CN101160402B - 肿瘤特异性抗体和细胞表面蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了癌症特异性抗体的重链和轻链互补决定区的氨基酸和核酸序列。并且，本发明还提供了癌症特异性的抗体和免疫偶联物，其含有癌症特异性抗体，附于毒素或标记物之上，以及它们的方法及应用。本发明还涉及使用本发明的癌症特异性抗体的诊断方法和试剂盒。另外，本发明还提供了新的与癌症相关的抗原和其应用。

Description

肿瘤特异性抗体和细胞表面蛋白质
技术领域
本发明涉及人肿瘤特异性结合蛋白及其所有应用。特别的，本发明涉及对癌细胞上的抗原或分子为特异的抗体或抗体片段、及含有本发明的结合蛋白的免疫偶联物，以及它们的使用方法。本发明还涉及新的与癌症相关的抗原和其应用。 
背景技术
在2000年，全世界有约2200万人患癌症，620万人死于这类疾病。每年有超过1000万新增病例，且预计在未来15年内增加50％(WHO，世界癌症报道(World Cancer Report))。Bernard W.Stewart和PaulKleihues编，IARC Press，Lyon，2003)。目前的癌症治疗局限于侵入性手术、放射疗法和化学疗法，所有的这些方法或是导致潜在的严重副作用，非特异性毒效和/或由创伤带来的体形和/或生活质量的改变。癌症可发展成为对化学疗法产生不反应性，从而降低了其他治疗手段的选择余地和成功机会。对于一些癌症的预后比其他的更坏，且某些癌症其结果几乎都是致命的。此外，那些有着相对较高治疗成功率的癌症，同样也有着非常高的发生率，因此还是主要的杀手。 
导致现有癌症疗法的不足的原因之一是它们缺少对受影响的组织和细胞的选择性。手术切除总是包含移除看似正常的被认为是“安全界限”的组织，而这样会增加发病率和并发症的危险。另外，手术切除还包含移除一些散置于癌细胞中、有可能维持或恢复受影响的器官或组织的健康组织。放射线和化疗由于其非特异性的作用模式，会损害到许多正常的细胞。这将会导致严重的副作用，例如严重的恶心、体重减轻和体力 降低、脱发等，并且还会增加其在以后患其他癌症的危险。对于癌细胞有更高选择性的治疗将不会伤及正常细胞，从而将提高作用/副作用比例和生活质量。 
对癌症治疗的选择性可通过使用对仅存在于或主要上存在于癌细胞中的分子有特异性的抗体来提高。这样的抗体可被用于调节免疫系统以及增强患者自身免疫系统对癌症的识别和毁灭。它们还可以妨碍或改变靶分子的功能，从而妨碍或改变癌细胞的功能。它们还能用于靶向药物、基因、毒素或其他与癌细胞医学相关的分子。这种抗体—药物复合物通常被称作为免疫毒素或免疫偶联物，且近年来许多这样的化合物都被进行了测试。[Kreitman RJ(1999)Immunotoxins in cancer therapy.CurrOpin Immunol11：570-578；Kreitman RJ(2000)Immunotoxins.ExpertOpin Pharmacother1：1117-1129；Wahl RL(1994)Experimentalradioimmunotherapy.A brief overview.Cancer73：989-992；Grossbard ML，Fidias P(1995)Prospects for immunotoxin therapy of non-Hodgkin′slymphoma.Clin Immunol Immunopathol76：107-114；Jurcic JG，Caron PC，Scheinberg DA(1995)Monoclonal antibody therapy of leukemia andlymphoma.Adv Pharmacol33：287-314；Lewis JP，DeNardo GL，DeNardoSJ(1995)Radioimmunotherapy of lymphoma：a UC Davis experience.Hybridoma14：115-120；Uckun FM，Reaman GH(1995)Immunotoxins fortreatment of leukemia and lymphoma.Leuk Lymphoma18：195-201；Kreitman RJ，Wilson WH，Bergeron K，Raggio M，Stetler-Stevenson M，FitzGerald DJ，Pastan I(2001)Efficacy of the anti-CD22recombinantimmunotoxin BL22in chemotherapy-resistant hairy-cell leukemia.N Engl JMed345：241-247].迄今已测试过的对抗已知肿瘤标记物的抗体大多为小鼠的单克隆抗体，有时通过分子工程进行“人类化”。不幸的是，它们的靶也通常存在于正常细胞的亚群中，因此引起一些非特异性的影响。此外，这些抗体基本上是小鼠蛋白，它们被人类患者的免疫体统识别为外 来蛋白。接下来的免疫反应和抗体响应可导致效率的丧失或副作用的产生。 
本发明的发明人在开发治疗癌症的抗体过程中使用了各种不同的方法。与对带有癌细胞或分离的癌细胞标记物的试验动物进行免疫处理不同的是，本发明的发明人仅仅寻求那些可被患者自身免疫系统识别的标记物，换句话说，那些被免疫系统识别为外来分子的标记物。这就意味着标记物或抗体通常是基本上不存在于正常细胞中的，因此进一步降低了非特异性毒性的危险。杂交瘤文库产生自癌症患者衍生的淋巴细胞，及由它们分泌的抗体进行了结合到正常和癌细胞的测试。只有那些显示出对癌细胞有高选择性的抗体为了以后的评价和发展才被作为癌症治疗或诊断试剂的研究。本专利申请的主题即是这样的一种高选择性的抗体。除了具有选择性外，该抗体由于是完全的人蛋白，因此能与病人的免疫系统完全相容。本发明的抗体可以用作诊断或治疗用，或者作为改造其他靶抗原的结合分子的基础。本发明的抗体还可以用作识别靶抗原。然后，该抗原能被用在设计新的癌症治疗和诊断之中。 
抗体分子的基本结构包括4条蛋白链，其中2条重链，2条轻链。这些链通过二硫键相互连接。每条轻链均是由轻链可变区和轻链恒定区组成。每条重链均是由重链可变区和重链恒定区组成。轻链和重链的可变区可进一步细分为构架区和超变区，被称作互补决定区(CDR)。每条轻链和重链的可变区均是由3个CDRs和4个构架区组成。 
葡萄糖转运体8(GLUT8)是蛋白质GLUT家族中的一员，及已知其具有转运糖的活性。GLUT8由在人染色体9上发现的基因slc2a8编码。GLUT8的长度为477个氨基酸，是～50kDa的II型跨膜蛋白质。其具有12个跨膜区域。其在TM1和TM2之间具有一个短的细胞外环，以及在TM9和TM10之间具有一个长的细胞外环。尽管具有几个跨膜区域，由于N-端的二-亮氨酸部分的原因，GLUT8很可能位于细胞内(Ibberson et al.JBC275：4607-4612，2000；Moadel et al.，Cancer Res65：698-702，2005)。在 经胰岛素处理的小鼠细胞中已观察到了向膜的迁移(Carayannopoulos etal.，PNAS97：7313-18，2000)或在经低氧休克或胰岛素处理的大鼠细胞中(US09/886,954[2002/0038464])。在人类中，还没有膜定位的报道，且没有确认任何诱导迁移的刺激物(Widmer et al.，Endocrinology146：4727-36，2005)。 
GLUT/SLC2A   家    族   的   命   名    法   已   公   开   在Amer.J.Physiol.Endocrinol.Metab.282：E974-76，2002中。如在该文中指出的，GLUT8在过去被用作描述现在所知的GLUT12。N-端的二-亮氨酸部分已被发现存在于所有的哺乳动物的GLUT8序列中(见Zhao et al.，Biochimica et Biophysica Acta1680：103-113，2004-显示在牛、人、大鼠和小鼠)。 
发明内容
本发明者们制备了人癌症特异性抗体，其结合到包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、肝癌、结肠癌、子宫颈癌、头和颈癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌和子宫内膜癌在内的几种癌症细胞。重要的是，该抗体不会显著地结合到正常的组织上，因此使得其适用于癌症的治疗和诊断中。 
本发明者们已克隆出抗体并对其进行了测序，还确定了抗体轻链和重链可变区和互补决定区1，2和3的序列。因此，本发明提供了分离的轻链互补决定区1，2和/或3，其分别包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQ ID NO：1)，AASSLHS(SEQ ID NO：2)和LQYSTYPIT(SEQ IDNO：3)；以及分离的重链互补决定区1，2和3，其分别包含氨基酸序列NYAMS(SEQ ID NO：4)，AITPSGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：5)和VPYRSTWYPLY(SEQ ID NO：6)。 
本发明还提供了分离的核酸序列，该核酸序列编码轻链互补决定区1，2和/或3，其分别包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQ ID NO：1)， AASSLHS(SEQ ID NO：2)和LQYSTYPIT(SEQ ID NO：3)；以及分离的核酸序列，该核酸序列编码重链互补决定区1，2和/或3，其分别包含氨基酸序列NYAMS(SEQ ID NO：4)，AITPSGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：5)和VPYRSTWYPLY(SEQ ID NO：6)。 
本发明的其它方面是关于分离的轻链可变区，其包含本发明的轻链互补决定区1，2和/或3(SEQ ID NOS：1-3)，以及分离的重链可变区，其包含本发明的重链互补决定区1，2和/或3(SEQ ID NOS：4-6)。在一实施方式中，轻链可变区包含示于图1中的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。在另一实施方式中，重链可变区包含示于图2中的氨基酸序列(SEQ IDNO：9)。 
本发明还提供了编码本发明的轻链可变区的一个分离的核酸序列，以及编码本发明的重链可变区的一个分离的核酸序列。在一实施方式中，轻链可变区包含示于图1中的核酸序列(SEQ ID NO：8)。在另一实施方式中，重链可变区包含示于图2中的核酸序列(SEQ ID NO：10)。 
本发明的另一方面是关于一种结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其包含至少一个本发明的轻链互补决定区(即一个或多个SEQ IDNOS：1-3)和/或至少一个本发明的重链互补决定区(即一个或多个SEQ IDNOS：4-6)。本发明还提供一种结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其包含本发明的轻链可变区和/或本发明的重链可变区。 
本发明者们还确认了与本发明的结合蛋白结合的抗原。因此，本发明提供的结合蛋白结合到：葡萄糖转运体8(GLUT8)或其变异体；包含氨基酸序列SEQ ID NOS：11-20，优选为SEQ ID NOS：11-13中任何一个的蛋白质；或在癌细胞表面表达的与癌症相关的GLUT8的变异体。在本发明的一个实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含由SEQ ID NOS：11，12或13中任何一个或其变异体定义的氨基酸序列。在本发明的另一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含在N-端的二-亮氨酸部分产生改性的GLUT8。在本发明的又一实施方式中，N-端的二-亮氨酸部 分被改性为二-丙胺酸。 
此外，本发明还提供含有本发明的结合蛋白，例如抗体或抗体片段，并具有药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂或稳定剂的组合物。 
本发明的又一方面是关于一种免疫偶联物，其包含：(1)本发明的结合蛋白，优选为结合到癌细胞上的抗原或分子上的抗体或抗体片段，其附于(2)效应物分子上。本发明的再一方面是一种免疫偶联物包含：(1)本发明的结合蛋白，优选为结合到被癌细胞内化的抗原或分子上的抗体或抗体片段，其附于(2)效应物分子上。在一优选的实施方式中，效应物分子是(i)一种标记物，其可直接或间接地生成可检测的信号，或者是(ii)一种癌症治疗试剂，其或者是毒害细胞的、抑制细胞生长的，或者是阻止或降低癌症细胞分裂和/或转移的能力。优选地，该癌症治疗试剂是毒素或细胞毒素。 
本发明还提供含有本发明的免疫偶联物的组合物，以及该免疫偶联物在生产治疗或预防及诊断癌症的药物中的应用。此外，本发明提供了使用本发明的免疫偶联物及相关的试剂盒于治疗或预防癌症的方法。 
本发明的另一方面是检测或监控受测试者中癌症的方法，该方法包含以下步骤： 
(1)将从所述受测试者中取出的测试样品与本发明的结合蛋白接触，所述结合蛋白特异性地结合到癌细胞上的抗原，形成结合蛋白—抗原复合物； 
(2)测量测试样品中结合蛋白—抗原复合物的含量；以及 
(3)将测试样品中的结合蛋白—抗原复合物的含量与对照物比较。 
本发明的另一方面是关于包含本发明的免疫偶联物的诊断试剂，其中的效应分子是一标记物，其可以直接或间接地生成可探测的信号。 
本发明还包括可特异性地结合到本发明的结合蛋白之一的分离的蛋白、其核酸序列及应用。
本发明者们还确认了与本发明的结合蛋白结合的抗原。本发明包括新的与癌症相关的抗原，其是在癌细胞表面表达的GLUT8的变异体。本发明还包括了新的与癌症相关的抗原在癌症的治疗和诊断的应用。 
在本发明的一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含由SEQ ID NOS：11，12或13中任何一个或其变异体定义的氨基酸序列。在本发明的另一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含在N-端的二-亮氨酸部分产生改性的GLUT8。在本发明的又一实施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性为二-丙胺酸。 
本发明还包括检测或监控患有或怀疑患有癌症的受测试者的癌症的方法，该方法包括检测样品中细胞上的与癌症相关的GLUT8的变异体，其中，如果在细胞上检测到与癌症相关的GLUT8的变异体，则表明有癌症存在。 
此外，本发明还包括检测或监控患有或怀疑患有癌症的受测试者的癌症的方法，该方法包含检测在样品的细胞中与癌症相关的GLUT8的变异体的表达，其中，如果在细胞中检测到与癌症相关的GLUT8的变异体的表达，则表明有癌症存在。 
本发明的另一方面是治疗或预防受测试者中的癌症的方法，该方法通过调整GLUT8在癌细胞中的功能或表达而达成。 
本发明还包括治疗或预防受测试者中的癌症的方法，该方法使用与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段。此外，本发明还包括含有有效量的与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段、编码与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段的核酸序列、和/或包含了编码与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段的核酸序列的重组体表达的载体的药物组合物。 
本发明的其他特征及益处将从以下的详细说明中更清楚地看出。然而，应当明白的是这些详细的说明和具体的例子虽然给出了本发明的优选的实施方式，但它们仅是为了示例的目的。本领域的技术人员能够在不脱离本发明精神下，从本发明详细的描述中得出各种基于本发明的变 化和改进。 
附图说明
本发明将由附图加以说明，其中： 
图1是轻链可变区VB1-050的核酸(SEQ ID NO：8)和氨基酸(SEQ IDNO：7)序列。 
图2是重链可变区VB1-050的核酸(SEQ ID NO：10)和氨基酸(SEQ IDNO：9)序列。 
图3显示了于不同温度下温培A-375细胞之后、由流式细胞仪确定的抗体结合到细胞的表面。在4℃下温培细胞悬浮液后的A-375细胞的荧光标记：4B5(1)和VB1-050(2)。将抗体结合的细胞加温到37℃后的A-375细胞的荧光标记：VB1-050(3)保持60分钟，(4)保持120分钟。 
图4显示了共聚焦显微镜对VB1-050内化的评估。A-375细胞与抗体一同在4℃下温培，洗净并加温到37℃保持60分钟。细胞被固定、透化和用已荧光标记的第二抗体标记。在VB1-050于4℃下温培60分钟后，对A-375细胞的荧光标记显示出标记物的圆周表面分布，(60X x4)的放大(A)。当抗体结合的细胞在37℃下温培60分钟后，细胞通过内化的抗体，显示出强的细胞内染色，(60X x4)的放大(B). 
图5显示了PCR反应的琼脂糖胶。在UV灯下用溴化乙锭检测到DNA。A)通过EcoRI和PvuII消化PelB-VH845-CH-F-de-bouganin/psV73质粒和PelB(-S)-VH050-CH-F-de-bouganin/pSV73，并分别加载到泳道1和泳道3上。*号表示EcoRI-PelB-PvuII插入了连接到预消化的PelB(-S)-VH050-CH-F-de-bouganin/pSV73(用箭头表示的)的肽前导序列，从而产生了PelB-VH050-CH-F-de-bouganin/pSV73。B)通过EcoRV和XhoI消化PelB-(S)-VL050-CL/pSV73和SpeI-de-bouganin-PelB-VL845-CL/pSV73质粒，并分别加载到泳道2-3和泳道4-5上。用*号和箭头分别标识插入片段和载体，用于产生SpeI-de-bouganin-PelB-VL845-CL/pSV73质粒，随后， 该质粒被插入到3302质粒中。C)SpeI-de-bouganin-PelB-VL845-CL/3302质粒，和D)PelB-VH050-CH-F-de-bouganin插入片段，通过EcoRI和SpeI消化(分别用箭头和*号标识)，并加载到泳道2上，该插入片段经连接产生VB6-050/3302。 
图6示出了VB6-050的西方墨点。在非还原的条件下，将典型的VB6-845(泳道1)和VB6-050(泳道2)的上清液加载到SDS—PAGE凝胶上，并用抗-人K轻链-HRP抗体(1/1000)进行免疫印迹。泳道3和4分别对应于未经诱导培养物的上清液和梯状条带(ladder)。泳道5是VB6-845上清液，之前在西方墨点法测试中为阳性。 
图7示出了由E104上清液得到的典型的经纯化的VB6-050的西方墨点。A)用抗人K轻链-HRP抗体对16μL取自纯化过程中不同阶段的样品进行免疫印迹。箭头表示完整的产物。泳道1：培养物上清液；泳道2：浓缩上清液的渗透物；泳道3：以1/10稀释的浓缩上清液；泳道4：经渗透过滤浓缩的上清液的渗透物；泳道5：经渗透过滤的上清液稀释1/10；泳道6：CM-琼脂糖柱的流经物；泳道7：CM-琼脂糖柱的洗涤物；泳道8：CM-琼脂糖柱或Ni-琼脂糖起始材料的洗脱物；泳道9：Ni-螯合柱的流经物；泳道10，11和12：Ni-螯合柱中不同步骤的洗涤物；泳道13：Ni-螯合-琼脂糖或SEC-200起始材料的洗脱物；泳道14：SEC-200流分物26-28的汇总；泳道15：梯和VB6-845作为对照物。B)VB6-050的考马斯(Coomassie)染色。泳道1：SEC-200起始材料；泳道2：流分物27；泳道3：纯化的VB6-845；泳道4：梯。 
图8示出了VB6-050的滴定曲线。用不同浓度的VB6-050培育SKBR-3，A-375和SK-OV-3细胞，并由流式细胞仪获得荧光强度的中位数。中荧光强度(median fluorescence，MF)增加倍数使用下面公式计算，MF增加倍数＝在各浓度测得的MF/用PBS测得的MF。 
图9示出了VB6-050的体外细胞毒性。用抗原阳性细胞MB-435S(空心圆圈)和抗原阴性细胞Daudi(实心圆圈)进行VB6-050的MTS测定。 每个孔植有1000细胞，与Fab-de-bouganin纯化的蛋白质温培。经培育5天后，进行细胞生存力的测定和IC50的确定。 
图10示出了HepG2，MCF-7，Panc-1和C-33A在PF-2D系统上的分级谱图。在两个阳性和两个阴性细胞系之间的抗原表达的不同的比较谱图。该图代表了从10到25分钟的层析谱图。分离的抗原的区别可清楚地在两个阳性细胞系中看到。MCF-7和HepG2在洗脱时间为15和18分钟处显示出两个峰，表明了中等水平的疏水性。Panc-1和C-33A未显示出相应的峰。在12分钟处的峰在各细胞系中均有观察到。 
图11示出了由HepG2细胞系获得的肽的TOF-MS扫描结果，以探测样品中所有的肽离子的存在。在1200-1400V下对静态纳米喷雾进行53次100-1200amu范围的扫描发现了大量回收的肽，对它们的分析获得了蛋白质ID为葡萄糖转运体8。 
图12示出了由Panc-1细胞系获得的肽的TOF-MS扫描结果，以探测样品中所有的肽离子的存在。在1200-1400V下对静态纳米喷雾进行30次100-1200amu范围的扫描发现了大量回收的肽，对它们的分析获得了蛋白质ID为1gG。 
图13示出了由MCF-7细胞系获得的肽的TOF-MS扫描结果，以探测样品中所有的肽离子的存在。在1200-1400V下对静态纳米喷雾进行27次100-1200amu范围的扫描发现了大量回收的肽，对它们的分析获得了蛋白质ID为葡萄糖转运体8。 
图14示出了由C-33A细胞系获得的肽的TOF-MS扫描结果，以探测样品中所有的肽离子的存在。在1200-1400V下对静态纳米喷雾进行30次100-1200amu范围的扫描发现了大量回收的肽，对它们的分析获得了蛋白质ID为lgG。 
图15示出了由质谱分析回收的肽的序列覆盖(sequence coverage)，其列于表8中。从溶液内经胰蛋白酶消化的溶液中总共回收了8个肽，获得了34％的蛋白质覆盖。划下底线的序列表示回收的肽序列，用粗体 表示的序列表示变异的氨基酸序列。 
图16示出了从VB1-050Ag回收的肽的肽质量指纹分析结果。蛋白质分数大于64的被认为是显著的。唯一观察到的显著的蛋白质IDs指向一个抗原，即葡萄糖转运体8。 
图17示出了鉴定的抗原，即葡萄糖转运体8，具有显著的分数83。由于数据库本身服务器的特点，以及相似性/同源性相关连的蛋白质，该蛋白质的所有的异构体就象被击中而萎靡。由MS/MS裂解和肽的同一性确认了该抗原是葡萄糖转运体8。 
图18示出了中性肽Mr.1401.54的MS/MS离子裂解谱，显示为三价的分子(466.60000，3+)。肽序列与葡萄糖转运体8的肽序列完全符合。 
图19示出了中性肽Mr.1070.785的MS/MS离子裂解谱，显示为二价的分子(536.40000，2+)。肽序列与葡萄糖转运体8的肽序列完全符合。 
图20示出了中性肽Mr.1997.9992的MS/MS离子裂解谱，显示为三价的分子(667.098230，3+)。与葡萄糖转运体8的同源肽序列相比，显示的肽序列改变了位于7，10，12，13，14，15和18处的氨基酸。 
图21示出了中性肽Mr.1176.3547的MS/MS离子裂解谱，显示为二价的分子(589.100000，2+)。与葡萄糖转运体8的同源肽序列相比，显示的肽序列改变了位于7，10，12，13，14和15处的氨基酸。 
具体实施方式
(A)定义
在此使用的术语“全身性施用”意味着例如通过注射(皮下、静脉、肌肉等)、口服、吸入、经皮肤给予或局部施用(例如局部药膏或油膏等)、栓剂施用或植入手段等方便的方法进行全身性施用免疫偶联物和/或其他癌症治疗剂。植入物可以是多孔的、非多孔的或凝胶状的物质，包括膜，例如硅橡胶膜或纤维。栓剂通常含重量比例为0.5％到10％的活性成分。 
术语“氨基酸”包括所有的天然氨基酸和改性的氨基酸。
在此使用的术语“抗体”意在包括单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合抗体。抗体可由重组源得到和/或由转基因动物产生。在此使用的术语“抗体片段”意在包括Fab，Fab′，F(ab′)2，scFv，dsFv，ds-scFv，其二聚体、微型抗体、双抗体和多聚抗体，以及双特异性抗体片段。可使用常规技术将抗体变为片段。例如，F(ab′)2片段可经由胃蛋白酶处理抗体而产生。产生的F(ab′)2片段可经处理而还原二硫键，从而产生Fab′片段。木瓜蛋白酶的消化可导致Fab片段的形成。Fab、Fab′和F(ab′)2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段，以及其他片段也可通过重组技术合成。 
在此使用的术语“本发明的抗体或抗体片段”包括至少一本发明的轻链互补决定区(即一个或多个SEQ ID NOS：1-3)和/或至少一本发明的重链互补决定区(即一个或多个SEQ ID NOS：4-6)。优选地，抗体或抗体片段包含轻链CDR序列(SEQ ID NOS：1-3)和/或重链CDR序列(SEQ IDNOS：4-6)或这些序列的功能性变异体(functional variants of thesequences)，这样，这些抗体或抗体片段就能够结合到癌细胞上而不会具体地结合到正常细胞上。本发明的抗体或抗体片段还包括结合到葡萄糖转运体8(GLUT8)或其变异体，或包含氨基酸序列SEQ ID NOS：11-20，优选为SEQ ID NOS：11-13中任何一个的蛋白质上的抗体或抗体片段。 
“至少为适度的严格杂交条件”是指为促进在溶液中两个互补核酸分子间进行选择性杂交所选择的条件。杂交可发生在全部或部分核酸序列分子上。杂交的部分的长度通常至少为15个(例如，20，25，30，40或50)核苷酸。本领域技术人员应当知道核酸双链(duplex)或杂种的稳定性取决于Tm，而在含钠的缓冲液中，Tm是钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃-16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)600/1)，或类似的方程)。因此，决定杂种稳定性的洗涤条件的参数为钠离子浓度和温度。为了鉴定某一分子与一已知的核酸分子是相似的，而不是相同的，可假设1％的错配将会导致Tm降低约1℃。例如，如果认为核酸分子有大于95％的同 一性，则最终的洗涤温度将降低约5℃。基于这些考虑，本领域的技术人员将能够轻松地选择合适的杂交条件。在优选的实施方式中，选择的是严格的杂交条件。例如，以下条件可应用于获得严格杂交：基于上述方程，在5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x Denhardt’s溶液/1.0％SDS中于Tm-5℃的条件下进行杂交，然后在60℃下用0.2x SSC/0.1％SDS洗涤。适度的严格杂交条件包括在42℃下于3x SSC中洗涤的步骤。然而，应当理解的是，相当的严格度可通过使用替代缓冲液、盐和温度来达成。另外，还可在如下著作中找到关于杂交条件的其他指导：CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.，2002，以及Sambrook et al.，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001。 
在此使用的术语“结合蛋白”指特异性地结合到其他物质上的蛋白。在一实施方式中，结合蛋白为抗体或抗体片段。 
在此使用的术语“本发明的结合蛋白”包括本发明的抗体或抗体片段。 
“适合体内施用的生物相容性形式”是指一种被施用的物质的形式，其疗效超过任何毒效。 
在此使用的术语“癌症”包括可被本发明的结合蛋白，优选为本发明的抗体或抗体片段结合的任何癌症。 
在此使用的术语“与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体”是指表达于癌细胞表面的葡萄糖转运体8的新的变异体。在本发明的一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体具有与GLUT8相同的作为糖的转运体的功能，但位于细胞中的不同位置。例如，与癌症相关的GLUT8的变异体具有与GLUT8相同的作为糖的转运体的功能，但定位于细胞的表面。在另一实施方式中，与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体是含有由SEQ ID NO：11定义的氨基酸序列的蛋白质。在又一实施方式中，与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体是含有由SEQ ID NO：12定义的氨基 酸序列的蛋白质。在再一实施方式中，与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体是含有由SEQ ID NO：13定义的氨基酸序列的蛋白质。在本发明的另一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含了在N-端的二-亮氨酸部分发生改性的GLUT8。在本发明的又一实施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性为二-丙氨酸。 
在此使用的“保守氨基酸取代”是指在该氨基酸中，一氨基酸残基被另一氨基酸残基所取代，而不丧失该蛋白质所期望的功能。 
在该方法中可使用对照。在此使用的术语“对照”是指受测试者或一组受测试者中的样品，已知他们或者患有癌症，或者不患有癌症。 
所用的术语“可控制的释放系统”指本发明的免疫偶联物和/或其他癌症治疗剂可以可控制的方式施用。例如，用微型泵可直接将可控制的剂量送至肿瘤区域，从而能够精确地调节药物组合物递送的时机和浓度(例如参见Goodson，1984，in Medical Applications of Controlled Release，vol.2，pp.115-138)。 
术语“肽的衍生物”是指具有一个或多个通过功能性侧基反应而发生化学衍生的残基的肽。这样的衍生的分子包括那些自由氨基被衍生形成胺盐酸盐、对甲苯磺酸基、苄氧羰基、叔丁基氧基羰基、氯乙酰基或甲酰基形式的分子。自由的羧基可衍生形成盐、甲酯、乙酯或其它形式的酯或酰肼。自由的羟基可衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可衍生形成N-im-苄基组氨酸。其它的衍生物包括那些含有20个标准氨基酸中一个或多个天然氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可代替脯氨酸；5-羟基赖氨酸可代替赖氨酸；3-甲基组氨酸可代替组氨酸；高丝氨酸可代替丝氨酸；以及鸟氨酸可代替赖氨酸。 
术语“检测或监控癌症”是指确定受测试者是否患有癌症以及癌症程度的方法或过程。并且，本发明的结合蛋白可被用于检测或监控疾病的出现和发展。 
在此使用的术语“直接施用”是指免疫偶联物和/或其他癌症治疗剂可 在肿瘤内、血管内和肿瘤周围施用，而无限制。例如，免疫偶联物可通过一次或多次直接注射到肿瘤中、通过连续或间断地灌注入肿瘤中、通过引入免疫偶联物蓄库、通过在肿瘤中引入一缓慢释放装置、通过在肿瘤中引入一缓慢释放的配方，和/或通过直接应用在肿瘤上来进行施用。“在肿瘤中”施用的方式包括将免疫偶联物和/或其他癌症治疗剂引入肿瘤区域，或引入基本上直接流入肿瘤区域的血管或淋巴管中。 
在此用的术语“有效量”是指在一定剂量下和一段时间内有效达到预期结果的量。免疫偶联物的有效量可根据一些因素如动物的疾病状态、年龄、性别、体重而变化。可对治疗剂量进行调整，以提供最佳治疗反应。例如，可将剂量分为若干次每日施用，或可以根据治疗情况的紧迫度而适当地降低剂量。 
“葡萄糖转运体8”(GLUT8)是由在人染色体9上发现的基因slc2a8编码的蛋白质。其是GLUT蛋白质家族中III级中的一员，已知具有转运糖的能力。GLUT8的长度为477个氨基酸，是约50kDa的II型跨膜蛋白质。其具有12个跨膜区域。在TM1和TM2之间具有一个短的假定的细胞外环，以及在TM9和TM10之间具有一个长的细胞外环。该术语包括了GLUT8的变异体。(GLUT/SLC2A家族命名法：Amer.J.Physiol.Endocrinol.Metab.282：E974-76，2002.) 
在此用的术语“重链互补决定区”指在抗体分子的重链可变区域内的超变区。重链可变区有3个互补决定区，从氨基端到羧基端，分别是重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3。 
在此用的术语“重链可变区”指重链的可变区。 
在此用的术语“本发明的免疫偶联物”包含(1)结合蛋白，优选为本发明的抗体或抗体片段，其附于(2)效应物分子上。效应物分子可以是某人希望递送到癌症细胞的任何分子，其包括但不限于(i)一种标记物，其可直接或间接地生成可检测的信号，或者是(ii)一种癌症治疗试剂，例如是毒害细胞的、抑制细胞生长的，或是阻止或降低癌症细胞分裂和/或转 移的能力的毒素。 
在此使用的术语“分离的核酸序列”是指在用重组DNA技术产生时基本上没有细胞物质或培养介质的核酸，或在用化学合成时基本上没有化学前体或其他化学物质的核酸。另外，分离的核酸基本上也没有那些天然侧接于核酸(即位于核酸5′和3′端的序列)的序列，而由此衍生出该核酸。术语“核酸”意在包括DNA和RNA，可以是双链的或单链的。 
在此使用的术语“分离的蛋白质”是指在用重组DNA技术产生时基本上没有细胞物质或培养介质的蛋白质，或在用化学合成时基本上没有化学前体或其他化学物质的蛋白质。其包括本发明的轻链互补区1，2和3、本发明的重链互补区1，2和3、本发明的轻链可变区、本发明的重链可变区和本发明的结合蛋白和结合到本发明的结合蛋白上的抗体。 
在此用的术语“轻链互补决定区”指在抗体分子的轻链可变区域内的超变区。轻链可变区有3个互补决定区，从氨基端到羧基端，分别是轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3。 
在此用的术语“轻链可变区”指轻链的可变区。 
GLUT8中的术语“在N-端的二-亮氨酸部分的改性”是指在N-端的二-亮氨酸部分发生的改变，其影响了GLUT8的定位，使得GLUT8在细胞表面，优选为癌细胞表面表达。在本发明的一实施方式中，N-端基二-亮氨酸部分变为了二-丙氨酸。 
在此用的术语“改性的bouganin”指具有在PCT/CA2005/000410和美国专利申请号11.084,080中描述的具有减少的倾向性以激活免疫反应的改性的bouganin。在一个例子中，改性的bouganin具有氨基酸序列(SEQ ID NO：29)： 
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNF KVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK. 
在此用的术语“核酸序列”是指含天然碱基、糖和糖间(骨架)键连的核苷或核苷酸单体的序列。该术语也包括含有非天然的单体或其部分的改性的或取代过的序列。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸(DNA)的序列或核糖核酸(RNA)的序列，并可包括天然的碱基，其包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列也可含改性的碱基。这些改性的碱基的例子包括氮和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。 
在此用的术语“样品”是指任何由受测试者中获得的任何液体、细胞或组织样品，其可用于进行癌症测定。 
在此用的术语“序列同一性”指两个多肽序列中的序列相同的百分比例。为确定两个多肽序列中的序列相同的百分比例，需将该两个序列的氨基酸序列进行排序，优选用Clustal W运算法则(Thompson，JD，HigginsDG，Gibson TJ，1994，Nucleic Acids Res.22(22)：4673-4680)，及BLOSUM62记分矩阵(Henikoff S.and Henikoff J.G.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915—10919)，以及空位开放罚分为10，空位延伸罚分(gapextension penalty)为0.1，这样就获得了两序列中最高等级的匹配，而在该两序列中之一的至少50％的总长度包括在序列对比之中。另一可用于序列对比的方法是Needleman和Wunsch序列对比法(J.Mol.Biol.，1970，48：443)，其由Smith和Waterman加以修改(Adv.Appl.Math.，1981，2：482)，从而就获得了两序列中最高等级的匹配，并确定了两序列中相同的氨基酸的数目。其他计算两氨基酸序列之间的同一性百分比的方法通常有如在Carillo和Lipton(SIAM J.Applied Math.，1988，48：1073)中描述的方法，以及在Computational Molecular Biology，Lesk，e.d.Oxford UniversityPress，New York，1988，Biocomputing：Informatics and Genomics Projects中描述的方法。通常，计算机程序会被用于这些计算。可用于此的计算机 程序包括但不限于GCG(Devereux et al.，Nucleic Acids Res.，1984，12：387)BLASTP，BLASTN和FASTA(Altschul et al.，J.Molec.Biol.，1990：215：403)。 
术语“N-端的二-亮氨酸部分”是指在GLUT8中的N-端的二-亮氨酸部分，其涉及蛋白质定位到细胞的细胞内区域。在本发明的一实施方式中，二-亮氨酸部分位于GLUT8的12-13处。 
在此用的术语“受测试者”是指动物界中的任何成员，优选为哺乳动物，更优选为人。在一优选的实施方式中，受测试者疑似或确实患有癌症。 
在此用的术语“治疗癌症”指抑制癌细胞的复制，抑制癌细胞的扩散(转移)，抑制肿瘤的生长，减少癌细胞的数量或肿瘤生长，降低癌症的恶性程度(例如，增加的癌细胞分化)，或改善与癌症相关的症状。 
在此用的术语“变异体”包括本发明的氨基酸和核苷酸序列的改性或化学等同物，其与本发明的氨基酸和核酸序列以基本上相同的方式实现基本上相同的功能。例如，本发明的蛋白的变异体包括但不限于：保守氨基酸取代。本发明的蛋白的变异体还包括本发明的蛋白的添加和缺失。此外，变异的肽和变异的核苷酸序列包括它们的类似物和衍生物。 
(B)本发明的蛋白和核酸
(i)轻链和重链互补决定区以及轻链和重链可变区 
本发明提供分离的轻链互补决定区1，其包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQ ID NO：1)。本发明还提供分离的轻链互补决定区2，其包含氨基酸序列AASSLHS(SEQ ID NO：2)。此外，本发明还提供分离的轻链互补决定区3，其包含氨基酸序列LQYSTYPIT(SEQ ID NO：3)。 
本发明提供分离的重链互补决定区1，其包含氨基酸序列NYAMS(SEQ ID NO：4)。本发明还提供分离的重链互补决定区2，其包含氨基酸序列AITPSGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：5)。此外，本发明还提供分离 的重链互补决定区3，其包含氨基酸序列VPYRSTWYPLY(SEQ IDNO：6)。 
本发明提供分离的轻链互补决定区1，2和3，其分别包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQ ID NO：1)，AASSLHS(SEQ ID NO：2)和LQYSTYPIT(SEQ ID NO：3)；以及分离的重链互补决定区1，2和3，其分别包含氨基酸序列NYAMS(SEQ ID NO：4)，AITPSGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：5)和VPYRSTWYPLY(SEQ ID NO：6)。 
本发明还包括CDR序列的变异体，其能结合到由上述CDR序列识别的相同的抗原决定位或抗原上。 
本发明的其他方面还涉及分离的轻链可变区，其包含本发明的轻链互补决定区1，2和/或3(SEQ ID NOS：1-3)；以及重链可变区，其包含本发明的重链互补决定区1，2和/或3(SEQ ID NOS：4-6)。在一实施方式中，轻链可变区包含示于图1中的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)，而重链可变区包含示于图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。 
本发明还包括分离的轻链可变区和重链可变区的变异体，它们可结合到由上述分离的轻链可变区和分离的重链可变区序列识别的相同的抗原决定位或抗原上。 
本领域的技术人员应当理解，本发明包括氨基酸序列SEQ IDNOS：1-6，7和9的变异体，包括本发明公开的序列的化学等同物。这样的等同物包括与在此揭露的特异性蛋白以基本相同的方式实现基本相同的功能的蛋白。CDR序列的功能变异体将能够结合到由天然CDR序列识别的抗体或抗原决定位。例如，等同物包括但不限于保守氨基酸取代。 
在一个实施方式中，轻链互补决定区1，2和3及重链互补决定区1，2和3的变异的氨基酸序列分别至少有50％，优选为至少60％，更优选为至少70％，最优选为至少80％，及进一步更优选为至少90％的序列与SEQID NOS：1-6相同。 
在另一实施方式中，轻链可变区及重链可变区的变异的氨基酸序列 至少有50％，优选为至少60％，更优选为至少70％，最优选为至少80％，及进一步更优选为至少90％的序列分别与SEQ ID NOS：7和9相同。 
本发明还提供编码本发明的轻链可变区的分离的核酸序列，以及编码本发明的重链可变区的分离的核酸序列。在一实施方式中，轻链可变区包含示于图1中的核酸序列(SEQ ID NO：8)。在另一实施方式中，重链可变区包含示于图2中的核酸序列(SEQ ID NO：10)。本发明还包括编码本发明的轻链可变区和重链可变区的核酸序列的变异体。例如，变异体包括至少在适度的严格杂交条件下，杂交到编码本发明的轻链可变区和重链可变区的核酸序列上的核苷酸序列。 
本发明还提供编码轻链互补决定区1，2和/或3的分离的核酸序列，其分别包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQ ID NO：1)，AASSLHS(SEQID NO：2)和LQYSTYPIT(SEQ ID NO：3)；以及编码重链互补决定区1，2和/或3的分离的核酸序列，其分别包括氨基酸序列NYAMS(SEQ IDNO：4)，AITPSGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：5)和VPYRSTWYPLY(SEQ ID NO：6)。本发明还提供编码示于图1中的轻链可变区(SEQ IDNO：7)的分离的核酸序列，以及编码示于图2中的重链可变区(SEQ IDNO：9)的分离的核酸序列。 
本发明还包括编码以上讨论的CDR序列的变异体和变异区域的分离的核酸序列。 
变异的核酸序列包括至少在适度的严格杂交条件下，杂交到编码示于SEQ ID NOS：1-6，7和9中的氨基酸序列以及其变异体上的核酸序列。 
(ii)结合蛋白 
本发明的另一方面是结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其包含至少一个本发明的轻链互补决定区(即一个或多个SEQ ID NOS：1-3)和/或至少一个本发明的重链互补决定区(即一个或多个SEQ ID NOS：4-6)。这样的结合蛋白可通常被称作“本发明的结合蛋白”，或优选地被称之为“本发明的抗体或抗体片段”。
在一实施方式中，该结合蛋白，优选地为抗体或抗体片段，包含轻链互补决定区1，2和3，其分别包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQ IDNO：1)，AASSLHS(SEQ ID NO：2)和LQYSTYPIT(SQ ID NO：3)；以及分离的重链互补决定区1，2和3，其分别包含氨基酸序列NYAMS(SEQ IDNO：4)，AITPSGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO：5)和VPYRSTWYPLY(SEQID NO：6)。本发明还提供结合蛋白，优选地为抗体或抗体片段，其包含本发明的示于图1中的轻链可变区(SEQ ID NO：7)和/或示于图2中的重链可变区(SEQ ID NO：9)。 
本领域的技术人员应当理解，本发明包括上述公开的特异性结合蛋白的变异体，其包括上述公开的序列的化学等同物。这样的等同物与上述公开的结合蛋白以基本上相同的方式实现基本上相同的功能。如上述公开的结合蛋白，结合蛋白的功能性变异体将能结合到相同的抗原上。在一实施方式中，结合蛋白结合到葡萄糖转运体8或其变异体、一个包含氨基酸序列SEQ ID NOS：11-20，优选为SEQ ID NOS：11-13中任何一个的蛋白质、或在癌细胞表面表达的与癌症相关的GLUT8的变异体上。 
本发明者们发现了在癌细胞表面表达的GLUT8的新的变异体。因此，本发明包括了对与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体产生特异性的结合蛋白。在一实施方式中，与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体包含由SEQ ID NOS：11-13定义的氨基酸序列中的任何一个，或其变异体。在本发明的另一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含在N-端的二-亮氨酸部分发生改性的GLUT8。在又一实施方式中，N-端的二-亮氨酸部分已被改性为二-丙氨酸。 
在一些实施方式中，抗体或抗体片段包含所有或部分重链恒定区，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgE，IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区。再有，抗体或抗体片段可包含所有或部分κ(kappa)轻链恒定区或λ(lambda)轻链恒定区。优选的是，轻链恒定区是λ轻链恒定区。
为产生人的单克隆抗体，产生抗体的细胞(淋巴细胞)可从癌症患者中获得，且通过标准的体细胞融合程序与骨髓瘤细胞融合，从而无限增殖化这些细胞以产生杂交瘤细胞(hybridoma cells)。这些技术已为本领域所熟知(例如，首先由Kohler和Milstein提出的杂交瘤技术(Nature 256：495-497(1975))，以及其他的技术，例如人B-细胞杂交瘤技术(Kozboret al.，Immunol.Today4：72(1983))，EBV-杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(Cole et al.，Methods Enzymol，121：140-67(1986))，和筛选组合抗体文库(Huse et al.，Science246：1275(1989))。杂交瘤细胞可经免疫化学筛选以产生与癌细胞的特异性反应的抗体，而且该单克隆抗体可以被分离。 
对特殊的抗原或分子，如癌细胞上的抗原或分子有反应性的特异性抗体，或抗体片段也可通过筛选编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库，并表达于具有细胞表面成分的细菌来产生。例如，完整的Fab片段，VH区域和FV区域可使用抗菌素表达文库来表达在细菌中(例如，参见Ward等，Nature341：544-546(1989)；Huse等，Science246：1275-1281(1989)；和McCafferty等，Nature348：552-554(1990))。 
本发明包括所有的与本发明的抗体或抗体片段结合到相同抗原的抗体和抗体片段。本领域的技术人员应当理解结合测试可用于发现具有与本发明的抗体或抗体片段相同的结合特异性的其他抗体和抗体片段。如以下所示例的，竞争结合测定可用于发现这样的其他抗体。 
在使用流式细胞仪进行竞争测定前，先确定本发明的抗体的最低浓度(Ab1)，在该浓度下，抗体对固定数量的癌细胞(例如，用于VB1-050的A-375细胞)产生最大的结合。从呈指数增长的培养物中收集总计为106个细胞，并与各种浓度的抗体于4℃下温培1小时。细胞经洗涤并与适当的探测抗体于4℃下再温培1小时。洗涤后，细胞用流式细胞仪进行分析。对每一测试抗体，以中荧光强度对抗体浓度作图，由数据得到饱和曲线。 
对于竞争测定，癌细胞按上述进行制备，并用固定浓度的抗体(Ab1) 以双份进行处理。该固定浓度是抗体对按上述确定的固定数量的癌细胞产生最大的结合的最低浓度。在加入Ab1后立即向每个试管中加入不同浓度的潜在抑制抗体(Ab2)，并将混合物在4℃下温培1小时。抑制百分比以及随最大的中荧光强度的变化均通过从各测试样品(Ab1+Ab2)的中荧光强度读数中扣除背景荧光强度(PBS-5％ FCS)而计算得到。然后，得到的结果除以Ab1的中荧光强度(最大结合)与背景强度(如下)的差。再乘以100后得到抑制百分比的结果。用重复点的平均值及它们相对的标准误差对抗体浓度作图。以下公式用于计算抑制百分比： 
PI＝[(MF(Ab1+Ab2)-MFBgd)/(MFAb1-MFBgd)]x100 
其中，PI＝抑制百分比；MF(Ab1+Ab2)＝由Ab1+Ab2混合物测得的中荧光强度；MFBgd＝以PBS-5％ FCS得到的背景中荧光强度。 
从而，本发明提供能结合到癌细胞上抗原的结合蛋白，其中，该结合蛋白可通过如下方法鉴定，该方法包括： 
(1)用最小浓度的本发明的结合蛋白与固定数量的癌细胞一起温培，优选是以产生对固定数量的癌细胞的最大结合的抗体或抗体片段(Ab1)，并测量(Ab1)的中荧光强度(MFAb1)； 
(2)通过向Ab1和癌细胞中加入Ab2，对测试的结合蛋白(Ab2)的两个或更多浓度进行测试，并测量中荧光强度(MF(Ab1+Ab2))； 
(3)测量背景中荧光强度(MFBgd)； 
(4)计算PI，其中， 
PI＝[(MF(Ab1+Ab2)-MFBgd)/(MFAb1-MFBgd)]x100；以及 
(5)将PI与对照物的PI值进行比较； 
其中，与对照物的PI有在统计上显著不同的PI表明该测试的结合蛋白能够结合到癌细胞的抗原上。 
本领域的技术人员应当知道，通过增加其对抗原、葡萄糖转运体8 或其变异体的亲和力，亲和力成熟技术(affinity maturation techniques)可用于改性本发明的结合蛋白或免疫偶联物。 
通常使用两种策略来增加抗体的结合亲和力。一种方法应用到Ab-Ag复合物的晶体结构的分辨率来鉴定抗原结合中涉及的关键残基(Davies D.R.，Cohen G.H.1996.Interactions of protein antigens withantibodies.Proc Natl.Acad.Sci.U.S A.93，7-12)。接着，这些残基可发生突变而增加交互作用。另一方法是模仿体内的抗原刺激，其驱动由B细胞产生的免疫球蛋白的亲和力成熟。在免疫反应的成熟过程中，免疫球蛋白的可变区发生体细胞突变(Mc Heyzer-Williams M.2003.B-cellsignaling mechanism and activation.Fundamental Immunology，Fifth edition，195-225)。该对免疫系统有高度特异性的过程，其特征在于在非常高的速率下引入点突变。它仅仅发生在编码可变区的DNA片段中，且不包括保守区域。然后，表达发生了体细胞突变的变异的抗体的B细胞被进行抗原介导的选择，从而选择有更高亲和力的免疫球蛋白。为在体外重复该现象，采用了多种方法以通过任意的或靶向的过程来引入突变。任意的突变可使用倾向差错PCR、链改组或突变大肠杆菌(E.coli)菌株来引入(Clackson T.Hoogenboom N.R.，Griffiths A.D.and Winter G.1991Makingantibody fragments using phage display libraries.Nature 352，624-628，Hawkins R.E.，Russell S.J.and Winter G.1992.Selection of phage antibodiesby binding affinity.Mimicking affinity maturation.J.Mol.Biol.226，889-896，Low N.，Holliger P.and Winter G.1996.Mimicking somatic hypermutation：affinity maturation of antibodies displayed on bacteriophage using a bacterialmutator strain.J Mol.Biol.260，359-368)。由该策略产生了巨大的文库，并通过如核糖体、噬菌体或酵母等的展示技术来选择反应性的克隆。(MinL(2000).Applications of display technology in protein analysis.Nat.Biotechnol.18，1251-1256)。 
CDRs的靶向突变，特别是轻链和重链的CDR3，已展示出其为增加 抗体亲和力的有效技术。CDR3的3—4个氨基酸段或被称为“热点”的特异性区域被靶向以形成突变。据Yang等报道，通过4个CDR残基的突变，抗-HIV gp120Fab片段增加了420倍的亲和力(Yang W.P，Green K.，Pinz-Sweeney S.，Briones A.T.，Burton D.R.and Barbas C.F.III.1995.CDRwalking mutagenesis for the affinity maturation of a potent human anti-HIV-1antibody into picomolar range.J.Mol.Biol.，254，392-403)。在C6.5scFv中的VL CDR3的一个突变与VH CDR3的三个突变组合得出1230倍的亲和力的增加。(Schier R.，McCall A.，Adams G.P.，Marshall K.W.，Merrit H.，YinM.，Crawford R.S.Weiner L.M.，Marks C.and Marks J.D.1996.Isolation ofpicomolar affinity anti-c-erbB-2single-chain Fv by molecular evolution ofthe complementary determining regions in the center of the antibody bindingsite.J.Mol.Biol.，263，55l-567)。 
“热点”是体内发生体细胞超突变的序列。(Neuberger M.S and MilsteinC.1995.Somatic hypermutation.Curr.Opin.Immunol.7，248-254)。热点序列可被定义为在某些密码子中的共有核苷酸序列。共有序列是四核苷酸，RGYW，其中，R可以是A或G，Y可以是C或T，W可以是A或T(Neuberger M.S and Milstein C.1995.Somatic hypermutation.Curr.Opin.Immunol.7，248-254)。此外，由核苷酸AGY编码的丝氨酸残基主要存在于可变区域的CDR区，优于位于那些由TCN编码的对应于潜在热点序列之上的丝氨酸。(Wagner S.D.，Milstein C.and Neuberger M.S.1995.Codon bias targets mutation.Nature，376，732)。结构分析表明，CDR环，特别是CDR3环，对抗原结合贡献最大(Giudicelli V.，Chaume D.andLefranc M.P2004.IMGT/V-QUEST，an integrated software program forimmunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis.Nucleis Acids Res.32，435-440)。因此，本发明每一抗体的重链和轻链的CDRs的核苷酸序列均被扫描以检查热点序列和AGY密码子的存在。使用国际免疫原Tics数据库(International ImMunoGen Tics database)，将轻 链和重链的CDR区中经鉴定的热点与重链和轻链的生殖序列进行比较(IMGT，http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)(Davies D.R.，Padlan E.A.andSheriff S.1990.Antibody-antigen complexes.Annu.Rev.Biochem.59，439-473)。若一序列与生殖系相同，则说明体细胞突变未发生；因此，任意突变被引入来模仿发生在体内的体细胞事件。与此相反的是，不同的序列则说明一些体细胞突变已经发生。然而该体内的体细胞突变是否为最佳，还有待于确定。编码CDR中埋藏的或保守的氨基酸的热点未被诱变。这些残基通常对整个结构都是至关重要的，且由于它们被埋藏而不太可能与抗原发生作用。此外，该序列可以与生殖系序列中预测的主要是发生体细胞突变之处相比较(Tomlinson I.M.，Cox J.P.L.，Gherardi E.，Lesk A.M.and Chotia C.1995.The structural repertoire of the humanVldomain.EMBO J.14，4628-4638，Tomlinson I.M.，Walter G.，Jones P.T.，Dear P.H.，Sonnhammer E.L.L.and Winter G.1996.The imprint of somatichypermutation on the repertoire of human germline V genes.J.Mol.Biol.256，813-817)。类似的策略应用于BL22scFv的亲和力成熟。对重链的CDR3引入的点突变导致5—10倍在多种CD22阳性细胞系的结合活性的增加(Salvatore G.，Beers R.，Margulies I.，Kreitman R.J.and Pastan I.2002.Improved cytotoxic activity toward cell lines and fresh leukemia cells of amutant anti-CD22immunotoxin obtained by antibody phage display.ClinicalCancer research，8，995-1002)。此外，在CDR1和CDR2环中的多种氨基酸的突变也产生了具有在3—7倍的范围内增加的亲和力的突变体(HoM.，Kreitman J.，Onda M.and Pastan I.2005.In vitro antibody evolutiontargeting germline hot spots to increase activity of an anti-CD22immunotoxin.J.Biol.Chem.，280，607-617)。 
在通过任意的或靶向的过程引入突变后，抗体得以表达并被评价其功能。例如，可基于结合进行功能性筛选。一旦功能得以评价，即可用已知的方法进行所选抗体的DNA排序。
在另一个实施方式中，锚固周质的表达(anchored periplasmicexpression)(APEx)方法被用于本发明的结合蛋白或免疫偶联物的亲和力成熟，该方法被描述于Harvey，B等中(PNAS2004June22；101(25)：9193-8)。 
从而，本发明包括本发明的结合蛋白，该结合蛋白经亲和力成熟化而增加结合蛋白对葡萄糖转运体8或其变异体的亲和力、一种包含SEQID NOS：11-20，优选SEQ ID NOS：11-13的氨基酸序列的蛋白质，或一种与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体。 
本发明还提供了包含本发明的结合蛋白的组合物，优选的是抗体和抗体片段，并附有药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂或稳定剂。 
(iii)新的与癌症相关的抗原 
如上所述，本发明者们已鉴定了与本发明的结合蛋白结合的抗原。该新的与癌症相关的抗原表达在癌细胞的表面，在正常细胞表面无显著表达。因此，本发明包括能够特异性地与本发明的结合蛋白之一结合的分离的蛋白质，及其氨基酸序列和其应用。 
在一实施方式中，本发明提供一种包含葡萄糖转运体8或其变异体的分离的蛋白质。在另一实施方式中，本发明提供一种包含氨基酸序列SEQ ID NOS：11-20中任何一个或其变异体的分离的蛋白质。在又一实施方式中，本发明提供一种包含氨基酸序列SEQ ID NOS：11或其变异体的分离的蛋白质。本发明还提供一种包含氨基酸序列SEQ ID NOS：12或其变异体的分离的蛋白质。进而，本发明还提供一种包含氨基酸序列SEQ IDNOS：13或其变异体的分离的蛋白质。此外，本发明提供一种表达在癌细胞的表面的与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体。在本发明的一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含由SEQ ID NOS：11，12或13中的任何一个或其变异体定义的氨基酸序列。在本发明的另一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含在N-端的二-亮氨酸部分发生改性的GLUT8。在本发明的进一步的实施方式中，N-端的二-亮氨酸部分 被改性为二-丙胺酸。 
本领域的技术人员应当理解，本发明包括氨基酸序列SEQ IDNOS：11-13的变异体，包括本发明公开的序列的化学等同物的变异体。这样的等同物包括一种与在此公开的特异性蛋白以基本上相同的方式实现基本上相同的功能的蛋白。例如，等同物包括但不限于保守氨基酸取代。 
在一个实施方式中，本发明的分离的蛋白质的变异的氨基酸序列至少有50％，优选为至少60％，更优选为至少70％，最优选为至少80％，进一步更优选为至少90％的序列分别与SEQ ID NOS：11-13相同。 
本发明包括分离的蛋白质的使用。例如，使用本发明的分离的蛋白质来生成结合蛋白和免疫偶联物，其可用于治疗或预防癌症，或可用于探测或监控受测试者中的癌症。因此，本发明包括本发明的分离的蛋白质在生产治疗或预防癌症的药物中的应用。 
(C)免疫偶联物
本发明也包括一种免疫偶联物，其包括：(1)本发明的的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其附于(2)效应物分子上。在一实施方式中，本发明的结合蛋白结合到癌细胞上的抗原或分子上。 
抗原可以是葡萄糖转运体8或其变异体；一种包含氨基酸序列SEQID NOS：11-20，优选为SEQ ID NOS：11，12或13中任何一个的蛋白质；或与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体。在本发明的一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含由SEQ ID NOS：11，12或13中的任何一个或其变异体定义的氨基酸序列。在本发明的另一实施方式中，GLUT8的与癌症相关的变异体包含在N-端的二-亮氨酸部分产生改性的GLUT8。在本发明的又一实施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性为二-丙胺酸。 
在一个优选的实施方式中，效应物分子是(i)一种标记物，其可直接或间接地生成可检测的信号，或者是(ii)一种癌症治疗试剂，其或者是毒 害细胞的、抑制细胞生长的，或者是阻止或降低癌症细胞分裂的和/或转移的能力。该免疫偶联物在此通常被称为“本发明的免疫偶联物”。 
在本发明的一个实施方式中，效应物分子是一种癌症治疗试剂，该癌症治疗试剂优选为一种毒素，其或者是毒害细胞的、抑制细胞生长的，或者是阻止或降低癌症细胞分裂的和/或转移的能力。因此，本发明的一方面是一种免疫偶联物，包含(1)本发明的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其附于(2)一种癌症治疗试剂，例如细胞毒素上。 
在另一实施方式中，免疫偶联物被内化，且癌症治疗试剂是一种细胞毒素，其阻碍了细胞的蛋白质合成，从而导致细胞的死亡。重要的是，由于大多数正常细胞不会广泛表达位于癌细胞上的抗原，它们不能结合并内化免疫偶联物，从而保护其不会被毒素或其它癌症治疗试剂的杀伤效应。 
可在本发明的免疫偶联物中使用多种效应物分子，而若干这样的效应物分子是细胞内活化的分子。因此，在本发明的一个实施方式中，免疫偶联物被癌症细胞内化。 
在优选的实施方式中，效应物分子是一种癌症治疗试剂，更优选的是包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素，其包括但不限于：多花白树毒素(gelonin)、bouganin、皂草毒素(saporin)、篦麻毒素(ricin)、篦麻毒素A链、异株泻根毒素(bryodin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、局限曲菌素(restrictocin)、假单细胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)和它们的变异体。当蛋白是核糖体失活蛋白时，免疫偶联物必须在结合到癌细胞时被内化，从而使该蛋白对细胞产生细胞毒害性。因此，在本发明的一实施方式中，效应物分子是一种毒素，且免疫偶联物被癌症细胞内化。 
在本发明的一个实施方式中，毒素是bouganin或假单细胞菌外毒素A，以及它们的变异体。在另一个实施方式中，毒素是经改性的bouganin，或是失去细胞结合区域的假单细胞菌外毒素A的截去形式。 在又一的实施方式中，毒素是基本上失去T细胞的抗原决定位的bouganin，或是由氨基酸252-608组成的假单细胞菌外毒素A的截去形式。 
在其他的非限制性实施方式中，癌症治疗试剂包含一种破坏DNA的试剂。因此，癌症治疗试剂可以选自但不局限于烯二炔类(例如刺孢霉素和埃斯波霉素(esperamicin))以及非烯二炔类的小分子试剂(例如博来霉  素(bleomycin)、甲  锭  丙  基  乙  二  胺  四  乙  酸  铁(methidiumpropyl-EDTA-Fe(II)))。可用于本发明中的其他癌症治疗试剂包括但不限于：道诺霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、远端霉素A(distamycinA)、顺铂(cisplatin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、海鞘素(ecteinascidins)、倍癌霉素(duocarmycin)/CC-1065以及博来霉素/培洛霉素(pepleomycin)。 
在其他非限制性实施方式中，癌症治疗试剂包含一种破坏微管蛋白的试剂。这样的试剂可包括但不限于：力索新(rhizoxin)/美登素(maytansine)、紫杉醇(paclitaxel)、长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicine)、auristatin海兔毒素(dolastatin)10MMAE和peloruside A。 
在其他的非限制性实施例中，本发明的免疫偶联物的癌症治疗试剂的部分可包含烷基化试剂，其包括但不限于：Asaley NSC167780、AZQNSC182986、BCNU NSC409962、白消安(Busulfan)NSC750、羧基邻苯二甲酸铂(carboxyphthalatoplatinum)NSC271674、CBDCA NSC241240、CCNU NSC79037、CHIP NSC256927、苯丁酸氮芥(chlorambucil)NSC3088、氯脲霉素(chlorozotocin)NSC178248、顺式-铂(cis—platinum)NSC119875、克罗米松(clomesone)NSC338947、氰基吗啉代阿霉素(cyanomorpholinodoxorubicin)NSC357704、cyclodisone NSC348948、二去水卫矛醇(dianhydrogalactitol)NSC132313、fluorodopan NSC73754、hepsulfam NSC329680、羟胺硫蒽酮(hycanthone)NSC142982、 美法仑(melphalan)NSC8806、甲基CCNU NSC95441、丝裂霉素C NSC26980、米托唑酰胺(mitozolamide)NSC353451、氮芥(nitrogen mustard)NSC762、PCNU NSC95466、哌嗪NSC344007、二酮哌嗪(piperazinedione)NSC135758、哌泊溴烷(pipobroman)NSC25154、甲基丝裂霉素(porfiromycin)NSC56410、螺旋乙内酰脲芥(spirohydantoinmustard)NSC172112、特洛西酮(teroxirone)NSC296934、四氧环己铂(tetraplatin)NSC363812、硫替派(thio-tepa)NSC6396、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)NSC9706、尿嘧啶氮芥(uracil nitrogenmustard)NSC34462和Yoshi-864NSC102627。 
在其他非限制性实施方式中，本发明的免疫偶联物的癌症治疗试剂的部分可包含抗有丝分裂试剂，其包括但不限于：别秋水仙碱(allocolchicine)NSC406042、软海绵素(Halichondrin)B NSC609395、秋水仙碱(colchicine)NSC757、秋水仙碱衍生物NSC33410、海兔毒素10NSC376128(NG-auristatin衍生的)、美登素(maytansine)NSC153858、力索新(rhizoxin)NSC332598、紫杉醇(taxol)NSC125973、紫杉醇衍生物NSC608832、硫代秋水仙碱(thiocolchicine)NSC361792、三苯甲游基半胱氨酸(trityl cysteine)NSC83265、硫酸长春碱(vinblastinesulfate)NSC49842和硫酸长春新碱(vincristine sulfate)NSC67574。在其他非限制性实施方式中，本发明的免疫偶联物的癌症治疗试剂的部分可包含拓扑异构酶I抑制剂，其包括但不限于：喜树碱(camptothecin)NSC94600，喜树碱钠盐NSC100880、氨基喜树碱(aminocamptothecin)NSC603071、喜树碱衍生物NSC95382、喜树碱衍生物NSC107124、喜树碱衍生物NSC643833、喜树碱衍生物NSC629971、喜树碱衍生物NSC295500、喜树碱衍生物NSC249910、喜树碱衍生物NSC606985、喜树碱衍生物NSC374028、喜树碱衍生物NSC176323、喜树碱衍生物NSC295501、喜树碱衍生物NSC606172、喜树碱衍生物NSC606173、喜树碱衍生物NSC610458、喜树碱衍生物NSC 618939、喜树碱衍生物NSC610457、喜树碱衍生物NSC610459、喜树碱衍生物NSC606499、喜树碱衍生物NSC610456、喜树碱衍生物NSC364830、喜树碱衍生物NSC606497和吗啉代阿霉素(morpholinodoxorubicin)NSC354646。 
在其他非限制性实施方式中，本发明的免疫偶联物的癌症治疗试剂的部分可包含拓扑异构酶II抑制剂，其包括但不限于：阿霉素(doxorubicin)NSC123127、氨萘非特(amonafide)NSC308847、m-AMSANSC249992、蒽吡唑类(anthrapyrazole)衍生物NSC355644、吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)NSC366140、盐酸比生群(bisantrene HCL)NSC337766、正定霉素(daunorubicin)NSC82151、脱氧阿霉素(deoxydoxorubicin)NSC267469、米托蒽醌(mitoxantrone)NSC301739、美诺立尔(menogaril)NSC269148、N，N-联卞基正定霉素NSC268242、oxanthrazole NSC349174、柔红脖(rubidazone)NSC164011、VM-26NSC122819和VP-16NSC141540。 
在其他非限制性实施方式中，本发明的免疫偶联物的癌症治疗试剂的部分可包含RNA或DNA抗代谢物，其包括但不限于：L-阿拉诺新(alanosine)NSC153353、5-氮杂胞苷(azacytidine)NSC102816、5-氟尿嘧啶(fluorouracil)NSC19893、阿西维辛(acivicin)NSC163501、氨基喋呤(aminopterin)衍生物NSC132483、氨基喋呤衍生物NSC184692、氨基喋呤衍生物NSC134033、an antifol NSC633713、an antifolNSC623017、Baker′s soluble antifol NSC139105、二氯烯丙基甲花醌(dichlorallyl lawsone)NSC126771、布利喹啉(brequinar)NSC368390、呋喃氟脲嘧啶(ftorafur)(前体药物(pro-drug))NSC148958、5，6-二氢-5-氮杂胞嘧啶核苷NSC264880、甲氨蝶呤(methotrexate)NSC740、甲氨蝶呤衍生物NSC174121、N-(磷乙酰基)-L-天冬氨酸酯(PALA)NSC224131、吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)NSC143095、三甲曲沙(trimetrexate)NSC352122、3-HP NSC95678、2′-脱氧-5-氟尿嘧啶NSC27640、5-HP NSC 107392、α-TGDR NSC71851、甘氨阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)NSC303812、ara-C NSC63878、5-氮-2′-脱氧胞苷NSC127716、β-TGDRNSC71261、环胞苷NSC145668、胍唑(guanazole)NSC1895、羟基脲NSC32065、次黄嘌呤核苷甘油二醛(inosine(肌苷)glycodialdehyde)NSC118994、麦克菌素(macbecin)II NSC330500、吡唑啉咪唑(pyrazoloimidazole)NSC51143、硫鸟嘌呤NSC752和硫嘌呤(thiopurine)NSC755。 
在另一非限制性实施方式中，本发明的免疫偶联物的治疗部分可以是核酸。可用的核酸包括但不限于反义RNA、基因或其它多核苷酸、核酸类似物例如硫鸟嘌呤和硫嘌呤。 
本发明进一步提供了免疫偶联物，其包含：(i)本发明的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其附于(2)效应物分子上，该效应物分子为一标记，可直接或间接地生成可检测的信号。这些免疫偶联物可用于研究或诊断，例如用于癌症的体内探测。标记物优选为能够直接或间接地产生可检测的信号。例如，标记物可是不透射线的或是放射线同位素，例如， 3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；荧光的(荧光团)或化学发光的(发色团)化合物，例如荧光素异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate)、若丹明(rhodamine)或荧光素(luciferin)；酶，例如碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)、β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)或辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)；成像试剂；或金属离子。 
在另一实施方式中，免疫偶联物可被间接地检测到。例如，对免疫偶联物有特异性的第二抗体，且含有可用于检测免疫偶联物的可探测的标记物。 
本发明的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，可通过任何能将该结合蛋白与效应物分子关联或连接的方式而“附于”效应物分子之上。例如，结合蛋白可通过化学或重组的方式而附于效应物分子上。用于制备融合物或偶联物的化学方法已为本领域所知，其可用于制备免疫偶联物。用 于偶联结合蛋白和效应物分子的方法必须能够将结合蛋白连接到效应物分子上，而不会影响结合蛋白结合到癌细胞上抗原的能力。 
本发明的结合蛋白可间接地连接到效应物分子上。例如，结合蛋白可直接连接到含有若干种类型中的一种效应物分子的脂质体上。效应物分子和/或结合蛋白也可结合到固体表面上。 
在一实施方式中，结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，以及效应物分子均是蛋白质且可使用习知方法进行偶联。有几百种用于偶联两蛋白的偶联剂。(例如，见“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”.1991，Shans Wong，CRC Press，Ann Arbor)。通常，偶联剂的选择是基于在结合蛋白上或可被插入到结合蛋白的反应性官能团，该结合蛋白优选为抗体或抗体片段、和/或效应物分子。此外，如果有没有反应性基团，则可使用光活化的偶联剂。在某些情况下，需要在结合蛋白，优选为抗体或抗体片段和效应物分子之间加入一间隔区(spacer)。本领域已知的偶联剂包括同源双官能性试剂(homobifunctional agents)：戊二醛(glutaraldehyde)、乙二酸二甲酯(dimethyladipimidate)和双重氮对二胺基联苯(Bis(diazobenzidine))，以及异源官能性试剂(heterobifunctionalagents)：间双马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺(mMaleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimi de)和硫代间双马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-m Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide)。 
也可使用重组DNA技术来制备结合蛋白—效应物分子蛋白的融合物。在此，编码结合蛋白的DNA序列融合到编码效应物分子的DNA序列中，产生嵌合(chimeric)DNA分子。嵌合DNA序列被转染到宿主细胞中以表达融合蛋白。该融合蛋白可从细胞培养基中回复，并用已知技术进行纯化。 
将作为标记物的效应物分子附在结合蛋白上的例子包括描述于以下文献中的方法：Hunter等，Nature144：945(1962)；David等，Biochemistry13：1014(1974)；Pain，et al.，J.Immunol.Meth.40：219(1981)；Nygren，J. Histochem.and Cytochem.30：407(1982)；Wenseland Meares，Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy，Elsevier，N.Y.(1983)；和Colcher等.，″Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals ForThe Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice″，Meth.Enzymol.，121：802-16(1986)。 
(D)本发明的蛋白质的制备
本领域的技术人员应当能理解，本发明的蛋白，例如轻链和重链的互补决定区、轻链和重链的可变区、抗体和抗体片段、免疫偶联物以及与癌症相关的抗原，可通过许多方法中的任何一种来制备，但最为优选的是采用重组方法进行制备。 
因此，本发明的核酸分子可通过已知的方式引入到能确保良好地表达本发明的蛋白的合适的表达载体中。可用的表达载体包括但不限于：黏端质粒、质粒或改性的病毒(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒)，只有在载体与所使用的宿主细胞相容时。表达载体为“适合于宿主细胞的转化”，意为表达载体含有本发明的核酸分子以及基于被用于进行表达的宿主细胞而选择的调整序列，其有效地连接到核酸分子上。有效地连接意为核酸通过允许核酸进行表达的方式而连接到调整序列上。 
因此，本发明构思出了本发明的重组表达载体，其含有本发明的核酸分子、或其片段，以及用于转录和翻译插入的蛋白序列的必要的调节序列。 
适合的调节序列可衍生自多种来源，包括细菌的、真菌的、病毒的、哺乳动物的或昆虫的基因(例如，见描述于以下文献中的调节序列：Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990))。适合的调节序列的选择取决于如 下讨论的所选的宿主细胞，且这可以由本领域的技术人员容易地实现。这些调节序列的例子包括：转录启动区和增强子或RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列，包括一翻译起始信号。此外，基于所选的宿主细胞以及使用的载体，还可向表达载体中引入其他序列，例如复制起点、附加的DNA限制性位点、增强子以及可施加诱导转录的序列。 
本发明的重组表达载体还可含有选择性标记基因，从而便于选择经本发明的重组分子转化或转染的宿主细胞。选择性标记基因的例子是编码蛋白如G418和潮霉素(hygromycin)这类对某些药物产生抵制性的蛋白、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、萤火虫荧光素酶、或免疫球蛋白或其一部分，例如免疫球蛋白的Fc部分，优选为lgG的基因。通过选择性标记蛋白例如β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶或萤火虫荧光素酶浓度的改变来监控选择性标记基因的转录。如果选择性标记基因编码的蛋白产生对抗生素的抵抗性，例如对新霉素的抵抗性，则被转化的细胞可用G418进行选择。插入了选择性标记基因的细胞将存活，而其他的细胞则会死亡。这就使得对本发明的重组表达载体的表达的显现和测定，特别是使得确定表达和表现型的突变的效果成为可能。可以理解的是，选择性标记物可从感兴趣的核酸引入到另一个的载体上。 
重组的表达载体也可以含有编码融合部分的基因，该融合部分提供重组蛋白的增强的表达；重组蛋白的增强的溶解性；以及通过在亲和力纯化中作为配体而辅助靶的重组蛋白的纯化。例如，蛋白水解的切割位点可被加入到靶的重组蛋白中，以允许在纯化融合蛋白后，重组蛋白从融合部分分离。典型的融合表达载体包括pGEX(Amrad Corp.，Melbourne，Australia)，pMal(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A到重组蛋白上。 
重组表达载体可被引入到宿主细胞中而产生转化的宿主细胞。术语“用转化”、“用，，，转染”、“转化”和“转染”意在包含用习知的许多可能的方 法之一，将核酸(例如载体)引入到细胞中。在此使用的术语“转化的宿主细胞”也意在包括能够进行糖基化的细胞，其已被本发明的重组表达载体进行了转化。原核细胞可用核酸通过如电穿孔或氯化钙介导的转化而被转化。例如，可用常规技术，如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE—右旋糖苷介导的转化、脂质转染剂、电穿孔或微型注射等将核酸引入到哺乳动物细胞中。合适的转化和转染宿主细胞的方法均可在Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)的著作以及其他实验教科书中找到。 
合适的宿主细胞包括大量不同的真核宿主细胞和原核细胞。例如，本发明的蛋白可在酵母细胞或哺乳动物细胞中得以表达。其他适用的宿主细胞可在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1991)中找到。此外，本发明的蛋白还可以在原核细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)(Zhang et al.，Science303(5656)：371-3(2004))中表达。再有，还可使用基于假单胞菌属(Pseudomonas)的表达系统，例如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)(US Patent Application Publication No.US2005/0186666，Schneider，Jane C et al.)。 
适合于实现本发明的酵母和真菌宿主细胞包括但不限于：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母(Kluyveromyces)属，以及各种曲霉菌属的菌种。用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体包括pYepSecl(Baldari.等，Embo J.6：229-234(1987))，pMFa(Kurjan and Herskowitz，Cell30：933-943(1982))，pJRY88(Schultz等，Gene54：113-123(1987))，和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。酵母和真菌转化的协议已为本领域的技术人员所熟知。(见Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：1929(1978)；Itoh等，J.Bacteriology153：163(1983)，和Cullen et al.(BiolTechnology5：369(1987))。
适合于进行本发明的哺乳动物细胞包括：COS(例如ATCC No.CRL1650或1651)、BHK(例如ATCC No.CRL6281)、CHO(ATCC No.CCL61)、HeLa(例如ATCC No.CCL2)、293(ATCC No.1573)和NS-1细胞。适合于直接在哺乳动物细胞中表达的表达载体通常包括启动子(例如，来自病毒性物质，如多瘤病毒、腺病毒2、细胞巨化病毒和猿病毒40)，以及其他的转录和翻译控制序列。哺乳动物的表达载体的例子包括pCDM8(Seed，B.，Nature329：840(1987))和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J.6：187-195(1987))。 
由在此所述的教导，也可以容易地实现启动子、终止区以及向植物、鸟、昆虫细胞中引入适当类型的表达载体的方法。例如，在一实施方式中，本发明的蛋白可以从植物细胞得以表达(见Sinkar等.，J.Biosci(Bangalore)11：47-58(1987)，该文综述了发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)载体的使用；另见Zambryski等，Genetic Engineering，Principles and Methods，Hollaender和Setlow(eds.)，Vol.VI，pp.253-278，Plenum Press，NewYork(1984)，该文描述了使用表达载体用于植物细胞，包括PAPS2022、PAPS2023和PAPS2034)。 
适合于进行本发明的昆虫细胞包括源自蚕(Bombyx)、夜蛾(Trichoplusia)或夜蛾(Spodotera)种的细胞和细胞系。可用于温培的昆虫细胞(SF9细胞)中蛋白表达的杆状病毒(Baculovirus)载体包括pAc系列(Smith等，Mol.Cell Biol.3：2156-2165(1983))和pVL系列(Lucklow，V.A.，和Summers，M.D.，Virology170：31-39(1989))。适合表达本发明的重组蛋白的一些杆状病毒—昆虫细胞表达系统描述在PCT/US/02442中。 
可选择的，本发明的蛋白也可表达在非人的转基因动物中，如在大鼠、兔、羊和猪中(Hammer等Nature315：680-683(1985)；Palmiter等Science222：809-814(1983)；Brinster等Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：4438-4442(1985)；Palmiter和Brinster Cell41：343-345(1985)以及U.S.Patent No.4,736,866)。
本发明的蛋白可通过化学合成法使用蛋白化学中习知的方法，例如固体相合成法制备(Merrifield，J.Am.Chem.Assoc.85：2149-2154(1964)；Frische等，J.Pept.Sci.2(4)：212-22(1996))或在均相溶液里合成(Houbenweyl，Methods of Organic Chemistry，ed.E.Wansch，Vol.15I and II，Thieme，Stuttgart(1987))。 
N-端的或C-端的融合蛋白包含与其他分子偶联的本发明的蛋白，例如，蛋白可通过重组技术经融合制备。所得的融合蛋白含有融合到在此描述的挑选的蛋白或标记物蛋白的本发明的蛋白。本发明的重组蛋白也可由已知技术偶联到其他蛋白上。例如，可使用WO90/10457中描述的异源双官能性含硫的偶联剂、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫-丙酸)或N-琥珀酰亚胺-5-硫代乙酸偶联蛋白。可用于制备融合蛋白或偶联物的蛋白的例子包括细胞结合蛋白，例如免疫球蛋白、荷尔蒙、生长因子、外源凝集素、胰岛素、低密脂蛋白、胰高血糖素、内啡肽、铁传递蛋白、铃蟾肽(bombesin)、脱唾液酸糖原蛋白谷胱甘肽-S-转移酶(asialoglycoprotein glutathione-S-transferase(GST))、红血球凝聚素(HA)和截断的myc。 
因此，本发明提供了重组表达载体，其包含编码本发明的蛋白的核酸序列，例如本发明的轻链和重链互补决定区，轻链和重链可变区，结合蛋白，例如抗体和抗体片段，以及本发明免疫偶联物和本发明的新的分离的蛋白质。再有，本发明提供含有本发明的重组表达载体的宿主细胞。 
(E)本发明的结合蛋白和免疫毒素的治疗方法和药物组合物
本发明者们已示出了本发明的结合蛋白结合到葡萄糖转运体8或其变异体；包含氨基酸序列SEQ ID NOS：11-20中任何一个定义的氨基酸序列，优选为11、12或13，或与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体；或 与癌症相关的GLUT8的变异体上。在本发明的一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含由SEQ ID NOS：11，12或13中的任何一个或其变异体定义的氨基酸序列。在本发明的另一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含在N-端的二-亮氨酸部分发生改性的GLUT8。在本发明的进一步的实施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性为二-丙胺酸。 
发明者们还示出了本发明的结合蛋白显示出对癌细胞的特异性，且它们被细胞所内化。因此本发明的结合蛋白可被用于靶向递送生物活性的或与医药相关的试剂，例如成像试剂、放射性试剂或细胞毒素。 
在一实施方式中，本发明提供一种治疗或预防癌症的方法，该方法包含向患有或疑似患癌症的病人施用有效量的本发明的免疫偶联物。在另一实施方式中，本发明提供有效量的本发明的免疫偶联物在制造治疗和预防癌症的药物中的应用。此外，本发明提供有效量的本发明的免疫偶联物的应用，进一步包含另外的癌症的治疗试剂在制造同时的、分开的或连续的治疗或预防癌症的药物中的应用。本发明还提供有效量的本发明的免疫偶联物在治疗或预防癌症中的应用。另外，本发明还提供有效量的本发明的免疫偶联物，进一步包含使用其它的癌症治疗制剂在制备同时、分开或连续治疗或预防癌症的药物中的应用。 
在本发明的一实施方式中，癌症包括但不限于：胃癌、结肠癌、前列腺癌、和子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、头和颈癌、鳞状细胞癌、胃肠癌、乳癌(例如恶性肿瘤、输送管的、小叶的和乳头的)、肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、脑癌、神经母细胞瘤、肉瘤、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、质浆细胞瘤、淋巴瘤和黑素瘤。在一优选的实施方式中，癌症包括但不限于：乳癌、前列腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫颈癌、肾癌、黑素瘤、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、和头和颈癌。
本发明的免疫偶联物的选择性抑制或破坏癌细胞的能力可通过使用癌细胞系在体外容易地进行测试。本发明的免疫偶联物的选择性抑制效果可通过如展示对癌细胞的细胞增殖的选择性抑制来确定。 
毒性也可基于细胞生存能力来测量，例如，癌症和正常细胞培养基在暴露于免疫偶联物时的生存能力可进行比较。细胞生存能力可借助已知的技术，如台盼蓝排除法(trypan blue exclusion assays)进行评价。 
在另一例子中，可使用许多模型来测试本发明的免疫偶联物的效力。Thompson，E.W.等(Breast Cancer Res.Treatment31：357-370(1994))描述了一种模型，其通过测量肿瘤细胞介导的细胞外基质的蛋白水解和肿瘤细胞对重构基底膜(胶原质、层粘蛋白、纤维连接蛋白、Matrigel或明胶)的入侵，来确定人的乳癌细胞在体外的入侵性。其他的适用的癌细胞模型包括培养的卵巢腺癌细胞(Young，T.N.等Gynecol.Oncol.62：89-99(1996)；Moore，D.H.等Gynecol.Oncol.65：78-82(1997))，人滤泡性甲状腺癌细胞(Demeure，M.J.et al.，World J.Surg.16：770-776(1992))，人黑素瘤(A-2058)和纤维肉瘤(HT-1080)细胞系(Mackay，A.R.等Lab.Invest.70：781783(1994))，以及肺鳞状(HS-24)和腺癌(SB-3)细胞系(Spiess，E.等J.Histochem.Cytochem.42：917-929(1994))。体内测试系统包括植入肿瘤，且描述了肿瘤在无胸腺的裸鼠中的生长和转移的测量(Thompson，E.W.等，Breast Cancer Res.Treatment31：357-370(1994)；Shi，Y.E.等，Cancer Res.53：1409-1415(1993))。 
本发明的免疫偶联物可配入药物组合物中，以适合体内施用的生物相容形式给予受试者。可向包括人和动物在内的有机生物施用药物。施用治疗活性量的本发明的药物组合物被定义为以一定剂量，在一定时间内有效地获得期望的结果的必要的剂量。例如，一种物质的治疗活性量可根据个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及本发明的重组蛋白在个体中产生期望反应的能力等因素而定。可对剂量的选取进行调整，以期望获得最佳治疗反应。例如，可每日施用若干次分开的剂量，或者可 以根据治疗情况的紧迫度而成比例地降低剂量。 
因此，本发明提供了用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含本发明的免疫偶联物，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一优选的实施方式中，在药物组合物中的效应物分子是癌症治疗试剂，更优选是毒素。 
包含本发明的免疫偶联物的药物制剂可全身地进行施用。药物制剂可直接施用到癌症部位。取决于施用的方式，可用一种材料将免疫偶联物进行涂层，以保护化合物不受到酶、酸和其他使化合物失活的天然环境的作用。 
根据本发明的一方面，免疫偶联物通过直接施用而给予患者。本发明构思出了施用至少为足以获得端点的一定量的药物组合物，如果需要，还包含药学上可接受的载体。 
本发明也提供了降低手术后并发症危险的方法，包含在手术治疗癌症之前、之中和之后施用有效量的本发明的免疫偶联物。 
在此所述的组合物可通过已知的制备药学上可接受的组合物的方法制备，该药学上可接受的组合物在施用时，有效量的活性物质与药学上可接受的载体结合形成混合物。适合的载体例如在以下文献中有描述：Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington′s Pharmaceutical Sciences，20th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA，2000)。基于此，组合物包括但不限于与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂相关的物质的溶液，且在具有适当的pH值的缓冲液中和具有生理液的等渗透压。 
药物组合物包括但不限于：冻干粉或水性的或非水的灭菌的可注射溶液或悬浮液，其可进一步含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使组合物基本上与受药者的组织和血液相容的溶质。其他可存在于该组合物中的成分如包括水、表面活性剂(例如Tween)、醇、多元醇、甘油和植物油。即时注射溶液和悬浮液可用灭菌粉末、颗粒、药片或浓缩的溶液或悬浮液来配制。免疫偶联物的非限制性的供给形式可以是如冻干粉，其可以 在向病人施用前，用蒸馏水或盐水复原。 
本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体。合适的药学上可接受的载体包括基本上是化学惰性的和非毒性的组合物，它们不会影响到药物组合物的生物活性的效力。合适的药学上可接受的载体的例子包括但不限于：水、盐水溶液、甘油溶液、乙醇、N-(1(2，3-二油基氧)丙基)N，N，N-氯化三甲铵(DOTMA)、二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)和脂质体。这样的组合物应当含有治疗有效量的化合物，以及适当量的载体，以提供直接形式供病人施用。 
组合物可以是药学上可接受的盐的形式，其包括但不限于那些用自由氨基形成的盐，而那些自由氨基源自如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等；以及那些用自由羧基形成的盐，而那些自由羧基源自如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2—乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。 
在本发明的各种实施方式中，药物组合物被直接全身地施用或直接递送至肿瘤区域。 
药物组合物可被用于治疗患有癌症的动物的方法中，包括哺乳动物，优选为人。施用的免疫偶联物的剂量和类型将取决于许多能够容易地在人类受治者中得以监控的因素。这样的因素包括癌症的病因学和严重程度(级别和阶段)。 
本领域的技术人员，例如内科医师，应当能够容易地察觉到使用本发明的免疫偶联物治疗癌症的结果。例如，标准的医学测试以测量癌症的临床标记物的方法可作为治疗效力的有力指示物。这样的测试可包括但不限于：身体检查、表现量表、疾病标记物、12-导联ECG、肿瘤测量、活体组织检查、细胞检查、细胞学研究、最长肿瘤直径计算、肿瘤的放射线照相术、肿瘤的数码成像、维生征象、体重、不良事件的记录、感染性事件的评价、伴随药物的评价、疼痛评价、血液或血清化学、尿样分析、CT扫描以及药物代谢动力学分析。此外，包含免疫偶联物和另一 癌症治疗剂的组合疗法的协同效应可通过与经历单一疗法的病人进行对比研究来确定。 
本发明的另一实施方式是关于治疗或预防癌症的试剂盒，其包含有效量的本发明的免疫偶联物，以及使用其治疗癌症的指导说明。 
在大多数核准的抗癌疗法中，抗癌疗法与其他抗癌疗法联合使用。因此，本发明提供了用于预防或治疗癌症的方法，该方法使用本发明的免疫偶联物以及至少一种另外的抗癌疗法。其他的癌症疗法可以在施用免疫偶联物之前、交叠、同时和/或之后施用。当同时施用时，免疫偶联物和其他的癌症治疗剂可在同一配方中或在不同的配方中，如果在不同的配方中，则可选用不同施用方式。一种或多种免疫偶联物和一种或多种其他癌症疗法的组合可以协同对抗癌症。其他的癌症疗法包括但不限于：放射性和其他的抗癌治疗剂。这些其他的癌症治疗剂可包括但不限于：2，2′，2″三氯三乙胺、6-氮尿苷(6-azauridine)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、aceglarone、aclacinomycins、放射菌素、六甲蜜胺(altretamine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、胺苯吖啶(amsacrine)、阿纳托唑(anastrozole)、安西他滨(ancitabine)、血管生成素反义寡核苷酸(angiogenin antisense oligonucleotide)、安曲霉素(anthramycin)、阿扎胞苷(azacitidine)、重氮乙酰丝氨酸(azaserine)、氮丙环(aziridine)、batimastar、bcl-2反义寡核苷酸、苯佐替派(benzodepa)、必卡他胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、博来霉素(bleomycin)、布舍瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、放线菌素C(cactinomycin)、卡普睾酮(calusterone)、卡铂(carboplatin)、卡巴醌(carboquone)、洋红霉素(carminomycin)、卡莫氟(carmofur)、卡莫司汀(carmustine)、卡柔比星(carubicin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯地孕酮(chlormadinoneacetate)、氯脲霉素(chlorozotocin)、色霉素(chromomycins)、顺铂 (cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、正定霉素(daunorubicin)、地磷酰胺(defosfamide)、秋水仙胺(demecolcine)、denopterin、地托比星(detorubicin)、地吖醌(diaziquone)、烯紫衫醇(docetaxel)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、多柔比星(doxorubicin)、屈洛昔芬(droloxifene)、屈他雄酮(dromostanolone)、依达曲沙(edatrexate)、eflomithine、依利醋铵(elliptinium acetate)、乙嘧替氟(emitefur)、enocitabune、表柔吡星(epirubicin)、环硫雄醇(epitiostanol)、依索比星(esorubicin)、雌莫司汀(estramustine)、依托格鲁(etoglucid)、依托泊苷(etoposide)、法倔唑(fadrozole)、芬维A胺(fenretinide)、2-去氧氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他胺(flutamide)、亚叶酸(folinic acid)、福美斯坦(formestane)、磷雌酚(fosfestrol)、福莫司汀(fotemustine)、硝酸镓(gallium nitrate)、吉西他汀(gemcitabine)、戈舍瑞林(goserelin)、己雌酚(hexestrol)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、英丙舒凡(improsulfan)、干扰素-α(interferon-alpha)、干扰素-β(interferon-beta)、干扰素-γ(interferon-gamma)、白细胞介素-2(interleukin-2)、左旋门冬酰胺酶(L-asparaginase)、香菇多糖(lentinan)、来曲唑(letrozole)、柳菩林(leuprolide)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼达明(lonidamine)、甘露醇氮芥(mannomustine)、麻西罗霉素(marcellomycin)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧化双氯乙基甲胺(mechlorethamine oxide hydrochloride)、安宫黄体素(medroxyprogesterone)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氯地孕酮(melengestrol)、、美法仑(melphalan)、美诺立尔(menogaril)、美雄烷(mepitiostane)、甲氨蝶呤(methotrexate)、美妥替哌(meturedepa)、米帕(miboplatin)、米替福新(miltefosine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、米托胍腙(mitoguazone)、二溴卫矛醇(mitolactol)、丝裂霉素 (mitomycins)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌达醇(mopidamol)、霉酚酸(mycophenolic acid)，尼鲁米特(nilutamide)、尼莫司汀(nimustine)、nitracine，诺拉霉素(nogalamycin)、novembichin、olivomycins、草酸铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、培洛霉素(peplomycin)、哌磷酰胺(perfosfamide)、蛋氨氮芥(phenamet)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、哌泊溴烷(pipobroman)、哌泊舒凡(piposulfan)、吡柔比星(pirarubicin)、吡曲克辛(piritrexim)、普卡霉素(plicamycin)、足叶草酸2-乙基-酰肼(podophyllinic acid2-ethyl-hydrazide)、聚磷酸雌二醇(polyestradiol phosphate)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、甲基丝裂霉素(porfiromycin)、泼尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼(procabazine)、丙帕锗(propagermanium)、PSK，蝶罗呤(pteropterin)、嘌呤霉素(puromycin)、quelamycin、雷莫司汀(ranimustine)、丙亚胺(razoxane)、鲁道柔比星(rodorubicin)、罗喹美克(roquinimex)、sizofican、、索布佐生(sobuzoxane)、螺锗(spirogermanium)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、它莫西芬(tamoxifen)、泰素帝(taxotere)、替加氟(tegafur)、替莫唑胺、(temozolomide)、替尼泊甙(teniposide)、细交链孢菌酮酸(tenuzonicacid)、testolacone、硫咪嘌呤(thiamiprine)，巯基鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、托穆戴克斯(Tomudex)、拓扑替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、三亚胺醌(triaziquone)、三亚乙基密胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramide)、曲洛司坦(trilostane)、三甲曲沙(trimetrexate)、曲普瑞林(triptorelin)、曲洛磷胺(trofosfamide)、trontecan、6-mercaptopurin结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、尿嘧啶芥子气(uracil mustard)、乌瑞替派(uredepa)、乌拉坦(urethan)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、吉妥单抗 (gemtuzumab)、thioepa、cyclothosphamide、抗代谢物(antimetabolites)(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine(鸟嘌呤))、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他汀(gemcitabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、temozoamide)、六甲密胺(hexamethylmelamine)、LYSODREN、核苷相似物(nucleoside analogues)、植物生物碱(plant alkaloids)(例如，泰素(Taxol)、紫杉醇(paclitaxel)、喜树碱(camptothecin)、拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)(CAMPTOSAR，CPT-11)、长春新碱(vincristine)、长春花生物碱(vinca alkyloids)例如长春碱(vinblastine)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、VP-16(依托泊苷(etoposide))、松胞菌素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidinD)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、蒽环类(anthracyclines)(例如，正定霉素)、阿霉素脂质体(doxorubicinliposomal)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米拉霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、阿地白介素(aldesleukin)、allutamine、biaomycin、卡培他滨(capecitabine)、carboplain、chlorabusin、cyclarabine、daclinomycin、、floxuridhe、lauprolide acetate、左旋咪唑(levamisole)、lomusline、mercaptopurino、美司钠(mesna)、mitolanc、pegaspergase、pentoslatin、picamycin、riuxlmab、坎帕斯-1(campath-1)、straplozocin、维A酸(tretinoin)、VEGF反义寡核苷酸、长春地辛(vindesine)和长春瑞宾(vinorelbine)。含有一种或多种癌症制剂的组合物(例如，FLAG，CHOP)也可用于本发明。FLAG包含氟达拉滨(fludarabine)、阿糖胞苷(cytosine(胞嘧啶)arabinoside)(Ara-C)和G-CSF。CHOP包含环磷酰胺(cyclophosphamide)、长春新碱(vincristine)、阿霉素(doxorubicin)和强的松(prednisone)。已知的所有癌症制剂可参见最新版的The Merck Index和Physician′s Desk Reference两书。 
用于联合疗法的药物组合物也可包括，但不限于：抗生素(例如，更 生霉素(dactinomycin)、平阳霉素(bleomycin)、米拉霉素(mithramycin)、氨茴霉素(anthramycin))、门冬酰胺酶(asparaginase)、杆状菌(Bacillus)和介兰(Guerin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、抗有丝分裂剂、相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒蛋白A(ricin A)、假单细胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织血浆酶原活化剂、抗组胺剂、抗作呕剂等。 
实际上，向需要这种治疗的病人施用有效量的免疫偶联物，可减少其他具有显著临床功效的癌症治疗剂的剂量。这种其他癌症治疗剂减少的剂量的功效在没有施用免疫偶联物时可能未观察到。因此，本发明提供了治疗肿瘤或癌症的方法，该方法包含施用减少剂量的一种或多种其他癌症治疗剂。 
再有，与标准治疗方法的周期长短或多少相比，向需要这种治疗的病人施用包含免疫偶联物的联合疗法可导致更短的治疗时间。因此，本发明提供了治疗肿瘤或癌症的方法，该方法包含施用减少剂量的一种或多种其他癌症治疗剂，以获得相对较短的持续时间和/或更少的治疗周期。 
因此，根据本发明，包含免疫偶联物和其他癌症治疗剂的联合疗法可降低整个癌症治疗的毒性(即副作用)。例如，与单一疗法或其他联合疗法相比，当施用减少剂量的免疫偶联物和/或其他癌症治疗剂时，和/或当减少周期的持续时间(即单一施药的时段或一系列的施药的时段)时，和/或当减少周期数目时，可观察到毒性的降低。 
因此，本发明提供药物组合物，其包含免疫偶联物和一种或多种其他癌症治疗剂，可选择地含在药学上可接受的载体中。 
本发明还提供包含有效量的免疫偶联物的试剂盒，可选择地与一种或多种其他癌症治疗剂联合，以及使用其治疗癌症的指导说明。 
如上所述，含免疫偶联物的联合疗法可能敏化癌症或肿瘤对其他癌症治疗剂的施用。因此，本发明构思出用于预防、治疗、和/或预防癌症 复发的联合疗法，该疗法包含在施用减少剂量的癌症治疗剂之前、之后或同时，施用有效量的免疫偶联物。例如，用免疫偶联物的最初的治疗可能增加癌症或肿瘤对随后的癌症治疗剂的剂量的敏感程度。该剂量接近或低于单独采用癌症治疗剂或无免疫偶联物时的标准剂量的下限。当同时施予时，免疫偶联物可与癌症治疗剂分开施用，可选择地通过不同的施用模式给予。 
在另外的实施方式中，其他的癌症治疗剂的施用可使癌症或肿瘤对免疫偶联剂或结合蛋白产生敏化。在该实施方式中，其他的癌症治疗剂可在施用免疫偶联剂或结合蛋白前给予。 
在一实施方式中，其他的癌症治疗剂包括顺铂(cisplatin)，例如PLATINOL或PLATINOL-AQ(Bristol Myers)，其剂量大约在5到10、11到20、21到40或41到75mg/m2/周期的范围。 
在另一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含卡铂(carboplatin)，例如PARAPLATIN(Bristol Myers)，其剂量大约在2到3、4到8、9到16、17到35或36到75mg/m2/周期的范围。 
在又一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含环磷酰胺(cyclophosphamide)，例如CYTOXAN(Bristol Myers Squibb)，其剂量大约在0.25到0.5、0.6到0.9、1到2、3到5、6到10、11到20或21到40mg/kg/周期的范围。 
在另一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含阿糖胞苷(cytarabine)，例如CYTOSAR-U(Pharmacia&Upjohn)，其剂量大约在0.5to1、2to4、5to10、11到25、26到50或51到100mg/m2/周期的范围。在另一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含阿糖胞苷脂质体例如DEPOCYT(Chiron 
Corp.)，其剂量大约在5到50mg/m2/周期的范围。 
在又一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含达卡巴嗪(dacarbazine)，例如DTIC或DTICDOME(Bayer Corp.)，其剂量大约在15到250mg/m2/周期的范围，或大约在0.2到2mg/kg/周期的范围。
在另一实施方式中，其他的癌症制剂包含拓扑替康(topotecan)，例如HYCAMTIN(SmithKline Beecham)，其剂量大约在0.1到0.2、0.3到0.4、0.5到0.8或0.9到1.5mg/m2/周期的范围。 
在又一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含依立替康(irinotecan)，例如CAMPTOSAR(Pharmacia & Upjohn)，其剂量大约在5到9、10到25或26到50mg/m2/周期的范围。 
在另一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含氟达拉滨(fludarabine)，例如FLUDARA(Berlex Laboratories)，其剂量大约在2.5到5、6到10、11到15或16到25mg/m2/周期的范围。 
在又一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含胞嘧啶阿糖胞苷(cytosinearabinoside)(Ara-C)，其剂量大约在200到2000mg/m2/周期、300到1000mg/m2/周期、400到800mg/m2/周期或500到700mg/m2/周期的范围。 
在另一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含多烯紫衫醇(docetaxel)，例如TAXOTERE(Rhone Poulenc Rorer)，其剂量大约在6到10、11到30或31到60mg/m2/周期的范围。 
在又一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含紫杉醇(paclitaxel)，例如泰素(TAXOL)(Bristol Myers Squibb)，其剂量大约在10到20、21到40、41到70或71到135mg/kg/周期的范围。 
在另一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，其剂量大约在0.5到5mg/kg/周期、1到4mg/kg/周期或2-3mg/kg/周期的范围。 
在又一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含多柔比星(doxorubicin)，例如ADRIAMYCIN(Pharmacia & Upjohn)、DOXIL(Alza)、RUBEX(Bristol Myers Squibb)，其剂量大约在2到4、5到8、9到15、16到30或31到60mg/kg/周期的范围。 
在另一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含依托泊苷(etoposide)，例如VEPESID(Pharmacia&Upjohn)，其剂量大约在3.5到7、8到15、16 到25或26到50mg/m2/周期的范围。 
在又一实施方式中，其他的癌症治疗剂包含长春碱(vinblastine)，例如VELBAN(EliLilly)，其剂量大约在0.3到0.5、0.6到0.9、1到2或3到3.6mg/m2/周期的范围。 
在另一实施方式中，其他的癌症治疗剂包括长春新碱(vincristine)，例如ONCOVIN(EliLilly)，其剂量大约在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mg/m2/周期的范围。 
在又一实施方式中，其他的癌症治疗剂包括甲氨蝶呤(methotrexate)，其剂量大约在0.2到0.9、1到5、6到10或11到20mg/m2/周期的范围。 
在另一实施方式中，免疫偶联物与至少一种其他的免疫治疗剂联合施用，该其他的免疫治疗剂包括但不限于：利妥昔(rituxan)、利妥昔单抗(rituximab)、campath-1、吉妥单抗(gemtuzumab)和trastuzutmab。 
在又一实施方式中，免疫偶联物与至少一种或多种抗血管新生的试剂联合施用，该抗血管新生的试剂包括但不限于：抑制管张素(Angiostatin)、沙利度胺(thalidomide)、三环(kringle)5、内皮抑制素(endostatin)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)、抗凝血酶(anti-thrombin)、纤维连接蛋白的29kDa N-端的和40kDa C-端的水解蛋白片段、催乳素的16kDa水解蛋白片段、血小板因子4的7.8kDa水解蛋白片段、对应于血小板因子4的含13个氨基酸的肽(Maione et al.，1990，Cancer Res.51：2077-2083)、对应于胶原质I片段的含14个氨基酸的肽(Tolma et al.，1993，J.Cell Biol.122：497-511)，对应于凝血酶敏感蛋白1片段的含19个氨基酸的肽(Tolsma等，1993，J.Cell Biol.122：497-511)，对应于SPARC片段的含20个氨基酸的肽(Sage等，1995，J.Cell.Biochem.57：1329-1334)，和它们变异体，包括其药学上可接受的盐。 
在另一实施方式中，免疫偶联物与一种放射疗法联合施用。该疗法也可包含手术和/或化学疗法。例如，免疫偶联物可与放射疗法以及顺铂(cisplatin)(Platinol)、5—氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU，Adrucil)、卡 铂(carboplatin)(Paraplatin)和/或紫杉醇(paclitaxel)(泰素(Taxol))联合物施用。使用免疫偶联物进行治疗可容许较低的放射剂量和/或较低放射治疗的频率，例如可减少影响吞咽功能从而导致减重或脱水的严重喉咙疼痛的发生。 
在又一实施方式中，免疫偶联物与至少一种或多种细胞激素(cytokines)联合施用，该细胞激素包括但不限于：淋巴因子(lymphokine)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factors)、类肿瘤坏疽因子的细胞激素、干扰素、巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatoryprotein)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte monocyte colonystimulating factor)、白细胞介素(包括但不限于：白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素-18)和它们的变异体，包括它们的药学上可接受的盐。 
在另一实施方式中，免疫偶联物与一种癌症疫苗或生物试剂联合施用，该癌症疫苗或生物制剂包括但不限于：自体同源的细胞或组织、非自体同源的细胞或组织、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen)，α—胎球蛋白、人类绒毛膜性腺激素(human chorionic gonadotropin)、卡介苗活疫苗(BCG live vaccine)、分枝杆菌细胞壁—DNA复合物(Mycobacterial cellwall-DNA complexes)、黑色素细胞衍生蛋白(melanocyte lineage proteins)和突变的及肿瘤特异性抗原。 
在又一实施方式中，免疫偶联物与荷尔蒙疗法联合施用。荷尔蒙治疗剂包括但不限于：荷尔蒙兴奋剂(hormonal agonist)、荷尔蒙拮抗剂(hormonal antagonist)(例如，氟他胺(flutamide)、它莫西芬(tamoxifen)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(LUPRON))和类固醇(例如，地塞米松(dexamethasone)、维甲类化学物、倍他米松(betamethasone)、氢化可的松(cortisol)、可的松(cortisone)、强的松(prednisone)、去氢睾酮(dehydrotestosterone)、糖肾上腺皮质激素(glucocorticoid)、盐皮质激素(mineralocorticoid)、雌激素(estrogen)、睾丸激素(testosterone)、孕酮 (progestin)). 
在另一实施方式中，免疫偶联物与基因治疗计划联合物施用，以治疗或预防癌症。 
因此，联合疗法可增加癌症或肿瘤对所施用的免疫偶联物和/或其他的癌症治疗剂的敏感度。这样，可有望获得更短的治疗周期，从而减少毒性事件。治疗周期的长短可随所施用的特异性的癌症治疗剂而改变。本发明也考虑了连续或不连续地进行给药，或者将每日的剂量分为若干次进行部分给药。本领域的技术人员应当能够认识到对特异性的癌症治疗制的适当的治疗周期，而本发明考虑了对每一种癌症疗法的最佳治疗计划的评估。具体的专业指导已为人知。参见例如Therasse等，2000，“Newguidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors.EuropeanOrganization for Research and Treatment of Cancer，National Cancer Instituteof the United States，National Cancer Institute of Canada，”J Natl Cancer Inst.Feb2；92(3)：205-16。 
免疫偶联物可通过任何适合的方法例如注射、口服、吸入、经皮肤、在肿瘤内施用。而其他的癌症治疗剂可通过相同的或不同的模式施用。此外，当需要向病人施用多种癌症治疗剂时，免疫偶联物和一种或多种其他的癌症治疗剂可用一种方法施用，而其他的癌症治疗剂可用另一种模式施用。 
(F)本发明的结合蛋白和免疫毒素的诊断方法和试剂
本发明的结合蛋白选择地结合到癌细胞或被癌细胞内化的分子，而无明显地结合到正常细胞。因此，结合蛋白可用于诊断癌症。如上所述，发明者们已示出了本发明的结合蛋白结合到葡萄糖转运体8或其变异体；包含氨基酸序列SEQ ID NOS：11-20中任何一个定义的蛋白质；或与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体。在本发明的一个实施方式中，与癌症 相关的GLUT8的变异体包含由SEQ ID NOS：11、12或13或其变异体中任何一个定义的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体包含在N-端的二-亮氨酸部分产生改性的GLUT8。在本发明的又一实施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性为二-丙胺酸。 
在一优选的实施方式中，结合蛋白是本发明的抗体或抗体片段。并且，癌细胞可被评价以确定它们对本发明的治疗方法的易感性。评价方法例如取癌细胞样品，确定样品的能力结合到本发明的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段。 
因此，本发明包括诊断方法、试剂和试剂盒，它们本身可用在本发明的治疗方法之前、之中或之后，以确定是否有癌细胞的存在，所述癌细胞是否表达抗原，并结合到本发明的蛋白，优选抗体或抗体片段上。 
在一实施方式中，本发明提供一种检测或监控受测试者中的癌 
症的方法，该方法包括以下步骤： 
(1)将从所述受测试者中取出的测试样品与本发明的结合蛋白接触，所述结合蛋白特异性地结合到癌细胞上的抗原，形成结合蛋白—抗原复合物； 
(2)测量测试样品中结合蛋白—抗原复合物的量；以及 
(3)将测试样品中的结合蛋白—抗原复合物的量与对照物比较。 
在一实施方式中，抗原是葡萄糖转运体8或其变异体；一种包含氨基酸序列SEQ ID NOS：11-20，优选为SEQ ID NOS：11、12或13中任何一个定义的蛋白质；或与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体。在另一实施方式中，与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体在N-端的二-亮氨酸部分包含一个突变，这样，该突变的葡萄糖转运体8就定位在细胞膜中。 
本发明进一步包括用于诊断癌症的试剂盒，其包含任何一种本发明的结合到癌细胞表面的抗体的结合蛋白，以及使用其诊断癌症的指导说明。 
为应用于诊断，本发明的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，可用 可探测的标记物，如不透射线的或放射线同位素例如3H、14C、32P、35S、 123I、125I、131I；荧光的(荧光团)或化学发光的(发色团)化合物，例如荧光素异硫氰酸盐、若丹明或荧光素；酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或山葵过氧化酶；成像试剂；或金属离子进行标记。如上所述，将标记物附着于结合蛋白，如抗体或抗体片段之上的方法已为本领域所习知。 
本发明的另一方面是检测或监控受测试者中癌症的方法，该方法包含以下步骤： 
(1)测量在取自所述受测试者的样品中本发明的抗体的量；以及 
(2)将测试样品中本发明的抗体的量与对照物作比较。 
在一实施方式中，本发明的抗体的量是通过用如ELISA来测量测试样品中的本发明的抗体的量而测定。在另一实施方式中，本发明的抗体的量是通过用如RT-PCR来测量编码测试样品中的本发明的抗体的核酸的表达水平而测定。 
(G)新的与癌症相关的抗原的药物组合物，方法和应用
本发明提供了新的与癌症相关的抗原，其表达在癌细胞的表面，且在正常细胞表面无显著表达。因此，该新的与癌症相关的抗原可用于治疗和预防癌症的疗法中，包括使用该新的与癌症相关的抗原或其片段来引起体内的免疫应答。并且，本发明包括了新的与癌症相关的GLUT8的变异体来探测或监控癌症。 
(i)药物组合物 
本发明的一实施方式是药物组合物，其包含有效量的新的与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段在具有适当的稀释剂或载体的混合物中。本发明的另一实施方式是药物组合物，其包含有效量的分离的核酸在具有适当的稀释剂或载体的混合物中，该核酸编码新的与癌症相关的GLUT8的变异体。本发明的进一方面是药物组合物，其包含有效量的重组表达在具有适当的稀释剂或载体的混合物中，该重组表达包括编码新 的与癌症相关的GLUT8的变异体的核酸序列。 
例如，本发明的药物组合物可被用于治疗或预防癌症。并且，药物组合物可被用于引起受测试者对新的与癌症相关的GLUT8的变异体的免疫应答。 
药物组合物可按如上所述进行制备和施用。药物组合物可与如上讨论的其它的抗癌症的治疗试剂联合使用。 
当免疫试剂(即新的与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段，和/或对其编码的核酸序列，和/或其的重组表达载体)和/或其组合物在不受施用形式约束下，能够与佐药用于共免疫，则免疫原性可得到显著地提高。通常，佐药的用量为磷酸盐缓冲盐水溶液中的0.05-1.0％。佐药能够提高免疫原的免疫原性，但它们自身却不一定是免疫性的。佐药可通过将免疫原保留在靠近施用的部位来产生贮库效应，从而达成向免疫系统的细胞缓慢的、持续地释放免疫原。佐药也能够将免疫系统的细胞吸引到免疫原贮库，并激发这些细胞产生免疫应答。这样，本发明的实施方式包含了进一步含有佐药的药物组合物。 
佐药已被使用多年来提高宿主对如疫苗的免疫应答。内部佐药(例如脂多糖)通常为疫苗中使用的被杀死的或毒性减弱的细菌的成分。外部佐药为免疫调节剂，其通常是以非共价键的方式连接到抗原上，并配制用于增强宿主的免疫应答。因此，佐药已被确认为经肠胃外的递送而增强对抗原的免疫应答。但是，这些佐药中的一些是有毒的，能导致不期望的副作用，从而不适合用于人和许多动物。事实上，只有氢氧化铝和磷酸铝(通常统称为alum)是通常被用作人和兽医用的疫苗中的佐药。已建立了完整的Alum在增加抗体对白喉和白喉类毒素的应答方面的效果。尽管如此，这是有限制的。例如，alum对于用作流感疫苗是没有效果，且不一致地引起细胞介导的与其它免疫原的免疫应答。在小鼠中被alum-辅助的抗原而诱出的抗体主要是IgG1同种型，其可不被一些疫苗试剂作出最佳的保护。
大量的外部佐药可激起潜在的对免疫原的免疫应答。这些佐药包括复合到细胞膜蛋白质抗原的皂角苷(免疫刺激复合物)、具有矿物油的普流尼克(pluronic)聚合物、杀死的分枝细菌和矿物油、弗氏完全佐药(Freund′s complete adjuvant)、细菌产品，例如胞壁酰二肽(muramyldipeptide，MDP)和脂多糖(LPS)以及脂质A和脂质体。 
在本发明的一方面，在本发明的任何一个实施方式中均可使用的佐药如下所述。用于肠胃外免疫的佐药，包括铝化合物(如氢氧化铝、磷酸铝和氢氧化磷酸铝)。抗原可根据标准协议沉淀到或吸附到铝化合物中。其它的佐药如RIBI(ImmunoChem，Hamilton，MT)也可用于肠胃外施用。 
用于粘膜免疫的佐药包括细菌毒素(例如，霍乱毒素(CT))、大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)、艰难梭状芽孢杆菌毒素A(Clostridium difficile toxin A)和日咳毒素(pertussis toxin，PT)，或它们的组合、亚单位、类毒素，或它们的突变体)。例如，可使用天然的霍乱毒素亚单位B(CTB)的纯化制剂。只要它们保留佐药活性，则这些毒素的片段、类似物、衍生物和它们任意的毒素的融合体也可适用。优选的，使用减毒的突变体。合适的突变体在以下文献中有描述：(例如，WO95/17211(Arg-7-Lys CT突变体)，WO96/6627(Arg-192-Gly LT突变体)，和WO95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-Gly PT突变体))。可用于本发明的方法和组合物中的其它的LT突变体包括如，Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-Asp和Glu-112-Asp突变体。其它不同来源(例如，大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，或弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、皂角苷，或聚交酯乙交酯(PLGA)微球)的佐药也可用于粘膜施用。 
同时适用于肠胃外免疫和粘膜免疫的佐药包括聚磷腈(polyphosphazene)(例如，WO95/2415)、DC-chol(3b-(N-(N′，N′-二甲基氨基甲烷)-氨基甲酰)胆固醇)(例如，美国专利No.5,283,185和WO 96/14831)以及QS-21(例如，WO88/9336)。 
采用任何一种本领域的技术人员熟知的传统方法，可向受测试者进行免疫的药物组合物，该药物组合物包含与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段、和/或对其编码的分离的核酸序列、和/或重组表达载体。这药物组合物可通过包括，如粘膜(例如眼睛、鼻内、口、胃、肺、肠、直肠、阴道、或尿道)表面、肠胃外(如皮下、皮内、肌肉、静脉内或腹膜内)途径或经结节内进行免疫。优选的途径是取决于对本领域的技术人员能够容易地选出的免疫原。可以是单一剂量的或间隔重复的形式进行给药。本领域技术人员应该理解，合适的剂量取决于各种参数，如免疫原本身(即肽对核酸)(和其更特异性的类型)、施用途径和被免疫的动物的状况(体重、年纪等)。 
本发明还提供含有有效量的本发明的药物组合物的试剂盒，可选择的，可含有一种或多种其它的癌症治疗剂，以及其使用说明。 
(ii)治疗方法 
如上所述，新的与癌症相关的GLUT8的变异体位于癌细胞表面，而在正常细胞上不显著。因此，该新的与癌症相关的抗原可用于预防或治疗癌症的疗法中。并且，该新的与癌症相关的抗原可用于在受测试者中引起免疫应答，例如，在疫苗中。 
本发明的一实施方式是与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段在制造治疗或预防癌症的药物中的应用。本发明的另一实施方式是与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段在制造在受测试者中引起免疫应答的药物中的应用。 
本发明还包括编码与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段的分离的核酸序列在制造治疗或预防癌症的药物中的应用。并且，本发明还包括编码与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段的分离的核酸序列在制造在受测试者中引起免疫应答的药物中的应用。 
本发明的进一步的实施方式是包含了编码与癌症相关的GLUT8的 变异体或其片段的分离的核酸序列的重组表达载体在制造治疗或预防癌症的药物中的应用。并且，本发明还包括包含了编码与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段的分离的核酸序列的重组表达载体在制造在受测试者中引起免疫应答的药物中的应用。 
本发明的其它的实施方式是对患有或疑似患有癌症的受测试者进行癌症的治疗或预防的方法，包括向该受测试者施用有效量的与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段。此外，本发明还包括对患有或疑似患有癌症的受测试者进行癌症的治疗或预防的方法，包括向该受测试者施用有效量的编码与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段的分离的核酸序列。进而，本发明还包括对患有或疑似患有癌症的受测试者进行癌症的治疗或预防的方法，包括向该受测试者施用有效量的包含了编码与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段的分离的核酸序列的重组表达载体。 
本发明的另一实施方式是在受测试者中诱发对与癌症相关的GLUT8的变异体的免疫应答的方法，包括向该受测试者施用有效量的与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段。此外，本发明还包括在受测试者中诱发对与癌症相关的GLUT8的变异体的免疫应答的方法，包括向该受测试者施用有效量的编码与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段的分离的核酸序列。进而，本发明还包括在受测试者中诱发对与癌症相关的GLUT8的变异体的免疫应答的方法，包括向该受测试者施用有效量的包含了编码与癌症相关的GLUT8的变异体或其片段的分离的核酸序列的重组表达载体。 
(iii)诊断方法 
新的与癌症相关的GLUT8的变异体位于癌细胞表面，而在正常细胞上不显著。因此，对新的与癌症相关的GLUT8的变异体的检测可用于癌症的诊断方法。在优选的实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体含有由SEQ ID NOS：11、12或13或其变异体的任何一个定义的氨基酸序 列。在本发明的另一实施方式中，与癌症相关的GLUT8的变异体含有在N-端的二-亮氨酸部分发生改性的GLUT8。在本发明的进一步的实施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性为二-丙胺酸。 
本发明的一个实施方式是对患有或疑似患有癌症的受测试者进行癌症的检测或监控的方法，包括检测样品中细胞上的与癌症相关的GLUT8的变异体，其中，如果在细胞上检测到了与癌症相关的GLUT8的变异体，则表明有癌症。 
若干的技术可用于检测细胞上与癌症相关的GLUT8的变异体。例如，本发明的结合蛋白可用于免疫分析，以探测与癌症相关的GLUT8的变异体在细胞表面的表达。本领域的技术人员应当理解有若干的技术可用于检测和/或定量与癌症相关的GLUT8的变异体在细胞表面的表达。这些技术包括西方墨点法、SDS-PAGE后进行的免疫沉淀、免疫细胞化学、FACS、蛋白质阵列等。 
本发明的其它方面是对患有或疑似患有癌症的受测试者进行癌症的检测或监控的方法，包括检测样品中细胞内的与癌症相关的GLUT8的变异体，其中，如果在细胞内检测到与癌症相关的GLUT8的变异体，则表明有癌症。在一优选的实施例中，编码与癌症相关的GLUT8的变异体的RNA表达产物被用于检测细胞上的与癌症相关的GLUT8的变异体。本领域技术人员应当理解，通过检测编码与癌症相关的GLUT8的变异体的mRNA，或那些特异性地和/或选择性与编码与癌症相关的GLUT8的变异体的mRNA杂交的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产物、合成的DNA、合成的RNA或其它天然或改性的核苷酸，则可对RNA表达产物进行检测或定量。 
若干的方法可用于检测和/或定量细胞内与癌症相关的GLUT8的变异体的RNA表达，包括RT-PCR，核酸酶保护分析(nuclease protectionassay)，例如核糖核酸酶保护分析(ribonuclease protection assays)和S1核酸酶分析(S1 nuclease assays)，以及北方墨点法(Northern blots)等。
(H)其它方法
葡萄糖转运体8已显示出具有转运糖的活性。因此，本发明包括通过调控癌细胞上或内的与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体，来治疗或预防受测试者中的癌症的方法。 
在本发明的一实施方式中，治疗或预防受测试者中的癌症的方法包括，阻止或减少与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体作为糖的转运体的功能。 
在本发明的另一实施方式中，葡萄糖转运体的非抗体抑制剂被用于治疗或预防受测试者中的癌症。 
已知有几种葡萄糖转运体家族的分子的抑制剂，包括类黄酮家族中的几个成员。例如，腺苷酸环化酶激动剂(forskolin)、根皮素(phloretin)(一种类似类黄酮的化合物)和细胞松弛素B(cytochalasin B)已知为抑制GLUT1，且它们的假定结合部位已在GLUT-1的三维分子模型上得到确认(Salas-Burgos等，Biophys.J.87：2990-2999，2004)。槲黄素(Quercetin)，一种黄酮醇，显示出抑制GLUT2-介导的葡萄糖转运(Song等，J.Biol.Chem.277：15252-15260，2002)。雌二醇(Oestradiol)和异黄酮植物雌激素染料木素(isoflavone phytoestrogen Genistein)也是GLUT1-介导的葡萄糖转运的抑制剂，且也有人提出了这些分子的假定的结合部位(Afzal等，Biochem J.365：707-719，2002)。葡萄糖转运体抑制剂中的腺苷酸环化酶激动剂(forskolin)、骈嘧啶氨醇(dipyridamole，潘生丁)和异丁基甲基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine(黄嘌呤)(IBMX))均结合到GLUT1和GLUT4上(Hellwig&Joost，Mol.Pharmacol.40：383-389，1991)。细胞松弛素B也结合到GLUT4上(Wandel等，Biochim.Biophys.Acta1284：56-62，1996)。 
除了这些已知的抑制剂外，本领域的技术人员应当理解，存在若干已知的用于确认葡萄糖转运体抑制剂的分析。例如，抑制剂对葡萄糖转 运体的作用可通过表达感兴趣的GLUT，优选为葡萄糖转运体8，在细胞如非洲爪蟾卵母细胞(Xenopus laevis oocytes)或CHO中，测量在有或没有抑制剂的存在下的葡萄糖的摄取，并确定抑制剂是否具有竞争性来进行评价。一旦知道给定的GLUT异构体的序列后，就可容易地测试出它对大量分子的敏感性，从而确认候选药物。 
因此，本发明包括了向受测试者根据其需要施用有效量的葡萄糖转运体的抑制剂，来治疗或预防受测试者中的癌症的方法。该抑制剂包括类黄酮家族中的成员，例如槲黄素(Quercetin)或染料木素(genistein)、似类黄酮的化合物，例如根皮素(phloretin)、雌性激素类(Oestrogenic)化合物，包括雌二醇(oestradiol)或染料木素(genistein)、腺苷酸环化酶激动剂(forskolin)、细胞松弛素B(cytochalasin B)和/或异丁基甲基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine(黄嘌呤)(IBMX))。 
在本发明的另一实施方式中，与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体的功能通过降低或阻止与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体在细胞中的表达而得到阻止或降低。 
用于阻止或降低与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体在细胞中的表达的标准技术包括，使用对与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体基因的转录物活泼的反义、三螺旋核酸或核酶分子。 
例如，可采用标准技术生产反义核酸分子，即与编码感兴趣的多肽的正义核酸的互补的分子，例如，与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA序列互补。因此，反义核酸可由氢键结合到正义核酸上。反义核酸可与整条编码链或仅与其部分互补，例如蛋白质编码区域(或开发阅读框)的全部或部分。反义核酸分子可与编码感兴趣的多肽的核酸序列的编码链中的非编码区形成反义。该非编码区(5’和3’的非翻译区)是5’和3’的序列，其与编码区的侧翼相接，并不会翻译为氨基酸。 
反义寡核苷酸例如可以在长度上有约5，10，15，20，25，30，35，40，45或50个核苷酸或更多。本发明的反义核酸可使用本领域习知方法，采用 化学合成和酶连接反应构建。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可使用天然核苷酸，或多项地经改性以提高分子生物稳定性的或增加反义和正义核酸间形成的双链的物理稳定性的核苷酸而进行化学合成。例如，可使用硫代磷酸酯(phosphorothioate)衍生物和吖啶取代的核苷。可用于产生反义核酸的改性的核苷酸包括：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-而氨基嘌呤。此外，反义核酸可使用表达载体以生物形式产生，将一核酸按反义取向亚克隆到该载体(即从插入的核酸转录的RNA将与感兴趣的靶核酸呈反义取向)。 
被施用到受测试者的或与编码感兴趣的多肽的细胞的mRNA杂交或结合的原位生成的反义核酸分子，从而抑制表达，例如通过抑制转录和/或翻译。杂交可通过传统的核苷酸的互补性形成稳定的双链，或如在反义核酸分子通过在双链的主要凹区内的形成特异性相互反应的情况下，结合到DNA双链。本发明的施用反义核酸分子的例子包括在组织部位直接注射。另外，反义核酸分子也可经改性而靶向选择的细胞，然后进行全身性施用。例如，对于全身性施用，反义分子可经改性，从而对表达在所选细胞上，如T细胞或脑细胞上的受体或抗原，通过连接反义核酸 分子到结合于细胞表面的受体或抗原的肽或抗体上，而进行特异性结合。反义核酸分子也可使用载体，如下面描述的基因疗法的载体向细胞传递。为了获得足够的反义核酸分子的细胞内浓度，优选的载体构建是反义核酸分子在强pol II或pol III启动子控制下放置于其中的。 
感兴趣的反义核酸分子可为α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特异性双链杂交链，其中，与通常的α-单元不同的是，杂交链是相互平行(Gaultier等.，1987，Nucleic Acids Res.15：6625-6641)。该反义核酸分子也可含有2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucleic AcidsRes.15：6131-6148)或一嵌合RNA-DNA的类似物(Inoue等，1987，FEBSLett.215：327-330)。 
核酶是催化性的RNA分子，具有核糖核酸酶活性，能够切割单链核酸，例如mRNA，核酶具有与单链核酸互补的区域，且可通过标准技术生成。因此，核酶(例如锤头型核酶)(描述于Haselhoffand Gerlach，1988，Nature334：585-591)可被用于催化性切割mRNA转录物，从而抑制由mRNA编码的蛋白质的翻译。对编码感兴趣的多肽的核酸分子具有特异性的核酶可基于编码与癌症相关的GLUT8的变异体的cDNA的核苷酸序列而设计。例如，根据Cech等的美国专利No.4,987，071；和Cech等的美国专利No.5,116,742，可构建出四膜虫(Tetrahymena)L-19IVS RNA的衍生物，其中，活性部位的核苷酸序列是互补于被切割的核苷酸序列。此外，编码感兴趣的多肽的mRNA可被用于选择催化的RNA，其选自RNA分子的汇总，且具有特异性核糖核酸酶的活性。参见如Bartel andSzostak，1993，Science261：1411-1418。 
三螺旋结构也可用已知的技术生成。例如，可通过靶向与编码多肽的基因的调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，形成三螺旋结构，以抑制基因在靶细胞中的转录，从而抑制感兴趣的多肽的表达。参见Helene，1991，Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和Maher，1992，Bioassays14(12)：807-15。
在多个实施方式中，可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架处对核酸组合物进行改性，以提高如分子的稳定性、杂交性或溶解性。例如，核酸的脱氧核糖磷酸骨架可经改性而生成肽核酸(见Hyrup等，1996，Bioorganic & Medicinal Chemistry4(1)：5-23)。在此使用的术语“肽核酸”或“PNAs”是指核酸模仿物，例如DNA模仿物，其中的脱氧核糖磷酸骨架被假肽骨架取代，而仅保留了4个天然的核碱基。PNAs的中性骨架显示出在低离子浓度条件下对DNA和RNA的特异性杂交。PNA低聚物的合成可使用标准的固相肽合成协议进行，该协议描述于Hyrup等，1996，supra；Perry-O’Keefe等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14670-675中。 
PNAs可经改性而如提高它们的稳定性或细胞性摄入。这通过附着亲脂性的或其它辅助基团到PNA上，形成PNA-DNA嵌合体，或通过使用脂质体或其它本领域习知的药物递送技术达成。例如，可生成PNA-DNA嵌合体，其可集PNA和DNA的有利特点于一身。这样的嵌合体允许DNA识别酶，例如RNAse H和DNA聚合酶，与DNA部分作用，而PNA部分可提供高的结合亲和力和特异性。PNA-DNA嵌合体可使用适当长度的连接体(linker)连接，连接体的选择考虑碱基堆积、核碱基之间的键的数目和取向(Hyrup，1996，supra)。PNA-DNA嵌合体的合成可按Hyrup，1996，supra，和Finn等，1996，Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63中的描述进行。例如，DNA链的合成可在一支撑物上使用标准亚磷酰胺偶联化学和改性的核苷类似物进行。化合物如5’-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5’-脱氧-胸苷亚磷酰胺可用于连接PNA和DNA的5’端(Mag等，1989，NucleicAcids Res.17：5973-88)。然后，PNA单体逐步偶联，与5’PNA片段和3’DNA片段产生嵌合分子(Finn等，1996，Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63)。嵌合分子也可用5’DNA片段和3’PNA片段合成(Peterser等，1975，Bioorganic Med.Chem.Lett.5：1119-11124)。 
在其它实施方式中，寡核苷酸可包括其它的侧基，例如肽(例如，用于体内靶向宿主细胞的受体)，或有助于跨细胞膜传输的试剂(例如， 参见Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：6553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：648-652；International PublicationNo.WO88/09810)或血-脑屏障(参见如International Publication No.WO89/10134)。此外，寡核苷酸可用杂交触发的切割试剂(参见如Krol等，1988，Bio/Techniques6：958-976)或插入试剂(参见如Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)进行改性。为此，寡核苷酸可与其它分子，如肽，杂交触发的交联试剂、转运试剂、杂交触发的切割试剂等偶联。 
本发明的其它方面涉及识别能够调节与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体的表达或活性的化合物的方法，该方法可用于预防或治疗癌症。在本发明的一实施方式中，用于识别具有预防或治疗癌症的能力的化合物的方法包括以下步骤： 
(a)将表达与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体的细胞与测试化合物接触；以及 
(b)确认与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体的表达或功能； 
(c)将与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体的表达或功能与对照物比较，其中，与对照物相比，当与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体的表达或功能有所降低，则表明一化合物可用于预防或治疗癌症。 
以下用非限制性的实施例来说明本发明： 
实施例
实施例1：VB1-050单克隆抗体的生成
VB1-050单克隆抗体是由癌症病人的汇总的(pooled)淋巴细胞产生。SHFP-1被用作融合伙伴(fusion partner)来产生单克隆抗体。VB1-050是IgG1，λ—单克隆抗体。 
实施例2：序列测定
信使RNA(mRNA)从杂交瘤细胞中分离，且合成第一股互补DNA(cDNA)。然后，通过PCR，cDNA被用于分离抗体H和L链基因。根据H(γ)和L(κ)链同型的一致骨架区来设计PCR引物(见注释)。 PCR的产物被分别克隆到TOPO-pCR2.1载体，且被转化到大肠杆菌(E.coli)细胞中。在TOPO-pCR2.1中含有插入片段的独立的克隆经分离并培养。质粒DNA经纯化并测定序列。 
γ引物： 
1)5’TCT AAA GAA GCC CCT GGG AGC ACA GCT CAT CAC CATG3’(SEQ ID NO：21) 
2)5’GCC CGG GGA GCG GGG GCT TGC CGG CCG TCG CACTCA3’(SEQ ID NO：22) 
3)5’ACC ATG AGT GAG AAA AAC TGG ATT TGT GTG GCA3’(SEQ ID NO：23) 
4)5’GGA GCC GGT GAC CAG GGT TCC CTG GCC CCA3’(SEQID NO：24) 
5)5’CTC ACC ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT3’(SEQ IDNO：25) 
6)5’GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC CTGGCC3’(SEQ ID NO：26) 
κ引物： 
7)5’GGC TCG AGA TGG ACA TGR RRD YCC HVG YKC ASC TT3’(SEQ ID NO：27) 
8)5’CCC GTC GAC CAT CAG ATG GCG GGA AGA T3’(SEQ IDNO：28) 
备注：为了用单一引物分离尽可能多的种类，对某些共有引物使用混合的碱基：R＝A+G，D＝A+T+G，Y＝C+T，H＝A+C+T，V＝A+C +G，K＝T+G，S＝C+G，W＝A+T。 
各PCR反应在50μL的反应体积内包含以下成分： 
10x PCR 缓冲剂  5μL 
2mM dNTPs  5μL 
50mM MgCl2  2μL 
5’引物  20pmoL 
3’引物  20pmoL 
Taq DNA 聚合酶  2.5U 
DNA 模板  50ng 
PCR循环条件为：94℃下1分钟，62℃下1分钟，72℃下1.5分钟，进行30个循环，且最后在72℃下延伸10分钟。扩增的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上经电泳分离，切离，用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化，并克隆到TOPO pCR2.1克隆载体中，然后用373DNA延伸测序仪进行DNA测序(Griffin G.H.and Griffin M.A.：PCR technology，Currentinnovations.CRC Press，Boca.Raton.Florida3431.USA；Cloning vector pCR2.1，Catalogue#205184.Invitrogen，Carlsbad，CA；Qiagen，Qiaquick gelextraction kit，Catalogue#28706.Qiagen Inc.，Mississauga，ON；and373DNA Stretch.PE Applied Biosystems，Mississauga ON.)。 
VB1-050的CDR序列示于表1。 
轻链可变区和重链可变区分别示于图1和图2。 
实施例3：由癌细胞活性测定的抗体谱(Antibody Profiling)
用流式细胞仪测试VB1-050对肿瘤和正常细胞的反应性。对代表了15种不同类型的上皮癌细胞的单板癌细胞系进行了筛选。VB1-050的结果总结于表2中。尽管VB1-050对于所有症状的MF值均大于2.0，但 在乳房、黑素瘤和卵巢细胞系等中，却不限于此，而观察到最强的活性。相比之下，正常细胞的反应性通常低于那些在癌细胞上见到的。在乳房和前列腺细胞系中的VB1-050的平均表达是在癌细胞系上的9倍以上。肾脏和肺细胞系是两个例外，但它们的MF值仍低于相应的癌细胞类型。MF值是在各症状中，由所有细胞系中相对于对照抗体的中荧光强度的平均增加的倍数的总和计算得到的平均。MF值为0表明相对于对照抗体而言，没有可测量的反应性。 
实施例4：正常组织微阵列
测试VB1-050对流动阳性癌细胞系SKBR-3的作用，以评估适当的组织形式以表明膜的染色以及定义最佳的染色条件。在所有的实验组中，VB1-050表现出强的核和/或核膜的染色。值得注意的是，细胞离心的载片中显示出在细胞膜上有斑点状的染色，这出现在约30％的完整细胞中。在冷冻切片上，除了核和/或核膜的染色(60％的细胞)和细胞质的染色(10％的细胞)外，也检测到了类似的细胞膜的染色(10％的细胞)。在固定的细胞颗粒上，该抗体对核和核膜(70％的细胞)和细胞质(10％的细胞)的染色，几乎没有对细胞膜(3-5％的细胞)染色。由于固定并不对抗原产生影响(可由细胞离心图片机的照片上对固定的细胞的染色证明)，在固定的细胞颗粒中明显的细胞膜的染色的丢失可能是由于这些细胞具有比冷冻细胞更小的表面积。在冷冻细胞中可见的更大的膜面积是由于细胞质收缩所致，以及因本质问题，使用冷冻细胞需要更厚的切片。另外，固定后的加工(如嵌入等)可改变表面抗原。 
一旦优化的染色条件确定后，即对抗体进行测试，且与在用于正常组织反应性的福尔马林固定的重要正常的低密度(LD)阵列之上的同型对照物(4B5)进行比较。VB1-050的结果总结于表3中。在任何正常的重要组织中均没有发现明显的膜染色。在许多组织中看到强烈的核和/或核膜的染色。类似的，在非重要正常组织中均未看到一致性的细胞膜染色。 但除了测试以外，在接受测试的1/5中显示出30％的膜染色。 
实施例5：肿瘤组织微阵列
与重要和非重要正常组织筛选不同的是，在一些但不是所有的肿瘤组织中观察到了细胞膜反应性。VB1-050更多地在结肠、前列腺、胃、卵巢和肝脏中被检测到。最强的染色(2+)一致地在胃癌中检测到。通常，膜被染色的细胞的百分比随症状和各症状中的组织样品而改变；然而，结肠癌显示出了最高百分比的被染色的细胞。见表5。从肺癌、直肠癌、皮肤癌和子宫癌的组织样品中没有发现染色。 
实施例6：由流式细胞仪和共焦显微镜对VB1-050结合及内化的评价：
使用VB1-050和两个对肿瘤细胞系A-375显示强反应性的对照抗体(5E9和MA-103)来评价VB1-050的内化。代表性的实验示于表6。在不同的温度下的VB1-050结合结果与内化抗体5E9的没有区别。在37℃下60分钟后，结合于膜上的VB1-050从细胞表面消失，且中荧光强度减少了61.8％。在37℃下的温培时间的增加与继续减少的中荧光强度有关，但是在较慢的速率下而增加的。到120分钟时，中荧光强度已减少了69.6％。显示细胞表面结合的流式柱状图见于图3。 
为了确认结合于细胞表面的VB1-050是否被内化到A-375细胞或从质膜脱落，通过借用激光扫描共焦显微镜观察直接观察荧光分布以及细胞内染色，对经抗体处理的细胞作进一步评价。与MA-103和5E9相似，用VB1-050在4℃下温培60分钟的A-375细胞显示出荧光标记的圆周表面分布(图4A)。将VB1-050抗体结合的细胞加温到37℃揭示了用内化的抗体在60分钟内的强的细胞内染色。见图4B。 
实施例7：结合亲和力状态
影响抗体-抗原复合物的最为重要的因素是抗体对其抗原的亲和力。 该结合亲和力是这些反应物的恒定性能，表达为平衡常数(K)，定义为结合/解离的比率或KA/KD。对于给定的抗体，观察到的亲和力的不同与解离(KD)的相关程度是高于与结合(KA)的相关程度，因此，选择KD来测量VB1-050的亲和力。 
使用流式细胞方法来确定抗体亲和力[Benedict，C.A.等(1997)″Determination of the binding affinity of an anti-CD34single-chain antibodyusing a novel，flow cytometry based assay″J.Immunol.Methods2001，223-31]。简言之，用不同浓度范围的VB1-050温育A-375细胞在足够时间内以获得平衡。然后，细胞经洗过并用生物素偶联的抗人lgG二抗体处理。然后用流式细胞仪检测结合了抗体的细胞以分析肿瘤细胞。确定的中荧光强度的倒数作为抗体浓度的倒数的函数，以通过Lineweaver-Burk方法作图[Lineweaver，H.等(1934)″The determination ofenzyme dissociation constants″J.Am.Chem.Soc.56，658]确定KD。 
VB1-050和A-375之间相互作用的KD值确定为4.90x10-8M。 
实施例8：改造和测试De-Bouganin免疫毒素
1)改造VB6-050 
将由EcoRI和PvuII对PelB-VH845-CH-F-de-bouganin/pSV73质粒的消化获得的PelB-VH-PvuII插入片段连接到由相同酶预消化过(之前经改造的含有PelB前导体而无信号肽序列PelB(-S)的内含物表达)的PelB(-S)-VH050-CH-F-de-bouganin/psV73载体中。通过连接反应转化的10F受态细胞，并在氨比西林盘上被选择。通过绘制限制性位点来筛选菌落以确定含有PelB-VH050-CH-F-de-bouganin插入片段的克隆。 
PelB(-S)-VL050-CL片段用EcoRV和XhoI消化，并连接到由相同酶预消化过的SpeI-de-bouganin-PelB-VL845-CL/psV73载体中。然后，通过连接反应转化10F受态细胞，并置于含有氨比西林的LB-琼脂盘上。通过绘制限制性位点来筛选菌落以确定含有SpeI-de-bouganin-PelB-VL050-CL插 入片段的克隆。然后使用EcoRV和XhoI限制性位点将SpeI-de-bouganin-PelB-VL050-CL插入片段克隆到pING3302质粒。PelB-VH050-CH-F-de-bouganin片段用EcoRI和SpeI消化，并连接到由产生VB6-050  插  入  片  段  的  相  同  酶  预  消  化  过  的SpeI-de-bouganin-PelB-VL050-CL/3302载体上。然后，含有VB6-050插入片段的质粒经分离并用于转化E104细胞。 
2)小试表达研究 
经转化的含有VB6-050的E104细胞在含30mL的TB培养液(1％接种体)在250mL振动烧瓶中于37℃，225rpm下振动繁殖约5小时，直到光学密度(O.D.600nm)达到2。此时，用最终浓度为0.1％的L-(+)树胶醛醣诱导培养物，并在25℃培养16小时。接着，在14000rpm下，离心5分钟以收集上清液，并以西方墨点法，在非还原的条件下使用抗λ或抗人K轻链的抗体确认免疫毒素的存在和大小来进行分析。 
3)种细胞库生产 
为了生成MCB，使用采自含有25μg/mL的四环素的LB-琼脂盘上的单一菌落，在37℃恒定振动下，培育5mL的2xYT和25μg/mL的四环素。当OD600达到～2时，在250mL的振动烧瓶中于37℃下，用1.25mL的种子培养物接种到50mL的含25μg/mL的四环素的2xYT介质。将1.5mL的部分置于冷冻管(cryotube)中，并储存于-80℃。测试三个独立的小瓶如上所述的表达。 
4)发酵和纯化 
VB6-050的补料发酵在15L CHEMAP发酵器中以TB培养液进行。在OD600为20(中间-log)时，用混合料(50％甘油)和诱导剂(200g L-树胶醛醣)进行诱导。在诱导后30个小时，获得培养物，并在8000rpm下离心30分钟，然后用CM-琼脂糖柱和螯合-琼脂糖柱及再经体积排斥色谱柱进行纯化。简单说来，上清液经浓缩和用20mM磷酸钠pH6.9±0.1进行渗透过滤。然后，将经渗透过滤的浓缩的上清液载入CM-琼脂糖柱， 并用20mM磷酸钠、25mM NaCl pH6.9±0.1平衡。该柱子用20mM磷酸钠，25mM NaCl pH6.9±0.1洗。然后用20mM磷酸钠和150mM NaClpH7.5±0.1洗脱结合的VB6Fab-de-bouganin融合蛋白。再将CM-琼脂糖洗脱液调节到最终浓度为0.25％曲拉通-X100，并载入带电荷的螯合-琼脂糖柱。然后，螯合-琼脂糖柱由3种不同的清洗缓冲剂清洗，首先是20mM磷酸钠，150mM NaCl，0.25％曲拉通-X100pH7.5±0.1，然后是20mM磷酸钠，150mM NaCl pH7.5±0.1和再是20mM磷酸钠，150mM NaCl，10mm咪唑pH7.5±0.1。结合的VB6Fab-de-bouganin融合蛋白经20mM磷酸钠，150mM NaCl，250mM咪唑pH7.5±0.1洗脱，并收集2mL的流分物。确定各流分物在A280nm的吸收率，并收集含有原料的流分物并载入体积排斥色谱柱S200，以获得约80％的纯度。该过程中各步骤的样品均用西方墨点法分析，分析用到抗K的抗体。最后用胶体蓝染色确定经体积排斥色谱柱后的纯度。 
5)VB6-050的生物活性 
人黑素瘤A-375、人T细胞Daudi、人卵巢SK-OV-3、人胰腺Panc-1、人乳腺SKBR-3和MB-435S以及人结肠Colo-320细胞系分别在它们各自的基质中按照ATCC协议生长。在30-40％的饱和度下获得的细胞具有生存能力大于90％。 
a)结合活性 
使用流式细胞仪展示分别使用抗原阳性细胞系SKBR-3、A-375和SK-OV-3，以及抗原阴性细胞系Panc-1、Colo-320和Daudi来使纯化的VB6-050保留结合的特异性。使用抗de-bouganin的抗体检测结合。简言之，待测试的构建体用0.45x106个癌细胞在冰上培育1.5小时。经清洗后，用兔抗de-bouganin(1/100)在冰上1小时检测细胞表面的结合反应性。细胞经清洗并用FITC-偶联的抗-兔lgG在冰上培育30分种。然后，清洗细胞，并再悬浮于含5％FCS的碘化丙啶的PBS中，供流式细胞仪测定Fab结合之用。
b)竞争分析 
饱和曲线通过用浓度在10-750μg/mL范围内增加的VB6-050与抗原阳性细胞培育而生成的。如前所述那样使用流式细胞仪测定结合的Fab-de-bouganin。然后，对应于饱和点的Fab-de-bouganin的浓度用抗原阳性细胞在增加浓度的亲本lgG抗体存在下培育。结合的Fab-de-bouganin的减少由流式细胞仪测量。4B5IgG被用作阴性对照。 
c)细胞毒性分析 
VB6-050的细胞毒性通过MTS分析测量。简言之，抗原阳性和抗原阴性细胞以每孔1000个细胞进行下种，并在37℃下培育3小时。接着，改变VB6-050的浓度，向细胞中加入de-bouganin，5天后，确定细胞生存能力。 
结果 
1)在pING3302表达载体中VB6-050的改造和小试表达 
为第一个尝试生产Fab-de-bouganin蛋白质，载体被改造为两个分离的构建体，其中，Fd部分融合到de-bouganin和轻链。每个链的表达通过PelB前导序列PelB(-S)中的信号肽的缺失而导入内含体中。然而，在内含体中Fd-de-bouganin蛋白质的表达的缺少以及成功的VB6-845可溶性表达阐释了对VB6-050可溶的Fab-de-bouganin构建体的重新改造。为了减少重新改造的时间，并基于可行性，限制酶被用于将Fd-F-de-bouganin和VL-CL片段连接到含有信号肽的PelB前导序列。 
对050的Fd和轻链的分析分别揭示了重链和轻链中EcoRI，PvuII，EcoRV和XhoI所处的限制性位点，从而允许在没有PCR反应下使用VB6-845中间的构建体来重新改造VB6-050。为此，通过使用EcoRI和PvuII 限 制 性 位 点，并 连 接 到 事 先 用 相 同 酶 预 消 化 的PelB(-S)-VH050-CH-F-de-bouganin上(图5A)，可 获 得 具 有PelB-VH845-CH-F-de-bouganin的前导肽的PelB插入片段。类似的，PelB(-S)-VL050-CL/pSV73质粒由EcoRV和XhoI消化，且插入片段克隆到 事先用EcoRV和XhoI预消化的SpeI-de-bouganin-PelB-VL845-CLκ载体。接着，使用EcoRI和XhoI限制性位点将该插入片段PelB-VL050-CL插入到3302质粒中(图5B)。然后，PelB-VH050-CH-F-de-bouganin片段通过EcoRI-SpeI限制性位点而连接，从而在3302DNA质粒中产生VB6-050插入片段。最后3302DNA质粒再转化到E104细胞(图5C和5D)。 
在非还原的条件下对VB6-050进行的西方墨点分析表明，用抗K轻链的抗体探测出了全长的蛋白质(图6)。此外，VB6-050的表达水平与用作参考的VB6-845相似。未经诱导的E104培养物上清液的西方墨点揭示了没有对应的条带，这说明这些蛋白质被特异性地以相应的抗体探测到(图6，泳道4)。另外，在各克隆中，也获得了在VB6-845中观察到类似的降解产物的谱。 
2)VB6-050的纯化 
对采自15升发酵器中的VB6-050进行了纯化。用西方墨点对纯化过程中取自各步骤的等量样品进行了分析，以评估各柱的回收率(图7A)。免疫印迹用抗人K轻链培育。在浓缩和渗透过滤的步骤中的渗透物，没有观察到可检测的产物(图7A，泳道2和4)。经渗透过滤的材料，以1/10稀释，载入CM-琼脂糖柱(图7A，泳道5)。西方墨点分析显示，CM洗脱物(图7A，泳道8)包含了全长的VB6-050和可能的降解的VB6-050片段。泳道9的镍柱的流经物显示大多数VB6-050和其它产物结合到柱上。然后，将泳道13的Ni2+洗脱物载入SEC200体积排斥色谱，以从降解的片段分离出完整的VB6-050(图7A，泳道14和图7B，泳道2)。 
3)由流式细胞仪检测VB6-050的蛋白质结合 
对于VB6-050，根据各抗体谱的数据选择抗原阳性和抗原阴性细胞系。通过流式细胞仪用抗bouganin的抗体检测出了结合的 Fab-de-bouganin。如所期望的，在用抗原阴性细胞系培育后，用流式细胞仪未检测出有结合。相反，在用抗原阳性细胞系培育后，检测到了结合的Fab-de-bouganin。此外，抗原阳性细胞用在0 to 500μg/mL范围内的多种浓度的Fab-de-bouganin蛋白质进行了培育，并通过流式细胞仪确定结合活性。由此生成滴定曲线(图8)。以确定的中荧光强度的倒数作为抗体浓度的倒数的函数作图，并通过Lineweaver-Burk方法[Lineweaver，H.等(1934)″The determination of enzyme dissociation constants″J.Am.Chem.Soc.56，658]确定KD。作图产生了一条直线，且KD可由曲线的斜率计算出。离解常数KD由以下方程确定：1/F＝1/Fmax+(KD/Fmax)(1/VB6)，其中，F＝扣除背景的中荧光强度，Fmax由图中计算得到(图8)。Fab-de-bouganin的饱和点由饱和曲线确定，并用于使用了亲本抗体的竞争分析。VB6-050的饱和点，250μg/mL，用抗原阳性细胞在其相应亲本lgG范围由0-1000μg/mL增加的条件下进行培育。使用抗bouganin的抗体，通过流式细胞仪检测出了结合的VB6-050。如所期望的，亲本lgG争夺了对Fab-de-bouganin蛋白质的结合。抑制50％的结合的Fab-de-bouganin所需要的lgG的浓度被确定为180μg/mL。 
4)VB6-050蛋白质的细胞毒性 
用浓度范围在1nM到1μM的不同浓度的VB6-050与阴性和阳性抗原细胞系培育。培育后5天，计算出VB6-050的IC50值为400nM(图9)。与之相比的，用抗原阴性细胞系未能确定出IC50。 
结论 
选自Hybridomics和ImmunomineTM平台的VB1-050 IgG被改造成可溶的Fab-de-bouganin融合蛋白质，其含有经弗林蛋白酶(furin)可裂解的连接体而基因连接到VH-CH区的de-bouganin。数据证实了由IgG衍生的Fab-de-bouganin形式适合于可溶的表达，并使得下游过程易于进行。一旦经纯化，流式细胞仪数据显示出VB6形式的谱数据符合亲本lgG， 这说明特异性和选择性得以保留。此外，lgG与VB6融合蛋白质的竞争说明两个片段都结合到相同抗原。计算出的VB6形式的亲和力在微摩尔级范围内，导致IC50≥280nM。 
实施例9：抗原识别
VB1-050Ag的初步表征 
在去糖基化后，VB1-050在结合上显示出58.62％(P-值0.008)的增加。该在去糖基化后观察到的抗原结合的增加表明，多糖部分可能部分地掩盖了细胞表面的抗原位点，而去糖基化可能是识别抗原的关键步骤。 
免疫沉淀 
用N-聚糖酶对等量的分别取自四种阳性细胞系：MCF-7、MDA-MB-435S、A-375、HepG2，和三种阴性细胞系：Panc-1、Daudi、C-33A的细胞膜制剂进行去糖基化，并用40μg的VB1-050和4B5-IgG回转。上述过程均是在模拟体内环境的条件下，以及有蛋白酶抑制剂存在下进行。免疫复合物经离心，并用RIP-A溶解缓冲剂清洗，及用0.2M甘胺酸pH2.5洗脱。 
基于凝胶的分析和西方墨点 
由上述所有细胞系获得的免疫沉淀物暴露于样品制备物的还原的和非还原的条件下，然后进行SDS-PAGE和西方墨点分析。所得墨点用4B5-IgG和VB1-050同时探测，以及相应的第二抗体偶联到HRP上，从而通过化学发光显示出了经免疫沉淀的蛋白质。在所有细胞系的1D-PAGE上，检测出了位于VB1-050的免疫沉淀物的约50kDa的条带，2D-PAGE未产生任何结果。4B5-IgG未检测出任何条带。由于用传统的方法未显示出任何不同表达的抗原，于是探索出另一种用于抗原识别的方法。 
先后使用ProteomeLab TM PF-2D和nano-ESI-MS/MS得到的HTP-抗原ID
HepG2，MCF-7，Panc-1和C-33A的PF2D分级 
由细胞膜制备物获得的预分级的VB1-050免疫沉淀物通过高速离心清除所有的颗粒物质。清澈的上清液用初始(Start)缓冲剂平衡，并在第一维的色层聚焦柱上分级。在pH＝7.4-7.6洗脱的峰值流分用溶剂A(0.1％TFA)以1:4的比率平衡，并在HPRP柱上分级，并用到含有微量TFA的浓度梯度在0-100％范围的乙腈。 
通过在色层聚焦柱上的分级(CF)，HepG2和MCF-7显示出单一的在pH7.4-7.6洗脱出的宽峰含有两个流分(构成#B6和B7)，分别出现在68分钟和65分钟。另外，还在图10A和B中观察到，从HPRP柱洗脱出的HepG2和MCF-7的膜显示出不同的分离谱，且完全依赖于VB1-050反应性抗原的存在。这两个峰在阳性细胞系中显示出有差异的调节，而这在阴性细胞系Panc-1和C-33A的膜(图10A和B)中可忽略或完全不存在。对在阳性细胞系(MCF-7和HepG2)中的蛋白质峰的详细分析表明，从RP-HPLC柱洗脱的峰的保留时间分别为15和18分钟。这些峰在抗原-阴性细胞系(Panc-1和C-33A)中未观察到。相反，在阴性细胞系中观察到了在稍早于12分钟时洗脱出的单峰。 
使用ProteoVueTM/DeltaVueTM软件进行的分级分析 
将由HPRP柱获得的色谱谱图输入到ProteoVueTM文件中，转化成可接受的形式，再用于在DeltaVueTM上进行最后分析。这些分析结果经合并用于来自阳性(HepG2和MCF-7)和阴性(Panc-1和C-33A)细胞系的抗原分级，并用Proteo
Figure S05848522820070823D000781
软件编排处理，以产生各细胞系的完整的膜蛋白图。然后在DeltaVueTM软件上生成有差异地调节的蛋白质的比较谱。两种细胞系的分级的色谱谱图由峰转化为带状图，使得有差异地表达的区域更易于识别。阳性细胞系中的特别是差异表达的峰/带可聚焦以获得更好的分辨率和分析。在各实验中获得的阳性和阴性图的重叠显示出仅在阳性细胞系(HepG2和MCF-7)中可见到蛋白质的过度表达，这些流分被用作肽提取之用。
由峰值流分提取肽 
用测序级胰蛋白酶进行胰蛋白酶消化，通过20小时的肽提取过程，最终获得肽用配备了纳米源且工作流速为20-50nL/min的QSTARPulsar-I(ESI-qTOF-MS/MS)进行分析。将肽离子化，并检测二价、三价或四价的分子，然后对应到它们相应的质量。在条件允许的情况下，也进行被识别的蛋白质的重新测序。从阳性和阴性细胞系中同时提取肽，以确保抗原是正确的。由质谱获取的肽的质量被直接用于识别抗原，所依据的是由蛋白质数据库获得的MOWSE分数。这可通过MASCOT搜索引擎获得。 
在胰蛋白酶消化后由在15-18分钟洗脱出的所有四个样品(MCF-7，HepG2，Panc-1和C-33A)的峰值提取肽，并进行MS分析。除了在15和18分钟洗脱出的流分外，在12分钟从阳性和阴性细胞系洗脱的流分也同时进行处理。图11-14示出了由细胞系获得的肽的TOF-MS扫描结果。如图15所示，从两个阳性细胞系中确认出了一种单一对应于葡萄糖转运体8的蛋白质，而在阴性细胞系中未检测出。两峰(15对18分钟)之间在洗脱上的差别可归咎于糖基化或其它翻译后改性上的变化。 
质谱分析 
以两种方法进行肽的分析： 
·所有回收的和重新构建到它们的正确质量的肽均直接用于肽质量指纹技术分析步骤，以获得蛋白质的ID。 
·高丰度的和很好离子化的肽被进一步进行MS/MS离子碎片化，其中，y’和‘b’离子被用作推导它们的主要结构。然后在蛋白质数据库中检索这些序列的同源物，以获得蛋白质的ID。 
将肽离子化，并在LC-MS/MS系统上检测二价、三价或四价的分子，这不同于在由矩阵辅助的离子化的如MALDI系统上检测单价离子。具有电荷差异的肽随后在质量重建步骤，被归属于它们各自对应的质量。这些肽的质量随后用基于矩阵科学的mascot搜索引擎进行直接分析以获得 抗原ID。由质谱获取的肽的质量被直接用于识别抗原，所依据的是由蛋白质数据库获得的MOWSE分数。这可通过搜索引擎如MASCOT，SEQUEST，和Prospector获得。由于QSTAR-pulsar-I的购买包括了从Pepsea服务器得到大多数近期蛋白质数据库新增内容的许可，且又与MASCOT兼容，因此选用该搜索引擎于所有的蛋白质检索。 
图15，16和表8给出了回收的肽和它们在葡萄糖转运体8中绘制成的序列位置。所有的具代表性的肽均通过重新测序获得。图17确认了葡萄糖转运体8为抗原。 
四个肽的MS/MS片段化(1401.54-466.600000，3+；1070.785448-536.400000，2+；1998.272862-667.098230，3+；1176.185448-589.100000，2+)产生了示于图18-21的碎片离子，绘制成葡萄糖转运体8的肽。由于这些2种肽均在TOF-MS中检测出，除源自质谱指纹法的肽外，这些肽也被用作MS/MS离子片段化。安装在纳米源上的离散纳喷雾头被用于此用途。碰撞能量为48V，气帘气体和CAD气体分别维持在25和6，样品循环1.667分钟(100个循环)以获得稳定的质谱离子片段化。源自谱图的肽与葡萄糖转运体8的序列明显吻合，因此被视作主要的命中。离子片段化的数据进一步确认了葡萄糖转运体8为VB1-050的同源抗原。 
肽的质量指纹和抗原-阳性流分的MS/MS片段化解释了葡萄糖转运体-8/GLUTX1/SLC2A8基因产物是VB1-050的同源结合抗原。葡萄糖转运体-8是约50kDa的二型跨膜蛋白质，在细胞内具有N-末端。在回收的的肽中，获得了34％的序列覆盖率。由流动选择为阳性的细胞系表现出在免疫沉淀后抗原的存在。对两个肽的MS/MS分析为1070.785，表现为二价分子(536.40000，2+)；1401.54，表现为三价分子(466.60000，3+)，分别确认了两个肽序列，SLASVVVGVIQ(292-303)和KTLEQITAHFEGR(466-477)。与对应于葡萄糖转运体-8的蛋白质序列明显吻合。 
由MCF-7回收的另外两个肽的MS/MS测序，1176.3547和1997.9992，与GLUT8的相应的肽具有68.2％的序列同源性，在7个位置，即7，10， 12-15，18发生了氨基酸的改变。该并入的改变对于由Shin等报道的在12，13的位置从LL到AA的改变(2004，J.Neuro.Res.75：835)，这导致GLUT8从细胞溶质到细胞质膜的定向。 
尽管本发明已通过目前被认为是优选的实施例加以了说明，但应当理解本发明并不限于上述揭示的例子。相反，本发明还包括在权利要求所表现的本发明的精神和范围中的各种变化和等同的情况。 
正如各单独的出版公开物、专利和专利申请被具体和单独地完全引用，在此，所有的出版公开物、专利和专利申请均被全文引入作为参考。
表1：CDR序列 
CDR序列 
Figure S05848522820070823D000821
表2：肿瘤和正常细胞与VB1-050的表面活性的比较 
  
临床症状 代表性的癌细胞系 N1 MF2 相对排名
乳腺 MCF-7c，MDA-MB-231d， MDA-MB-435Se 3 29.9 1
黑素瘤 A-375，SK-MEL-5a，b， SK-MEL-28a 3 22.7 2
卵巢 SK-OV-3a，OVCar-3 2 21.7 3
前列腺 DU-145a，b，f，PC-3a，b，g，LNCaP a，b，g 3 19.6 4
肾 Caki-1a，A498a，ACHNa 3 18.4 5
直肠 Sw837，NCI-H630 2 15.2 6
肺 A-549，NCI-H460， NCI-H69 3 14.8 7
[0407]   
肝 SK-HEP-1，Hep-G2 2 14.6 8
结肠 HT-29a，SW480，WiDr 3 13.3 9
子宫颈 HeLa，C-41，C-33A 3 11.8 10
头和颈 SCC-15，SCC-25 2 11.4 11
膀胱 UM-UC-3，T24 2 9.8 12
胃 AGS，NCI-N-87，KATO III 3 9.6 13
胰腺 PANC-1，BxPC-3，MIA PaCa-2 3 7.6 14
子宫内膜 RL-95-2，HEC-1-A 2 7.0 15
正常细胞类型 细胞系     肿瘤：正常
肾 HRE 1 12.5 1.5
肺 NHLF 1 8.7 1.7
内皮 HUVEC 1 5.0 不适用
乳腺 HMEC 1 3.1 9.6
前列腺 PrEC 1 2.1 9.3
1N表示每种症状测试的细胞系的数目。2MF：数值表示各症状中，从所有细胞系获得的由相对于对照抗体的中荧光强度的增加的平均倍数的总值计算出的平均值。0值表示相对于对照抗体，没有可测量的相对反应性。a表示由AntiCancer Inc.提供的常位模型。b可进行GFP(绿色荧光蛋白)-转染的细胞系。cHer2/neu-，ER+.dHer2/neu，ER-，p53wt，raswt. eHer2/neu-，ER-，p53mt，raswt.f雄激素-响应的.g雄激素-不响应的。
表3：VB1-050的福尔马林固定的重要正常组织的LD阵列 
  
组织 膜染色 评分范围1
脑 无(0/6) 0
结肠2 无(0/4) 0
心脏 无(0/5) 0
肾 无(0/3) 0
肝 无(0/5) 0
肺 无(0/4) 0
胰腺 无(0/4) 0
胃3 无(0/4) 0
1评分标准基于0-3+级，0表示没有染色，且微量少于1+，但大于0。分数1+到3+表示染色强度的增加，3+为强的深褐色的染色。通常，6个不同患者的单一样品被筛选。其中，少于6个患者被筛选出的表明分数或者是丢失，或者不是有代表性的被染色的组织。括号中的值表明在评分范围内被染色的细胞的百分比。2仅使用了相邻的正常组织。35个中的4个为相邻的正常组织样品。
表4：VB1-050的HD福尔马林固定的正常TMA 
  
组织 膜染色 评分范围*
肾上腺 无(0/5) 0
大动脉 无(0/5) 0
动脉 无(0/5) 0
前列腺 无(0/5) 0
脑 无(0/5) 0
乳腺 无(0/5) 0
输卵管 无(0/5) 0
淋巴结(LN) 无(0/4) 0
肌肉 无(0/5) 0
卵巢 无(0/5) 0
垂体 无(0/5) 0
胎盘 无(0/5) 0
前列腺 0/5 0
皮肤 0/1  
脊髓 无(0/3) 0
脾 无(0/5) 0
睾丸 1/5 1+(30％)
胸腺 无(0/1) 0
甲状腺 无(0/5) 0
输尿管 0/2 0
子宫 无(0/3) 0
*评分标准基于0-3+级，0表示没有染色，且微量少于1+，但大于0。分数1+到3+表示染色强度的增加，3+为强的深褐色的染色。通常，8个不同患者中的两个样品被筛选。其中，少于8个患者被筛选出的表明分数或者是丢失，或者不是有代表性的被染色的组织。括号中的值表明在评分范围内被染色的细胞的百分比。
表5：VB1-050的HD福尔马林固定的肿瘤TMA 
  
组织 膜染色 评分范围*
膀胱 2/8 2+(50％)
乳腺 1/8 1+(90％)
子宫颈 1/8 1+(30％)
结肠 4/7 1+(70-90％)
肾 1/8 2+(40％)
肝 3/6 1+(80％)
肺 0/6 不适用
卵巢 3/7 1+(20％)
胰腺 2/8 2+(30-80％)
前列腺 4/7 1+(20-60％)
直肠 0/7 不适用
皮肤 0/4 不适用
胃 4/8 2+(30％)
子宫 0/8 不适用
头和颈 2/8 2+(30-50％)
*评分标准基于0-3+级，0表示没有染色，且微量少于1+，但大于0。分数1+到3+表示染色强度的增加，3+为强的深褐色的染色。通常，8个不同患者中的两个样品被筛选。其中，少于8个患者被筛选出的表明分数或者是丢失，或者不是有代表性的被染色的组织。头和颈癌包括咽喉、唇、喉、口、扁桃腺和齿龈表面的癌症。括号中的值表明在评分范围内被染色的细胞的百分比。用粗体表示的癌症症状指示出VB1-050的反应性。
表6：以时间和温度的函数作为抗体结合的流式细胞仪的评核 
1示出了代表性的实验。2MF增加高于阴性对照，小鼠骨髓瘤IgG或人IgG(4B5)。3从肿瘤细胞的细胞表面的MF降低的百分比。4(-)是在冰上培育120分钟的细胞。
表7：VB6-050的生物学表征 
    亲和力  (M)   VB6饱和浓  度(μg/mL) IgG浓度(μg/mL)＊   IC50  (nM)
  VB6-050   5.10-6   250 180   400
ND：未确定。＊抑制50％的VB6结合的IgG的浓度。 
表8：回收的肽 
  观察值   起点   终点   肽   SEQ ID  NO：
  1998.27   3   22   PEDPSETEPAAPRPGASAPR   12
  1151.241   6   15   PSETEPAAPR   13
  3140.68   26   56   RVFLAAFAAALGPLSFGFALGYSSPA  IPSLQRA   14
  2916.29   64   93   RLDDAAASWFGAVVTLGAAAGGVL  GGWLVDRA   15
  889.04   216   223   RQEAMAALRF   16
  2984.32   224   249   RFLWGSEQGWEDPPIGAEQSFHLAL  LRQ   17
  4263.10   427   463 KEFSSLMEVLRPYGAFWLASAFCIF SVLFTLFCVPEIKG   18
  1401.54   466   477   KTLEQITAHFEGR   19
    292   302   SLASVVVGVIQ   20
序列表
<110>维文蒂阿生物技术股份有限公司
<120>癌症特异性抗体和细胞表面蛋白质
<130>10241-64
<140>
<141>
<150>US 60/637,448
<151>2004-12-21
<160>29
<170>专利文本3.3
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>2
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Ala Ala Ser Ser Leu His Ser
1               5
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Leu Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Ile Thr
1               5
<210>4
<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Asn Tyr Ala Met Ser
1               5
<210>5
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Ala Ile Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Val Pro Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Pro Leu Tyr
1               5                   10
<210>7
<211>108
<212>PRT
<213>智人
<400>7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Phe Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Lys Val Pro Thr Gln Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Ile
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>8
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<400>8
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc    60
atcacttgtc gggcgagtca ggacattagt aattatttag cctggtttca gcggaaacca    120
gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcacagtaa ggtcccaaca    180
caattcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgcctacag tatagtactt accctatcac cttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa acga                                           324
<210>9
<211>120
<212>PRT
<213>智人
<400>9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Gly Arg Val Pro Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Pro Leu Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>10
<211>360
<212>DNA
<213>智人
<400>10
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggggggtc gctgagactc     60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagc aactatgcca tgagctgggt ccgccaggct    120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg attactccta gtggtggtag tacaaattat    180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attcccagaa tacactgtat    240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggccgtat attactgtgg gagagtccca    300
tatagaagca cttggtaccc tttatattgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca    360
<210>11
<211>477
<212>PRT
<213>智人
<400>11
Met Thr Pro Glu Asp Pro Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ala Pro Arg Pro
1               5                   10                  15
Gly Ala Ser Ala Pro Arg Gly Arg Arg Val Phe Leu Ala Ala Phe Ala
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Gly Pro Leu Ser Phe Gly Phe Ala Leu Gly Tyr Ser Ser
        35                  40                  45
Pro Ala Ile Pro Ser Leu Gln Arg Ala Ala Pro Pro Ala Pro Arg Leu
    50                  55                  60
Asp Asp Ala Ala Ala Ser Trp Phe Gly Ala Val Val Thr Leu Gly Ala
65                  70                  75                  80
Ala Ala Gly Gly Val Leu Gly Gly Trp Leu Val Asp Arg Ala Gly Arg
                85                  90                  95
Lys Leu Ser Leu Leu Leu Cys Ser Val Pro Phe Val Ala Gly Phe Ala
            100                 105                 110
Val Ile Thr Ala Ala Gln Asp Val Trp Met Leu Leu Gly Gly Arg Leu
        115                 120                 125
Leu Thr Gly Leu Ala Cys Gly Val Ala Ser Leu Val Ala Pro Val Tyr
    130                 135                 140
Ile Ser Glu Ile Ala Tyr Pro Ala Val Arg Gly Leu Leu Gly Ser Cys
145                 150                 155                 160
Val Gln Leu Met Val Val Val Gly Ile Leu Leu Ala Tyr Leu Ala Gly
                165                 170                 175
Trp Val Leu Glu Trp Arg Trp Leu Ala Val Leu Gly Cys Val Pro Pro
            180                 185                 190
Ser Leu Met Leu Leu Leu Met Cys Phe Met Pro Glu Thr Pro Arg Phe
        195                 200                 205
Leu Leu Thr Gln His Arg Arg Gln Glu Ala Met Ala Ala Leu Arg Phe
    210                 215                 220
Leu Trp Gly Ser Glu Gln Gly Trp Glu Asp Pro Pro Ile Gly Ala Glu
225                 230                 235                 240
Gln Ser Phe His Leu Ala Leu Leu Arg Gln Pro Gly Ile Tyr Lys Pro
                245                 250                 255
Phe Ile Ile Gly Val Ser Leu Met Ala Phe Gln Gln Leu Ser Gly Val
            260                 265                 270
Asn Ala Val Met Phe Tyr Ala Glu Thr Ile Phe Glu Glu Ala Lys Phe
        275                 280                 285
Lys Asp Ser Ser Leu Ala Ser Val Val Val Gly Val Ile Gln Val Leu
    290                 295                 300
Phe Thr Ala Val Ala Ala Leu Ile Met Asp Arg Ala Gly Arg Arg Leu
305                 310                 315                 320
Leu Leu Val Leu Ser Gly Val Val Met Val Phe Ser Thr Ser Ala Phe
                325                 330                 335
Gly Ala Tyr Phe Lys Leu Thr Gln Gly Gly Pro Gly Asn Ser Ser His
            340                 345                 350
Val Ala Ile Ser Ala Pro Val Ser Ala Gln Pro Val Asp Ala Ser Val
        355                 360                 365
Gly Leu Ala Trp Leu Ala Val Gly Asn Met Cys Leu Phe Ile Ala Gly
    370                 375                 380
Phe Ala Val Gly Trp Gly Pro Ile Pro Trp Leu Leu Met Ser Glu Ile
385                 390                 395                 400
Phe Pro Leu His Val Lys Gly Val Ala Thr Gly Ile Cys Val Leu Thr
                405                 410                 415
Asn Trp Leu Met Ala Phe Leu Val Thr Lys Glu Phe Ser Ser Leu Met
            420                 425                 430
Glu Val Leu Arg Pro Tyr Gly Ala Phe Trp Leu Ala Ser Ala Phe Cys
        435                 440                 445
Ile Phe Ser Val Leu Phe Thr Leu Phe Cys Val Pro Glu Ile Lys Gly
    450                 455                 460
Lys Thr Leu Glu Gln Ile Thr Ala His Phe Glu Gly Arg
465                 470                 475
<210>12
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>12
Pro Glu Asp Pro Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ala Pro Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Ala Pro Arg
            20
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>13
Pro Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ala Pro Arg
1               5                   10
<210>14
<211>33
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Arg Val Phe Leu Ala Ala Phe Ala Ala Ala Leu Gly Pro Leu Ser Phe
1               5                   10                  15
Gly Phe Ala Leu Gly Tyr Ser Ser Pro Ala Ile Pro Ser Leu Gln Arg
            20                  25                  30
Ala
<210>15
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<400>15
Arg Leu Asp Asp Ala Ala Ala Ser Trp Phe Gly Ala Val Val Thr Leu
1               5                   10                  15
Gly Ala Ala Ala Gly Gly Val Leu Gly Gly Trp Leu Val Asp Arg Ala
            20                  25                  30
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>16
Arg Gln Glu Ala Met Ala Ala Leu Arg Phe
1               5                   10
<210>17
<211>28
<212>PRT
<213>智人
<400>17
Arg Phe Leu Trp Gly Ser Glu Gln Gly Trp Glu Asp Pro Pro Ile Gly
1               5                   10                  15
Ala Glu Gln Ser Phe His Leu Ala Leu Leu Arg Gln
            20                  25
<210>18
<211>39
<212>PRT
<213>智人
<400>18
Lys Glu Phe Ser Ser Leu Met Glu Val Leu Arg Pro Tyr Gly Ala Phe
1               5                   10                  15
Trp Leu Ala Ser Ala Phe Cys Ile Phe Ser Val Leu Phe Thr Leu Phe
            20                  25                  30
Cys Val Pro Glu Ile Lys Gly
        35
<210>19
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>19
Lys Thr Leu Glu Gln Ile Thr Ala His Phe Glu Gly Arg
1               5                   10
<210>20
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>20
Ser Leu Ala Ser Val Val Val Gly Val Ile Gln
1               5                   10
<210>21
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>γ引物
<400>21
tctaaagaag cccctgggag cacagctcat caccatg                                      37
<210>22
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>γ引物
<400>22
gcccggggag cgggggcttg ccggccgtcg cactca                                       36
<210>23
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>γ引物
<400>23
accatgagtg agaaaaactg gatttgtgtg gca                                          33
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>γ引物
<400>24
ggagccggtg accagggttc cctggcccca                                      30
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>γ引物
<400>25
ctcaccatgg agtttgggct gagctgggtt                                      30
<210>26
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>γ引物
<400>26
ggaggctgag gagacggtga ccagggttcc ctggcc                               36
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>K引物
<400>27
ggctcgagat ggacatgrrr dycchvgykc asctt                                      35
<210>28
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>K引物
<400>28
cccgtcgacc atcagatggc gggaagat                                              28
<210>29
<211>250
<212>PRT
<213>智人
<400>29
Tyr Asn Thr Val Ser Phe Asn Leu Gly Glu Ala Tyr Glu Tyr Pro Thr
1               5                   10                  15
Phe Ile Gln Asp Leu Arg Asn Glu Leu Ala Lys Gly Thr Pro Val Cys
            20                  25                  30
Gln Leu Pro Val Thr Leu Gln Thr Ile Ala Asp Asp Lys Arg Phe Val
        35                  40                  45
Leu Val Asp Ile Thr Thr Thr Ser Lys Lys Thr Val Lys Val Ala Ile
    50                  55                  60
Asp Val Thr Asp Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly
65                  70                  75                  80
Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser
                85                  90                  95
Lys Leu Phe Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly
            100                 105                 110
Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Ala Asp Arg Lys Ala Leu
        115                 120                 125
Glu Leu Gly Val Asn Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly
    130                 135                 140
Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ala Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile
145                 150                 155                 160
Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Thr Glu Val
                165                 170                 175
Val Asp Arg Gly Leu Tyr Gly Ser Phe Lys Pro Asn Phe Lys Val Leu
            180                 185                 190
Asn Leu Glu Asn Asn Trp Gly Asp Ile Ser Asp Ala Ile His Lys Ser
        195                 200                 205
Ser Pro Gln Cys Thr Thr Ile Asn Pro Ala Leu Gln Leu Ile Ser Pro
    210                 215                 220
Ser Asn Asp Pro Trp Val Val Asn Lys Val Ser Gln Ile Ser Pro Asp
225                 230                 235                 240
Met Gly Ile Leu Lys Phe Lys Ser Ser Lys
                245                 250

Claims (49)

1.与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体，其由SEQ ID NOS:11的氨基酸序列组成。
2.一种分离的核酸序列，其编码权利要求1的与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体。
3.一种重组表达载体，包含权利要求2的核酸序列。
4.一种宿主细胞，其包含权利要求3的重组表达载体。
5.一种鉴定能够结合到癌细胞上的抗原上的结合蛋白的方法，其中所述方法是竞争性结合分析，其包括：
用最小浓度的结合蛋白Ab1与固定数量的癌细胞一起温培，所述结合蛋白包含如SEQ ID NOs:1-6所示的互补决定区或包含如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区和如SEQ IDNO:9所示的重链可变区，所述结合蛋白对固定数量的癌细胞产生最大结合，并测量Ab1的中荧光强度MFAb1；
通过向Ab1和癌细胞中加入结合蛋白Ab2，测试试验的结合蛋白Ab2两个或更多浓度，并测量中荧光强度MF(Ab1+Ab2)；
测量背景中荧光强度MFBgd；
计算PI，其中
PI=[(MF(Ab1+Ab2)-MFBgd)/(MFAb1-MFBgd)]x100；以及
将PI与对照物的PI值进行比较；
其中，与对照物的PI在统计学上有显著不同的PI表明试验的结合蛋白能够结合到与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体，所述与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
6.一种免疫偶联物，包含(1)结合到与癌症相关的变异体上的包含SEQ ID NO:1-6的互补决定区CDR或SEQ ID NO:7和9的可变区的结合蛋白，所述与癌症相关的变异体由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成，和(2)一种癌症治疗剂，所述结合蛋白附于该癌症治疗剂上，该癌症治疗试剂是毒害细胞的、抑制细胞生长的，或者是阻止或降低癌症细胞分裂的和/或转移的能力。
7.权利要求6的免疫偶联物，其中，癌症治疗剂是细胞毒素。
8.权利要求7的免疫偶联物，其中，细胞毒素是核糖体-失活的多肽。
9.根据权利要求7的免疫偶联物，其中，细胞毒素选自由多花白树素、bouganin、皂草毒素、篦麻毒素、篦麻毒素A链、异株泻根毒素、白喉毒素、局限曲菌素、或假单细胞菌外毒素A组成的组。
10.权利要求7的免疫偶联物，其中，毒素是改性的bouganin。
11.权利要求7的免疫偶联物，其中，毒素是包含氨基酸252-608的假单细胞菌外毒素A的截去形式。
12.一种用于治疗或预防癌症的组合物，包含根据权利要求6-11中任何一项的免疫偶联物，和药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂或稳定剂。
13.根据权利要求6-11中任何一项的有效量的免疫偶联物在制造治疗或预防癌症的药物中的应用。
14.根据权利要求13的应用，其中所述药物还包含一种或多种其它癌症治疗剂以用于同时、分开或连续地治疗或预防癌症。
15.一种治疗或预防癌症的试剂盒，包含权利要求6-11中任何一项的有效量的免疫偶联物，以及使用其治疗或预防癌症的指导说明。
16.包含SEQ ID NO:1-6的互补决定区CDR或SEQ ID NO:7和9的可变区的结合蛋白在制造检测或监控受测试者中的癌症的药物中的应用，其中所述结合蛋白结合到癌细胞上与癌症相关的变异体，所述与癌症相关的变异体由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
17.一种诊断癌症的试剂盒，包含结合到癌细胞上与癌症相关的变异体的结合蛋白，所述结合蛋白包含SEQ ID NO:1-6的互补决定区CDR或SEQ ID NO:7和9的可变区，所述与癌症相关的变异体由SEQ IDNO:11的氨基酸序列组成，以及其使用指导说明。
18.一种诊断试剂，包含(1)结合到癌细胞上与癌症相关的变异体上的结合蛋白，所述结合蛋白包含SEQ ID NO:1-6的互补决定区CDR或SEQ ID NO:7和9的可变区，所述与癌症相关的变异体由SEQ IDNO:11的氨基酸序列组成，和（2）可直接或间接地生成可检测的信号的标记物，所述结合蛋白附于该标记物上。
19.一种用于诊断癌症的试剂盒，包含权利要求18的诊断试剂以及其使用指导说明。
20.一种药物组合物，包含有效量的与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体与适合的稀释剂或载体的混合物，所述与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
21.权利要求20的药物组合物，进一步包含佐药。
22.一种药物组合物，包含有效量的权利要求2的分离的核酸序列与适合的稀释剂或载体的混合物。
23.权利要求22的药物组合物，进一步包含佐药。
24.一种药物组合物，包含有效量的权利要求3的重组表达载体与适合的稀释剂或载体的混合物。
25.权利要求24的药物组合物，进一步包含佐药。
26.权利要求1的与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体在制造治疗或预防癌症的药物中的应用。
27.根据权利要求1的与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体在制造诱发受测试者的免疫应答的药物中的应用。
28.根据权利要求2的分离的核酸序列在制造治疗或预防癌症的药物中的应用。
29.根据权利要求2的分离的核酸序列在制造诱发受测试者的免疫应答的药物中的应用。
30.权利要求3的重组表达载体在制造治疗或预防癌症的药物中的应用。
31.权利要求3的重组表达载体在制造诱发受测试者的免疫应答的药物中的应用。
32.有效量的与癌症相关的变异体在制造治疗或预防患有或疑似患有癌症的受测试者中的癌症的药物中的应用，所述与癌症相关的变异体由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
33.有效量的与癌症相关的变异体在制造诱发受测试者针对所述与癌症相关的变异体的免疫应答的药物中的应用，所述与癌症相关的变异体由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
34.有效量的权利要求2的分离的核酸序列在制造诱发受测试者针对蛋白质的免疫应答的药物中的应用，所述蛋白质由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
35.有效量的权利要求3的重组表达载体在制造诱发受测试者针对蛋白质的免疫应答的药物中的应用，所述蛋白质由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
36.一种用于治疗或预防癌症的试剂盒，包含权利要求20-25中任何一项的药物组合物及其使用指导说明。
37.能够用于降低与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体作为糖的转运体的功能的试剂在制造治疗或预防受测试者中的癌症的药物中的应用，其中所述试剂是结合蛋白或葡萄糖转运体抑制剂，所述结合蛋白包含SEQ ID NO:1-6的互补决定区CDR或SEQ ID NO:7和9的可变区，所述结合蛋白结合由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体。
38.一种识别具有预防或治疗癌症的能力的化合物的方法，其包括以下步骤:
将表达与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体的细胞与测试化合物接触，所述与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成；以及
测定与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体作为葡萄糖转运体的表达或功能，所述与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成；
将与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体的表达或功能与对照物比较，其中与对照物相比，当与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体的表达或功能降低，则表明化合物可用于预防或治疗癌症，其中与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。
39.包含SEQ ID NO:1-6的互补决定区CDR或SEQ ID NO:7和9的可变区的结合蛋白在制造靶向细胞表面上的葡萄糖转运体8的药物中的应用。
40.权利要求39所述的应用，其中所述结合蛋白是抗体或抗体片段。
41.权利要求40所述的应用，其中，抗体片段是微型抗体或双抗体。
42.权利要求40所述的应用，其中，抗体片段是双特异性抗体片段。
43.权利要求40所述的应用，其中，抗体片段是二聚体。
44.权利要求40所述的应用，其中，抗体片段是Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dsFv。
45.权利要求40所述的应用，其中，抗体片段是ds-scFv。
46.权利要求39-45任一项的应用，其中所述葡萄糖转运体8由SEQID NO:11的氨基酸序列组成。
47.权利要求39-45任一项的应用，其中所述结合蛋白结合到与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体，所述与癌症相关的葡萄糖转运体8的变异体在N-端的二-亮氨酸部分发生改性。
48.根据权利要求47的应用，其中，在N-端的二-亮氨酸部分的改性是由二-亮氨酸改性为二-丙氨酸。
49.权利要求39-45任一项所述的应用，其中亲和力成熟被用于提高所述结合蛋白对葡萄糖转运体8或者对由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成的蛋白质的亲和力。
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