CN101157931A - 产甘油假丝酵母nad+依赖－甘油3－磷酸脱氢酶基因及其克隆 - Google Patents

Abstract

产甘油假丝酵母NAD⁺依赖－甘油3－磷酸脱氢酶基因及其克隆，属于微生物分子生物学领域。本发明涉及一种新的基因序列SEQID NO.1，采用简并引物PCR和反向PCR法从产甘油假丝酵母WL2002－5－59的基因组DNA中克隆出甘油合成的限速酶NAD⁺依赖－甘油3－磷酸脱氢酶基因及其侧翼的调控序列。该基因全长4900bp，在2082bp处具有起始密码子ATG，3246bp处具有终止密码子TAA。该序列无内含子，具有1167bp完整的开放阅读框，编码388个氨基酸。其与酿酒酵母GPD1基因同源性高达60％，与安格斯毕赤酵母GPD基因同源性高达70％。该基因的克隆扩大了微生物抗渗透压胁迫研究的基因资源，也为产甘油假丝酵母高产甘油的分子机理研究奠定了基础。

Description

产甘油假丝酵母NAD+依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因及其克隆

技术领域

产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因及其克隆，涉及微生物学，基因工程和分子生物学等领域，特别涉及一种耐高渗产甘油假丝酵母中甘油合成途径的关键酶编码基因NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因及其克隆。

背景技术

当细胞处于高渗透压环境中时，为了保持胞内的水分和小分子物质向环境中外泄，就需要通过自身合成一些生物相容性物质来提高胞内的渗透压来平衡胞内和胞外的压力差，从而起到保护和防御细胞的作用。对于酵母细胞而言，在渗透压胁迫作用时产生的生物相容性物质主要是甘油，还有少量的其他多元醇。NAD⁺依赖性3-磷酸甘油脱氢酶是酿酒酵母细胞以葡萄糖为碳源合成甘油过程的限速酶，编码该酶的基因存在两个异构形式：GPD1和GPD2，前者受渗透压诱导表达，而后者在厌氧环境中起着平衡氧化还原力的作用。GPD1基因的表达水平是受到促有丝分裂源蛋白激酶(MAPK)介导的高渗压甘油应答途径(HOG)调控的。但是对于没有经过人工诱变或分子改造的酿酒酵母，其甘油合成能力有限，通常为每升发酵液中含有几克到十几克甘油。

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5-59，是从自然界中分离出来的一种优良的能够耐高渗压的甘油生产菌株，它能在25％葡萄糖或5％NaCl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，在实验室规模发酵中，甘油产量可达到12％，即使在工业化规模中，甘油产量也可达到10％，这是用酿酒酵母甘油代谢理论难以解释的。目前，该酵母已经应用于甘油发酵的工业化生产，然而与酿酒酵母相比，其相关的分子知识和遗传背景非常缺乏。该产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5-59已在中国专利CN1070235C中公开，公告日2001年8月29日。

产甘油假丝酵母(C.glycerinogenes)WL2002-5-59甘油合成的关键酶基因NAD⁺-甘油3-磷酸脱氢酶基因克隆有以下几点重要作用：

1、为从分子水平上深入研究Candida glycerinogenes高产甘油的代谢机制奠定了基础。

2、为试图通过分子改造进一步提高Candida glycerinogenes的发酵特性提供了可能性。

3、为研究不同酵母属种的高渗压信号转导途径之间的差异提供了材料。

4、为微生物和真核生物的抗逆性改良研究特别是抗高渗透压研究提供了更加丰富的优良候选基因。

发明内容

甘油3-磷酸脱氢酶是假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5-59高产甘油中的限速酶，本发明的目的在于提供一种新的产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶基因及其编码序列。

在本发明中，术语“甘油3-磷酸脱氢酶”、“胞浆NAD⁺-依赖的甘油3-磷酸脱氢酶”、“3-磷酸甘油脱氢酶”或/和“GPD”可互换使用，都指具有产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶氨基酸序列(SEQ ID NO.2)蛋白或多肽。

甘油3-磷酸脱氢酶脱氢酶催化的反应如下：

sn-Glycerol 3-phosphate+NAD⁺→Glycerol 3-phosphate+NADH

一方面，本发明提供一种包含编码甘油3-磷酸脱氢酶基因的DNA片段。

更具体的说，本发明提供包含调控序列，如启动子和终止子，以及甘油3-磷酸脱氢酶基因的开放阅读框的DNA分子。

本发明提供编码Candida glycerinogenes WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢酶基因的DNA片段。所述DNA是指含有侧翼5′-和3′-非翻译区中的短片段之间的开放阅读框的DNA或包含有调控序列如在Candida glycerinogenesWL2002-5-59表达甘油3-磷酸脱氢酶基因所必需的启动子和终止子的基因组DNA。

相应地，本发明涉及含有选自下述组的核酸分子的多核苷酸：

a)编码SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

b)与编码含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，

d)与a)中经过一个或多个碱基的取代、缺失或添加的有义突变。

在本发明的另一方面，提供了一种编码的多肽，所述多肽具有与SEQ IDNO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。更佳的，所述多肽是含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽。

本发明的技术方案：

一种产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5-59中分离的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

如上所述的多核苷酸的2082bp-3249bp的核苷酸序列，编码基因产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

其2082bp-3249bp的核苷酸序列，经过一个或多个碱基的取代、缺失、置换、倒位或添加的有义突变。

所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中自起始密码子ATG上游向前的1-2081bp核苷酸序列。

所述产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因的克隆：

(1)简并引物PCR扩增产甘油假丝酵母WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢酶基因片段：

以GeneBank公布的其他物种的甘油3-磷酸脱氢酶的基因序列为基础，通过序列比对分析，设计简并引物

CD-U：5′-TBRTBGGITCHGGYAAITGGG-3′，

CD-R：5′-RGCVAIVAYRTTYTTYARIGC-3′；

通过PCR技术，以WL2002-5-59基因组DNA为模板，以CD-U，CD-R为引物扩增获得0.63kb的核苷酸片段，经过TA克隆，测序；

(2)反向引物PCR扩增WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢酶基因的全长序列：

根据简并引物PCR获得的DNA序列结果，设计一对反向引物

CgI-F：5′-CCTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTG-3′，

CgI-R：5′-CGCCTTCAATCAATTCTTCATAGAC-3′；

提取WL2002-5-59基因组DNA，分别用BamH I、Pst I、Sal I酶切后用酚、氯仿纯化，再用T₄DNA连接酶进行自身连接环化，用乙醇沉淀后作模板进行PCR扩增分别获得6.7kb、2.5kb、2.3kb的DNA片段，经TA克隆挑选阳性转化子，序列测定拼接后获得全长的产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶编码基因及其侧翼调控序列。

本发明的有益效果：本发明采用简并引物PCR和反向PCR法从产甘油假丝酵母WL2002-5-59的染色体基因组中克隆出甘油合成的限速酶基因：产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因(CgGPD)及其侧翼的调控序列。该基因全长4900bp，在2082bp处具有起始密码子ATG，3246bp处具有终止密码子TAA。该序列无内含子，具有1167bp完整的开放阅读框，编码388个氨基酸。所述基因的氨基酸序列与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因GPD1同源性高达60％，与安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)基因GPD同源性高达70％。该基因的克隆扩大了微生物抗渗透压胁迫研究的基因资源，也为产甘油假丝酵母高产甘油的分子机理研究奠定了基础。CgGPD基因的克隆为运用基因工程技术改善微生物及其它高等真核生物的抗逆性改良研究提供了更加丰富的优良候选基因。

附图说明

图1、简并引物PCR扩增甘油3-磷酸脱氢酶基因0.63kb片段。

Lane 1 DNA Marker：DL2000；Lane 2 and Lane 3简并引物PCR产物。

图2、反向PCR扩增甘油3-磷酸脱氢酶基因及其侧翼序列。

Lane 1，DNA Marker：λDNA/HindIII；

Lane 2，以BamH I酶切基因组DNA的反向PCR产物；

Lane 3，以Pst I酶切基因组DNA的反向PCR产物；

Lane 4，以Sal I酶切基因组DNA的反向PCR产物；

Lane 5，DNA Marker：DL2000。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明。

实施例1：简并引物PCR扩增Candida glycerinogenes WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢酶基因片段

1.简并引物的设计

搜索GeneBank公布的相关酵母和其他真核生物的甘油3-磷酸脱氢酶基因的序列，通过氨基酸序列的比对分析，找到两个保守区域对应的氨基酸序列为VVGSGNWGT和GALKNVVA，根据这两个保守区域设计一对简并引物

CD-U：5′-TBRTBGGITCHGGYAAITGGG-3′，

CD-R：5′-RGCVAIVAYRTTYTTYARIGC-3′。

其中I指次黄嘌呤碱基；R指A或G；Y指C或T；H指A、C或T；V指A、C或G；B指C、G或T。

2.Candida glycerinogenes WL2002-5-59基因组DNA的提取

产甘油假丝酵母WL2002-5-59染色体DNA制备按参考文献[酵母遗传学技术手册]进行。将提取的DNA用DU640核酸蛋白分析仪进行测定，根据A₂₆₀/A₂₈₀的比值判断所提取的DNA纯度，利用260nm下的OD值计算所提取的DNA浓度，同时，通过琼脂糖凝胶电泳判定模板的质量。

3、PCR扩增

反应体系50ML，包含5μL 10×Hot Start Taq^TM Buffer(Mg²⁺plus，大连宝生物公司)，4μL 2.5mM DNTPs，1μL 1.00mM简并引物CD-U和CD-R，1μL C.glycerinogenes WL2002-5-59基因组DNA作为模板，加入1.25 U Hot StartTaq^TM(大连宝生物公司)，最后用水补足体积50μL。PCR扩增条件：95℃变性4分钟，随后94℃  50秒、56℃  90s、72℃  2分钟进行32个循环，最后以72℃延伸15钟。电泳检测PCR产物，获得片段长度约为0.63kb的核酸分子，胶回收后按pGEM-T-Easy(Promega)试剂盒操作说明进行TA克隆，测序结果获得一个631bp的序列。

将该序列及其编码蛋白质序列用Blast程序在GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与安格斯毕赤酵母的甘油3-磷酸脱氢酶基因有较高的同源性，证实了简并引物的正确性。

实施例2：反向引物PCR扩增甘油3-磷酸脱氢酶基因的全长序列

1、反向PCR引物的设计

根据简并引物PCR扩增获得的序列结果，设计一对反向PCR引物

CgI-F：5′-CCTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTG-3′

CgI-R：5′-CGCCTTCAATCAATTCTTCATAGAC-3′用于PCR扩增。

2、PCR模板的制备

按上述方法提取C.glycerinogenes WL2002-5-59的基因组DNA，分别用限制酶BamH I，Pst I和Sal I各酶切5μg基因组DNA，琼脂糖电泳检查酶切效果。用1∶1的酚和氯仿等体积抽提酶切产物，然后用2.5倍体积的无水乙醇沉淀，最后溶于50μL超纯水中。在200μL连接体系中，加入0.1μg酶切后的DNA，20μL的连接缓冲液和10 U T₄ DNA连接酶，用水补足体积，16℃过夜。连接产物用无水乙醇沉淀后，溶于25μL无菌超纯水中，用于下一步反向PCR扩增。

3、反向PCR扩增

反向PCR扩增体系50μL：50ng自环化的基因组DNA作为模板，5μL10×LA TaqTM Buffer(大连宝生物公司)，8μL 2.5mM的DNTPs，上下游引物各1μL和1.25U LATaq^TM(大连宝生物公司)，用无菌水补足体积50μL。PCR扩增条件如下：95℃变性4分钟，随后94℃  50秒、60℃  3分钟、  68℃  3.5分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测扩增产物，用BamHI酶切后自环化的基因组DNA作为模板获得6.7kb的DNA片段，用Pst I酶切后自环化的基因组DNA作为模板获得2.5kb的DNA片段，用Sal I酶切后自环化的基因组DNA作为模板获得2.3kb的DNA片段，分别胶回收6.7kb、2.5kb和2.3kb后，按pGEM-T-Easy(Promega)试剂盒操作说明进行TA克隆，通过蓝白鉴定挑取阳性克隆测序。测序结果经拼接后获得全长的C.glycerinogenes甘油3-磷酸脱氢酶基因序列和侧翼序列。

实施例3：C.glycerinogenes甘油3-磷酸脱氢酶基因序列信息和同源性分析

本发明产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶基因的核苷酸序列全长4900bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放阅读框于2082-3246位核苷酸，编码388个氨基酸，并且内部编码框内不含有内含子。

将产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶基因序列及其编码蛋白用BSLAT程序在Non-redundant GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GeneBank cdstranslations+PDB+SwissProt+PIR数据库进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现在氨基酸水平上，它与安格斯毕赤酵母的甘油3-磷酸脱氢酶基因有70％的同源性，与酿酒酵母的甘油3-磷酸脱氢酶基因有60％的同源性。由此可见，产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶基因与其它酵母的甘油3-磷酸脱氢酶基因在蛋白质水平上存在较高的同源性，属于同一家族蛋白。

实施例4：产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶蛋白的结构和功能

将产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶蛋白的氨基酸在blocks数据库(http:/www.blocks.fhcrc.org)中检索结构域，发现在该氨基酸序列中存在甘油3-磷酸脱氢酶蛋白功能模块，因此可以预见其具有甘油3-磷酸脱氢酶蛋白的相应功能。用在线预测软件(http:/www.psort.nibb.ac.jp)进行蛋白的亚细胞定位分析发现，产甘油假丝酵母甘油3-磷酸脱氢酶蛋白是位于细胞的胞浆中，这进一步验证了所克隆的基因是属于胞浆NAD⁺-依赖的甘油3-磷酸脱氢酶。

                            序列表

SEQ ID NO.1

ctgcagagtc tctacgtttt tgcatcagag gaagatttga aaaaaaaaaa aaaatttttg 60

atttaaaaaa ccactacagt tttccccttc tgctaacaac tacacacaca gccgactaac 120

caacaatgcc gtcgaaaaac agtatcaaca agcccaaggg gaatattacc cgtcaaagaa 180

agtcccatct ggcaagcaag aagcgtgcgc aacgggcacg ccaggcagtt acgagtgtga 240

cacaggccac aggaagtagt gcacttgttc ccctaagcgc cagtggggga gttgttgtga 300

acactgtact ctccaacaag aaggccagga agttagagag aaacctcaaa tatgcgcagc 360

ttagacgtga aggatctgtt ggaaagggga agcgtgtaga cgttgaaatg agtggtgaag 420

agattgcgca agcgaaggat aaggagaatg tctacagaaa ggcgctctgg agtgtcgttg 480

agaggagcag agtgcagggt attccgatta tgacgccggt tggccaggga actacccttg 540

gtggtgggtc attctaagag gtgatttggc aaggatatgc cgatggacgt caagctacca 600

ggtgaagtgt aagaaggtaa tgacttctcg gatcactgta gagagggtcc gttgatgtca 660

agggaaaggc acagtgagtg tgagtgagtg tgtgtcatga gcataccatt tccttgacag 720

aaatgaaggg gggatggtgt aacccagtaa aaaaaaatat tattgtatac tcttttctat 780

tagaaaatta agaaactttg tgtttccgcc aagacggcag tggtgccagt gatgacattt 840

gatggttatc actattatta ccaatactat cgtcgttact attgctattg tcattggcat 900

caccattatt acagagaccg aatctatggt gatcatcacc acctgtcagt gacgagccac 960

ttcgccataa ggagaggctg tagatttgtc cttacgcatt cttcatctac gaaataaagt 1020

gccgcggtta cgcagcacac acgaacaatc acgtgcagtg tctttttctt tttttttttt 1080

cttttttttc ctctttttct tttgttttgt ttcgtttctt ttccgccagt tcccgttttc 1140

catttccgga acaacaatag gactccactg ttttctttcc ccccttccct tttcggctcg 1200

cagtctgtac atgcacgttt atccgacacc tgtcttgttt ggcgcgtaat taatacagtt 1260

tctccggagt ccaggtctcg gacgggtaat ttacacgtca tcattcattt ctgtgtcaag 1320

agaggtagcg caaaaagtag aaatggtgaa ccacgggaat gacttgctgg aaatcgacgc 1380

cagagtccat ttgaaaacct acctctacaa gagaggaaac acactacagg gtgtccctgg 1440

tccgtaaaat ggcgtaatat gatgacttcc ctctatagac gttgtatttc cagctccaac 1500

atggttaaac tattgctctg gtgatggtat tacaaatagt aaaagaagga aggggggggg 1560

tggcaatctc accctaacag ttactaagaa cgtctacttc atctactgcc aatatacatt 1620

ggccacatgc cgagaaatta cgtcgacgcc aaagaagggc ccagccgaaa aaagaaatgg 1680

aaaacttggc cgaaaaggga aacaaacaaa aaggtgatgt aaaattagcg gaaaggggaa 1740

ttggcaaatt gagggagaaa aaaaaaaagg caaaaaaagg aggcggaaag tcagtacgtt 1800

ttgaaggcgt cattggtttt cccttttgca gagtgtttca tttcttttgt ttcatgacgt 1860

agtggcgttt cttttcctgc actttagaaa tctatctttt ccttatcaag taacaagcgg 1920

ttggcaaagg tgtatataaa tcaaggaatt cccactttga accctttgaa ttttgatatc 1980

gtttatttta aatttatttt atgtttctaa tctcaaagag tttacacttt acaaggagtt 2040

tctcaaatac tatcaagaca ttgaatagat caaacattaa aatggtgtcc cctgctgaaa 2100

gattatctac tattgcgtcc acaatcaagc caaacagaaa agattccaca tcattacaac 2160

cagaagacta tccggaacat ccgttcaagg tgacggttgt tggttccggt aactgggggt 2220

gtacaattgc caaggttata gcggaaaaca ccgttgagag acctcgtcaa tttcaaagag 2280

atgttaatat gtgggtctat gaagaattga ttgaaggcga aaagttgact gaaatcataa 2340

ataccagaca cgaaaacgtc aagtacttgc caggtatcaa gttgccagtt aacgttgttg 2400

cagttccaga cattgttgag gcttgtgcag gctcagactt gattgtcttt aatattcctc 2460

accaattttt accaagaatt ttgtcccaat taaagggtaa ggtgaatcca aaggctagag 2520

caatttcttg tttgaaaggt ttggatgtca atcctaatgg atgtaagttg ctcttcactg 2580

ttattactga agagttgggt atttattgtg gtgccttatc aggtgctaat ttagctcctg 2640

aagttgcaca atgtaaatgg tcggaaacaa ctgttgcata tacaattccg gacgatttca 2700

gaggtaaagg caaggatatt gaccatcaaa ttctaaagag tttgttccat agaccttatt 2760

tccgtgttcg tgttattagt gatgttgcag gtatttccat tgccggtgca ctcaagaatg 2820

tcgttgctat ggctgctgga tttgtcgaag gtttaggttg gggtgataat gcaaaggctg 2880

cagtcatgag aataggtttg gtggaaacca ttcaatttgc caagactttt ttcgatggct 2940

gtcatgctgc aacctttact catgaatctg caggtgttgc cgacctaatt actacctgtg 3000

ccggcggccg taacgttaga gttggtagat atatggcaca acattctgtc tctgcaacgg 3060

aggctgaaga aaagttgttg aatggccaat cctgtcaagg tatccacaca actagggaag 3120

tttacgagtt cctctccaac atgggcagga cagatgagtt cccactattt accaccacct 3180

accgtatcat ctacgaaaac ttcccaattg agaagctgcc agaatgcctt gaacctgtgg 3240

aagattaaat aacctcaagg agaactttgg cattgtactc tccattgacg agtccgccaa 3300

cccattcttg ttaaacctaa ccttgcatta tcacattccc tttgaccccc tttagctgca 3360

tttccacttg tctacattaa gattcattac acattctttt tcgtatttct cttacctccc 3420

tcccccctcc atggatctta tatataaatc ttttctataa caataatatc tactagagtt 3480

aaacaacaat tccacttgac atggctgtct cagcaaatct gcttctacct actgcacggg 3540

tttgcatgtc attgtttcta gcagggaatc gtccatgtat gttgtcctcc atgatggtct 3600

tcccgctgcc actttcttta gtatcttaaa tagagcagat cttacgtcca ctgtgcatcc 3660

gtgcaccccg aaaatcgtat ggttttcctt gccacctctc acaattttga atatgctcaa 3720

cgcgaaagag atgggaagag gaatcgcatt cgtagagtgg ctacattcaa ccctgacaaa 3780

ggaactagcg tttgtgcagg agagagtggt ttgcatagat ttcttttcct ttgcaagcat 3840

attatataga gtagccaata cagtcacagc tacagcacaa aaaagagaac gagaacgaga 3900

acgagaacga gaacaagaac aagaactagc actactgtca ctgccagcat caacatcact 3960

actattattc caacatgttt gcaactagaa atataaccat tggtgtcaga acactcagac 4020

caaccagttt cttgaaaaca aggtcttttc tgcaacagag gctacaatca acgctaaaga 4080

agagctatga accaaccaaa tccgagcttg acattgcaag caagatgtcc tgggaacagt 4140

ttctaaccat gagaaagcaa cagagaagat tgggaggcat tgggtccatt gcagcagcaa 4200

ttttggcaat gggcgcctcc ttctcgtatt tctcacagat tgaaatcgat cctactgaga 4260

ccttgtttgg tctagatata ttcaccgttt atattggtgc aatattgtgt accgggtttg 4320

ttggcttcat gcttggtccg gcagttattg gcgacccatt gtttgccatc atcaacagga 4380

aaaacatggc cactttcaga ataaagcaaa agttgtttct aaagcacatt gccaagatga 4440

gggtcgatgc ttcaagacag agcatgaaca acccagttcc agattattac ggcgagaaaa 4500

tcggttctct gaaagactac agacaatggt taagagactg caatgaatac agaagaaagg 4560

caaaggagtt cttataagtc tttcagctat tcttttccat tagtttctca aaataccaaa 4620

aagaaaaatc actcgtattc ttactaattt agcttttcta attttttaat tgtttttcct 4680

ccctcccttt cttgtcttct ctctctttct ctctctctcc catccccaca ctcaaaccaa 4740

tcatacattt ctaaactctt tgatgtattc cctgtcctct gtatatacat ttatttaaac 4800

aaaattaaca ttgtctaatg gcattctgac ctgcagctat agccagagtt aggagaggaa 4860

aaaaaaaacc tgtgcgaatt gatgcatctt gtgtgtcgac                        4900

SEQ2ID NO.2

Met Val Ser Pro Ala   Glu Arg Leu Ser Thr   Ile Ala Ser Thr Ile

1                 5                   10                    15

Lys Pro Asn Arg Lys   Asp Ser Thr Ser Leu   Gln Pro Glu Asp Tyr

                20                    25                    30

Pro Glu His Pro Phe   Lys Val Thr Val Val   Gly Ser Gly Asn Trp

                35                    40                    45

Gly Cys Thr Ile Ala   Lys Val Ile Ala Glu   Asn Thr Val Glu Arg

                50                    55                    60

Pro Arg Gln Phe Gln   Arg Asp Val Asn Met   Trp Val Tyr Glu Glu

                65                    70                    75

Leu Ile Glu Gly Glu   Lys Leu Thr Glu Ile   Ile Asn Thr Arg His

                80                    85                    90

Glu Asn Val Lys Tyr   Leu Pro Gly Ile Lys   Leu Pro Val Asn Val

                95                    100                   105

Val Ala Val Pro Asp   Ile Val Glu Ala Cys   Ala Gly Ser Asp Leu

                110                   115                   120

Ile Val Phe Asn Ile   Pro His Gln Phe Leu   Pro Arg Ile Leu Ser

                125                   130                   135

Gln Leu Lys Gly Lys   Val Asn Pro Lys Ala   Arg Ala Ile Ser Cys

                140                   145                   150

Leu Lys Gly Leu Asp   Val Asn Pro Asn Gly   Cys Lys Leu Leu Phe

                155                   160                   165

Thr Val Ile Thr Glu   Glu Leu Gly Ile Tyr   Cys Gly Ala Leu Ser

                170                   175                   180

Gly Ala Asn Leu Ala   Pro Glu Val Ala Gln   Cys Lys Trp Ser Glu

                185                   190                   195

Thr Thr Val Ala Tyr   Thr Ile Pro Asp Asp   Phe Arg Gly Lys Gly

                200                   205                   210

Lys Asp Ile Asp His   Gln Ile Leu Lys Ser   Leu Phe His Arg Pro

                215                   220                   225

Tyr Phe Arg Val Arg   Val Ile Ser Asp Val   Ala Gly Ile Ser Ile

                230                   235                   240

Ala Gly Ala Leu Lys   Asn Val Val Ala Met   Ala Ala Gly Phe Val

                245                   250                   255

Glu Gly Leu Gly Trp   Gly Asp Asn Ala Lys   Ala Ala Val Met Arg

                260                   265                   270

Ile Gly Leu Val Glu   Thr Ile Gln Phe Ala   Lys Thr Phe Phe Asp

                275                   280                   285

Gly Cys His Ala Ala   Thr Phe Thr His Glu   Ser Ala Gly Val Ala

                290                   295                   300

Asp Leu Ile Thr Thr   Cys Ala Gly Gly Arg   Asn Val Arg Val Gly

                305                   310                   315

Arg Tyr Met Ala Gln   His Ser Val Ser Ala   Thr Glu Ala Glu Glu

                320                   325                   330

Lys Leu Leu Asn Gly   Gln Ser Cys Gln Gly   Ile His Thr Thr Arg

                335                   340                   345

Glu Val Tyr Glu Phe   Leu Ser Asn Met Gly   Arg Thr Asp Glu Phe

                350                   355                   360

Pro Leu Phe Thr Thr   Thr Tyr Arg Ile Ile   Tyr Glu Asn Phe Pro

                365                   370                   375

Ile Glu Lys Leu Pro   Glu Cys Leu Glu Pro   Val Glu Asp

                380                   385           388

Claims (5)

1.一种产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5-59中分离的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的多核苷酸的2082bp-3249bp核苷酸序列，编码基因产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1所述的一种分离的多核苷酸SEQ ID NO.1，其特征是其2082bp-3249bp核苷酸序列，经过一个或多个碱基的取代、缺失、置换、倒位或添加的有义突变。

4.根据权利要求1所述的一种分离的多核苷酸SEQ ID NO.1，其特征是所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中自起始密码子ATG上游向前的1-2081bp核苷酸序列。

5.如权利要求2所述产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶基因的克隆，其特征是：

(1)简并引物PCR扩增产甘油假丝酵母WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢酶基因片段：

以GeneBank公布的其他物种的甘油3-磷酸脱氢酶的基因序列为基础，通过序列比对分析，设计简并引物

CD-U：5′-TBRTBGGITCHGGYAAITGGG-3′，

CD-R：5′-RGCVAIVAYRTTYTTYARIGC-3′；

通过PCR技术，以WL2002-5-59基因组DNA为模板，以CD-U，CD-R为引物扩增获得0.63kb的核苷酸片段，经过TA克隆，测序；

(2)反向引物PCR扩增WL2002-5-59的甘油3-磷酸脱氢酶基因的全长序列：

根据简并引物PCR获得的DNA序列结果，设计一对反向引物

CgI-F：5′-CCTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTG-3′，

CgI-R：5′-CGCCTTCAATCAATTCTTCATAGAC-3′；

提取WL2002-5-59基因组DNA，分别用BamH I、Pst I、Sal I酶切后用酚、氯仿纯化，再用T₄DNA连接酶进行自身连接环化，用乙醇沉淀后作模板进行PCR扩增分别获得6.7kb、2.5kb、2.3kb的DNA片段，经TA克隆挑选阳性转化子，序列测定拼接后获得全长的产甘油假丝酵母NAD⁺依赖-甘油3-磷酸脱氢酶编码基因及其侧翼调控序列。

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