CN101163520A - 延长鱼的季节性游动期的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物饲料领域,更具体属于鱼饲料领域。令人惊讶地发现,鱼的季节性游动期可以通过干涉鱼的饮食而被延长。我们发现,可能将鱼的季节性游动期延长到即使温度低至2摄氏度仍然是活动的程度。其可以通过向鱼饲料中添加天然存在的物质来实现。这些天然存在的物质的实例是免疫增强成分如β-葡聚糖和/或少量的如茁长素或赤霉酸的植物激素。而且这些物质的组合,特别是β-葡聚糖和植物激素的组合,在延长鱼的季节性游动期中表现出比它们单独使用也具有更好的协同效果。
Description
本发明属于动物饲料领域,更具体属于鱼饲料领域。
鱼饲料中含有大量的物质。其必须含有能够使动物良好生长所必须的全部营养并能使动物远离疾病。
众所周知的现象是,许多鱼种在水温或白天的长度降低到一定值时会有一段静止期。在游动减少的时期内,鱼的新陈代谢也会显著地降低。因此,只要温度和/或日光条件保持在低于临界的水平,鱼就不会消耗饲料并且将保持不游动的状态。当水温和/或白天的长度再次上升时,例如由于季节的变化,鱼将会再次游动起来并开始进食。
上述机理已经被广泛地研究,例如在锦鲤(koi fish)中。锦鲤在水温降低到大约8℃时就会变得不游动。只要上述条件能够保持,鱼的游动性就会大大降低,它会沉入深水中并且待在那儿。当春天水温上升到8℃以上时,鱼将重新游动起来,并且开始偶尔地游上水面。
锦鲤的饲养人由于显而易见的理由而试图延长他们的锦鲤的活动期或游动期。众所周知,在春天,大气的温度比水的温度上升的快得多。因此,与那些鱼自己想要重新回到外面的大约同一时间,锦鲤的饲养人也希望他们的鱼到水面上来。
解决上述问题的一个显而易见的方式是通过人工加热设备对水加热,而使水温不会下降到临界值以下。也可以建议人工延长白天以使锦鲤的游动保持比较久的时间。但是,显然这样可能是很昂贵和耗能的方式,尤其是在寒冷气候下的大型室外池塘中。
现在令人惊讶地发现,鱼的季节性游动期可以通过干预鱼的膳食来延长。我们发现其可以将鱼的季节性游动期提高到即使温度低至2℃,鱼仍然游动着。上述的方法可以通过向鱼饲料中添加天然存在的物质而实现。
本文中所使用的惯用语“延长鱼的季节性游动期”是指鱼可以当其游动期间有一个延长的周期,例如是由季节变化所决定的周期。更特别的是,惯用语“延长鱼的季节性游动期”是用来表示在两个寒冷季节期之间鱼可游动的时间间隔的延长。所以该现象也可以被描述为把最低温度降低至鱼在寒冷期之后变成游动的温度。参照图1可以了解该现象的图示。
那些根据本发明能够带来影响的天然存在物质的例子有,免疫增强成分如β-葡聚糖和/或少量的植物激素如茁长素或赤霉酸。这些物质的组合,尤其是β-葡聚糖与植物激素,更具体是游离吲哚-3-乙酸(IAA,茁长素)的组合,在延长鱼的季节性游动期方面表现出具有协同的效果,该效果甚至比单独使用单一的成分更大。
本文中的植物激素被定义为那些能够调整植物生长和发育的分子。被认为是植物激素的化合物有:吲哚-3-乙酸(IAA,茁长素),细胞分裂素,赤霉素,赤霉酸,乙烯,脱落酸。此外,油菜素类固醇(brassinosteroids)、茉莉酸和水杨酸也表现出显著的生长调节能力并且被认为起到了植物激素的作用。
特别是,当周游离IAA代替缀合IAA补充给鱼饲料时将会获得良好的结果。本文中使用的术语“游离IAA”表示那些游离状态或酸形式的游离IAA,而术语“缀合IAA”是指那些通过酯键或通过酰胺键缀合的IAA。
游离IAA和缀合IAA均是已知的化合物。游离IAA是已被广泛研究的天然存在的植物生长激素。在植物中,大多数的IAA是以缀合的形式存在的(Slovin等,1999,Biochemistry and molecularbiologyof plant hormones,Elsevier,Amsterdam,p115-140),或者通过酯键与糖缀合,或者通过酰胺键与氨基酸和肽缀合。
游离IAA可以作为工业产品而容易获得。其可以是化学合成的或通过生物方法制备的。产IAA的微生物在自然界中广泛存在。酵母,真菌和一些细菌和植物均已知可以将IAA的前体转化为游离IAA。除了由细菌转化L-色氨酸之外,将L-色氨酸转化为游离IAA的独立生物途径也被广泛描述(J.Plant Growth Regul(2001)20:198-216)。
为大家所熟知的能够产游离IAA的细菌是巴西固氮螺菌(Azospirillum Brasilense)(AB)。在普通发酵工艺中的生长末期,AB能够将L-色氨酸转化为游离IAA。为了提高转化效率,可以将少量的合成游离IAA加入到培养基中。通过反馈机制,AB增强了L-色氨酸到游离IAA的转化。
最终浓度为1克游离IAA/升的肉汤培养基可以容易地获得,而且还可以达到更高的浓度,这取决于所使用的微生物。
在发酵结束之后,可以将微生物溶解,并可以通过喷雾干燥或其他任何方便的方式干燥肉汤培养基而得到富含游离IAA的粉末。也可以采用其他技术来部分或完全地除去液体。
早至1956年,就有游离IAA对人类影响的研究,其揭示了单计量为0.1g/kg是无毒的(Mirsky A and Diengott D,Hypoglycemicactionof indole-3-acetic acid by mouth in patients with diabetesmellitus,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.93:109-110.1956)。在1964年,发现了作为微生物生长抑制剂的游离I AA光氧化产物(Still C,Fukuyama T and Moyed H,Inhibitory Oxidation Products ofIndole-3-acetic acid,J.Biological Chemistry,240.6,2612-2618,1964)。
游离IAA及其衍生物的药物用途也在早先被描述过。EP1.296.676描述了游离IAA作为药物的用途,特别是用于治疗人类肿瘤性疾病。WO02/080906描述了游离IAA治疗女性子宫内膜异位的用途。Nachson等(Food and Chemical Toxocology 41,745-752)报道了一些游离IAA衍生物(吲哚-3-甲醇和3,3′-二吲哚基甲烷)对人前列腺癌细胞系中的增殖和凋亡诱导的效果,而Rossiter等(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,12,2523-2526),和Folkes等(Biochemical Pharmacology 63,265-272)都描述了游离IAA以及一些衍生物在涉及癌症治疗的酶-前药中的用途。
包含IAA的动物饲料在本领域中也有描述,例如,US-A-2925341公开了一种饲料添加剂,其在每公斤的饲料中包含有10-50mg的吲哚乙酸。
目前发现植物激素和β-葡聚糖可以在大范围的浓度下延长鱼的季节性游动期。最佳浓度可以在不同鱼种之间略微变化,然而,本领域技术人员将会知道如何针对给定的鱼种得到最佳浓度,例如将希望的化合物滴定入鱼饲料中,并测定何时出现最佳效果。下述内容可以在该方法中起指导作用。
本领域的技术人员将会意识到,为了给动物提供有效量的游离IAA,游离IAA在即用鱼饲料中的量必须被调整。为了调整饲料中游离IAA的浓度以获得一定的游离IAA的日摄入量,必须作出动物或动物群饲料摄入量的评估。本领域技术人员知道具体(种或群的)动物的饲料摄入量。通常每天的饲料摄入量在动物体重的0.05%和10%之间,偶尔会高达20%。但是,从静止期中醒来的锦鲤消耗的要少得多,约为其体重的0.01至0.1%。
当提供的游离IAA在0.02至240微克每千克生命体重每天(ug/kglw/day)时,锦鲤会作出延长游动期的反应。当浓度在0.2和24ug/kglw/day时会达到成本和收益之间的最佳点,特别是含有1和5ug/kglw/day之间,如2.4ug/kglw/day的游离IAA的饲料是十分有效的。
因此本发明在一方面涉及一种延长鱼的季节性游动期的方法,其中用范围在0.02和240微克每千克体重每天(ug/kglw/day)的游离IAA喂饲鱼。
特别适宜于此目的的是,每公斤鱼饲料中包含0.3至3000毫克之间的游离IAA的鱼饲料。在另一方面,本发明还涉及每公斤鱼饲料包含0.3至3000毫克的植物激素的鱼饲料在延长鱼的季节性游动期中的用途。
我们还发现,在β-葡聚糖的同族物中,特别是1,3以及1,6β-葡聚糖对于延长鱼的季节性游动期十分有用。该1,3及1,6β-葡聚糖的特别好的来源可以在姬松茸(Agaricus blazei murill)(ABM)或酵母细胞壁的制备中发现。鲜ABM或干ABM都可以在本发明中使用,干ABM通常是鲜ABM重量的10%。干ABM可以含有约为2%至50%的1,3和/或1,6β-葡聚糖,一般约为10%至20%。
当给鱼喂饲1至10.000ug/kglw/day的干姬松茸(相当于10至100.000ug的鲜姬松茸每kglw/day)时,我们发现在延长鱼的季节性游动期方面产生了期望的效果。其相当于大约0.1至2000ug/kglw/day的1,3和1,6β-葡聚糖。当给鱼喂饲10至200ug/kglw/day的1,3和1,6β-葡聚糖时能够获得极好的结果。最佳的成本收益点会在60ug/kglw/day左右的1,3和1,6β-葡聚糖或600ug/kglw/day的干姬松茸时发现。
在一方面,本发明还因此涉及一种延长鱼的季节性游动期的方法,其中是用0.1至2000ug/kglw/day的1,3和1,6β-葡聚糖喂饲鱼。
特别适宜于此目的的是每公斤鱼饲料中含有0.015至150克的鱼饲料。因此在本发明的另一方面涉及了每公斤鱼饲料含有0.015至150克的β-葡聚糖的鱼饲料在延长鱼的季节性游动期中的用途。
含有β-葡聚糖的动物饲料是容易获得的。例如,WO02/091850A公开了一种动物饲料,其在每公斤饲料中含有100-1000mg的β-葡聚糖。而JP07051000A,US6306453B1,WO2004/105775,WO02/37988,WO2004/066863,WO2004/014320和US2005/020490A1中均公开了含有β-葡聚糖的组合物,且该组合物适于作为本发明中的动物饲料。该动物饲料也被描述于Hiss和Sauerwein,Journal of animal physiologyand animal nutrition,87,2003,pp2-11,Deblackwell,Berlin。
当它们的饲料中补入了赤霉素或赤霉酸时,锦鲤也表现出期望的效果。在此发现其最佳浓度是在0.002至20ug/kglw/day的范围。在0.02至2ug/kglw/day的范围内时,对鱼的季节性游动期的延长效果特别显著。在0.1至2ug/kglw/day之间能够获得最佳的结果,如0.24ug/kglw/day。
可以在本发明中使用的含有赤霉酸的适宜饲料物质已经被公开了。US-A-2943938和Svihua等(Journal of Animal Science,64,1997,p257-272)描述了一种动物饲料,其在每公斤组合物中含有适量的赤霉酸。
附图说明
图1,该图表现了荷兰每个月的平均温度(来自KNMI,de Bilt,荷兰,www.knmi.nl)。图例中8℃和3℃的水平线表示如果温度在此水平,鱼的状态就是游动的。该水平线从8℃下降到了3℃,鱼的季节性游动期就延长了大约2至3个月。
实施例
实施例1:含有游离IAA的微生物产品的制备
用在培养管中的琼脂培养基获得巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilence)Sp7(ATCC)。用LB培养基在28℃、175rpm条件下培养菌株过夜。往培养基中加入甘油直至10%,混合并分装至Nalgenecreovials中,并在-80℃下冷冻。母液-80℃下贮藏在creovials中。
为了制备巴西固氮螺菌的种子培养物,将母液(1.2至1.8ml)解冻并加入到1升的LB培养基中,并使其在28℃和175rpm条件下生长约20h,使吸光度达到约2.5(OD620nm)。
用水清洗一个10升的发酵罐,并校准pH电极。制备9升的LB培养基并加入1g/l的L-色氨酸和0.1g/l的游离IAA。将培养基与2ml的消泡剂一起加入到发酵罐中。将发酵罐在121℃下消毒30min。冷却至28℃后,分别在0和100%的气体饱和度下用N2和O2校准O2探测器。
用分别在高压锅中消毒过的烧瓶和导管将种子培养物转移到发酵罐中。当加入过程完成时,移走导管和烧瓶,并按照下述的参数开始发酵:
搅拌器速度 400rpm
温度 28℃
换气速率 0.75Nl/min
pH 7
15分钟后,取样在OD620nm下测量吸光度并测定pH。取样是有一定间隔的以确定巴西固氮螺菌的生长量。当生长率降低时,应额外补充培养基,以确保形成足够生物物质以产生游离IAA。我们发现当快速生长期结束时游离IAA的产生就开始并持续一个延长期。IAA的浓度用LC-MS法进行跟踪。当游离IAA的浓度达到约1g/l的水平时,终止发酵,收集细胞并周非喷气(nonojet)均质机在大约1400巴的压力下溶解。对剩余的上清液和溶解的细胞进行杀菌处理并喷雾干燥而得到期望的产品组成。
实施例2:含有β-葡聚糖的饲料的制备
将量为3.0g的β-葡聚糖天然来源的姬松茸(Agaricus BlazeiMurill)(Agaricus Farm)悬浮在100ml的橄榄油中。本发明中的鱼饲料是通过用100ml的油悬浮液真空浸渍1千克的市场上可购买的(Coppens)Cyprico White的3mm漂浮饲料制成。对照饲料是仅用橄榄油来真空浸渍同样量的饲料制成。
实施例3:制备含有植物生长激素的饲料
将相当于12mg游离IAA的,如实施例1中所描述的适量喷雾干燥成分悬浮在100ml的橄榄油中。本发明中的鱼饲料是通过用100ml的油悬浮液真空浸渍1kg市场上可购买的(Coppens)Cyprico White 3mm的漂浮饲料而制成的。对照饲料是仅用橄榄油真空浸渍同样量的饲料而制得。
实施例4:含有β-葡聚糖和植物生长激素的饲料的制备
将量为3.0g的是β-葡聚糖天然来源的姬松茸(ABM,AgaricusFarm)和相当于12mg游离IAA的如实施例1中所描述的喷雾干燥成分悬浮在100ml的橄榄油中。本发明的鱼饲料是通过用100ml的油悬浮液真空浸渍1kg市场上可购买的(Coppens)Cyprico White的3mm漂浮饲料制成。对照饲料是仅用橄榄油真空浸渍同样量的饲料制得。
实施例5:含有β-葡聚糖和植物生长激素的饲料在延长鱼的季节性游
动期中的用途
用4个40立方米的池塘来表示本发明中鱼饲料的效果,每个池塘中均有50条总体重大约为50kg的锦鲤。作为对照的一个池塘是其中的鱼喂饲对照饲料,其他池塘中的鱼喂饲的是如上述实施例2至4中所述那样制备的本发明中的饲料。试验当水温为大约2℃时开始。
对照池塘中的鱼每天喂饲10g的Cyprico White的3mm漂浮饲料,而其他池塘中的鱼喂饲10g实施例2,3和4中所描述的饲料(表1)。
可以观察到,测试组中的鱼游到水面并开始进食饲料,而对照组却没有表现出活动的迹象。该影响每天逐步增大直到5天之后鱼完全游动起来,而水温却仍然是在2至3摄氏度之间。鱼的游动性用相对指标1至5来进行评分,其中1表示完全不游动,而5表示完全游动(表2)。对照池塘中的水与其他池塘中的具有完全相同的温度,但是对照池塘中的鱼却是完全不游动的。在4周之后,当水温逐步提高到6摄氏度时,在测试组中并没有出现不良副作用。鱼是健康的并是完全游动的,而对照组却几乎是完全不游动的。
表1
饲料添加物 | |
池塘1 | 2.4ug/kglw/day的游离IAA |
池塘2 | 600ug//kglw/day的ABM |
池塘3 | 2.4ug/kglw/day的游离IAA+600ug/kglw/day的ABM |
池塘4(对照) | 无 |
表2
天数 | 温度(摄氏度) | 池塘1中的游动性 | 池塘2中的游动性 | 池塘3中的游动性 | 池塘4中的游动性 |
1 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 |
2 | 2 | 1 | 1 | 2 | 1 |
3 | 3 | 1 | 1 | 2 | 1 |
4 | 3 | 2 | 2 | 2 | 1 |
5 | 3 | 2 | 2 | 3 | 1 |
8 | 3 | 3 | 1 | 2 | 1 |
12 | 3 | 2 | 2 | 3 | 1 |
16 | 4 | 2 | 2 | 4 | 1 |
20 | 5 | 3 | 3 | 4 | 1 |
24 | 5 | 4 | 4 | 5 | 2 |
28 | 6 | 4 | 4 | 5 | 2 |
表2表现了以指标1至5(1是完全不游动,5是完全游动)表示的鱼的游动性之间的关系,以及池塘中的水温。在池塘1,2和3中的鱼喂饲本发明中的鱼饲料,池塘4中的鱼喂饲对照饲料。进一步的细节将会在实施中描述。
Claims (8)
1.每公斤饲料含有0.015至150克的β-葡聚糖和/或0.3至3000毫克的植物激素的鱼饲料在延长鱼的季节性游动期中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其中的鱼饲料包含每公斤饲料0.015至15克,优选0.1至1克的β-葡聚糖。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其中的β-葡聚糖包含1,3和/或1,6β-葡聚糖。
4.根据权利要求1-3所述的用途,其中植物激素选自由吲哚-3-乙酸,细胞分裂素,赤霉素,赤霉酸,乙烯,脱落酸,油菜素类固醇,茉莉酸和水杨酸构成的组。
5.根据权利要求1-4所述的用途,其中鱼饲料包含每公斤饲料3至300毫克,优选5至100毫克的植物激素。
6.根据权利要求1-5所述的用途,其中的植物激素是游离IAA。
7.根据权利要求1-5所述的用途,其中的植物激素是赤霉酸。
8.鱼饲料,其包含每公斤饲料0.015至150克β-葡聚糖和0.5至6000毫克的游离IAA。
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