进行研究，制备IK-14(相当于6位的46％)和IK-15(相当于6位的92％)，但在IK-14的交联反应中，也不是所有的二异氰酸酯发生反应，在停止33小时反应后，也存在残留的二异氰酸酯，因此认为在IK-14和IK-15的填充剂中，交联度基本没有不同。因此，在光学拆分能力和对溶剂的耐久性中，基本没有发生变化。由此，为了研究交联度的影响，必须减少加入的二异氰酸酯。
接下来，对通过改变交联剂的种类制备的IK-14、IK-16、IK-17、IK-19的光学拆分能力进行比较。由表4、5没有发现在光学拆分能力上存在大的差别，此外，由表4、5，还发现在对溶剂的耐久性上也基本没有差别。由此，认为制备交联珠型填充剂时交联剂的种类不是很重要。
此外，在IK-14、IK-16、IK-17、IK-19的柱中，反式-茋氧化物的洗脱顺序与OD涂覆类型相反，为了研究该相反是否由于通过进行交联导致的超级结构的变化所引起，制备在柱中填充实施例3的(4)中制备的交联前的OD(6-OH)-100珠的柱IK-18，进行光学拆分能力的评价，在IK-18中，反式-茋氧化物的洗脱顺序也与OD涂覆类型相反。由此认为该相反不是由于交联所导致，而是纤维素的衍生化没有充分进行所导致。
为了研究不仅珠的表面，而且连至珠内部的多糖衍生物在光学拆分上均是有效的，在THF中溶解IK-18中使用的多糖衍生物珠(非交联)的剩余部分，负载在硅胶上，制备IK-22。在结束IK-18与IK-22的光学拆分能力评价后，取出柱中的填充剂，测定其重量，比较k1’。硅胶负载型填充剂的重量由热重量分析计算。其结果在表6中示出。
表6
Figure S2006800159420D00201
柱：25×0.20cm(i.d)，
流速a)：0.2ml/min.b)0.3ml/min.
比较珠型(IK-18)和硅胶负载型(IK-22)柱中多糖衍生物的量，存在约6倍(300/50)的不同。另一方面，保留体积(k1’)的不同是(55.78/8.19)＝6.81倍的不同。由于该值是较接近的值，因此认为直至珠内部的多糖衍生物在光学拆分上是有效的。此外，保留体积与多糖衍生物的量不是正确的比例，保留体积的比值较大。这可能是由于多糖衍生物不仅一个分子形成的不对称空间具有对映选择性相互作用，而且通过聚集多个分子形成的不对称空间在光学拆分上也发挥作用。
实施例4
(1)具有非特异部分羟基的纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯OD(ran-OH)的合成
在1.5g(9.3mmol)干燥的纤维素中加入22.5ml脱水N，N-二甲基乙酰胺，在氮气氛围下，在90℃下溶胀12小时后，放冷至室温，加入1.61g氯化锂，在室温下搅拌28小时，均匀溶解纤维素。加入22.5ml吡啶和4.50g(30.6mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在90℃下反应36小时。将反应溶液滴入甲醇中，以不溶物的形式回收，获得4.17g纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯OD(ran-OH)。
(2)OD(ran-OH)珠的制备
在45ml四氢呋喃/庚醇(2/1，v/v)的混合溶剂中溶解0.375g OD(ran-OH)。在分散器中，在以轴旋转数1100rpm搅拌下，将其滴入500ml用水浴加热至75℃的0.2％月桂基硫酸钠水溶液中。在滴入后，也将表面活性剂溶液加热至75℃，馏去四氢呋喃。吸滤回收生成的珠，用甲醇洗净后，进行真空干燥。重复该操作，获得OD(ran-OH)珠。分散器的轴使用6根桨叶型，容器使用1升的烧杯。
(3)OD(ran-OH)珠通过二异氰酸酯交联
在氮气氛围下，在780mg干燥的OD(ran-OH)珠中加入8ml甲苯，在85℃下加热10小时，使珠溶胀后，加入55mg(0.22mmol)4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯，在85℃下反应34小时。取样少量的珠，确认在四氢呋喃中不溶。然后，加入10ml过量的叔丁醇，反应5小时，测定上清液的液体IR，确认没有异氰酸酯的存在。
然后，通过吸滤回收珠，为了除去由异氰酸酯与叔丁醇产生的尿素，边吸引边用温甲醇洗净。通过固体IR确认没有尿素存在，获得768mgOD(ran-OH)珠。将通过与实施例1的(4)相同的方法填充了所得珠的珠柱称为柱IK-8。
(4)通过HPLC光学拆分消旋体
使用所述操作获得的交联珠柱柱IK-8，光学拆分实施例1的10种消旋体(3-12)。洗脱液使用己烷/2-丙醇＝90/10，流速为0.1ml/min。另外，理论板数N由苯的图求出，在柱中没有保留的物质通过的时间t0由1，3，5-三叔丁基苯的洗脱时间求出。
对柱IK-8光学拆分能力评价的结果在表7中示出。为了进行比较，还示出进行特异交联的IK-11，和硅胶负载型的OD涂覆型的结果。
表7
Figure S2006800159420D00221
柱：25×0.20cm(i.d.)，流速：0.1ml/min
在IK-11和IK-8中，由于严格地衍生化的程度不同，因此无法简单地进行比较，由表7，IK-11与IK-8相比，光学拆分能力全部得到提高，在6位进行特异交联的珠存在获得高光学拆分的倾向。多糖衍生物等高分子类不对称识别材料具有规则的超级结构起重要作用。因此，认为通过尽可能不破坏其规则结构，在6位进行特异交联，从而能获得更高的光学拆分能力。
实施例5
(1)在6-位具有部分羟基的纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯OD(6-OH)-50的合成
在10.15g(62.7mmol)干燥的纤维素中加入150ml脱水N，N-二甲基乙酰胺，在氮气氛围下，在85℃下溶胀22小时后，放冷至室温，加入15.7g氯化锂，在室温下搅拌0.5小时，均匀溶解纤维素。加入155ml吡啶和30.2g(108mmol)三苯基氯甲烷，在85℃下反应31小时后，加入29.6g(201mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在80℃下再反应41小时。
将反应溶液取样，测定红外吸收光谱，确认在溶液中存在未反应的异氰酸酯后，将反应溶液滴入甲醇中，以不溶物的形式回收，获得纤维素2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酰基)-6-O-三苯甲基纤维素。
然后，在500ml 1％HCl/甲醇中搅拌该衍生物42小时，进行脱保护，将6位恢复至羟基。获得24.4g目标纤维素2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
然后，将所得衍生物中的10.4g(22.8mmol)溶解在70ml吡啶中，在氮气氛围下，加入1.88g(12.7mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在85℃下反应18小时。将反应溶液滴入甲醇中，以不溶物的形式回收，进行真空干燥，获得9.5g在6位具有部分羟基的纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯。然而，由于作为保护基的三苯甲基没有完全除去，因此在500ml1％HCl/甲醇中搅拌52小时，再次进行脱保护。
用甲醇洗净，进行真空干燥后，由通过NMR的分析，发现葡萄糖环6位的羟基残留50％左右。以下，将该衍生物称为OD(6-OH)-50。
(2)具有空孔的OD(6-OH)-50珠的制备
与以上的制备不同，在制备珠时加入添加剂进行制备。具体地说，在THF-庚醇混合溶剂中溶解多糖衍生物与添加剂，与先前同样制备珠，通过用仅溶解添加剂的溶剂冲洗所得含有添加剂的珠，从而制备具有空孔的珠。通过添加PNIPAM、PMMA等聚合物作为添加剂，能制备具有空孔的纤维素衍生物珠。
在3ml四氢呋喃/庚醇(2/1，v/v)的混合溶剂中溶解25mg OD(6-OH)-50和3mg作为添加剂的PNIPAM。在分散器中，在以轴旋转数1100rpm搅拌下，将其滴入500ml用水浴加热至75℃的0.2％月桂基硫酸钠水溶液中。在滴入后，也将表面活性剂溶液加热至75℃，馏去四氢呋喃。重复该操作，获得OD(6-OH)-50珠。
吸滤回收生成的珠后，用蒸馏水充分清洗，仅冲洗添加剂，将所得珠真空干燥。通过SEM观察所得珠，确认在珠表面存在空孔。分散器的轴使用6根桨叶型，容器使用200ml的烧杯。
(3)多孔OD(6-OH)-50珠通过二异氰酸酯交联
在氮气氛围下，在730mg干燥的OD(6-OH)-50珠中加入8ml甲苯，在85℃下加热21小时，使珠溶胀后，加入43mg(0.17mmol)4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯，在85℃下反应24小时。取样少量的珠，确认在四氢呋喃中不溶后，加入220mg(1.5mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，反应24小时。然后，加入10ml过量的叔丁醇，反应2小时，测定上清液的液体IR，确认没有异氰酸酯的存在后，通过吸滤回收珠，为了除去由异氰酸酯与叔丁醇产生的尿素，边吸引边用温甲醇洗净。
通过固体IR确认没有尿素存在，获得720mgOD(6-OH)-50珠。将通过与3-1-4相同的方法填充了所得珠的珠柱称为柱IK-4(图1)。
(4)通过HPLC光学拆分消旋体
使用所述操作获得的交联珠柱柱IK-4，光学拆分实施例1的10种消旋体(3-12)。洗脱液使用己烷/2-丙醇＝90/10，流速为0.1ml/min。另外，理论板数N由苯的图求出，在柱中没有保留的物质通过的时间t0由1，3，5-三叔丁基苯的洗脱时间求出。
对柱IK-4光学拆分能力评价的结果在表8中示出。为了进行比较，还示出没有空孔的柱IK-2，硅胶负载型的OD涂覆型的结果。
表8
Figure S2006800159420D00241
洗脱液，己烷-2-丙醇(90∶10).
a)柱：25×0.20cm(i.d.)，流速：0.1ml/min.b)柱：25×0.20cm(i.d.)，流速：0.15ml/min.
为了增加与柱中光学拆分相关的多糖衍生物的比例，尝试制备表面积大的多孔纤维素衍生物珠，由实施例3的实验发现，在多糖衍生物珠型填充剂中，不仅珠表面，而且珠内部的多糖衍生物在光学拆分上均是有效的，此后发现，为了进一步提高分离能力，即使增大表面积，也无变化。
实施例6
(1)在6-位具有三苯甲基的纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯OD(6-Tr)的合成
在1.0g(6.2mmol)干燥的纤维素中加入15ml脱水N，N-二甲基乙酰胺，在氮气氛围下，在80℃下溶胀4小时后，降低至室温，加入0.95gLiCl，在室温下搅拌1小时，纤维素没有完全溶解，无法均匀。
向其中加入15ml吡啶和2.15g(7.71mmol)三苯基氯甲烷，在85℃下反应60小时，反应溶液不均匀。进行一次回收，为了再次进行三苯甲基化，将反应溶液滴入甲醇中，以不溶部分的形式回收后，进行真空干燥。在1.80g所得衍生物中，加入15ml脱水N，N-二甲基乙酰胺，在氮气氛围下，在80℃下溶胀5小时后，降低至室温，加入1.49gLiCl，在室温下搅拌1小时，均匀溶解纤维素衍生物。在其中加入15ml吡啶和0.70g(2.50mmol)三苯基氯甲烷，在80℃下反应20小时。
向其中加入2.33g(15.9mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在80℃下反应24小时。将反应溶液取样，测定红外吸收光谱，确认溶液中存在未反应的异氰酸酯后，将反应溶液滴入甲醇中，以不溶部分的形式回收，获得3.47g纤维素2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酰基)-6-O-三苯甲基纤维素OD(6-Tr)-040618。
(2)OD(6-Tr)珠的制备
首先，在15ml四氢呋喃/庚醇(2/1，v/v)的混合溶剂中溶解0.25gOD(6-Tr)-040618。在分散器中，在以轴旋转数1100rpm搅拌下，将其滴入500ml用水浴加热至75℃的0.2％月桂基硫酸钠水溶液中。在滴入后，也将表面活性剂溶液加热至75℃，馏去四氢呋喃。通过吸滤回收生成的珠后，用甲醇洗净。
洗净后，进行真空干燥，用20μm的过滤器分离，从而获得0.14g粒径为3～10μm左右的OD(6-Tr)-040618珠。此时珠的收率约为55％。重复该操作8次。分散器的轴使用6根桨叶型，容器使用1升的烧杯。通过SEM观察所得珠。
(3)OD(6-OH)珠的制备
在室温下，在100ml 2％HCl/甲醇中搅拌1.09g所述(2)中制备的OD(6-Tr)-040618珠36小时，进行脱保护，使6位恢复至羟基。用甲醇洗净后，进行真空干燥，获得0.81g目标OD(6-OH)珠。由NMR和元素分析的结果，确认在6位导入的三苯甲基99％以上脱落。
(4)OD(6-OH)珠通过二异氰酸酯交联
在氮气氛围下，在526mg干燥的实施例6的(3)中制备的OD(6-OH)珠中加入6ml甲苯，在85℃下加热15小时，使珠溶胀后，加入37mg(0.15mmol)4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯，在85℃下反应37小时。取样少量的珠，确认在四氢呋喃中不溶后，加入550mg(3.7mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，反应42小时。加入10ml过量的叔丁醇，反应4小时，测定上清液的液体IR，确认没有异氰酸酯的存在后，通过吸滤回收珠，为了除去由异氰酸酯与叔丁醇产生的尿素，边吸引边用温甲醇洗净。
通过固体IR确认没有尿素存在，获得530mgOD(6-OH)珠。将通过与实施例1的(4)相同的方法填充了所得珠的珠柱称为柱IK-5-2(图1)。
(5)通过HPLC光学拆分消旋体
使用所述操作获得的交联珠柱柱IK-5-2，光学拆分实施例1的10种消旋体(3-12)。洗脱液使用己烷/2-丙醇＝90/10，流速为0.1ml/min。另外，理论板数N由苯的图求出，在柱中没有保留的物质通过的时间t0由1，3，5-三叔丁基苯的洗脱时间求出。
在制备珠后，即使除去作为保护基的6位的三苯甲基，通过BET求出的表面积基本没有发现变化。因此，发现该方法无法制备多孔多糖衍生物珠(脱保护前珠的表面积：2.8mg2/g→脱保护后珠的表面积：3.0mg2/g)
对柱IK-5-2光学拆分能力评价的结果在表9中示出。为了进行比较，还示出硅胶负载型的OD涂覆型的结果。
表9
Figure S2006800159420D00271
a)柱：25×0.20cm(i.d.)，流速：0.1ml/min
与实施例5相同，为了增加与柱中光学拆分相关的多糖衍生物的比例，尝试制备表面积大的多孔纤维素衍生物珠，由实施例3的实验发现，在多糖衍生物珠型填充剂中，不仅珠表面，而且珠内部的多糖衍生物在光学拆分上均是有效的，此后发现，即使增大表面积，也无法期待在分离能力上有大的改善。
实施例7
2，2，2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇的大量拆分
在填充了珠的柱中，与现有硅胶负载型同尺寸的柱相比，存在更多的多糖衍生物。由此，填充了珠的柱与现有硅胶负载型柱相比，期待能1次拆分的消旋体的量增多。使用实施例2中制备的柱IK-11和硅胶负载型柱，对消旋体2，2，2-三氟-1-(9-蒽基)乙醇研究可1次拆分的量(图3)。
此时，在与洗脱液相同组成的溶剂中溶解该消旋体进行制备，使用57mg的溶液进行光学拆分，将所得图中2个对映体峰重叠时消旋体的量作为该柱能拆分的最大值。作为硅胶负载型柱，使用以下3种。
20wt％(TG结果)硅胶负载型(直径7μm-孔径100nm)
33wt％(TG结果)硅胶负载型(直径7μm-孔径200nm)
33wt％(TG结果)硅胶负载型(直径7μm-孔径100nm)
如果在硅胶负载型柱中进行研究，则负载量最少的20wt％负载柱无法拆分20mg的消旋体，最不适用于分离。此外，在硅胶的粒径大小与孔径不同的2种33％负载柱分离能力不同，认为是由于柱中填充剂的量不同。其中，硅胶的粒径较小，孔径较大的柱能良好地负载多糖衍生物，期待提高负载量，但发现即使改变硅胶的粒径大小和孔径，也无法增加负载量。
然后，在相同尺寸的硅胶负载型柱和珠型柱中比较分离能力。在硅胶负载型中能最良好分离的33wt％(TG结果)硅胶负载型柱(直径7μm-孔径100nm)中，如果一次打入28mg消旋体，则二个峰基本重叠，在珠型柱中，即使一次注入28mg消旋体，也能清楚地分离出二个峰，一次打入40mg消旋体时，也能分离出二个峰。
由此发现，珠型柱的分离能力比尽可能提高负载量制备的硅胶负载型柱(33wt％)还高。
实施例8
(1)在6-位具有部分羟基的直链淀粉3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯AD(6-OH)-20的合成
在1.5g(9.3mmol)干燥的直链淀粉中加入22.5ml脱水N，N-二甲基乙酰胺，在氮气氛围下，在85℃下溶胀5小时后，放冷至室温，加入1.55g氯化锂，在室温下搅拌0.5小时，均匀溶解直链淀粉。加入22.5ml吡啶和3.35g(12.0mmol)三苯基氯甲烷，在85℃下反应43小时后，加入3.35g(22.8mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，再在85℃下反应27小时。
将反应溶液取样，测定红外吸收光谱，确认在溶液中存在未反应的异氰酸酯后，将反应溶液滴入甲醇中，以不溶物的形式回收，获得直链淀粉2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酰基)-6-O-三苯甲基纤维素。
然后，将该衍生物在300ml 1％HCl/甲醇中，在室温下搅拌38小时，进行脱保护，将6位恢复至羟基。用甲醇洗净，进行真空干燥，获得3.98g目标直链淀粉2，3-双(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
然后，将所得衍生物中的3.9g溶解在20ml吡啶中，在氮气氛围下，加入0.59g(4.0mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在85℃下反应20小时。将反应溶液滴入甲醇中，以不溶物的形式回收，进行真空干燥，获得2.5g在6位具有部分羟基的直链淀粉3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯。由通过NMR的分析，发现葡萄糖环6位的羟基残留50％左右。以下，将该衍生物称为AD(6-OH)-50。
(2)直链淀粉衍生物珠(AD(6-OH)-50珠)的制备
在15ml四氢呋喃/庚醇(2/1，v/v)的混合溶剂中溶解0.25g AD(6-OH)-50。在分散器中，在以轴旋转数1100rpm搅拌下，将其滴入500ml用水浴加热至75℃的0.2％月桂基硫酸钠水溶液中。在滴入后，也将表面活性剂溶液加热至75℃，馏去四氢呋喃。
吸滤回收生成的珠后，用甲醇洗净。洗净后，真空干燥用20μm的过滤器分离的珠，获得0.18g粒径为3～10μm左右的AD(6-OH)-50珠。此时珠的收率约为72％。重复该操作，获得0.71gAD(6-OH)-50珠。分散器的轴使用6根桨叶型，容器使用1升的烧杯。
(3)直链淀粉衍生物珠通过二异氰酸酯交联
在氮气氛围下，在0.71g干燥的AD(6-OH)-50珠中加入8ml甲苯，在85℃下加热10小时，使珠溶胀后，加入42mg(0.17mmol)4，4’-二苯基甲烷二异氰酸酯，在85℃下反应27小时。然后，加入290mg(2.0mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在85℃下反应22小时，测定上清液的液体IR，确认没有异氰酸酯的存在，此外，取样少量的珠，确认在四氢呋喃中不溶。
然后，加入10ml过量的叔丁醇，反应1小时，测定上清液的液体IR，确认没有异氰酸酯存在后，通过吸滤回收珠，为了除去由异氰酸酯与叔丁醇产生的尿素，边吸引边用温甲醇洗净。
通过固体IR确认没有尿素存在，获得0.74g直链淀粉衍生物交联珠。将通过与实施例1(4)相同的方法填充了所得珠的珠柱称为柱IK-6(图1)。
(4)通过HPLC光学拆分消旋体
使用所述操作获得的交联珠柱柱IK-6，光学拆分实施例1的10种消旋体(3-12)。在洗脱液中使用己烷/2-丙醇＝90/10，流速为0.1ml/min。另外，理论板数N由苯的图求出，在柱中没有保留的物质通过的时间t0由1，3，5-三叔丁基苯的洗脱时间求出。
对柱IK-6光学拆分能力评价的结果在表10中示出。为了进行比较，还示出硅胶负载型的AD涂覆型的结果。
表10
Figure S2006800159420D00301
洗脱液，己烷-2-丙醇(90∶10).柱：25×0.20cm(i.d.)，流速：0.1ml/min.
与现有的硅胶负载型柱相比，由于在柱IK-6中不使用载体，因此与柱中消旋体产生相互作用的多糖衍生物的比例增加，k1’的值显著增大。然而，与负载型相比，发现所有的α值均降低。其原因认为是由于通过进行交联，在光学拆分中起到重要作用的多糖规则的超级结构部分被破坏。其结果与在珠型柱和负载型柱中α值基本没有变化的纤维素衍生物珠的结果不同。由此，认为在直链淀粉衍生物中，不完全进行衍生化和进行交联会对原本规则的结构付与敏感的变化，与纤维素衍生物相比，多糖规则的超级结构容易被破坏。
实施例9
在1.5g(9.3mmol)干燥的纤维素中加入22.5ml脱水N，N-二甲基乙酰胺，在氮气氛围下，在90℃下溶胀12小时。然后，放冷至室温，加入1.61g氯化锂，在室温下搅拌28小时，均匀溶解纤维素。加入22.5ml吡啶和4.50g(30.6mmol)3，5-二甲基苯基异氰酸酯，在90℃下反应36小时。将反应溶液滴入甲醇中，以不溶物的形式回收，获得4.17g纤维素3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯OD(ran-OH)。结果获得葡萄糖环2，3，6位的羟基约有70-80％被苯基氨基甲酸酯无规取代的衍生物。

Claims (6)

1.一种制造旋光异构体拆分用珠的方法，所述旋光异构体拆分用珠包含多糖衍生物，所述多糖衍生物在多糖的结构单元的2位、3位和6位的任一个上无规残留的羟基中具有通过交联剂交联的结构，所述多糖衍生物的全部结构单元中羟基的平均残留数为1个以下，
该方法包括：
使所述多糖的全部羟基的66～95％的羟基与必要量的用于转化为氨基甲酸酯基的衍生物形成用化合物反应，不进行多糖的特定的羟基的保护，从而获得多糖衍生物的工序；
在搅拌的表面活性剂水溶液中滴入所述多糖衍生物的有机溶剂溶液，从而产生珠的工序；
在分离所述珠后，根据需要进行洗净、干燥的工序；
通过在有机溶剂中使所述珠和交联剂反应，从而使所述多糖的结构单元的2位、3位和6位的任一个上无规残留的羟基与交联剂反应，获得包含具有交联结构的珠的反应液的工序。
2.如权利要求1所述的旋光异构体拆分用珠的制造方法，其中，所述多糖衍生物的有机溶剂溶液是可以溶解多糖衍生物的醇以外的有机溶剂和碳原子数为1～22的醇的混合溶剂，所述混合溶剂中碳原子数为1～22的醇含量为5％(体积)以上。
3.如权利要求1所述的旋光异构体拆分用珠的制造方法，其中，所述多糖衍生物是纤维素衍生物或直链淀粉衍生物。
4.如权利要求1所述的旋光异构体拆分用珠的制造方法，其中，所述珠具有1～10μm的粒径。
5.如权利要求1所述的旋光异构体拆分用珠的制造方法，其中，所述表面活性剂是阴离子表面活性剂。
6.如权利要求5所述的旋光异构体拆分用珠的制造方法，其中，所述阴离子表面活性剂是月桂基硫酸钠。
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