CN101146912A - 发酵方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种改进的包括在生产乙醇方法中使用的发酵方法。所述改进的发酵方法包括在发酵方法中应用最少一种脂肪酸氧化酶(特别是脂氧化酶)。所述改进的发酵方法还包括加入各种附加的酶和发酵微生物生长刺激物，包括维生素和矿物质。

Description

发酵方法和组合物
发明领域
本发明涉及用于生产发酵产品的酶方法和组合物，包括在发酵方法中改善酵母性能的方法和组合物。
发明背景
可使用发酵方法生产各种商品，包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸(itaconic acid)、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)，和更加复杂的化合物，包括，例如，抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；激素，以及其它很难以合成方式生产的化合物。在消费性醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳业(例如，在生长酸奶和奶酪中)、皮革工业和烟草工业中也同样通常使用发酵方法。
还有进一步改善发酵方法和改善包括发酵步骤的方法的需要。
发明概述
本发明提供用于生产发酵产品的方法和组合物。本发明还提供了使用一种或多种如本发明中所描述的方法生产乙醇的改进方法。根据本发明(回收的)回槽(backset)的百分比，如以下所规定的，在发酵培养基中可以得到显著地增加导致减少了往发酵方法中添加额外的水的需求。而且，发酵材料更有效的使用降低了发酵方法的成本因为更多的含淀粉原料转变成发酵产品，例如乙醇，和为发酵生物提供的碳水化合物营养。方法。
首先一个方面本发明涉及在发酵培养基中生产发酵产品的方法，所述方法含有发酵步骤，包括使至少一种脂肪酸氧化酶与发酵培养基接触。
在本发明的一个具体实施方案中，在发酵之前或发酵期间使至少一种脂肪酸氧化酶加入到发酵培养基。在一个优选的具体实施方案中，本发明包括将发酵培养基与至少一种脂肪酸氧化酶相接触。在一个具体的实施方案中在回槽回收至发酵罐/发酵容器前可用脂肪酸氧化酶预处理回槽。在另一个具体的实施方案中直接在含有或不含有回槽部分的发酵培养基上进行脂肪酸氧化酶处理。在一个优选的具体实施方案中直接往含回收的回槽的发酵培养基中加入脂肪酸氧化酶。在一个具体的实施方案中在发酵方法之前或期间加入脂肪酸氧化酶。脂肪酸氧化酶可以在加入发酵生物(例如酵母)之前加入到发酵培养基，但也可同时一起加入或在加入发酵生物之后加入。优选的是在发酵开始之前加入脂肪酸氧化酶。然而，在发酵期间加入脂肪酸氧化酶也在本发明范围之内，例如在发酵开始后。在优选的实施方案中，用脂肪酸氧化酶预处理含回槽部分的发酵培养基。
可在发酵前或发酵期间加入有效量的脂肪酸氧化酶。可在发酵之前加入有效量的脂肪酸氧化酶，例如，在发酵微生物增殖期间或发酵微生物增殖之后。
在本发明的一个优选实施方案中脂肪酸氧化酶是脂氧化酶(lipoxygenase)。在一个优选方案中发酵微生物是酵母。
在一个具体的实施方案中，本发明的发酵方法与糖化步骤(SSF)或液化步骤和糖化步骤(LSF)结合使用。除至少一种脂肪酸氧化酶之外也可加入其它的酶活性。这种酶活性包括酯酶活性，优选脂肪酶(lipase)和/或角质酶(cutinase)活性、漆酶活性、植酸酶活性、纤维素酶活性、木聚糖酶活性、α-淀粉酶活性或葡糖淀粉酶活性。
在一个优选的方案中，使用发酵方法生产醇类，优选乙醇。至少一种脂肪酸氧化酶的存在可用于提高乙醇的产率。根据本发明通过使用至少一种脂肪酸氧化酶能增加发酵培养基中(回收的)回槽的百分比。回槽可构成发酵开始前发酵培养基液体部分的高至30％w/w，优选高至50％w/w，更优选70％w/w，并且甚至高至90％w/w。换句话说，这意味着例如回收50％w/w的回槽相当于含有36％w/w(粉碎的)颗粒物质、32％w/w水和32％w/w回槽的发酵培养基(淤浆)。
术语“回槽”是指在将发酵副产品(即酒糟(whole stillage))分成(分离)固体部分(例如湿的颗粒)和液体的“回槽”部分后，从来自发酵步骤的副产品(即酒糟)中获得的液体部分。回槽“回槽”部分有时称为“酒糟水”。回槽含有大约10％的固体和通常含有各种抑制发酵方法的化合物，这可导致降低乙醇产率。因此，通常避免加入回槽。
根据本发明这问题可通过往发酵培养基中加入至少一种脂肪酸氧化酶来克服。在一个优选的实施方案中在一种或多种附加的酶活性存在下进行发酵。附加的酶可在脂肪酸氧化酶之前、当中/同时或之后引入。脂肪酸氧化酶可与一种或多种下列酶联合使用：酯酶，例如脂肪酶和/或角质酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶和/或葡糖淀粉酶及其混合物。
在本发明的另一个具体实施方案中，发酵微生物生长刺激剂与脂肪酸氧化酶和任选附加的本文所述的酶活性结合加入/存在，以进一步改进发酵方法。优选的生长刺激剂包括维生素和矿物质。
本发明的最后一个方面涉及含有脂肪酸氧化酶和附加的酶和/或刺激剂的组合物。
发明详述
本发明提供了生产发酵产品的方法和组合物，其中在发酵方法中使用至少一种脂肪酸氧化酶。
在发酵之前或期间用脂肪酸氧化酶处理发酵培养基提高了发酵产率。而且，相对于没有加入脂肪酸氧化酶获得的产率，用脂肪酸氧化酶处理含有回槽部分的发酵培养基提高了发酵产率。加入一种或多种附加的酶活性导致了发酵产率的进一步提高。
虽然未限定于任何一种工作原理，但在根据本发明的发酵方法中使用脂肪酸氧化酶可以认为，是由于造粉体膜从颗粒物质中破裂，基于淀粉释放的增加。并且，脂肪酸氧化酶促进了蛋白质中S-S桥的形成。这被认为是增加了淤浆的稳定性。
本发明首先一个方面涉及了在发酵培养基中生产发酵产品的方法，该方法含有发酵步骤，包括使发酵培养基与至少一种脂肪酸氧化酶接触。
脂肪酸氧化酶处理可在发酵方法的任何阶段进行。在一个优选的具体实施方案中，有效量的脂肪酸氧化酶在发酵期间加入(例如，通过接触发酵培养基)，例如，在发酵方法开始时。在另一个优选的具体实施方案中，有效量的脂肪酸氧化酶在发酵之前加入，例如，在发酵生物增殖期间或增殖之后或在糖化或糖化前步骤(pre-saccharification)或液化步骤期间。本发明的发酵方案可用于生产醇，例如乙醇，如作为传统乙醇方法的一个不可分割的部分。
发酵方法
“发酵”或“发酵方法”是指任何发酵方法或包括发酵步骤的任何方法。本发明的发酵方法包括，但不限于，用于生产下列物质的发酵方法：醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)；抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。发酵方法还包括用于消费性醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的发酵方法。优选的发酵方法包括醇发酵方法，这种方法是为本领域技术众所周知的。优选的发酵方法为厌氧发酵方法，这种方法是为本领域技术众所周知的。
在优选的实施方案中，本发明的发酵方法与液化方法和/或糖化方法联合使用，其中附加的酶活性，例如酯酶，包括脂肪酶和/或角质酶；植酸酶；漆酶；纤维素酶；木聚糖酶；α-淀粉酶；葡糖淀粉酶；或其混合物，可用于处理底物，例如淀粉底物。
在另一个优选的具体实施方案中，本发明的发酵方法用于生产乙醇的方法。在本发明的一个优选实施方案中脂肪酸氧化酶是脂氧化酶。
发酵培养基
“发酵培养基”或“发酵培养基”是指进行发酵的环境，其包括发酵底物，即被发酵微生物代谢的碳水化合物源。可在例如发酵方法之前或同时通过粉碎、液化和/或糖化或其它所需要的工序来处理本发明的发酵方法中所使用的发酵培养基，包括发酵底物和其它原材料。因此，发酵培养基可以指加入发酵微生物之前的培养基，例如，处于或来自液化和/或糖化方法的培养基，以及含有发酵微生物的培养基，例如，在同时进行糖化和发酵方法(simultaneous saccharification and fermentation process)(SSF)或同时进行液化-糖化-发酵(simultaneous liquefaction-saccharification-fermentation)(LSF)方法中所用的培养基。
发酵生物
“发酵微生物”是指在所需要的发酵方法中适于使用的任何微生物。根据本发明适当的发酵微生物能够发酵，即直接或间接地将糖类例如葡萄糖和/或麦芽糖转变成所需要的发酵产品。发酵微生物的例子包括真菌生物例如酵母。优选的酵母包括酵母属(Sacchromyces spp.)菌株，特别是酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)。可用的商品化酵母包括，例如Red Star/LesaffreEthanol Red(购自美国Red Star/Lesaffre)、SUPERSTART(购自Alltech)、GERT STRAND(购自瑞典Gert Strand AB)和FERMIOL(购自DSMSpecialties)
发酵底物
任何适当的底物或原料均可用于本发明的发酵方法。如同本领域技术众所周知的，通常基于所需要的发酵产品和所采用的方法来选择底物。适于本发明方法中使用的底物的例子包括：含淀粉物质例如块茎、根、整粒(whole grains)、玉米、玉米穗(cobs)、小麦、大麦、黑麦、高梁或谷类；含糖原料例如糖浆、水果材料、糖、甘蔗或甜菜、马铃薯和含纤维素物质例如木材或植物残渣。适当的底物还包括碳水化合物源，尤其是能被发酵微生物代谢的低分子糖(DP1-3糖)，其可通过直接加入发酵培养基中供给。
脂肪酸氧化酶
术语“一种”脂肪酸氧化酶是指这种酶中的至少一种。术语“至少一种”是指这种酶中的一、二、三、四、五、六或甚至更多种。
在本发明范围内，“脂肪酸氧化酶”是一种相比于底物丁香醛连氮(syringaldazine)可更有效地水解底物亚油酸的酶。“更有效”是指具有更高的反应速率。其可使用实施例2中所描述的方法来测试，并计算(1)每分钟在底物亚油酸上增加的吸光度(在234nm的吸光度)和(2)每分钟在丁香醛连氮底物上增加的吸光度(在530nm的吸光度)之间的差值，即计算反应速率的差值(RRD)＝(d(A234)/dt-d(A530)/dt)。如果RRD大于0，则所考察的酶可看作是本文所定义的脂肪酸氧化酶。如果RRD等于或小于0，则所考察的酶不是脂肪酸氧化酶。
在尤其具体的实施方案中，RRD至少为0.05、0.10、0.15、0.20或至少为0.25吸收单位/分钟。
在尤其具体的实施例2方法的实施方案中，酶进行了很好的定义。更进一步的是，对于实施例2的方法调节了酶剂量，从而在234nm或在530nm获得了最大的吸光度增量。在尤其具体的实施方案中，最大吸光度增量的范围为0.05-0.50；0.07-0.4；0.08-0.3；0.09-0.2；或0.10-0.25吸收单位/分钟。酶剂量范围可以为例如在0.01-20、0.05-15、或0.10-10mg酶蛋白/ml。
可供选择的是，“脂肪酸氧化酶”可定义为相对于丁香醛连氮能更有效地氧化不饱和脂肪酸的酶。酶活性可在如本申请实施例1中所描述的在PH6和30℃的在含有丁香醛连氮或亚油酸作为底物的标准血氧计装置中进行对比。
在尤其具体的实施方案中，脂肪酸氧化酶定义为分类为EC1.11.1.3或EC1.13.11.-.EC1.13.11.的酶-意思是指其任何亚类，目前为四十九个：EC1.13.11.1-EC1.13.11.49。EC1.11.1.3是指脂肪酸过氧物酶，EC1.13.11是指通过结合两个氧原子作用于单一供体的脂氧化酶。
在更具体的实施方案中，EC1.13.11.-酶分类为EC1.13.11.12、EC1.13.11.31、EC1.13.11.33、EC1.13.11.34、EC1.13.11.40、EC1.13.11.44或EC1.13.11.45，分别是指脂氧化酶、花生四烯酸酯12-脂氧化酶、花生四烯酸酯15-脂氧化酶、花生四烯酸酯5-脂氧化酶、花生四烯酸酯8-脂氧化酶、亚油酸二醇合酶和亚油酸11-脂氧化酶。
有效量的脂肪酸氧化酶的例子为0.001-400U/g DS(Dry Solids)(干燥固体)。优选的是，所用的脂肪酸氧化酶的量为0.01-100U/g DS，更优选的是0.05-50U/g DS，甚至更优选0.1-20U/g DS。
脂肪酸氧化酶的进一步优化此后可通过使用本领域已知的标准方法来获得。
脂氧化酶
在优选的具体实施方案中，脂肪酸氧化酶为脂氧化酶(LOX)，分类为EC1.13.11.12，它是催化聚不饱和脂肪酸特别是顺，顺-1，4-二烯例如亚油酸和制备氢过氧化物的酶。并且也可氧化其它的底物，例如单不饱和脂肪酸。
微生物脂氧化酶可来自于例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、普通嗜热放线菌(Ther moactinomyces vulgaris)、Fusarium oxysporum、Fusarium proliferatum、棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、Pyricularia oryzae和地霉属菌株(Geotrichum)。WO02/20730的实施例3-4中描述了来源于禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)的脂氧化酶的制备。WO02/086114的实施例2中描述了在米曲霉中表达来源于Magnaporthesalvinii的脂氧化酶，可使用标准方法来纯化这种酶，例如如WO02/20730的实施例4所描述的方法。
脂氧化酶(LOX)也可从植物种子中萃取，例如大豆、豌豆、鹰嘴豆和菜豆。可供选择地是，脂氧化酶可从哺乳动物细胞例如兔网织红细胞中获得。
脂氧化酶活性可如下面的“材料和方法”中所描述的来定义。
脂氧化酶有效量的例子为0.001-400U/g DS(干燥固体)。优选的是，所用脂氧化酶的量为0.01-100U/g DS，更优选为0.05-50U/g DS，甚至更优选为0.1-20U/g DS。脂氧化酶的进一步优化值此后可使用本领域公知的标准方法来获得。
附加的酶
在本发明优选的具体实施方案中一种或多种附加的酶活性可与本发明的脂肪酸氧化酶处理联合(例如，在此之前、期间或随后)使用。优选附加的酶是酯酶，例如脂肪酶和/或角质酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶例如α-淀粉酶、麦芽糖a-淀粉酶、β-淀粉酶或葡萄淀粉酶、或它们的混合物。
在本发明另一个优选的具体实施方案中，发酵微生物生长刺激物可与此处所述的酶活性结合加入以进一步改善发酵方法。优选的生长刺激物包括维生素和矿物质。
酯酶
在本发明优选的具体实施方案中，在发酵之前或期间使有效量的脂肪酸氧化酶与有效量的酯酶结合使用。酶可以在发酵之前或发酵期间加入，包括发酵微生物增殖期间或之后。也可用酶预处理发酵培养基(例如，加入或不加入回槽)。
这里所使用的“酯酶”也称羧酸酯水解酶，是指作用于酯键的酶，包括根据酶命名法分类于EC3.1.1羧酸酯水解酶类的酶(分别可得自http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme或从Enzyme Nomenclature1992，AcademicPress，San Diego，California，增刊1(1993)，增刊2(1994)，增刊3(1995)，增刊4(1997)和增刊5，Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250；1-6，和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650)。非限制性的酯酶的例子包括芳基酯酶、三酰基甘油酯酶、乙酰酯酶、乙酰胆碱酯酶、胆碱酯酶、托品酯酶(tropinesterase)、果胶酯酶、甾醇酯酶、叶绿素酶、L-阿拉伯糖内酯酶、葡萄糖内酯酶、糖醛酸内酯酶(uronolactonase)、鞣酸酶、棕榈酸视黄酯酶、羟丁酸二聚体水解酶、酰基甘油酯酶、3-氧己二酸烯醇-内酯酶(3-oxoadipate enol-lactonase)、1，4-内酯酶、半乳糖酯酶、4-吡哆醇内酯酶、酰基肉毒碱水解酶、氨酰-tRNA水解酶、D-阿拉伯内酯酶、6-磷酸葡萄糖内酯酶、磷脂酶A1、6-乙酰葡萄糖脱乙酰基酶、脂蛋白脂肪酶、二氢香豆素酯酶、柠檬苦素-D-环-内酯酶、类甾醇内酯酶、三乙酸酯内酯酶、放线菌素内酯酶、苔色酸缩酚酸水解酶、头孢菌素-C脱乙酰酶、氯原酸水解酶、α-氨基酸酯酶、4-甲基草酰乙酸酯酶、亚甲酸基丁烯醇酶(carboxymethylenebutenolidase)、脱氧柠檬苦素A-环-内酯酶、2-乙酰基-1-烷基甘油磷酸胆碱酯酶、镰孢氨酸-C鸟氨酸酯酶、芥子酸胆碱酯酶、蜡-酯水解酶、佛波醇-二酯水解酶、磷脂酰肌醇脱酰酶、唾液酸-O-乙酰酯酶、乙酸基丁炔并噻吩脱乙酰基酶(acetoxybutynylbithiophene deacetylase)、乙酰水杨酸脱乙酰基酶、甲基伞形乙酸盐脱乙酰酶(methylumbelliferyl-acetatedeacetylase)、2-吡喃酮-4，6-二羧酸内酯酶、N-乙酰半乳糖胺聚糖脱乙酰基酶、保幼激素酯酶、二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯酯酶、蛋白质-谷氨酸酯甲基酯酶、11-顺式棕榈酸视黄基酯水解酶、全反式棕榈酸视黄基酯水解酶、L-鼠李糖-1，4-内酯酶、5-(3，4-双乙酰氧基丁-1-炔基)-2，2′-联噻吩脱乙酰基酶、酯酰乙酯合酶、木糖1，4-内酯酶、N-乙酰葡萄糖胺磷脂酰肌醇脱乙酰酶、西曲酸酯苄基酯酶(cetraxate benzylesterase)、乙酰烷基甘油乙酰水解酶和乙酰木糖酯酶。
根据本发明优选的酯酶是脂肪分解酶，例如脂肪酶(分类为EC3.1.1.3、EC3.1.1.23和/或EC3.1.1.26)和磷酸酯酶(分类为EC3.1.1.4和/或EC3.1.1.32，包括分类为EC3.1.1.5的溶血磷酸酯酶)。其它的优选酯酶为角质酶(分类为EC3.1.1.74)。
当与应用除脂肪酸氧化酶之外的其它的酶的方法或处理结合使用时，例如在液化和/或糖化方法中所使用的例如植酸酶、漆酶、淀粉酶和葡糖淀粉酶，优选不抑制其它酶的酯酶组合物。例如，优选不含或仅含少量钙结合化合物的酯酶。同样地，优选不抑制发酵方法的酯酶。例如，优选不含或仅含少量甘油的酯酶。
可加入有效量的酯酶从而获得所需要的有利于改善发酵微生物的性能的益处，例如改变发酵微生物内部和/或外部或发酵微生物细胞膜内脂质的组成/浓度，从而导致发酵期间溶质向发酵微生物内和/或向外运动的改善，和/或提供更易代谢的能源(例如，如通过转变组分，例如将谷类底物中的油类转变成对发酵微生物有用的组分，例如不饱和脂肪酸和甘油)，从而提高乙醇产量。酯酶有效量的例子为0.01-400LU/g DS(干燥固体)。优选的是，所使用的酯酶的量为0.1-100LU/g DS，更优选为0.5-50LU/g DS，甚至更优选为1-20LU/g DS。酯酶的进一步优化此后可使用本领域已知的标准方法来获得。
在一个优选的具体实施方案中酯酶是脂肪分解酶，更优选的是脂肪酶。此处所使用的“脂肪分解酶”是指脂肪酶和磷酸酯酶(包括溶血磷酯酶)。脂肪分解酶优选来自于微生物，尤其是来自于细菌、真菌或酵母。所用的脂肪分解酶可来自于任何来源，包括例如犁头霉(Absidia)菌株，尤其是Absidiablakesleena和伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)；无色杆菌属菌株，尤其是解毒无色杆菌(Achromobacter iophagus)；气单胞菌属菌株；链格孢属菌株，尤其是甘蓝链格孢(Altenaria brassiciola)；曲霉菌属菌株，尤其是黑曲霉和黄曲霉；无色杆菌属菌株，尤其是解毒无色杆菌；短梗霉属菌株，尤其是出芽短梗霉；芽胞杆菌属菌株，尤其是短小芽胞杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus strearothermophilus)和枯草芽孢杆菌；白僵菌属(Beauveria)菌株；索丝菌属(Brochothrix)菌株，尤其是热杀索丝菌(Brochothrixthermosohata)；念珠菌属菌株，尤其是皱落念珠菌(Candida cylindracea)、Candida paralipolytica和Candida antarctica；色杆菌属菌株，尤其是粘稠色杆菌(Chromobacter viscosum)；鬼伞属(Coprinus)菌株，尤其是灰盖鬼伞(Coprinus cinerius)；镰刀菌属(Fusarium)菌株，尤其是Fusarium oxysporum、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、豌豆茄属镰孢菌(Fusarium solani pisi)和大刀玫瑰色镰孢菌(Fusarium roseum culmorum)；地霉属(Geotricum)菌株，尤其是帚状地霉(Geotricum penicillatum)；汉森酵母属(Hansenula)菌株，尤其是异常汉逊氏酵母；腐殖菌属(Humicola)菌株，尤其是Humicolabrevispora、Humicola brevis var.thermoidea和Humicola insolens；Hyphozyma菌株；乳杆菌属菌株，尤其是弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)；Metarhizium菌株；毛霉菌属(Mucor)菌株；拟青霉属(Paecilomyces)菌株；青霉属菌株，尤其是圆弧青霉(Penicillium cyclopium)、皮落青霉(Penicilliumcrustosum)和扩展青霉(Penicillium expansum)；假单胞菌属菌株，尤其是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)、洋葱假单胞菌(同义词为葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia))、荧光假单胞菌、莓实极毛杆菌(Pseudomonas fragi)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、嗜中温假单胞菌(Pseudomonas mephitica lipolytica)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、植物假单胞菌(Pseudomonas plantari)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、腐臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和Pseudomonaswisconsinensis；丝核菌属(Rhizoctona)菌株，尤其是立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)；根毛霉属(Rhizomucor)菌株，尤其是米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)；根霉属(Rhizopus)菌株，尤其是日本根霉(Rhizopus japonicus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)和结节根霉(Rhizopus nodosus)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium)菌株，尤其是念珠状红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)；红酵母属(Rhodotorula)菌株，尤其是粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)；掷孢酵母属(Sporobolomyces)菌株，尤其是Sporobolomycesshibatanus；高温霉属(Thermomyces)菌株尤其是Thermomyces lanuginosus(以前的Humicola lanuginosa)，Thiarosporella属菌株尤其是Thiarosporellaphaseolina；木霉属(Trichoderma)菌株，尤其是Trichodermal harzianum和Trichoderma reesei；和/或轮枝霉属(Verticillium)菌株。
在优选的具体实施方案中，脂肪分解酶来自曲霉属菌株、无色杆菌属菌株、芽胞杆菌属菌株、念珠菌属菌株、色杆菌属菌株、镰孢属菌株、腐质霉属菌株、Hyphozyma菌株、假单胞菌属菌株、毛霉属菌株、根霉菌属菌株、或高温霉属(Thermomyces)菌株。
在更优选的实施方案中，脂肪分解酶为脂肪酶。脂肪酶可以因其具有能改变例如得自谷类底物中的发酵培养基(包括发酵酵母)的甘油三酯油脂和脂肪的结构和组成的能力而在此被使用。脂肪酶催化不同类型的甘油三酯转化，例如水解、酯化和转酯反应。适当的脂肪酶包括酸性、中性和碱性脂肪酶，如本领域众所周知的，虽然在低脂肪酶浓度下酸性脂肪酶(例如，如购自Amano的脂肪酶G AMANO50)显然比中性或碱性脂肪酶更为有效。优选用于本发明的脂肪酶包括Candida antarcitca脂肪酶和Candidacylindracea脂肪酶。更优选的脂肪酶是纯化的脂肪酶，例如Candidaantarcitca脂肪酶(脂肪酶A)，Candida antarcitca脂肪酶(脂肪酶B)Candidacylindracea脂肪酶和沙门氏柏干酪青霉菌(Penicillium camembertii)脂肪酶。
所述脂肪酶可以是在EP258,068-A中公开的任一种脂肪酶或者是脂肪酶变体例如如WO00/60063或WO00/32758中所公开的变体，在这里将其引入作为参考。优选的商品化脂肪酶包括LECITASETM、LIPOLASETM和LIPEXTM(购自Novozymes A/S，Denmark)和GAMANO50(购自Amano)。
优选加入脂肪酶的量大约为l-400LU/g，优选1-10LU/g DS，更优选1-5LU/g DS。
在本发明的另一个优选的实施方案中，至少一种酯酶是角质酶。角质酶是能够分解角质的酶。角质酶可从任何来源获得。在一个优选的实施方案中，角质酶来自曲霉属菌株，尤其是米曲霉；链格孢属菌株，尤其是Altemaria brassiciola；镰孢菌属菌株，尤其是腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、豌豆茄属镰孢菌(Fusarium solani pisi)和大刀玫瑰色镰孢菌(Fusariumroseum culmorum)或接骨木玫瑰色镰孢(Fusarium roseum sambucium)；长入孢属(Helminthosporum)菌株，尤其是蒜头长蠕孢(Helminthosporumsativum)；腐殖霉属菌株(Humicola)，尤其是Humicola insolens；假单胞菌属菌株，尤其是门多萨假单胞菌或腐臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；丝核菌属(Rhizoctonia)菌株，尤其是茄属丝核菌(Rhizoctona solani)；链霉菌属菌株，尤其是疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)；或单格孢属(Ulocladium)菌株，尤其是Ulocladium consortiale。在一个最优选的具体实施方案中，角质酶来自Humicola insolens菌株，尤其是Humicolainsolens菌株DSM1800。Humicola insolens角质酶在WO96/13580中作了描述，在这里将其引入作为参考。角质酶可以是变体，例如在WO00/34450和WO01/92502中所公开的一种变体，这里将其引入作为参考。优选的角质酶变体包括WO01/92502的实施例2中所列的变体，在此将其特别引入作为参考。有效量的角质酶在0.01-400LU/g DS，优选大约为0.1-100LU/g DS，更优选为1-50LU/g DS。此后可使用本领域已知的标准方法获得角质酶量的进一步优化。
在另一个优选的实施方案中，至少一种酯酶是磷脂酶。这里所使用的术语磷脂酶是一种对磷脂具有活性的酶。磷脂例如卵磷脂或磷脂酰胆碱，是由与两个脂肪酸在外部(sn-1)和中间(sn-2)位置酯化以及与磷酸在第三个位置酯化的甘油组成；磷酸可依次被酯化成氨基醇。磷脂酶是参与磷脂水解的酶。可鉴别出若干种类的磷脂酶活性，包括磷脂酶A1和A2，其水解一个脂酰基(分别在sn-1和sn-2位置)形成溶血磷酸酯；溶血磷酸酶(或称磷脂酶B)可水解溶血磷酸酯中剩余的脂酰基。磷脂酶C和磷脂酶D(磷酸二脂酶)分别释放二酰基甘油或磷脂酸。
术语磷脂酶包括具有磷脂酶活性的酶，例如磷脂酶A(A1或A2)、磷脂酶B活性、磷脂酶C活性或磷脂酶D活性。此处所使用的术语“磷脂酶A”与本发明所述的酶相结合意在将所有具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶包括在内。磷脂酶活性可由具有其它活性的酶提供，例如具有磷脂酶活性的脂肪酶。磷脂酶活性可来自例如具有磷脂酶副活性的脂肪酶。在本发明另外的实施方案中，磷脂酶酶活性由基本上仅具有磷脂酶活性的酶提供，其中磷脂酶酶活性不是副活性。
磷脂酶可来自任何来源，例如动物来源(例如，哺乳动物)，例如来自胰腺(例如牛或猪胰腺)，或蛇毒或蜂毒。可选择性地，磷脂酶也可从微生物来源获得，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如曲霉菌属或种，例如黑曲霉(A.niger)；网柄菌属(Dictyostelium)，例如D.discoideum；毛霉菌属(Mucor)，例如爪哇毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)、细胞毛属(M.subtilissimus)；链孢霉属(Neurospora)，例如粗糙链孢霉(N.crassa)；根毛霉属(Rhizomucor)，例如R.pusillus；根霉菌属(Rhizopus)，例如无根根霉(R.arrhizus)，日本根霉(R.japonicus)，葡枝根霉(R.stolonifer)，核盘霉(Sclerotinia)，例如大豆核盘菌(S.libertiana)；毛癣菌属(Trichophyton)，例如刚果红毛癣菌(T.rubrum)；Whetzelinia，例如W.sclerotiorum；芽孢杆菌属(Bacillus)，例如巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)；柠檬酸细菌属(Citrobacter)，例如氟氏柠檬细菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟爱德华氏菌(E.cloacae Edwardsiella)、塔达氏肠杆菌(E tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)；克雷伯氏杆菌属，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形杆菌属(Proteus)，例如普通变形杆菌(P.vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)，例如斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如乳红化沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)，例如氟氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)，例如紫红链霉菌(S.violeceoruber)，耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)。因此，磷脂酶可以是真菌，例如来自核菌纲(Pyrenomycetes)，例如镰刀菌属(Fusarium)，例如大刀镰孢(F.culmorum)、异孢镰孢(F.heterosporum)、茄属镰孢(F.solani)菌株，或尖孢镰孢(F.oxysporum)菌株。磷脂酶也可来自曲霉菌属的丝状真菌菌株，例如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)菌株、臭曲霉属菌(Aspergillus foetidus)、日本曲霉属菌、黑曲霉或米曲霉。优选的商品化磷脂酶包括LECITASETM和LECITASETMULTRA(可从丹麦的Novozymes A/S购买)。
磷脂酶的有效量在0.01和400LU/g DS之间，优选大约为0.1-100LU/gDS，更优选1-50LU/g DS。可使用本领域已知的标准方法获得磷脂酶量的进一步优化。
植酸酶
在优选的实施方案中，脂肪酸氧化酶与有效量的植酸酶联合使用。根据这个具体实施方案，可以利用植酸酶促进从存在于培养基中的植酸(myo-inositol hexakisphosphate)或其中的任何盐类(植酸盐)释放无机磷酸。
植酸酶可根据其在最初水解步骤中的专一性来分类，即根据最初被水解的磷酸酯基来分类。所使用的植酸酶可具有任一专一性，例如3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或5-植酸酶(无E.C.编号)。植酸酶可在发酵期间加入或在发酵前加入，例如，在增殖期间或在发酵前的步骤中，例如液化和/或糖化步骤。如WO01/62947中所描述的，可加入植酸酶，例如以改善酵母必需矿物质的生物利用度，这里将其引入作为参考。植酸酶也可用于预处理发酵培养基(例如，有或没有回槽)。植酸酶可来自植物或微生物，例如细菌或真菌，如酵母或丝状真菌。植物植酸酶可来自小麦麦麸、玉米、大豆或百合花粉。适当的植物植酸酶在以下文献中作了描述：Thomlinson et al，Biochemistry，1(1962)，166-171；Barrientos et al，Plant.Physio.，106(1994)，1489-1495；WO98/05785；WO98/20139。
细菌植酸酶可来自芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或埃希氏杆菌属(Escherichia)，优选枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或大肠杆菌(E.coli)种。适当的细菌植酸酶在以下文献中作了描述：Paver和Jagannathan，1982，Joumal of Bacteriology151：1102-1108；Cosgrove，1970，Australian Journal of Biological Sciences23：1207-1220；Greiner et al，Arch.Biochem.Bio-phys.，303，107-113，1993；WO98/06856；WO97/33976；WO97/48812。
酵母植酸酶或肌醇单磷酸酶可来自糖酵母属(Saccharomyces)或许旺氏酵母属(schwanniomyces)，优选酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)或西方许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)种。适当的酵母植酸酶在以下文献中作了描述：Nayini et al，1984，Lebensmittel Wissenschaft undTechnologie17：24-26；Wodzinski et al，Adv.Appl.Microbiol.，42，263-303；AU-A-24840/95。
丝状真菌植酸酶可来自真菌门子囊菌(Ascomycota)(子囊菌纲(ascomycetes))或担子菌门(Basidiomycota)，例如曲霉菌属(Aspergillus)、高温霉属(Thermomyces)(也称腐殖霉属)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Manascus、青霉属(Penicillium)、隔孢革菌属(Peniophora)、田头霉属(Agrocybe)、桩菇菌属(Paxillus)或栓菌属(Trametes)，优选土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉泡盛曲霉变种(Aspergillus niger var..awamori)、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、T.lanuginosus(也称H.lanuginosa)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、Peniophoralycii、平田头菇(Agrocybe pediades)、Manascus anka、Paxillus involtus或绒毛栓菌(Trametes pubescens)。适当的真菌植酸酶在下列文献中作了描述：Yamadaet al.，1986，Agric.Biol.Chem.322：1275-1282；Pidding-ton et al.，1993，Gene133：55-62；EP684，313；EP0420358；EP0684313；WO98/28408；WO98/28409；JP7-67635；WO98/44125；WO97/38096；WO98/13480，此处将它们并入作为参考。
修饰过的植酸酶或植酸酶变体可采用本领域已知的方法获得，特别是通过下列文献中所公开的方法获得：EP897,010；EP897,985；WO99/49022；WO99/48330。
可购买的商品化植酸酶包括BIO-FEED PHYTASETM、PHYTASENOVOTM CT或L(丹麦Novozymes A/S)，或NATUPHOSTM NG5000(DSM)。
优选可加入的植酸酶在5,000-250,000FYT/g DS范围，优选10,000-100，000FYT/g DS。植酸酶优选的合适用量在0.005-25FYT/g DS，更优选在0.01-10FYT/g，例如0.1-1FYT/g DS。此处植酸酶活性用FYT单位定义，一个FYT指在下列条件下每分钟释放1毫摩尔无机正磷酸盐：PH5.5；温度37℃；底物：浓度为0.0050mole/L的植酸钠(C6H6O24P6Na12)。
蛋白酶
在另一个优选的实施方案中，脂肪酸氧化酶处理与至少一种蛋白酶结合使用。可使用蛋白酶用于例如消化蛋白质以产生游离氨基氮(FAN)。这种游离氨基酸可作为酵母的养分，从而增进酵母的生长并就此制备乙醇。
在发酵方法中使用的发酵微生物可通过在至少一种蛋白酶的存在下增殖发酵微生物来制备。虽然未限定于任一种工作原理，但确信的是，与在未加蛋白酶的相同条件下增殖的发酵微生物相比，当发酵微生物接着用于发酵方法中时，具有至少一种有效量的蛋白酶的发酵微生物的增殖缩短了发酵微生物的延迟时间(lag time)。可认为的是，在增殖方法中蛋白酶的作用直接或间接导致了在发酵期间对发酵微生物有害或有益的基因分别抑制或表达，从而缩短延迟时间并导致加快发酵周期。
蛋白酶是本领域已知，是指可催化肽键裂解的酶。适当的蛋白酶包括真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即以在低于PH7的酸性条件下能水解蛋白质为特征的蛋白酶。适当的酸性(acid)真菌蛋白酶包括来自下列的真菌蛋白酶：曲霉属(Aspergillus)、毛霉属(Mucor)、酒曲菌属(Rhizopus)、念珠菌属(Candida)、草盖菌属(Coriolus)、疫病霉属(Endothia)、Enthomophtra、耙菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、菌核(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)。特别倾向的是来自黑曲霉的蛋白酶(参见，例如Koaze et al.，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)，Aspergillus saitoi(参见，例如Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(Hayashida et al.，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)，棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)(WO95/02044)，或米曲霉(Aspergillus oryzae)；和来自微小毛霉(Mucor pusillus)或米赫毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
不是酸性蛋白酶的细菌蛋白酶，包括商品化产品ALCALASETM和NEUTRASETM(可从NovozymesA/S购买)。其它的蛋白酶包括Genencor Int，Inc.USA的GC106和丹麦Novozymes A/S的NOVOZYMTM50006。
优选的是，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，如同下列文献中所描叙的：Handbook of Proteolytic Enzymes，A.，J.Barrett，N.D.Rawlings and J.F.Woessner编辑，Academic Press，San Diego，1998，270章。天冬氨酸蛋白酶适当的例子包括例如在下列文献中所公开的那些：R.M.Berka et al.Gene，96，313(1990))；(R.M.Berka et al.Gene，125，195-198(1993))；和Gomi et al.Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)，在此将其引入作为参考。
漆酶
在另一个优选的实施方案中，脂肪酸氧化酶处理与漆酶结合使用。可在发酵期间加入有效量的漆酶，和/或在发酵之前或发酵期间例如，在发酵微生物增殖期间施用有效量的漆酶。虽然未限定于任一种工作原理，但可认为的是在发酵方法中使用至少一种漆酶促进了抑制剂的氧化和缺氧，从而促进更适于发酵微生物的缺氧环境的形成。
在本发明范围内，漆酶和涉及漆酶的酶包括酶分类(EC1.10.3.2)所包含的任何漆酶、酶分类(EC1.10.3.1)所包括的任何儿茶酚氧化酶、酶分类(EC1.3.3.5)所包括的任何胆红素氧化酶或酶分类(EC1.14.18.1)所包括的任何单酚单加氧酶。
上述酶可来自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)，适当的例子包括来自下列菌属的株的漆酶：曲菌属(Aspergillus)；链孢霉属(Neurospora)，例如粗糙链孢霉(N.crassa)；束柄霉属(Podospora)；葡萄孢属(Botrytis)；金钱菌属(Collybia)；层孔菌属(Fomes)；香菇属(Lentinus)；北风菌属(Pleurotus)；栓菌属(Trametes)，例如T.villosa和T.versicolor；丝核菌属(Rhizoctonia)，例如茄属丝核菌(R.solani)；鬼伞属(Coprinus)，例如C.cinereus，C.comatus，C.friesii和C.plicatilis；Psathyrella，例如P.condelleana；Panaeolus，例如P.papilionaceus；毁丝霉属(Myceliophthora)，例如嗜热毁丝霉(M thermophila)；Schytalidium，例如S.thermophilum；多孔菌属(Polyporus)，例如P.pinsitus；密孔菌属(Pycnoporus)，例如朱红密孔菌(P.cinnabarinus)；射脉菌属(Phlebia)，例如辐射射脉菌(P.radita)(WO92/01046)，或草盖菌属(Coriolus)，例如C.hirsutus(JP2-238885)。
优选来自下列菌属的漆酶：鬼伞属(Coprinus)、毁丝霉属(Myceliophthora)、多孔菌属(Polyporus)、密孔菌属(pycnoporus)、柱霉属(Scytalidium)或丝核菌属(Rhizoctonia)，特别是来自灰鬼伞属(Coprinuscinereus)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、Polyporus pinsitus、朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)、Scytalidium thermophilum或茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)的漆酶。
淀粉酶
在另一个优选的实施方案中，脂肪酸氧化酶处理与淀粉酶结合使用。优选来自真菌或细菌的α-淀粉酶。
α-淀粉酶更优选是芽孢杆菌属α-淀粉酶，例如来源于地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的菌株。其它α-淀粉酶包括来自芽孢杆菌属(Bacillussp.)NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的菌株的α-淀粉酶，所有的这些在WO95/26397中进行了详细描述：和Tsukamoto et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications，151(1988)，pp.25-31中描述的α-淀粉酶。其它α-淀粉酶变体和杂交体在WO96/23874、WO97/41213和WO99/19467中作了描述。其它的α-淀粉酶包括来源于曲菌属菌株的α-淀粉酶，例如米曲霉和黑曲霉α-淀粉酶。在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶。在更优选的具体实施方案中，酸性α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。更优选的是，酸性α-淀粉酶是来源于曲霉菌属的酸性真菌α-  淀粉酶。可购买的商业化酸性真菌淀粉酶为SP288(购自丹麦的Novozymes A/S)。
在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”是指加入的有效量的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)在PH3.0-7.0的范围内、优选3.5-6.0或更优选4.0-5.0范围内具有活性。
优选的酸性真菌α-淀粉酶为芬加密尔(Fungamyl)样的α-淀粉酶。在本发明中所用的术语“芬加密尔样α-淀粉酶”是指显示出高同源性的α-淀粉酶，即对在W096/23874中所示的SEQ ID NO.10氨基酸序列超过50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％的同源性。当用作产生麦芽糖的酶时，可加入真菌α-淀粉酶的有效量为0.001-1.0AFAU/g DS，优选为0.002-0.5AFAU/g DS，优选0.02-0.1AFAU/g DS。
优选α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，优选来源于曲霉属，优选黑曲霉或米曲霉种。在一个优选的实施方案中酸性真菌α-淀粉酶是如在Swiss-prot/TeEMBL数据库以最初登记号为P56271的“AMYA ASPNG”中披露的黑曲霉(A.niger)中的酸性真菌α-淀粉酶。此外考虑所述的酸性真菌淀粉酶变体，其具有与其最少70％的同源性(一致性)，例如至少80％的同源性或甚至至少90％的同源性。
优选含有α-淀粉酶的商品化组合物包括DSM的MYCOLASETMTM(Gist Brochades)、BANTM、TERMAMYLTMSC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM X和SANTM SUPER，和SANTM EXTRA L(novozymes A/S)和CLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEYME FRED、SPEYMETM AA和SPEZYMETM DELTA AA(Genencor Int)，以及以商品名SP288销售的酸性真菌α-淀粉酶(购自丹麦的Novozymes A/S)。
淀粉酶也可是产麦芽糖(maltogenic)α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能将直链淀粉和支链淀粉水解成α构型的麦芽糖。来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)菌株NCIB11837的产麦芽糖α-淀粉酶可从NovozymesA/S公司以商品名NOVAMYLTM购买到。产麦芽糖α-淀粉酶在下列文献中作了描述：美国专利号US4,598，048；4,604,355，和6,162,628，在此将其引入作为参考。优选的是，例如如同在WO95/10627中所描述的将产麦芽糖α-淀粉酶在粗淀粉水解方法中使用，此处将其引入作为参考。
α-淀粉酶可以本领域众所周知的量加入。当以AAU单位计量时，优选酸性α-淀粉酶活性的存在量为5-50,0000AAU/kg DS、量为500-50,000AAU/kg DS或更优选为100-10,000AAU/kg DS，例如500-1,000AUU/kg DS。优选加入真菌酸性α-淀粉酶的量为10-10,000AFAU/kg DS、量为500-2,500AFAU/kg DS或更优选量为100-1,000AFAU/kg DS，例如大约为500AFAU/kgDS。
根据本发明方法的实施方案中所用的葡糖淀粉酶可来源于任何合适来源，例如来源于微生物或植物。优选的葡萄糖淀粉酶来自真菌或细菌，选自由曲霉属葡萄糖淀粉酶组成的组，具体为黑曲霉G1或G2葡萄糖淀粉酶(Boel et al.(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，例如公开于WO92/00381和WO00/04136；泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(WO84/02921)，米曲霉(A.oryzae)(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或其变体或片段。
其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强其热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen et al.(1996)，Prot.Engng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chenet al.(1995)，Prot Engng.8，575-582)；N182(Chen et al.(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键，A246C(Fierobe et al.(1996)，Biochemistry，35，8698-8704；以及在A435和S436位置引入残基(Li et al.(1997)，ProteinEngng.10，1199-1204)。其它葡糖淀粉酶包括踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是来自Talaromyces emersonii(WO99/28448)、Talaromycesleycettanus(美国专利号.Re.32，153)、Talaromyces duponti、Talaromycesthermophilus(美国专利号US4,587,215)。所考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽胞杆菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP135,138)和C.thermohydrosulfuricum(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。
含葡糖淀粉酶的商品化组合物包括AMG200L；AMG300L；SANTMSUPER，SANTMEXTRA L，SPIRIZYMETM PLUS，SPIRIZYMETM FUEL和AMGTM E(购自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM300(购自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(购自DSM)；G-ZYMETMG900，G-ZYMETM和G990ZR(购自Genencor Int.)。
可加入葡糖淀粉酶的有效量为0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/gDS，例如2AGU/g DS。
木聚糖酶
在另一个优选的实施方案中，脂肪酸氧化酶处理与木聚糖酶结合使用。木聚糖酶(EC.3.2.1.8)活性可源于任何适合的来源，包括真菌和细菌生物体，例如曲霉属、Disporotrichum、青霉属、脉孢菌、镰刀菌属和木霉属。
含有木聚糖酶的优选商品化制品包括SHEARZYME、BIOFEEDWHEAT、CELLUCLAST、ULTRAFLO、VISCOZYME(Novozymes A/S)和SPEZYMECP(Genencor Int.)。
纤维素酶
在另一个优选的实施方案中，脂肪酸氧化酶处理与纤维素酶结合使用。根据发明所使用的纤维素酶活性源于任何适合的来源；优选纤维素酶是源于微生物，例如源于丝状真菌菌株(例如曲霉属、木霉属、腐殖菌属、镰刀菌属)。
可使用的含有纤维素酶的商品化制品包括CELLUCLASTTM、CELLUZYMETM、CEREFLOTM和ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)、LAMINEXTM和SPEZYMETM CP(Genencor Int.)，以及ROHAMENTTM7069W(购自Rhm GmbH)。
酶的制备
脂肪酸氧化酶和此处所引用的其它酶可来源于或获得于任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母或哺乳动物源。术语“来源”在本文中的意思是所述酶可以从其天然存在的生物体中分离出，即该酶的氨基酸序列与天然酶一致。术语“来源”也指该酶可以由宿主生物体重组产生，重组生成的酶具有与天然酶一致的特性或具有修饰的氨基酸序列，例如具有一个或多个缺失、插入和/或替换的氨基酸，即重组生成的酶为天然氨基酸序列的突变体和/或片段，或通过本领域已知的核酸改组的方法产生的酶。在天然酶意义内包括天然的变体。此外，术语“来源”包括合成产生的酶，例如肽合成。术语“来源”还包括不论是在体内或体外经过修饰例如通过糖化、磷酸化或其它的化学修饰的酶。术语“获得”在本文中的意思是指具有与天然酶一致的氨基酸序列的酶。该术语包括已从天然存在的生物体中分离的酶，或在同种或不同种类的生物体中已重组表达的酶，或通过合成例如肽合成产生的酶。就重组产生的酶而言，术语“获得”和“来源”是指酶的特性，而非其在其中重组产生的宿主生物体的特性。
酶也可以被纯化。这里所使用的术语“纯化的”包括不含其所来源的生物体的其它组分的酶。术语“纯化的”还包括不含其所从其获得的天然生物体中组分的酶。酶可以纯化至仅有少量的其它蛋白存在。措词“其它蛋白质”特别是指其它的酶。这里所使用的术语“纯化的”也指除去其它组分，特别是其它的蛋白质，更具体指存在于本发明酶的来源的细胞中的其它酶。酶可以是“基本上”纯的，即不含其从中产生的生物体的其它组分，即例如重组产生酶的宿主生物体。在优选的实施方案中，酶至少为75％(w/w)纯，更优选至少为80％、至少为85％、至少为90％、至少为95％、至少为96％、至少为97％、至少为98％或至少为99％纯。在另一个优选的实施方案中，酶为100％纯。
根据本发明所使用的酶可以以任何适合的形式用于此处所描述方法中使用，例如，如以干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定液体或受保护酶的形式。例如可如在美国专利US4,106,991和US4,661,452中所公开的方法制备颗粒，并且可任选采用本领域已知的方法包被。可根据既定方法例如通过加入稳定剂如糖、糖醇或其它多元醇、乳酸或其它有机酸来稳定液体酶制剂。受保护的酶可根据EP238,216中所公开的方法制备。
发酵刺激剂
根据本发明的另一个优选方案，发酵刺激剂可与此处所描述的任何的酶方法结合使用以进一步改善发酵方法，特别是，改善发酵微生物的性能，例如，提高速度和乙醇产率。“发酵刺激剂”是指发酵微生物生长刺激剂，发酵微生物特别是酵母。优选的发酵生长刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的例子包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E，例如参见Alfenore et al.，“Improving ethanol production and viability of Saccharomycescerevisia by a vitamin feeding strategy during fed-batch process”，Springer-Verlag(2002)，其在此引入作为参考。矿物质的例子包括那些能提供含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu营养素的矿物质和矿物质。
液化或糖化
任何液化或糖化均可与本发明的发酵方法结合使用。根据本发明糖化和液化可与发酵方法同时或分开进行。在本发明的一个优选实施方案中，液化、糖化和发酵方法同时进行(LSF)。
“液化”是其中磨碎的(完整的)谷类原料被分解(水解)成麦芽糖糊精(糊精)的方法。液化通常以三步热淤浆方法进行。在60-95℃、优选80-85℃加热淤浆，和加入酶以引发液化(稀释)。然后在95-140℃、优选在105-125℃下喷烤(iet-cooked)淤浆以使淤浆彻底糊化(gelanitization)。接着使淤浆冷却至60-95℃并加入更多的酶以结束水解(二级液化)。液化方法通常在PH4.5-6.5进行，特别是在PH5-6。磨碎并液化的全粒称为糊状物(mash)。
通常使用上述“淀粉酶”部分中所列的任何α-淀粉酶进行液化方法。
“糖化”是使麦芽糖糊精(例如由液化方法产生)变成可被发酵微生物例如酵母代谢的低分子量糖DP1-3(即碳水化合物源)的方法。糖化方法是为本领域众所周知的，通常由葡糖淀粉酶酶催化进行。可选择地或附加地，可使用α-葡糖苷酶或酸性α-淀粉酶。整个糖化方法可持续大约24-72小时，通常大约在30-65℃的温度、和在PH4-5、通常大约在PH4.5的条件下进行。然而，通常更优选进行预糖化步骤，该步骤持续大约40-90分钟、在30-65℃的温度、典型地大约在60℃下进行，随后在发酵期间在同时发生的糖化和发酵方法(SSF)中完全糖化。
在乙醇生产中使用的最普遍的方法是同时进行糖化和发酵(SSF)方法，其中不经过糖化保持阶段，这意味着共同加入发酵生物(例如酵母)和酶。在SSF方法中，通常恰恰在发酵前，在50℃以上的温度引入预糖化步骤。
更优选的是，液化、糖化或发酵方法是同时进行液化-糖化-发酵(LSF)方法或单一酶方法，其中液化、糖化和发酵方法全部在一个方法中进行，即所有用于液化、糖化和发酵的酶(或可替换的或另外的非酶试剂)在同一个方法中加入，更优选在同一方法内同时加入。优选的LSF方法的工艺条件包括温度约26-40℃、优选大约32℃，大约PH4至大约8、优选大约PH5，和方法步骤时间大约48-72小时，优选大约72小时。
优选LSF方法或单一酶催化方法为粗淀粉水解(RSH)方法，更优选用于生产醇例如乙醇。“粗淀粉水解”方法(RSH)不同于常规的淀粉处理方法在于粗的未煮过的淀粉(也称颗粒淀粉)用于乙醇发酵方法。此处所使用的术语“颗粒淀粉”是指粗的未煮过的淀粉，即以天然形式存在于谷物、块茎或谷类中的淀粉。淀粉在植物细胞内形成不溶于水的细小颗粒。当置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量液体并膨胀。在高至50-75℃的温度时膨胀是可逆的。然而，在更高的温度下开始不可逆膨胀，叫做糊化。
术语“初始糊化温度”是指淀粉开始糊化的最低温度。在水中加热的淀粉于50-75℃之间开始糊化；确切的糊化温度取决于具体的淀粉，并且本领域技术人员能容易地确定该温度。因此，初始糊化温度可根据植物品种植物品种的具体变种以及生长条件而不同，在本发明范围内，给定淀粉的最初糊化温度为在通过使用Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/Strke，Vol，44(12)pp.461-466(1992)中所描述的方法双折射损失5％淀粉颗粒的温度。
根据一个优选的实施方案，优选脂肪酸氧化酶与酯酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、淀粉酶和/或葡糖淀粉酶结合使用，以提高粗淀粉水解方法中的乙醇产率。
在优选的实施方案中，本发明包括用脂肪酸氧化酶和选自下列组中的一种或多种酶活性在低于颗粒淀粉的最初糊化温度下处理颗粒淀粉淤浆，其中所述组为：植酸酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、葡糖淀粉酶和/或(产麦芽糖)α-淀粉酶、酵母。优选酵母是乙醇红(red etharnol)酵母。优选淀粉酶是酸性α-淀粉酶，更优选是酸性真菌α-淀粉酶。
在更优选的实施方案中，粗淀粉水解方法需要用葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶在低于颗粒淀粉最初糊化温度的0-20℃下处理颗粒淀粉淤浆，随后在10-35℃温度下用葡糖淀粉酶和/或α淀粉酶、酵母和至少一种脂肪酸氧化酶以及任选的酯酶、蛋白酶、植酸酶、漆酶、淀粉酶和/或葡糖淀粉酶处理淤浆。
在另一个优选的实施方案中，该方法需要下列连续步骤：(a)在低于颗粒淀粉最初糊化温度的0-20℃下用酸性α-淀粉酶和葡糖淀粉酶处理颗粒淀粉淤浆，优选时间为5分钟-12小时，(b)在10-35℃在酸性α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、酵母和至少一种脂肪酸氧化酶以及任选的植酸酶、蛋白酶、漆酶、酯酶存在下处理淤浆，优选时间为20-250小时，以生成乙醇。
在RSH步骤中，可将其它酶和发酵刺激剂与脂肪酸氧化酶处理结合使用。优选其它的酶选自酯酶例如脂肪酶、或角质酶、植酸酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶或α-淀粉酶例如产麦芽糖α--淀粉酶、葡糖淀粉酶或它们的组合。在RSH步骤中存在大量的植酸。因此，在优选的实施方案中，如前面所述，植酸酶可用于促进从植酸(myo-inositol hexakisphosphate)或其任何盐(植酸盐)中释放无机磷酸。
在另一个优选的实施方案中，在RSH方法中将产麦芽糖α-淀粉酶与脂肪酸氧化酶结合使用。
本发明所述的发酵方法和组合物优选应用于醇的生产方法中(例如，用作燃料或燃料添加剂的乙醇)，更优选使用粗淀粉水解方法。使用如本发明所述的方法，例如可提高乙醇生产的速度和/或产率。加入至少一种有效量的脂肪酸氧化酶可用于改善发酵产品的乙醇产率。
乙醇生产方法通常包括磨碎、液化、糖化、发酵和蒸馏步骤。在生产乙醇和其它的基于淀粉的产品中，需要粉碎原料例如全粒，优选玉米，以便破坏结构然后进行下一步加工。根据本发明优选使用两种方法：湿法磨碎和干法磨碎。优选使用干法磨碎生产乙醇，其中将整个籽粒磨碎然后在后面的步骤中使用。也可使用湿法磨碎并且可很好的分离微生物和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)，除少数情况外湿法磨碎在平行生产糖浆时使用。湿法和干法磨碎方法是本领域所公知的。
在乙醇生产中，发酵生物优选酵母，将其应用于麦芽浆。酵母优选来源于酵母菌属(Saccharomyces spp.)，更优选来于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在优选的实施方案中，将酵母加入麦芽浆，然后发酵进行24-96小时，例如典型的为35-60小时。在优选的实施方案中，温度通常为26-34℃，特别是大约为32℃，PH值通常为PH3-6，优选大约为PH4-5。施用的酵母细胞的量优选为105-1012，优选为107-1010，特别是为每毫升发酵肉汤中活酵母计数为5×107。在乙醇产生阶段酵母细胞计数优选在107-1010范围内，特别是大约为2×108。关于使用酵母用于发酵的更多指导可参见，例如，″The alcohol Textbook″(Editors K.Jacques，T.P Lyons and D.R.Kelsall，Nottingham University Press，United Kingdom1999)，在此将其引入作为参考。
发酵后，可蒸馏麦芽浆以提取醇产品(乙醇)。在根据本发明方法获得的最终产品是乙醇的情况，其可用作例如燃料乙醇；饮用乙醇，即饮用酒精；或工业乙醇。
另一方面本发明涉及一种生产乙醇的方法，包括(a)磨碎全粒；(b)液化步骤(a)的产品；(c)糖化液化的物质；(d)使用微生物来发酵糖化的物质，其中发酵方法还包括使发酵培养基与至少一种脂肪酸氧化酶相接触。
脂肪酸氧化酶和附加的酶以及刺激剂可以是上面提到的任一种。脂肪酸氧化酶优选是脂氧化酶。
最后本发明涉及一种组合物，所述组合物含有脂肪酸氧化酶和一种或多种选自由酯酶、植酸酶、漆酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶例如α-淀粉酶或葡糖淀粉酶或它们的混合物组成的酶。在一个优选的实施方案中脂肪酸氧化酶是脂氧化酶(LOX)，优选上面所提到的任一种。在一个实施方案中组合物还含有脂肪酶和任选的α-淀粉酶，组合物还可含有脂肪酶和任选的α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。
材料和方法
脂肪酸氧化酶：脂氧化酶来源于Magnaporthe salvinii，其公开于WO02/086114(可购自丹麦的Novozymes A/S)。
脂肪酶：LIPOLASETM100L(购自丹麦的Novozymes A/S)
葡糖淀粉酶：SPIRIZYME FUEL(购自Novozymes A/S)
蛋白酶：NOVOZYMTM50006(购自丹麦Novozymes A/S)
酵母：乙醇红，购自美国Red Star/Lesaffre
方法：
回槽的制备：
从发酵醪(beer)解吸塔(stripper)柱中离心发酵的粗淀粉后的离心分离液。
脂氧化酶活性：
脂氧化酶活性可在25℃下通过监测氢过氧化物的形成采用分光光度来测定。对于标准分析方法，将10微升酶加入到含980微升25mM的磷酸钠缓冲液(PH7.0)和10微升底物溶液(10mM分散有0.2％(v/v)Tween20的亚油酸(不应保存时间过长))的1m1石英池中。通常将酶足够稀释以确保在第一时间内最大使加入的底物转换10％。吸收在234nm进行，其吸收率可通过曲线的直线部分来估计。假定顺式-反式-共轭的羟基(过氧)脂肪酸具有的分子消光系数为23,000M-1cm-1。
α-淀粉酶活性(KNU)
可采用马铃薯淀粉作为底物来测定淀粉分解活性。该方法以由酶破坏修饰的马铃薯淀粉为基础，随后通过使淀粉/酶溶液样品和碘溶液混和进行反应。最初形成微黑-蓝色，但分解淀粉期间蓝色变弱，然后逐渐变成红褐色，将其与有色玻璃标准比较。
1Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)的定义为在标准条件下(即在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和PH5.6)糊精化5260mg可溶性Merck Amylum淀粉干燥物所需要酶的量。
这种分析方法在文件EB-SM-0009.02/01中作了更详细地描述，其可从丹麦的Novozymes A/S索取得到，在此将其引入作为参考。
植酸酶活性
植酸酶活性以FYT单位来计量，在下列条件下：PH5.5；温度37℃；底物：浓度为0.0050mol/L的植酸钠(C6H6O24P6Na12)，1 FYT是指每分钟释放1毫摩尔无机正磷酸盐所需要酶的量。
FAU活性测定
1真菌α-淀粉酶单位(FAU)是指基于下列标准条件下每小时分解5.26g淀粉(Merck Amylum的可溶性Erg.B.6，批号9947275)所需要的酶的量：
底物........可溶性淀粉
温度........37℃
pH............4.7
反应时间.........7-20分钟
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)测试
酸性α-淀粉酶活性以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)来计量，其相对于酶的标准来确定。
使用的标准是AMG300L(丹麦Novozymes A/S，野生型黑曲霉属G1葡糖淀粉酶，还公开于Boel et al.(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)和WO92/00381)。在这一AMG的中性α-淀粉酶经在室温下存储3星期后从大约1FAU/mL降至低于0.05FAU/mL。
在这一AMG标准中的酸性α-淀粉酶活性根据下列说明来确定。在该方法中，1AFAU是指在标准条件下每小时分解5.260mg淀粉干物质所需的酶的量。
碘与淀粉而不是与其降解物形成蓝色络合物。颜色的强度与淀粉的浓度成正比。使用反向比色法如在所规定的分析条件下通过淀粉浓度的降低来测定淀粉酶活性。
       α-淀粉酶
淀粉+碘→糊精+低聚糖
       40℃，pH2.5
蓝/紫  t＝23秒褪色
标准条件/反应条件：(每分钟)
底物：           淀粉，大约0.17g/L
缓冲液：         柠檬酸盐，大约0.03M
碘(I2)：         0.03g/L
CaCl2：          1.85mM
pH：             2.50±0.05
孵育温度：       40℃
反应时间：       23秒
波长：           λ＝590nm
酶浓度：         0.025AFAU/mL
酶工作范围：     0.01-0.04AFAU/mL
如需更详细的细节，可在EB-SM-0259.02/01中找到，其可从丹麦的Novozymes A/S得到，在此并入本发明作为参考。
酸性α-淀粉酶单位(AAU)
酸性α-淀粉酶活性可以AAU(酸性α-淀粉酶单位)来计量，其是一个绝对的方法。一个酸性淀粉酶单位(AAU)是在标准条件下与强度已知等同于某一颜色基准的碘溶液反应后，将1g淀粉(100％干料)转变成在620nm能传输(transmission)的产品每小时所需的酶的量。
标准条件/反应条件：
底物：      浓度大约为20g DS/L的可溶性淀粉
缓冲液：    柠檬酸盐，大约O.13M，pH=4.2
碘溶液：    40.176g碘化钾+0.088g碘/L的
自来水：    15°-20°dH(德国度硬度)
PH：        4.2
孵育温度：  30℃
反应时间：  11分钟
波长：      620nm
酶浓度：    O.13-O.19AAU/mL
酶工作范围：O.13-O.19AAU/mL
淀粉应该是Lintner淀粉，它是一种用于实验室的作为比色指示的低稠性(thin-boiling)淀粉。Lintner淀粉是通过稀盐酸处理天然淀粉而获得的从而使其保持遇碘变蓝色的性能。在EP014041082中作了更详细的描述，在此将其并入作为参考。
测定葡糖淀粉酶活性(AGI)
葡糖淀粉酶(相当于淀粉葡萄糖苷酶)使淀粉转变成葡萄糖。在此通过葡萄糖氧化酶方法测定活性来测定葡萄糖的量。所述方法在下列文献中作了描述：参见″Approved methods of the American Association of CerealChemists″的76-11章节starch-Glucoamylase Method with subsequentMeasurement of Glucose with Glucose Oxidase.Vo1.1-2 AACC.AmericanAssociation of Cereal Chemists，(2000)；ISBN：1-891127-12-8。
1葡糖淀粉酶单位(AGI)是指在方法的标准条件下每分钟形成1微摩尔葡萄糖所需要的酶的量。
标准条件/反应条件：
底物：可溶性淀粉，浓度大约为16g干燥物质/L。
缓冲液：柠檬酸盐，大约0.04M，pH＝4.3
pH：4.3
孵育温度：60℃
反应时间：15分钟
中止反应：加入NaOH至浓度大约为0.2g/L(PH～9)
酶浓度：0.15-0.55AAU/mL
淀粉应该是Lintner淀粉，它是一种用于实验室的作为比色指示的低稠性淀粉。Lintner淀粉是通过稀盐酸处理天然淀粉而获得的从而使其保持遇碘变蓝色的性能。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
所述Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件37℃和PH4.3底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟下水解1微摩尔麦芽糖每分钟所需的酶的量。
可使用自动分析仪系统。往葡萄糖脱氢酶试剂中加入变旋酶以使存在的任一α-D-葡萄糖转变成β-D-葡萄糖。葡糖脱氢酶专一地与上述反应中的β-D-葡萄糖反应，形成NADH，其如同测量最初的葡萄糖浓度那样通过使用光度计在340nm测定。
AMG孵育
底物 麦芽糖23.2mM
缓冲液 乙酸盐0.1M
PH： 4.30±0.05
孵育温度 37℃±1
反应时间 5分钟
酶工作范围 0.5-4.0AGU/mL
颜色反应
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 0.12M磷酸盐；0.15M NaCl
PH： 7.60±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
更详细地描述这种分析方法的文件EB-SM-0131.02/01可从丹麦的Novozymes A/S索取得到，在此将其引入作为参考。
测定角质酶活性(LU)
如同测定脂解活性，可采用三丁酸甘油酯(tributyrine)作为底物来测定角质酶活性。所述方法基于酶水解三丁酸甘油酯，然后作为时间的函数来记录碱的消耗量。1脂肪酶单位(LU)定义为在标准条件下(即30℃；PH7.0；阿拉伯树胶(Gum Arabic)作为乳化剂和三丁酸甘油酯作为底物)释放1微摩尔可滴定的丁酸每分钟所需的酶的量。更详细地描述这种分析的方法在文件AF95/5可从丹麦的Novozymes A/S索取得到，在此将其引入作为参考。
木聚糖分解(Xylanolytic)活性(FXU)
可用FXU单位表示木聚糖分解活性，其用remazol-木聚糖(用RemazolBrilliant Blue R染色的4-O-甲基-D-glucurono-D-木聚糖，Fluka)作为底物在PH6.0下来测定。
用remazol-木聚糖底物孵育木聚糖酶样品。通过乙醇沉淀不降解的染色底物的底色。在上层清液中保留的蓝色(在585nm分光光度测定)与木聚糖酶活性成正比，然后相对于酶的标准在标准反应条件即在50.0℃、PH6.0和30分钟的反应时间下测定木聚糖酶单位。
更详细地描述这种分析方法的文件EB-SM-352.02/01可从丹麦的Novozymes A/S索取得到，在此将其引入作为参考。
测定产麦芽糖淀粉酶(Maltogenic Amylase)活性(MANU)
1MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位)可定义为在每毫升0.1M柠檬酸盐缓冲液PH5.0浓度为每毫升10mg麦芽三糖(Sigma M8378)底物下37℃和30分钟的反应时间，释放1微摩尔麦芽糖每分钟所需要的酶的量。
纤维素分解(Cellulytic)活性(EGU)
纤维素分解(cellulytic)活性可以内-葡聚糖酶单位来计算，其用羧甲基纤维素(CMC)作为底物在PH6.0来测定。制备底物溶液，其在PH6.0下在0.1M磷酸盐缓冲液中含有34.0g/L CMC(Hercules7LFD)的底物溶液。将要分析的酶样品在同一缓冲液中溶解。将5ml底物溶液和0.15ml酶溶液混和，然后转移至振动粘度计(例如法国Sofraser的MIVI3000)，在40℃恒温30分钟。1 EGU定义为在这些条件下使粘度减至一半所需要酶的量。反应混合物中酶样品的量应调至0.01-0.02EGU/mL。将主要标准(archstandard)定义为880EGU/g。
更详细地描述这种分析方法的文件EB-SM-0275.02/01可从丹麦的Novozymes A/S索取得到，在此将其引入作为参考。
实施例
实施例1
测定基于亚油酸的脂肪酸氧化酶活性
使用具有TriOxmatic300氧电极和4ml的标准反应容量的″Oxi3000Oximeter″(WTW，Weilheim，德国)。
将10mg亚油酸(10ml60％亚油酸)溶于1ml乙醇，然后加入2微升Tween20。将50微升这一底物原液加入含有3.85ml缓冲溶液(Britton-Robinson：100mM磷-、醋-和硼酸；用NaOH调节PH)的反应烧杯中，该反应烧杯还装备有使溶液很好混和的小搅动棒，将氧电极插入反应烧杯。加入100微升纯化的酶溶液，即，(a)来源于Magnaporthe salvinii的脂氧化酶浓度大约为0.4mg/ml；或(b)来源于Gaeumannomyces graminis的脂氧化酶浓度大约为0.76mg/ml(其意味着在最终的反应中大约为0.02mg/ml)。这些脂氧化酶的制备如前面所述。温度为25℃。测量溶解的氧的浓度(mg/l)并以时间(分钟)作为函数绘图。加入酶之后，计算曲线线性部分的斜率作为酶活性(mg/l/min)。当相关时用减法矫正基线，意思指在加入脂肪酸氧化酶(即对照物)之前，如果以时间作为函数显示氧浓度的曲线具有大于大约0.05mg氧/ml/分钟的斜率，则将该值从样品的斜率值中减去。
下面的表1列出了实验结果。
表1
脂肪酸氧化酶
PH (a)源于M.Salvinii的LOXmgO2/ml/分钟 源于G.Graminis的LOXmgO2/ml/分钟
2 0.0 0.0
4 0.4 0.1
5 0.7 0.4
6 1.1 0.4
7 1.0 0.4
8 0.7 0.5
9 0.8 0.4
10 0.7 0.4
11 0.6 0.2
实施例2
脂肪酸氧化酶
如下面所描述来对四种酶进行检测，即两种漆酶和两种脂氧化酶。来源于Polyporus pinsitus的漆酶具有65kDa SDSMW65kDa、3.5、和在PH5.5下60℃的最佳温度。来源于灰鬼伞属(Coprinus cinereus)的漆酶具有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳MW67-68kDa、用IEF的pI3.5-3.8和在PH7.5下65℃的最佳温度。酶的制备和纯化如在WO96/00290和美国专利US6,008,029中所描述的方法进行。这两种脂氧化酶来源于Magnaporthe salvinii和Gaeumannomyces graminis，它们的制备方法如前面所描述的。
调节酶的剂量以确保在234nm/530nm每分钟增加的吸光度最大，即每分钟在0.1-0.25吸光度单位的范围。
底物溶液：将11.65mg亚油酸(60％)和溶于乙醇的12.5m10.56mM丁香醛连氮(Sigma)与去离子水相混和以达到25ml的总体积。
将要测试的50微升酶制剂转移至含有900微升磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0)和50微升底物溶液的石英池中。所述石英池置于分光光度计(spectrofotometer)中，恒温于23℃，在234nm和530nm测量作为时间的函数的吸光度。吸光度在530nm指示为丁香醛连氮的降解，而吸光度在234nm指示为亚油酸的降解。以时间为函数的吸光度增量可基于2-4分钟的反应时间来计算，即d(A234)/dt，以及d(A530)/dt。
结果如下列表2中所示。四种酶中仅有两种脂氧化酶符合如本文中所定义的脂肪酸氧化酶。这是因为仅有这两种酶的RRD＝反应速率差＝(dA234/dt-dA530/dt)>0。
表2
酶 dA530/dt(单位/分钟) dA234/dt(单位/分钟) dA234/dt-dA530/dt(单位/分钟)
Polyporus pinsitus漆酶 0.20 0.002* -0.20
Magnaporthe salvin ii脂氧化酶 0.0001* 0.13 0.13
Coprinus cinereus漆酶 0.17 -0.001* -0.17
Gaeumannomyces graminis脂氧化酶 -0.03* 0.21 0.21
*是指等同于0活性(分析误差)
实施例3
含50％w/w回槽的LSF
粗淀粉水解(RSH)以下列方式进行：乙醇红酵母(Ethanol Red yeast)于500rpm和32.2℃下在0.02％DS NOVOZYM50006TM存在下有氧增殖8小时。通过混和粉碎的玉米(2-mm筛)、自来水和回槽来制备玉米淤浆，然后用磷酸调节PH至5。回槽的含量为液相的50％w/w，SP288，0.8AFAU/gDS、SPIRIZYMETM FUEL、2AGU/gDS。在填充配置有空气塞的25ml发酵罐之前，将酵母繁殖立即导入淤浆中。空气塞具有0.2-μm针筒式滤器以防止油的回流和微生物污染。发酵在32.2℃进行64小时。当发酵完成时，发酵罐在3,000rpm，20℃离心15分钟。迫使上层清液通过0.45-um过滤器并通过HPLC分析。
表1
回槽，％ 乙醇，％v/v
对照物 19.81
50 17.77
RSH中回槽浓度对64小时乙醇产率的影响。数据是在不同时间进行的7次发酵的平均。表1表明往发酵培养基中加入回槽降低了乙醇的产率。
实施例4
用Maqnaporthe salvinii脂氧化酶预处理发酵培养基和50％回槽的LSF
重复如实施例3中所进行的实验，其中使用发酵培养基，所述发酵培养基用脂氧化酶和发酵培养基中掺有脂肪酶的脂氧化酶预处理。
表2
脂氧化酶活性，U/g DS 脂肪酶 活性，LU/g DS 在发酵醪中的乙醇，％v/v
0 - - 17.77
9.3 - - 18.76
9.3 LIPOLASETM100L 5 19.13
表2表明1)脂氧化酶和2)脂氧化酶和脂肪酶预处理发酵培养基增加了乙醇的产率。

Claims (17)

1.一种在发酵培养基中生产发酵产品的方法，所述方法含有发酵步骤，包括将发酵培养基暴露于至少一种脂肪酸氧化酶。
2.权利要求1的方法，其中所述脂肪酸氧化酶是脂氧化酶，优选来源于酿酒酵母、普通嗜热放线菌、Fusarium oxysporum、Fusarium proliferatum、棉状嗜热丝孢菌、Pyricularia oryzae、地霉属菌株、禾顶囊壳或Magnaporthesalvinii。
3.权利要求1的方法，其中发酵微生物是酵母。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述发酵产品是乙醇。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中发酵步骤是同时糖化和发酵方法(SSF)或液化、糖化和发酵方法(LSF)中的一部分。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中发酵在一种或多种酶的存在下进行，所述酶选自酯酶、植酸酶、纤维素、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶、α-淀粉酶或葡糖淀粉酶。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中发酵是干法磨碎方法或湿法磨碎方法中的一部分。
8.权利要求7的方法，其中用于磨碎方法的原料是含淀粉的原料，例如玉米、小麦、大麦或买罗高梁。
9.一种生产乙醇的方法，包括(a)磨碎全粒；(b)液化步骤(a)的产品；(c)糖化液化的物质；(d)使用微生物发酵糖化的物质，其中发酵方法还包括使发酵培养基与至少一种脂肪酸氧化酶相接触。
10.权利要求9的方法，进一步还包括蒸馏发酵的物质。
11.权利要求9或10的方法，其中所述方法是同时液化和糖化方法(SSF)或同时液化、糖化和发酵方法(LSF)。
12.权利要求9-11中任一项的方法，其中所述方法包括加入一种或多种酶，所述酶选自酯酶例如脂肪酶或角质酶、植酸酶、纤维素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶或其混合物。
13.权利要求9的方法，其中所述脂肪酸氧化酶是脂氧化酶。
14.权利要求9的方法，其中所述微生物是酵母。
15.一种组合物，其含有脂肪酸氧化酶和一种或多种酶，所述酶选自酯酶、植酸酶、纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶或其混合物。
16.权利要求15的组合物，其中所述脂肪酸氧化酶是脂氧化酶。
17.权利要求15或16的组合物，进一步还含有脂肪酶。
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