CN101161673A - 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-n端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种活性肽类物质精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法。通过氯乙酰氯与天冬氨酸的制得氯乙酰化天冬氨酸、再与乙酸酐反应得到氯乙酰化天冬氨酸内酸酐、与N端游离的氨基酸(或其衍生物)反应得到氯乙酰化天冬氨酸-AA(AA代表N端游离的氨基酸或其衍生物)、进而氨解得到甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽;苄氧羰基精氨酸(Z-Arg-OH)与三溴化磷反应得到氮羧基内酸酐精氨酸(NCA-Arg),再与三肽反应得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA四肽。具有简化工艺、降低成本、减少工时、安全操作等优点,能够制备高纯度、高活性的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA四肽及其衍生物产品。
Description
技术领域
本发明属生物化学领域,具体涉及一种活性肽类物质精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法。
背景技术
细胞外基质及基底膜中的纤维连接蛋白(Fn)、玻璃体连接蛋白(VN)、胶原蛋白(Collagen)、血管性假血友病因子(vWF)等均含有一高度保守的氨基酸序列-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列。美国癌症研究中心的Pierschbacherherhe和Puoslahti于1984年首次发现并鉴定了此三肽的细胞粘附作用。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是整联蛋白的主要识别位点,而整联蛋白又是一类在细胞信号转导中发挥重要作用的细胞粘着因子。所以此三肽序列可以模拟细胞外基质成分被整联蛋白所识别从而对细胞进行调节。
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列在生物体内的功能很多。层粘连蛋白出现于早期胚中,对于保持细胞间粘连,细胞的极性及细胞的分化都有重要意义。层粘连蛋白也与肿瘤细胞的转移有关。而层粘连蛋白正是通过此三肽序列与细胞膜上的整联蛋白结合,从而在胚胎发育及组织分化中发挥重要作用。
在细胞外基质中的纤连蛋白中,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是其被细胞识别的最小结构单位。其受体也为整联蛋白家族成员之一。纤连蛋白的功能主要是介导细胞粘着。通过粘着,纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织促进细胞铺展。在胚胎发育过程中,纤连蛋白对于许多类型的细胞迁移和分化是必需的。在创伤修复中,纤连蛋白促进巨噬细胞和其他免疫细胞迁移到受损部位。在血凝块形成过程中,纤连蛋白促进血小板附着于血管受损部位。显微注射纤连蛋白受体的抗体或含此三肽序列的短肽可以阻断细胞的迁移。
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列与肿瘤细胞及其新生内皮血管表面的整联蛋白受体结合,参与肿瘤细胞的浸润过程。粘附是癌细胞侵袭的始动步骤。肿瘤细胞通过膜表面受体粘附于基底膜及细胞外基质成分。肿瘤细胞与细胞外基质的多种成分(如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等)的相互粘着,是肿瘤转移过程的重要环节,此类肽限制了肿瘤细胞向细胞外基质的粘附及转移。人工合成此肽类的氨基酸序列,竞争性地与肿瘤细胞表面的整联蛋白受体结合,抑制细胞与基质之间的粘附,达到抑制肿瘤细胞浸润、转移的目的。近年来,还发现此三肽在伤口愈合、神经再生、皮肤修复等方面具有良好的作用。
综上所述,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列是多种生物细胞外基质和血浆蛋白结构中常见的基本成分,也是广泛存在于细胞间识别系统的基本单位,能与细胞表面整联蛋白特异性结合,从而介导许多重要的生命活动。外源性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽能与体内含此三肽序列的物质竞争结合整联蛋白,从而具有一系列生物学功能。近些年的研究发现,和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列相连的第4位的氨基酸对其活性影响较大,和此三肽序列相连的第5位氨基酸对肽的结合专一性也起到重要的作用。含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(简写为精-甘-天)序列并具有生理功能的四肽有精-甘-天-丝氨酸、精-甘-天-缬氨酸、精-甘-天-苏氨酸、精-甘-天-胱氨酸、精-甘-天-苯丙氨酸等。
精-甘-天-丝氨酸四肽由于含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列,可以占领血小板表面的GP IIb/IIIa受体,因此可以抑制纤维蛋白参与的血小板聚集和血栓形成。
精-甘-天-丝氨酸四肽能抑制结肠癌细胞骨肉瘤细胞与血小板的粘附。如静注后此四肽可干扰肿瘤血管生成,使肿瘤灶生长缓慢。作用机理为阻断了血管内皮细胞表面整合素αVβ3与细胞外基质(ECM)的联系,使血管内皮细胞发生凋亡,从而抑制肿瘤细胞的生长和转移。
精-甘-天-丝氨酸四肽是血小板膜上GPIIb/IIIa受体的拮抗剂,具有对血栓部位活化血小板的趋向性,能与血小板Fg片断特异性结合,用精-甘-天-丝氨酸四肽修饰成尿激酶脂质体(第一代靶向脂质体,即导向弹头直接连在脂质体表面),可望作为血栓靶向制剂的导向弹头。此四肽还能明显促进成骨细胞的生长,对成型骨强度有一定的影响。
由于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA(AA代表N端游离的氨基酸或其衍生物)四肽具有如此广泛的作用,吸引了很多人对其功能进行研究,希望它能为多种疾病的治疗提供新方法。然而精-甘-天-丝氨酸四肽的价格十分昂贵,不但限制了它的应用,而且也制约了对它的应用的深入研究。
对于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽的合成已经分别有了酶法合成、化学法合成、化学法与酶法相结合的方法来合成。而我们选择了化学法合成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA四肽,并提出了合成此类四肽的规律性认识与创新性方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简化、成本降低、工时减少、操作安全的制备精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA(AA代表N端游离的氨基酸或其衍生物)四肽产品的方法。
我们选择了液相化学法合成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA(AA代表N端游离的氨基酸或其衍生物)四肽。我们所用的化学法并不是经典的用带保护基的氨基酸进行的肽合成,而是利用廉价的不带有保护基的氨基酸或只用苄氧羰基保护的氨基酸来合成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽,第四个氨基酸可以是N端游离的氨基酸或其衍生物。我们之所以选择这种方法是因为这种方法与其他方法相比较费用较低、反应简单、效率也是很高的。
本发明是一种液相化学合成法,过程有二肽合成——三肽合成——四肽合成,是以苄氧羰基精氨酸(Z-Arg-OH)、天冬氨酸、N端游离的氨基酸或其衍生物为原料(三种原料均为现有产品);包括:氯乙酰氯与天冬氨酸的反应得到氯乙酰化天冬氨酸、氯乙酰化天冬氨酸与乙酸酐反应得到氯乙酰化天冬氨酸内酸酐、氯乙酰化天冬氨酸内酸酐与N端游离的氨基酸(或其衍生物)反应得到氯乙酰化天冬氨酸-AA、氯乙酰化天冬氨酸-AA氨解得到甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽、苄氧羰基精氨酸(Z-Arg-OH)与三溴化磷反应得到氮羧基内酸酐精氨酸(NCA-Arg)、氮羧基内酸酐精氨酸(NCA-Arg)与甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽反应得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA四肽六个步骤。
具体工艺步骤如下:
(1)取25~35克L-天冬氨酸悬浮于40~60毫升、质量浓度为17%~27%氢氧化钠水溶液中使其完全溶解,用该浓度氢氧化钠水溶液调pH值8~12之间,然后加入30~60毫升乙酸乙酯;在0℃~10℃的条件下,以0.10~0.20ml/min的速度分别滴加15~30毫升10~13mol/l氯乙酰氯和15~40毫升17%~27%氢氧化钠到上述溶液中,边滴加边搅拌,滴加过程中控制氢氧化钠水溶液滴加速度保持溶液的pH在8~12范围内,滴加完毕,继续搅拌20~50分钟;结束反应时用浓盐酸(浓度37%)调PH至3以下,然后将此反应液用乙酸乙酯抽提三次,合并提取液,加无水硫酸钠干燥,减压除去乙酸乙酯,即得到氯乙酰化天冬氨酸白色粉末;
(2)将10~20克氯乙酰化天冬氨酸加入10~20毫升、10~11mol/L乙酸酐,在35℃~42℃空气浴加热下防潮搅拌3~4小时,再加入3~5毫升乙酸酐搅拌3~4小时,冷却至室温固化,加入40~60ml乙醚和10~20ml石油醚研碎,过滤,经200~500ml乙醚-石油醚(V乙醚∶V石油醚=4∶1)洗涤后干燥,得氯乙酰化天冬氨酸内酸酐;
(3)将氯乙酰化天冬氨酸内酸酐溶于乙腈中(氯乙酰化天冬氨酸内酸酐质量∶乙腈体积=1g∶10~20ml);将N端游离的氨基酸或其衍生物溶于0.1~0.5mol/L碳酸钾水溶液中,浓度为1g∶1~10ml,用碳酸钾水溶液调pH值为8~12之间,氯乙酰化天冬氨酸内酸酐与N端游离的氨基酸或其衍生物的摩尔比为1∶1,在0~10℃的条件下,缓缓滴入氯乙酰化天冬氨酸内酸酐乙腈溶液(滴速0.1~0.2ml/min),保持pH为8~12之间,滴完后继续搅拌30~60分钟。结束反应时用浓盐酸(浓度37%)调PH至3以下,将此反应液用乙酸乙酯抽提三次,将水层除盐后冻干,得到氯乙酰化天冬氨酸-AA;
(4)在0℃~10℃条件下,将前面所得的氯乙酰化天冬氨酸-AA按照1g∶5~10ml的比例加入浓度为25%~28%的浓氨水,搅拌24~48小时,然后减压除去多余氨气,旋转蒸发得到微黄粘稠状物质,加入乙醇振摇并倒掉,再加入乙醇搅拌至成粉末,旋转蒸发即得甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽白色粉末;
(5)于20ml~200ml四氢呋喃溶液中悬浮1g~10g的苄氧羰基精氨酸(Z-Arg-OH),于室温加入5ml~50ml含有三溴化磷的四氢呋喃溶液(V三溴化磷∶V四氢呋喃=1∶4),室温搅拌3~5小时,将反应液下层沉淀下来的比重比较大的油状物反复用200~400ml的四氢呋喃洗涤,真空干躁得淡黄色的焦油状物,即氮羧基内酸酐精氨酸(NCA-Arg);
(6)在带有温度计、pH电极、外冷却装置和搅拌装置的容器中,将甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽溶于pH 8~12的0.1~0.3mol/L的硼酸-硼酸钾缓冲体系中,体系中甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽的含量是0.5~0.8mol/l。用KOH调pH值为8~12,加入0.01~0.03毫升辛醇,在激烈搅拌下一次加入氮羧基内酸酐精氨酸(NCA-Arg),氮羧基内酸酐精氨酸与甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽的摩尔比为1~1.5∶1,并不断加入1~2mol/l的KOH溶液保持pH为8~12,3~5分种内碱消耗结束后加入浓硫酸(浓度98%)调pH到3以下终止反应。反应液冻干,用少量水溶解,用乙醇沉淀此液,抽滤得沉淀,用SephadexG-10柱层析分离产物,得到本专利所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA四肽产品。
我们的方法首先对天冬氨酸的氨基进行氯乙酰化,在合成中有三个作用:1.是对氨基进行了保护;2.是对天冬氨酸的羧基有活化作用;3.是氯乙酰基在氨解后可直接转化为我们所需的与天冬氨酸氨基成肽键的甘氨酸残基,省去了一步接氨基酸的步骤。
前述方法中所述的N端游离的氨基酸为丝氨酸、胱氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。
附图说明
图1:本专利制备的精-甘-天-丝氨酸四肽的质谱图。
由图可见434.0880处的峰为精-甘-天-丝氨酸四肽(Mw=433)的质谱峰,证明产物是精-甘-天-丝氨酸四肽。
具体实施方式
实施例1:氯乙酰化天冬氨酸的合成
取25克L-天冬氨酸悬浮于40毫升、质量浓度27%氢氧化钠水溶液中使其完全溶解,用该浓度氢氧化钠水溶液调pH=10,然后加入30毫升乙酸乙酯;在0℃的条件下,以0.16ml/min的速度分别滴加15毫升12.54mol/l氯乙酰氯和15毫升27%氢氧化钠到上述溶液中,边滴加边搅拌,滴加过程中控制氢氧化钠水溶液滴加速度保持溶液的pH在9.0,滴加完毕,继续搅拌30分钟;结束反应时用浓盐酸(浓度为37%)调PH至2.5,然后将此反应液用200ml乙酸乙酯抽提三次,合并提取液,加2克无水硫酸钠干燥,减压除去乙酸乙酯,即得到氯乙酰化天冬氨酸白色粉末约30克。
实施例2:氯乙酰化天冬氨酸内酸酐的合成
将10克氯乙酰化天冬氨酸加入10毫升乙酸酐(10.5mol/l),在40℃空气浴加热下防潮搅拌3小时,再加入3毫升上述乙酸酐搅拌3小时,冷却至室温固化,加入50ml乙醚和10ml石油醚研碎,过滤,再经200ml乙醚-石油醚(V乙醚∶V石油醚=4∶1)洗涤后干燥得氯乙酰化天冬氨酸内酸酐约7克。
实施例3:氯乙酰化天冬氨酸丝氨酸的合成
将1g氯乙酰化天冬氨酸内酸酐溶于20ml乙腈中,将0.8克丝氨酸溶于5毫升0.2mol/L碳酸钾水溶液中,用0.2mol/L碳酸钾水溶液调pH值,使pH值为9,在0℃的条件下,缓缓滴入氯乙酰化天冬氨酸内酸酐乙腈溶液(滴速0.16ml/min),保持pH为9,滴完后继续搅拌30分钟。结束反应时用浓盐酸(浓度为37%)调pH至3,将此反应液用30ml乙酸乙酯抽提三次,将水层除盐后冻干,得到氯乙酰化天冬氨酸丝氨酸约0.9克。
实施例4:甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸三肽的合成
在低温条件下(2℃),将前面所得的氯乙酰化天冬氨酸丝氨酸1克按照1.0g∶6ml的比例加入浓氨水(浓度为28%),此溶液搅拌24小时,然后减压除去多余氨水,旋转蒸发得到微黄粘稠状物质,加入15ml乙醇振摇并倒掉(除去醇溶物质),再加入20ml乙醇搅拌至成粉末,旋转蒸发即得约甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸三肽白色粉末约0.9克。
实施例5:氮羧基内酸酐精氨酸(NCA-Arg)的合成
于20ml四氢呋喃溶液中悬浮1g的苄氧羰基精氨酸(Z-Arg-OH),于室温加入5ml含有三溴化磷的四氢呋喃溶液(V三溴化磷/V四氢呋喃=1∶4),室温搅拌3小时后,将反应液上层的四氢呋喃倾注下去,下层为沉淀下来的比重较大的油状物,将此油状物反复用200ml的四氢呋喃洗涤,真空干躁得淡黄色的焦油状物约0.5克,即氮羧基内酸酐精氨酸。
实施例6:精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸四肽的合成
将1克甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸三肽溶于8ml的pH 9的0.2mol/L硼酸-硼酸钾缓冲体系中。在带有温度计、pH电极、外冷却装置和搅拌装置的容器中,用1mol/L的KOH溶液调pH=9,加入0.01毫升辛醇,加入0.8克氮羧基内酸酐精氨酸(NCA-Arg),并不断加入1mol/L的KOH溶液保持pH为9,3分种内碱消耗结束。加入浓硫酸(浓度98%)调pH到3终止反应。反应液冻干,用5ml水溶解,用10ml乙醇沉淀此液,抽滤得沉淀,用SephadexG-10柱层析分离产物,得到本专利所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸四肽产品约0.2克。
Claims (9)
1.精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法,其包括如下步骤:
(1)通过氯乙酰氯与天冬氨酸的反应得到氯乙酰化天冬氨酸;
(2)氯乙酰化天冬氨酸与乙酸酐反应得到氯乙酰化天冬氨酸内酸酐;
(3)氯乙酰化天冬氨酸内酸酐与N端游离的氨基酸或其衍生物反应得到氯乙酰化天冬氨酸-AA,AA代表N端游离的氨基酸或其衍生物;
(4)氯乙酰化天冬氨酸-AA氨解得到甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽;
(5)苄氧羰基精氨酸与三溴化磷反应得到氮羧基内酸酐精氨酸;
(6)氮羧基内酸酐精氨酸与甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽反应得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA四肽。
2.如权利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法,其特征在于:取25~35克L-天冬氨酸悬浮于40~60毫升、质量浓度为17%~27%的氢氧化钠水溶液中使其完全溶解,调pH值8~12之间,然后加入30~60毫升乙酸乙酯;在0℃~10℃的条件下,以0.12~0.20ml/min的速度分别滴加15~30毫升、10~13mol/L氯乙酰氯和15~40毫升17%~27%氢氧化钠到上述溶液中,边滴加边搅拌,滴加过程中保持溶液的pH在8~12范围内,滴加完毕,继续搅拌20~50分钟;结束反应时用浓盐酸调pH至3以下,然后将此反应液用乙酸乙酯抽提三次,合并提取液,加无水硫酸钠干燥,减压除去乙酸乙酯,即得到氯乙酰化天冬氨酸白色粉末。
3.如权利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法,其特征在于:将10~20克氯乙酰化天冬氨酸加入10~20毫升、10~11mol/L乙酸酐,在35℃~42℃空气浴加热下防潮搅拌3~4小时,再加入3~5毫升乙酸酐搅拌3~4小时,冷却至室温固化,加入40~60ml乙醚和10~20ml石油醚研碎,过滤,经200~500ml、体积比为4∶1的乙醚-石油醚洗涤后干燥,得氯乙酰化天冬氨酸内酸酐。
4.如权利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法,其特征在于:将氯乙酰化天冬氨酸内酸酐溶于乙腈中,浓度为1g∶10~20ml;将N端游离的氨基酸或其衍生物溶于0.1~0.5mol/L碳酸钾水溶液中,浓度为1g∶1~10ml,用碳酸钾水溶液调pH值为8~12之间,氯乙酰化天冬氨酸内酸酐与N端游离的氨基酸或其衍生物的摩尔比为1∶1,在0~10℃的条件下,在0.1~0.2ml/min速度下缓缓滴入氯乙酰化天冬氨酸内酸酐乙腈溶液,保持pH为8~12之间,滴完后继续搅拌30~60分钟;结束反应时用浓盐酸调PH至3以下,将此反应液用乙酸乙酯抽提三次,将水层除盐后冻干,得到氯乙酰化天冬氨酸-AA。
5.如权利要求4所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法,其特征在于:N端游离的氨基酸为丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、胱氨酸或苯丙氨酸。
6.如权利要求5所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法,其特征在于:N端游离的氨基酸为丝氨酸。
7.如权利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法,其特征在于:在0℃~10℃下,将前面所得的氯乙酰化天冬氨酸-AA按照1g∶5~10ml的比例加入浓度为25%~28%的浓氨水,搅拌24~48小时,然后减压除去多余氨气,旋转蒸发得到微黄粘稠状物质,加入乙醇振摇并倒掉,再加入乙醇搅拌至成粉末,旋转蒸发即得甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽白色粉末。
8.如权利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法,其特征在于:于20ml~200ml四氢呋喃溶液中悬浮1g~10g的苄氧羰基精氨酸,于室温加入5ml~50ml含有三溴化磷的四氢呋喃溶液,V三溴化磷∶V四氢呋喃=1∶4,室温搅拌3~5小时,将反应液下层沉淀下来的比重比较大的油状物反复用200~400ml的四氢呋喃洗涤,真空干躁得淡黄色的焦油状物,即氮羧基内酸酐精氨酸。
9.如权利要求1所述的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-N端游离的氨基酸或其衍生物细胞粘附四肽的制备方法,其特征在于:在带有温度计、pH电极、外冷却装置和搅拌装置的容器中,将甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽溶于pH 8~12的0.1~0.3mol/L的硼酸-硼酸钾缓冲体系中,体系中甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽的含量是0.5~0.8mol/L,用KOH调pH值为8~12,加入0.01~0.03毫升辛醇,在激烈搅拌下一次加入氮羧基内酸酐精氨酸,氮羧基内酸酐精氨酸与甘氨酸-天冬氨酸-AA三肽的摩尔比为1~1.5∶1,并不断加入1~2mol/L的KOH溶液保持pH为8~12,3~5分种内碱消耗结束后加入浓硫酸调pH到3以下终止反应;反应液冻干,用少量水溶解,用乙醇沉淀此液,抽滤得沉淀,用SephadexG-10柱层析分离产物,得到精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-AA四肽产品。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080416 |