CN101166763A - 稳定的抗乙肝病毒(hbv)抗体配制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了特异性结合乙肝病毒(HBV)抗原的抗体或其片段的液体配制剂，所述配制剂即使在长期贮存中也表现出稳定性、低至检测不到的水平的聚集、很小至没有抗体或抗体片段生物学活性损失。此外，本发明提供了利用本发明的液体配制剂来预防、治疗或减轻与HBV感染有关的一种或多种症状的方法。

Description

稳定的抗乙肝病毒(HBV)抗体配制剂
发明领域
本发明关注用于治疗或预防乙型肝炎感染的抗HBsAg人单克隆抗体的液体配制剂。
发明背景
乙肝病毒(HBV)感染是全球公共健康问题，其死亡率使之位于前10名主要传染性杀手之中。世界卫生组织估计全世界有4亿人携带该病毒。估计急性HBV疾病每年引起600,000例死亡，慢性疾病的并发症包括HBV诱发的肝硬化和肝细胞癌，每年造成约400,000例死亡(El-Serag HB and Mason AC.NEngl J Med.1999；340(10)：745-750)。
许多感染了乙肝病毒的患者不能解决感染，并形成慢性HBV，可引起肝功能衰退，包括硬化和肝代偿失调，随后需要移植。尽管在移植前切除了受到感染的肝脏，有些循环中的病毒仍然保留在血清中，而且认为其它机体隔室中还存在其它储库。因此，这些患者移植的肝脏有再次感染HBV的高风险。
HBV感染的预防可通过主动或被动免疫来实现。使用重组HBV疫苗的主动免疫可预防HBV感染，如果在暴露前给予的话。自非传染性病毒亚基制备的这些疫苗已经显示出是安全且有效的，而且赋予长期免疫力。
使用乙肝特异性抗体的被动免疫，在暴露后不久给予，可降低疾病的发生率或严重程度。乙肝免疫球蛋白(HBIG)是血浆衍生的、针对乙肝表面抗原的抗体(anti-HBs)的多克隆制剂。这些抗体结合并中和病毒表面上的肝炎表面抗原，从而预防感染。
使用HBIG的被动免疫在病毒滴度较低时给予且抗体达到过量时是最有效的。为此，HBIG已经证明对预防新的感染是有效的。在肝移植后用于预防再次感染时，它也表现出是部分有效的，在这种情况下病毒载量随受感染器官的切除而降低。在手术前具有较低病毒滴度的患者中，它已经证明是尤其有效的。
目前，有三种抗病毒产品可用于治疗慢性乙肝：干扰素2b(IntronA，Schering)、拉米夫定(lamivudine)(Epivir HBV，GlaxoSmithKline)和/或阿德福韦二匹伏酯(adefovir dipivoxil)(HepseraTM，Gilead Sciences)。然而，没有哪种疗法能够治愈所有患者中的慢性HBV感染。HBIG尚未证明在治疗产生持久水平病毒的慢性乙肝患者中是有效的，而且不可能在不频繁施用抗体的情况下产生过量的抗体。
涉及慢性病毒性肝炎的末期肝病是全世界原位肝移植(OLT)的主要适应症。术语“原位”(orthotopic)意味着切除患病器官并将新的同种异体移植物植入右上腹部中的正常或通常位置。由于HBV感染导致的硬化和器官衰竭而进行的OLT占到所有成人移植的5％到10％。
保护移植的肝脏免于复发性HBV感染对于保持移植物的功能是至关重要的。终生HBV预防性治疗可能是必需的，因为病毒在切除受感染的肝脏后保留在数个其它机体隔室(脾脏、淋巴结、肾脏、皮肤、胃肠道、性腺、神经节和脑)中。患者在移植后发生免疫抑制时，迅速复发肝脏的乙肝感染，导致进行性疾病、移植物衰竭和死亡。在移植时具有活动性HBV复制体征(HBeAg和/或高水平的HBV DNA)的患者风险增高。重复移植后，疾病复发的发生甚至更快(Rosen HR and Martin P.Infectious Disease Clinics of NorthAmerica.September 2002；14(3)：761-786)。
总之，血浆衍生的多克隆抗体的使用是有限的，因为这些制剂活性易变，可用性有限，且存在传播传染因子的潜在危险。
相反，单克隆抗体(mAb)可以一致地生产，而且没有与血浆衍生产品有关的传染风险。
在先前的研究中，针对乙肝表面抗原(HBsAg)的不同表位开发了两种完全人的单克隆抗体(PCT/IL97/00184和PCT/IL97/00183)。将这些抗体的混合物单次施用到HBV慢性携带者黑猩猩中导致HBsAg水平立即降低，随后在几天内重现初始水平(Eren et al.，2000 Hepatology 32，588-596)。
使用这两种单克隆抗体(称作HBV-ABXTL，现在称作HEPEX BTM)进行了1期临床研究。在研究的A部分，患者接受单次静脉内(IV)输注抗体，而在B部分，患者接受4次每周一次的输注。抗体混合物在降低HBsAg和HBV DNA水平方面是有效的。
用于静脉内使用的HEPEX BTM首先制备成两种分开的液体配制剂，即在磷酸盐缓冲盐水(65mM磷酸钠，80mM氯化钠，pH7.0)中含有任一抗体(17和19)。在施用前将两种单抗以大约1∶1国际单位的比例混合到一起。
需要开发适于皮下以及肌肉内施用的HEPEX B的高剂量液体配制剂。现有的液体抗体配制剂保存期短，而且可能由于贮存期间的化学和物理不稳定性而导致抗体生物学活性的损失。因此，需要有效预防HBV感染的抗HBV抗体的稳定液体配制剂。
发明概述
本发明部分基于特异性结合HBV抗原的抗体或其片段的高浓度液体配制剂的开发，所述配制剂在不存在无机盐但存在氨基酸、碳水化合物和表面活性剂时在制造、配制、运输和贮存期间表现出稳定性、抗体碎裂和/或聚集水平低-检测不到、及抗体或抗体片段的生物学活性损失很小或没有损失。本发明的液体配制剂有助于施用特异性结合HBV抗原的抗体或其片段以预防、治疗、处置和/或减轻HBV感染或其一种或多种症状。具体而言，本发明的液体配制剂能够迅速施用特异性结合HBV抗原的抗体或其片段的无菌剂量形式，无需像先前使用的剂量形式所要求的那样在施用前精确且在无菌情况下混合两种分开的抗体(17和19)或抗体片段。
本发明提供了基本上不含无机盐的抗HBV抗体或其片段的液体配制剂，所述配制剂含有氨基酸、有机盐、表面活性剂、碳水化合物及浓度为约10mg/ml或更高的特异性结合HBV抗原的抗体或其片段，所述配制剂的pH范围为约5.0-约7.5，优选约6.5。
本发明涵盖特异性结合HBV抗原的抗体或其片段的稳定的液体配制剂，所述配制剂在制造、配制、运输和长期贮存期间表现出抗体聚集和/或碎裂水平低-检测不到、抗体或抗体片段的生物学活性损失很小或没有损失。本发明还涵盖特异性结合HBV抗原的抗体或其片段的稳定的液体配制剂，所述抗体或其片段包含具有任何VH和VL结构域的氨基酸序列的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，而且所述配制剂表现出抗体聚集和/或碎裂水平低-检测不到、抗体或抗体片段的生物学活性损失很低-没有。
附图简述
图1
AB17+AB19组合样品在含有0.1％T80的配制剂3中在4℃、25℃和40°的还原性SDS-PAGE及考马斯蓝染色。在凝胶中观察到重链和轻链。
图2
AB17+AB19组合样品在含有0.01％T80的配制剂3中在4℃、25℃和40°的还原性SDS-PAGE及考马斯蓝染色。在凝胶中观察到重链和轻链。
本发明涵盖特异性结合HBV抗原的抗体或其片段的液体配制剂，根据通过测量比活(使用免疫测定法)、完整性和纯度(使用SDS-PAGE和高效大小排阻层析(HPSEC))表现(直观检查)及蛋白质浓度进行的评估，所述配制剂在4℃具有至少3个月的稳定性。本发明还涵盖特异性结合HBV抗原的抗体或其片段的液体配制剂，根据HPSEC的测量，所述配制剂具有低-检测不到的抗体聚集水平，并且根据抗体结合测定法诸如例如ELISA的测量，进一步表现出抗体或抗体片段与参比抗体相比生物学活性损失很小或没有损失。
本发明提供了用于制备特异性结合HBV抗原的抗体或其片段的液体配制剂的方法，所述方法包括使用具有适当分子量截留值(例如完整抗体分子和F(ab’)2片段的截留值为30kD，抗体片段诸如Fab片段的截留值为10kD)的半透膜将含有纯化抗体或抗体片段的级分浓缩至约10mg/ml、约20mg/ml、约30mg/ml、约40mg/ml、约50mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约200mg/ml、约250mg/ml，或约300mg/ml的终浓度，并使用相同的膜将所浓缩的抗体或抗体片段级分过滤到配制剂缓冲液中。
本发明的配制剂缓冲液含有丙氨酸，浓度范围为约10mM-约100mM，或者约85mM-约95mM，最优选90mM。
本发明的配制剂还含有柠檬酸钠，浓度范围为10mM-约30mM，或者约15mM-约25mM，最优选20mM。
本发明的配制剂还含有吐温80，浓度范围为约0.05％-约0.5％，最优选约0.1％。
本发明的配制剂还含有海藻糖，浓度范围为约1％-约5％，或者约2％-4％，最优选3％。
在制备本发明的液体配制剂的过程中，始终将抗体保持在水溶液中。换言之，液体配制剂的制备不包括通过例如冻干、真空干燥等将抗体或配制剂自身干燥的任何步骤。
本发明的液体配制剂可以通过使用0.2微米滤器无菌过滤来除菌。本发明的无菌液体配制剂可施用于受试者以预防、治疗、处置(manage)或减轻HBV感染或其一种或多种症状。
本发明还提供了包含特异性结合HBV抗原的抗体或其片段的液体配制剂的试剂盒，供例如保健专业人员或患者使用。本发明还提供了通过施用本发明的液体配制剂来预防、治疗、处置或减轻HBV感染或其一种或多种症状的方法。
应当理解，抗体和抗体片段还包括Fab片段、Fv片段、单链抗体、双抗体、及可基于本文中所描述的抗体的结合特性或CDR来合成或生产的其它结合分子。
本发明进一步概述如下：
1.一种抗体配制剂，在水性载体中含有：
(a)至少10mg/ml一种或多种特异性结合HBV抗原的抗体或其片段；
(b)丙氨酸；
(c)柠檬酸钠；
(d)吐温80；及
(e)海藻糖，
其中至少一种所述抗体或抗体片段是Mab17或Mab19。
2.权利要求1的配制剂，其中所述水性载体是蒸馏水。
3.权利要求1的配制剂，其中所述配制剂是无菌的。
4.权利要求1的配制剂，其中所述配制剂是同质的(homogenous)。
5.权利要求1的配制剂，其中所述配制剂的pH范围是约5.0-7.5。
6.权利要求1的配制剂，其中至少一种抗体或抗体片段的浓度是至少20mg/ml。
7.权利要求1的配制剂，其中至少一种抗体或抗体片段的浓度是至少40mg/ml。
8.权利要求7的配制剂，其中至少一种抗体或抗体片段的浓度是至少80mg/ml。
9.权利要求8的配制剂，其中至少一种抗体或抗体片段的浓度是至少100mg/ml。
10.权利要求1的配制剂，其中丙氨酸的浓度是约85-约95mM。
11.权利要求1的配制剂，其中丙氨酸的浓度是约90mM。
12.权利要求1的配制剂，其中柠檬酸钠的浓度是约10-约30mM。
13.权利要求1的配制剂，其中柠檬酸钠的浓度是约20mM。
14.权利要求1的配制剂，其中吐温80的浓度是约0.05％-约0.5％。
15.权利要求1的配制剂，其中吐温80的浓度是约0.1％。
16.权利要求1的配制剂，其中海藻糖的浓度是约1％-约10％。
17.权利要求1的配制剂，其中海藻糖的浓度是约3％。
18.权利要求1的配制剂，其中根据HPSEC的测定，至少一种特异性结合HBV抗原的抗体或抗体片段在室温至少6个月是稳定的。
19.权利要求1的配制剂，其中根据HPSEC的测定，至少一种特异性结合HBV抗原的抗体或抗体片段在4℃至少2年是稳定的。
20.权利要求1的配制剂，其中根据HPSEC的测量，少于10％的抗体或抗体片段形成聚集体。
21.权利要求1的配制剂，其中根据HPSEC的测量，少于5％的抗体或抗体片段形成聚集体。
22.权利要求1的配制剂，其中至少一种所述抗体或抗体片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.1的轻链可变区(VL)和具有氨基酸序列SEQ ID NO.2的重链可变区(VH)；且至少第二种所述抗体或抗体片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.3的轻链可变区(VL)和具有氨基酸序列SEQ ID NO.4的重链可变区(VH)。
23.一种适于肠胃外施用于人的制药学单位剂量形式，其在制药学合适容器中装有权利要求1或22的抗体配制剂。
24.权利要求23的制药学单位剂量形式，其中至少一种所述抗体或其片段的浓度为约10mg/ml-约100mg/ml，体积为1ml-20ml。
25.权利要求23的制药学单位剂量形式，其中所述抗体或其片段的浓度为80mg/ml，体积为1ml。
26.权利要求23的制药学单位剂量形式，其中所述抗体配制剂适于皮下施用。
27.权利要求23的制药学单位剂量形式，其中所述抗体配制剂适于静脉内施用。
28.权利要求23的制药学单位剂量形式，其中所述抗体配制剂适于肌肉内施用。
29.装有权利要求1的配制剂的密闭容器。
30.用于治疗受试者中的HBV感染的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的权利要求1的配制剂。
31.用于减轻移植的肝脏中的HBV感染的方法，包括给所有需要的个体施用权利要求1的配制剂。
32.用于治疗生来就有HBV感染母亲的个体的方法，包括给所述个体施用权利要求1的配制剂。
33.用于治疗暴露于HBV的保健工作人员的方法，包括给所述保健工作人员施用权利要求1的配制剂。
34.权利要求30、31、32或33的方法，其中所述配制剂是肠胃外施用的。
35.权利要求30、31、32或33的方法，其中所述配制剂是肌肉内施用的。
36.权利要求30、31、32或33的方法，其中所述配制剂是静脉内施用的。
37.权利要求30、31、32或33的方法，其中所述配制剂是皮下施用的。
38.一种配制剂，在水性载体中含有：
(a)至少10mg/ml至少两种特异性结合HBV抗原的抗体或其片段；
(b)氨基酸；
(c)缓冲剂；
(d)表面活性剂；及
(e)糖，
其中所述至少两种抗体或抗体片段选自Mab17和Mab19及其片段。
39.权利要求38的配制剂，其中在水性载体中：
(a)所述氨基酸包括至少一种丙氨酸；
(b)所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂；
(c)所述表面活性剂包括至少一种PEG-3350、PEG-4000(1％)、吐温-20或吐温-80(0.1％)；及
(d)所述糖包括至少一种乳糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖或海藻糖，
其中所述至少两种抗体或抗体片段选自Mab17和Mab19及其片段。
40.权利要求1或38的配制剂，其中所述片段结合HBV的一种或多种部分或片段，其中所述结合有效抑制受试者中的HBV感染。
发明详述
方法
AB19和AB17的VL和VH结构域的氨基酸序列
AB 19 VL(SEQ ID NO.1)
SYVLTQPPSV SVAPGKTARI SCGGNNIGTK NVHWYQQKPG QAPVLVVYAD
SDRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISRVEVG DEADYYCQVW DSVSYHVVFG
GGTTLTVLG
AB 19 VH(SEQ ID NO.2)
QVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAPSGFVFR SYGMHWVRQT PGKGLEWVSL
IWHDGSNRFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYFCARER
LIAAPAAFDL WGQGTLVTVS S
AB 17 VL(SEQ ID NO.3)
DIVMTQSPLS LSVTPGEPAS ISCRSSQSLL HRSGNNYLDW YLQKPGHSPQ
LLIYVGSNRA SGVPDRFSGS GSGTEYTLKI SRVEAEDVGV YYCMQALQTP
RTFGQGTKLE IK
AB 17 VH(SEQ ID NO.4)
QVQLVESGGG VVRPGRSLRL SCAASGFAFS DYSINWVRQA PGKGLEWVAI
ISYDGRITYY RDSVKGRFTI SRDDSKNTLY LQMNSLRTED TAVYYCARQY
YDFWSGSSVG RNYDGMDVWG LGTTVTVSS
为了确定将会给抗体AB17和AB19提供高度稳定性的配制剂，通过在经历变化(在时间和pH方面)和暴露于应力条件(例如剪切应力和缓慢冻融循环)的同时分析抗体的结构稳定性，包括经由在50℃温育1-2周进行的加速稳定性研究，测试了不同赋形剂。在有/没有应力下在数个时间点(例如t0、t7、t14)使用以下工具检验分子的稳定性：直角光散射(Right Angle Light Scatter，RALS)、内部和外部荧光(Intrinsic and Extrinsic Fluorescence，IF&EF)连同分析方法，像高效大小排阻层析(HP-SEC)。
采用RALS来检测和监测可导致聚集和/或沉淀的分子结合行为的细微变化。RALS监测像可溶性分子转变成不溶性聚集体这样的宏观变化。IF测定法测量应力诱导的蛋白质构象变化，如通过色氨酸环境变化观察到的。EF利用外部非共价的、对极性敏感的荧光探针来检验蛋白质疏水裂隙的明显暴露及监测该参数作为各种环境应力和条件的函数的可能变化。
缓慢冻融
在读取最初的RALS或浊度后，将约400μL样品在Eppendorf管中置于-80℃冰箱中缓慢冷冻。完全冷冻(最少4小时)后，将所有样品在桌面上融化(室温)。将此过程重复总共5个循环。
剪切应力
将约750μL测试配制剂在锥形玻璃瓶中使用三角形搅棒经受剪切应力。将样品以300rpm(没有气穴现象)离心24小时，然后取出磁力搅拌器进行分析。
SDS-PAGE
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)使用Bis-Tris梯度4-12％进行。
将2μg抗体组合物与含50mM DTT的天然样品缓冲液(native samplebuffer)(InvitroGen)混合，并在加样前于100℃温育10分钟。
将凝胶以200V运行约30分钟，然后在DDW中漂洗3分钟两次。然后将凝胶在摇动中用考马斯蓝(Gelcode；Pierce)染色1小时，然后在DDW中漂洗过夜。
在Renium相机中使用Lis-cap程序对凝胶照相。
实施例1
本实施例描述了用于包含人抗HBsAg抗体AB19和AB17的液体配制剂的赋形剂的选择，其中AB19具有轻链(SEQ ID NO.1)和重链(SEQ ID NO.2)所示氨基酸序列，而AB17具有轻链(SEQ ID NO.3)和重链(SEQ ID NO.4)所示氨基酸序列。
AB19和AB17可以用杂交瘤细胞(保藏于ECACC，编号96052169和96052168)来生产，或者可以通过本领域众所周知的重组方法来制备，例如通过经编码各抗体重链和轻链的基因转染的CHO表达系统。
缓冲剂的选择
在使用不同缓冲剂生成的5.0到7.5的范围内比较了配制剂的数个pH值：柠檬酸钠、组氨酸或琥珀酸。通过IF、RALS、EF和SEC-HPLC检验了不同条件下不同缓冲剂中的AB17和AB19：于50℃温育7天和14天，暴露于剪切应力和缓慢冻融循环。
含柠檬酸盐、pH6.5的配制剂在测定中表现最好，因此选择柠檬酸钠作为配制剂的优选缓冲剂。
氨基酸作为稳定剂的评估
使用柠檬酸钠作为缓冲剂，配制了以50mM浓度含有不同氨基酸的一组配制剂。
通过IF、RALS、EF和SEC-HPLC检验这些配制剂，并经受剪切应力和缓慢冻融循环。
含谷氨酸和脯氨酸的配制剂得分最高，随后是含丙氨酸的配制剂。
进一步分析了这三种氨基酸以确定将抗体浓缩至100mg/ml的可行性。
含丙氨酸的配制剂在浓缩研究中得分最好。因为谷氨酸在先前的研究中得分最好，选择这两种氨基酸作为优选氨基酸稳定剂并在如下所述包括别的配制剂赋形剂的组合研究中进行再次检验。
碳水化合物和表面活性剂作为稳定剂的评估
碳水化合物通常用作稳定剂、等张调节剂、和/或填充剂(在冻干的情况中)。表面活性剂通常用于保护蛋白质免于剪切应力。
配制了数种含20mM柠檬酸钠，50mM谷氨酸，不同碳水化合物或表面活性剂的配制剂。检验了以下赋形剂：乳糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖和海藻糖(3％)，PEG-3350和PEG-4000(1％)，吐温20和吐温80(0.1％)。
通过IF、RALS、EF和SEC-HPLC检验了所有配制剂，并经受剪切应力和缓慢冻融循环。
含海藻糖和山梨醇的配制剂随时间的得分最好。因此选择这两种碳水化合物作为抗体配制剂的优选碳水化合物，并在组合研究中进行进一步检验。
含吐温80(T80)的配制剂在表面活性剂中得分最好，因此选择T80作为抗体配制剂的优选表面活性剂。
最后，基于上文所述数据，制备了数种抗体配制剂来检验不同稳定用赋形剂组合以确定优选组合。通过IF、RALS、EF和SEC-HPLC检验了这些组合。
这些测定表明处于pH6.5的柠檬酸钠为AB17和AB19提供了最大的稳定性。氨基酸丙氨酸和谷氨酸鉴定为AB17和AB19的首选稳定剂，而且选择海藻糖胜于另一种强碳水化合物稳定剂山梨醇。发现表面活性剂吐温80降低分子的剪切应力。
基于这些发现，对含优选赋形剂的四种液体配制剂评估用于治疗或预防HBV感染的优选临床配制剂。所述配制剂如下文表1所示。
表1：为此项研究制备的配制剂的基质
  配制剂编号 柠檬酸钠(mM) 丙氨酸(mM)    T80(％) 海藻糖(％)
    1     20     20     0.1     5
    2     20     50     0.1     4
    3     20     90     0.1     3
    4     20     20     0.05     5
使用上文所述测定法再次检验了这些配制剂。在温度、剪切和冻融应力下，所有配制剂保持较高的纯度和回收率二者。总之，配制剂3在28天稳定性研究中的表现略好。这说明较高的丙氨酸浓度有助于稳定抗体。
实施例2：
AB17配制剂的制备
在浓缩前，将AB17(在PBS中)的储液用20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，100mM NaCl溶液1∶1稀释以提供浓缩中的稳定性。然后通过持续4天的切向流过滤(Tangential-Flow Filtration，TFF)将蛋白质浓缩至～89mg/ml。浓缩后的AB17略有混浊，而且自TFF的回收率为80％。
使用透析管(分子量截留值25,000)将抗体缓冲液更换到上文所述优选配制剂中。
实施例3
本实施例描述了在配制剂3中对抗体组合AB17和AB19进行的稳定性测试。稳定性研究是对在5℃、25℃和40℃受控温度下贮存的样品进行的。
制备在2ml(终浓度60mg/ml)含0.1％吐温80或0.01％吐温80的配制剂3中含有90mg/ml AB17+30mg/ml AB19的组合样品。将样品在还原性条件下进行SDS-PAGE以检查样品的纯度和降解产物的存在情况。
图2和图3显示了在不同贮存温度中温育4周后的抗体样品(图2：含0.1％T80的配制剂3；图3：含0.01％T80的配制剂3)。在测量的所有温度，抗体链保持完整，可以看到两条不同的带，分别代表抗体重链和轻链。没有检测到杂质和降解产物。测试的两种吐温80浓度(0.1％和0.01％)在稳定抗体方面都是有效的。
使用免疫测定法测量了抗体的功能特性，即对HBsAg的结合，并显示于表3。在温育开始时测量了时间零点(T0)的比活(IU/mg)，并与在不同温度温育4周后(T4)的比活进行了比较。如表3所示，抗体的比活在温育4周后没有明显变化，提供了抗体在测试配制剂中稳定性的另一种指标。
表2
  温度   配制剂3+0.1％T80T0(IU/mg)   配制剂3+0.1％T80T4(IU/mg)   配制剂3+0.01％T80T0(IU/mg)   配制剂3+0.01％T80T4(IU/mg)
  5℃     919.5     853.3     786     863.6
  25℃     919.5     909.5     786     883.74
  40℃     919.5     886.4     786     745.76
实施例4-32
如上所述进行了更多实施例，配制剂如下并保存于5、25和40摄氏度：
    实施例 单抗 浓度(mg/mL) 配制剂 ％吐温80 ％海藻糖 摩尔比海藻糖∶单抗
    5  17  30mg/ml  20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.1％吐温80  0.1  3  395
    6  17  30mg/ml  20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.01％吐温80  0.01  3  395
    7  17  60mg/ml  20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.1％吐温80  0.1  3  198
    8  17  60mg/ml  20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.01％吐温80  0.01  3  198
    9  17  90mg/ml  20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.1％吐温80  0.1  3  132
  实施例   单抗   浓度(mg/mL)     配制剂   ％吐温80   ％海澡糖   摩尔比海藻糖∶单抗
  10   17   90mg/ml   20-柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.01％吐温80   0.01   3   132
  11   17   30mg/mL   20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，6％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   6   795
  12   17   60mg/mL   20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，10％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   10   660
  13   17   60mg/mL   20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，10％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   10   660
  14   17   90mg/mL   20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，10％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   10   440
  15   19   10mg/ml   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   3   1196
  16   19   10mg/ml   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.01％吐温80   0.01   3   1196
  17   19   20mg/ml   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   3   594
  18   19   20mg/ml   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.01％吐温80   0.01   3   594
  19   19   30mg/ml   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   3   395
  20   19   30mg/ml   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.01％吐温80   0.01   3   395
  21   19   20mg/mL   20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，6％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   6   1195
  22   19   20mg/mL   20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，6％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   6   1195
  实施例   单抗   浓度(mg/mL)     配制剂   ％吐温80   ％海藻糖   摩尔比海藻糖∶单抗
  23   19   30mg/mL   20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，6％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   6   795
  24   17和19   20mg/mL   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   3   594
  25   17和19   20mg/mL   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.01％吐温80   0.01   3   594
  26   17和19   40mg/mL   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   3   304
  27   17和19   40mg/mL   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.01％吐温80   0.01   3   304
  28   17和19   60mg/mL   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   3   198
  29   17和19   60mg/mL   20mM柠檬酸钠，90mM丙氨酸，3％海藻糖，0.01％吐温80   0.01   3   198
  30   17和19   20mg/mL   20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，6％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   6   1195
  31   17和19   20mg/mL   20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，6％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   6   1195
  32   17和19   40mg/mL   20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，6％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   6   612
  33   17和19   40mg/mL   20mM柠檬酸钠，50mM丙氨酸，10％海藻糖，0.1％吐温80   0.1   10   1015
实施例4-32在3个月后的稳定性结果如下：
％单体手工综合 SDS-PAGE非还原性％主带(135～175KDa)     SDS-PAGE还原性(％MW4(重链)+％MW5(轻链))
  (MonomerManualIntegration)(12周)
+++   ＞88％     ＞86％     ＞95％
++   86％～88％     81％～86％     89～95％
+   ＜86％     ＜81％     ＜89％
实施例    温度(℃) ％单体手工综合(12周)     SDS-PAGE非还原性(12周)1     SDS-PAGE还原性(12周)1
    5     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +++     ++
    6     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +++     +++     +++
    7     5     +++     ++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +     ++
    8     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     ++     +
    9     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +     ++     +++
    10     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +++     +++
    11     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +     ++     +++
    12     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +     ++     +++
    13     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +     +     +++
    14     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +     ++     +++
    15     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +     +++     ++
    16     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +++     ++
    17     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     ++     ++
    18     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +++     +
    19     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +     ++     ++
    20     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +++     +
    21     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +     ++     ++
    22     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +     ++     ++
    23     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +     +     +
    24     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +++     +     +++
    25     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +++     +     +++
    26     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +++     +++
    27     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     +++     +     +++
    28     5     +++     ++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +     +++
    29     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +     +++
    30     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +++     +++
    31     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +++     +++
    32     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     ++     +++
    33     5     +++     +++     +++
    25     +++     +++     +++
    40     ++     +     +++
以上3个月的稳定性数据显示了17和19组合的有些40℃配制剂表现得像单独的17或19的类似配制剂一样好或更好。
在理解用于描述本文中的量的术语“(大)约”时，每种情况也涵盖在术语“(大)约”后面的精确量。将本文中引用的所有发表文献、专利和专利申请明确收入本文作为参考。

Claims (40)

1.一种抗体配制剂，含有：
(a)至少10mg/ml一种或多种特异性结合HBV抗原的抗体或其片段；
(b)丙氨酸；
(c)柠檬酸钠；
(d)吐温80；及
(e)海藻糖。
2.权利要求1的配制剂，其中所述水性载体是蒸馏水。
3.权利要求1的配制剂，其中所述配制剂是无菌的。
4.权利要求1的配制剂，其中所述配制剂是同质的。
5.权利要求1的配制剂，其中所述配制剂的pH范围是约5.0-7.5。
6.权利要求1的配制剂，其中至少一种抗体或抗体片段的浓度是至少20mg/ml。
7.权利要求1的配制剂，其中至少一种抗体或抗体片段的浓度是至少40mg/ml。
8.权利要求7的配制剂，其中至少一种抗体或抗体片段的浓度是至少80mg/ml。
9.权利要求8的配制剂，其中至少一种抗体或抗体片段的浓度是至少100mg/ml。
10.权利要求1的配制剂，其中丙氨酸的浓度是约85-约95mM。
11.权利要求1的配制剂，其中丙氨酸的浓度是约90mM。
12.权利要求1的配制剂，其中柠檬酸钠的浓度是约10-约30mM。
13.权利要求1的配制剂，其中柠檬酸钠的浓度是约20mM。
14.权利要求1的配制剂，其中吐温80的浓度是约0.05％-约0.5％。
15.权利要求1的配制剂，其中吐温80的浓度是约0.1％。
16.权利要求1的配制剂，其中海藻糖的浓度是约1％-约10％。
17.权利要求1的配制剂，其中海藻糖的浓度是约3％。
18.权利要求1的配制剂，其中根据HPSEC的测定，至少一种特异性结合HBV抗原的抗体或抗体片段在室温至少6个月是稳定的。
19.权利要求1的配制剂，其中根据HPSEC的测定，至少一种特异性结合HBV抗原的抗体或抗体片段在4℃至少2年是稳定的。
20.权利要求1的配制剂，其中根据HPSEC的测量，少于10％的抗体或抗体片段形成聚集体。
21.权利要求1的配制剂，其中根据HPSEC的测量，少于5％的抗体或抗体片段形成聚集体。
22.权利要求1的配制剂，其中至少一种所述抗体或抗体片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.1的轻链可变区(VL)和具有氨基酸序列SEQ ID NO.2的重链可变区(VH)；且至少第二种所述抗体或抗体片段包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.3的轻链可变区(VL)和具有氨基酸序列SEQ ID NO.4的重链可变区(VH)。
23.一种适于肠胃外施用于人的药物单位剂量形式，其在制药学合适容器中装有权利要求1或22的抗体配制剂。
24.权利要求23的药物单位剂量形式，其中至少一种所述抗体或其片段的浓度为约10mg/ml-约100mg/ml，体积为1ml-20ml。
25.权利要求23的制药学单位剂量形式，其中所述抗体或其片段的浓度为80mg/ml，体积为1ml。
26.权利要求23的制药学单位剂量形式，其中所述抗体配制剂是适于皮下施用的抗体配制剂。
27.权利要求23的制药学单位剂量形式，其中所述抗体配制剂是适于静脉内施用的抗体配制剂。
28.权利要求23的制药学单位剂量形式，其中所述抗体配制剂是适于肌肉内施用的抗体配制剂。
29.装有权利要求1的配制剂的密闭容器。
30.用于治疗受试者中的HBV感染的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的权利要求1的配制剂。
31.用于减轻移植的肝脏中的HBV感染的方法，包括给所有需要的个体施用权利要求1的配制剂。
32.用于治疗生来就有HBV感染母亲的个体的方法，包括给所述个体施用权利要求1的配制剂。
33.用于治疗暴露于HBV的保健工作人员的方法，包括给所述保健工作人员施用权利要求1的配制剂。
34.权利要求30、31、32或33的方法，其中所述配制剂是肠胃外施用的的配制剂。
35.权利要求30、31、32或33的方法，其中所述配制剂是肌肉内施用的的配制剂。
36.权利要求30、31、32或33的方法，其中所述配制剂是静脉内施用的的配制剂。
37.权利要求30、31、32或33的方法，其中所述配制剂是皮下施用的的配制剂。
38.一种配制剂，在水性载体中含有：
(a)至少10mg/ml的至少两种特异性结合HBV抗原的抗体或其片段；
(b)氨基酸；
(c)缓冲剂；
(d)表面活性剂；及
(e)糖，
其中所述至少两种抗体或抗体片段选自Mab17和Mab19及其片段。
39.权利要求38的配制剂，其中在水性载体中：
(a)所述氨基酸包括至少一种丙氨酸；
(b)所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂；
(c)所述表面活性剂包括至少一种PEG-3350、PEG-4000(1％)、吐温-20或吐温-80(0.1％)；及
(d)所述糖包括至少一种乳糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖或海藻糖，
其中所述至少两种抗体或抗体片段选自Mab17和Mab19及其片段。
40.权利要求1或38的配制剂，其中所述片段结合HBV的一种或多种部分或片段，其中所述结合有效抑制受试者中的HBV感染。
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