CN101138545B - 一种含有人参皂苷Rg2的包合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有人参皂苷Rg2的包合物及其制备方法。本发明包合物由人参皂苷Rg2与羟丙基-β-环糊精组成。本发明包合物的制备方法为：制备羟丙基β环糊精水溶液；在羟丙基β环糊精溶液保持水浴，加入人参皂苷Rg2提取物干粉或用溶媒溶解后的液态人参皂苷Rg2提取物，搅拌，包合；获得液态包合物，干燥得包合物。本发明包合物具有增加心脏灌流量、增加血流速度、扩张动、静脉管径，改善微循环障碍、改善心肌缺血或抗血栓作用，并明显降低人参皂苷Rg2的急性毒性。

Description

一种含有人参皂苷Rg2的包合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种药物包合物及其质量控制方法，特别涉及一种含有人参皂苷Rg₂的包合物及其质量控制方法。

背景技术

人参中含有许多种人参皂苷，目前已清楚的成分有30多种，其中人参皂苷Rg₂(Ginsengnoside Rg₂)属早年被分离的已知化合物。90年代以前，对该化合物的医疗用途，不尽清楚，故未被开发应用。研究表明，该化合物具有人参皂苷C-20(S)和C-20(R)两种异构体，但该化合物在水中溶解度很差，难以制备注射剂。

本发明人在2000年度申请了《人参皂苷Rg₂在制备心、脑血管疾病药物中的应用》的发明专利(中国专利ZL01102117.9)，继之于2004年又申请了《人参皂苷Rg₂的制备方法及其药物包合物在制药中的应用》的发明专利(中国专利200410086457.5)。自从环糊精系列产品问世以来，人们对羟丙基β环糊精的用途颇有重视，该产品的所用领域越来广泛，大大提高了药物的溶解度和生物利用度。故本发明选择毒性低、水溶性大的羟丙基β环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin HP-βCD)作为包合材料，制备了人参皂苷Rg₂羟丙基β环糊精包合物，其包合物将用于预防或治疗血栓性疾病及微循障碍相关疾病。

发明内容

本发明目的在于公开一种含有人参皂苷Rg₂的药物包合物，本发明另一目的在于提供该包合物的冻干粉针剂及其质量控制方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的药物包合物的原料组成为：

人参皂苷Rg₂提取物2-4重量份  羟丙基-β-环糊精  10重量份

上述原料的最佳配比关系是：

人参皂苷Rg₂提取物2重量份  羟丙基-β-环糊精  10重量份

人参皂苷Rg₂提取物3重量份  羟丙基-β-环糊精  10重量份

人参皂苷Rg₂提取物4重量份  羟丙基-β-环糊精  10重量份

上述人参皂苷Rg₂包合物可以由如下方法制备：

a、制备8-12％(优选10％)羟丙基β环糊精水溶液；

b、在羟丙基β环糊精溶液保持40～90℃(优选80℃)水浴，加入人参皂苷Rg₂提取物干粉或用溶媒溶解后的液态人参皂苷Rg₂提取物，搅拌0.5-3小时(优选1小时)，包合；

c、获得液态包合物，干燥得包合物。

本发明药物包合物按照常规工艺加入常规辅料制成临床或药学上接受的剂型，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液体剂、缓释制剂、滴丸、注射剂或冻干粉针剂。

本发明所述人参皂苷Rg₂是C-20(S)人参皂苷Rg₂单一构型、C-20(R)人参皂苷Rg₂单一构型和/或C-20(RS)人参皂苷Rg₂混合构型。本发明所用人参皂苷Rg₂提取物优选50％以上纯度的人参皂苷Rg₂。本发明所用人参皂苷Rg₂提取物可以由已有常规方法制备。步骤C中的干燥是指喷雾干燥、减压干燥或冷冻干燥。

相关辅料是指淀粉，滑石粉，糖，矫味剂，可溶性淀粉，糊精类，乙醇，聚乙二醇，丙二醇，植物油，明胶，以及吐温等其它表面活性剂。还包括稀释剂(如水)、赋形剂(如：淀粉、蔗糖等；粘合剂，如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮)、湿润剂(如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物)、表面活性剂(如十六烷醇)或润滑剂(如滑石粉、硬脂酸钙和镁和聚乙二醇等)。另外还可以在组合物中加入其它辅剂(如香味剂、甜味剂等)。

本发明上述药物包合物冻干粉针剂的制备方法如下：

取人参皂苷Rg₂提取物，加入到8-12％羟丙基-β-环糊精溶液中，溶液保持80～90℃水浴，边加边搅拌，加完后，继续搅拌0.5-2小时，冷却，加注射用水至450-550体积份，用G3垂熔漏斗滤至澄明，再用0.2μm的微孔滤膜滤过，得澄明滤液，灌装，冷冻干燥，封盖。

本发明上述药物包合物冻干粉针剂的优选制备方法如下：

取人参皂苷Rg₂提取物，加入到10％羟丙基-β-环糊精溶液中，溶液保持80～90℃水浴，边加边搅拌，加完后，继续搅拌0.5小时，冷却，加注射用水至500体积份，用G 3垂熔漏斗滤至澄明，再用0.2μm的微孔滤膜滤过，得澄明滤液，灌装，冻干，封盖。

本发明上述包合物制备方法及冻干粉针剂制备方法中搅拌速度为100-140rpm，优选120rpm。

本发明重量份与体积份的比例关系是g/ml。搅拌速度120rpm。

本发明冻干粉针剂的质量控制方法，其中指纹图谱的检测方法如下：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，B为水，按0.01分钟32：68；60分钟42：58；60.01分钟32：68比例进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；检测波长为203nm。理论板数按20(R)-人参皂苷Rg₂峰计算应不低于9000；参照物溶液的制备：精密称取20(R)-人参皂苷Rg₂对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.6mg的溶液，即得；供试品溶液的制备：本发明人参皂苷Rg₂包合物干燥粉末50mg或含人参皂苷Rg₂l5mg的冻干粉针剂1支，加3ml甲醇溶解进样；测定法：照高效液相色谱法，分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪测定，记录10～60分钟内各峰的保留时间和积分面积，检测阈值(最小峰面积)设定为总峰面积的0.5％；应有2个共有峰，以4号峰为参照峰S，计算各指纹峰相对面积及相对保留时间，非共有峰总面积占总峰面积的百分比应小于5％；相对保留时间0.890～0.984，优选0.937，相对峰面积比值为0.762～1.142，优选0.9529。

附图说明：

图1：为人参皂苷Rg₂冻干粉标准指纹图谱

图2：为包合物与羟丙基-β-环糊精和人参皂苷Rg₂提取物物理混合图谱

图3：10批人参皂苷Rg₂冻干粉指纹图谱

图4：10批人参皂苷Rg₂冻干粉指纹图谱全谱相似度

图5：10批人参皂苷Rg₂冻干粉指纹图谱峰面积相似度

图6：量热曲线图

图7：量热曲线图

图8：量热曲线图

本发明所制备的包合物易溶于水，溶于含水乙醇，不容于乙醚、苯。X射线衍射图谱显示衍射图谱图形几何拓扑与特征峰均与人参皂苷Rg₂、羟丙基β环糊精间存在很大的差异，表明物质存在状态发生了变化。

差示扫描量热法曲线图显示，包合物中，C-20(RS)人参皂苷Rg₂提取物的熔点峰(178.62℃)消失，而在192.43℃产生新的熔点峰。

本发明所制备的人参皂苷Rg₂羟丙基β环糊精包合物增加正常或垂体后叶素所致离体心脏灌流量、增加血流速度、扩张动、静脉管径，改善微循环障碍、改善心肌缺血、抗血栓作用，并明显降低人参皂苷Rg₂的急性毒性。

下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1溶解性的考察对比实验

注射用人参皂苷Rg₂提取物的原料为人参皂苷Rg₂提取物，因此，注射用人参皂苷Rg₂提取物生产工艺的关键在于人参皂苷Rg₂提取物在注射剂中的溶解程度和能使人参皂苷Rg₂提取物稳定的环境。由于人参皂苷Rg₂提取物在水中极微溶，通过包和技术增大人参皂苷Rg₂在水中的溶解度。

为了考察人参皂苷Rg₂提取物在水中的溶解性，精密称取人参皂苷Rg₂提取物100mg，共4份，加入新煮沸蒸馏水数毫升，用混合振荡器混合溶解5分钟，后于80℃水浴中溶解5分钟，冷却后观察。人参皂苷Rg₂包合物以人参皂苷Rg₂为计，精密称取人参皂苷Rg₂包合物1700mg，按上法观察溶解度。

表1人参皂苷Rg₂提取物水溶性考察

表1结果表明，人参皂苷Rg₂提取物在水中极微溶，常温下人参皂苷Rg₂溶解度为0.1mg/ml。

表2人参皂苷Rg₂包合物水溶性考察

表2结果显示，人参皂苷Rg₂羟丙基β环糊精包合物为170mg/ml以上，以人参皂苷Rg₂提取物为计，相当于39.3mg/ml以上。表明，经过包合后其溶解度明显增加。

实验例2人参皂苷Rg₂提取物、羟丙基-β-环糊精包合工艺优选

人参皂苷Rg₂提取物在水中极微溶，故制备人参皂苷Rg₂提取物-羟丙基-β-环糊精包合物，增加其在水中的溶解度，并冷冻干燥制成粉针剂。影响包合工艺的因素有主(羟丙基-β-环糊精)客(人参皂苷Rg₂提取物)分子之间的质量比、包合温度、搅拌时间及搅拌速度。

表3因素水平

(1)实验方法：按照主客重量比分别称取羟丙基-β-环糊精(10g)，置烧杯中，加水100ml溶解，制成10％的溶液。人参皂苷Rg₂提取物加入量、包合温度、搅拌时间及搅拌速度分别按L9(3⁴)正交表设计方案执行，包合过程中注意保持溶液体积恒定。包合液0.2μm微孔滤膜滤过，真空冷冻干燥，称重，计算包合物收率，测定包合率。包合物收率采用重量法计算，即冻干后重量除以人参皂苷Rg₂提取物、羟丙基-β-环糊精投料重；包合率计算以人参皂苷Rg₂为指标，即冻干物中人参皂苷Rg₂的量除以人参皂苷Rg₂提取物投料中人参皂苷Rg₂的量，人参皂苷Rg₂的含量采用高效液相色谱测定，方法见质量标准含量测定项。

(2)结果：以包合物收率和包合率综合评分，其中包合物收率权重为20％，包合率权重为80％。

表4正交试验方案及结果

(3)数据处理：分别对人参叶总皂苷收率和人参皂苷Rg₂含量进行极差分析和方差分析。

表5方差分析结果

表6方差分析结果

因素B为显著影响因子，影响因素大小顺序为B＞A＞D，最佳组合为A3B2D2。因此最佳包合工艺为主(羟丙基-β-环糊精)客(人参皂苷Rg₂提取物)分子之间的质量比为10∶3、包合温度80℃、搅拌时间1小时、搅拌速度120rβm。

实验例3 X射线衍射分析法对包合物的鉴定实验

考察包合前后相变化，通过比较包合物与羟丙基-β-环糊精和人参皂苷Rg₂提取物物理混合图谱，判断包合是否成功。

C_U靶/石墨单色器，电压30kV，电流20mA，扫描速度0.1°/s，采样时间为1s，扫描范围0～80°，分别得人参皂苷Rg₂提取物-羟丙基-β-环糊精包合物(图2A、B)、人参皂苷Rg₂提取物、羟丙基-β-环糊精物理混合物(图2C)、羟丙基-β-环糊精(图2D)、人参皂苷Rg₂提取物(图2E)。

羟丙基-β-环糊精的X射线衍射图无明显的晶型峰产生，说明为无定型粉末；人参皂苷Rg₂提取物衍射图谱有多个特异性结晶峰产生，人参皂苷Rg₂提取物、羟丙基-β-环糊精物理混合为两种物质的叠加，由于受环糊精量的影响，人参皂苷Rg₂提取物的峰均有下降，但其特征峰均存在，说明人参皂苷Rg₂提取物未被包合，两者仅为物理混合；人参皂苷Rg₂提取物、羟丙基-β-环糊精包合物衍射图谱中人参皂苷Rg₂提取物的特征峰已消失，提示由于主客分子之间的相互作用，环糊精分子将人参皂苷Rg₂提取物包合，人参皂苷Rg₂的晶型消失，形成新的物相。结果表明：人参皂苷Rg₂提取物与羟丙基-β-环糊精已经形成包合物。

实验例4差示量热扫描法对包合物的鉴定实验

取人参皂苷Rg₂提取物、羟丙基-β-环糊精、两者物理混合物、人参皂苷Rg₂提取物包合物适量，置差式扫描热分析仪样品室中，升温速度为10℃/min，温度范围25～300℃，分别记录样品的差示量热扫描升温曲线。差示扫描量曲线图显示，人参皂苷Rg₂提取物在178.62℃和248℃出现两个吸热峰，而包合物中，C-20(RS)人参皂苷Rg₂提取物的熔点峰(178.62℃)消失，而在192.43℃产生新的吸热峰。结果见量热曲线图6、7、8。

实验例5包合物对豚鼠离体心脏灌流的影响

试验采用Langendonff法，取豚鼠击其头部致昏迷，迅速开胸暴露心脏，剪破心包膜，剪断上下腔静脉，肺动脉，主动脉及心脏周围，摘取心脏立即放入含氧的冷LOCKE液玻璃器皿内。

轻轻挤压心脏，排空心脏内残留血液，将主动脉固定于灌流装置中的心脏套管上，左心尖夹一蛙心夹。通过肌力换能器输入二道生理记录仪，观察心脏搏动情况。适度调整心脏与液面高度。用氧饱和的LOCKE液，进行灌流，稳定10分钟后，由侧管内注入所试药物，体积为0.2毫升，观察心率、收缩振幅及冠脉流量。所试阳性对照为硝酸甘油10μg；人参皂苷Rg₂羟丙基β环糊精包合物(HP-βCD-Rg₂)以人参皂苷Rg₂提取物为计，分成大(5mg)、小(2.5mg)；溶媒为羟丙基β环糊精(16.5mg)。

若进行垂体后叶素所致离体心脏灌流试验时，其灌流液中加入垂体后叶素40U/L，其他同前。

结果显示，人参皂苷Rg₂羟丙基β环糊精包合物对正常或垂体后叶素所致离体心脏灌流量均明显增加，而对心率、收缩振幅无明显变化。

实验例6包合物对大鼠微循环障碍的影响

选用体重180-250g健康大鼠56只，均分7组，生理盐水组、溶媒，对照组(羟丙基β环糊精)、阳性对照组(山莨菪硷2.5mg/kg)和人参皂甙Rg₂羟丙基β环糊精包合物以人参皂苷Rg₂提取物为计，大(10mg/kg)、中(5mg/kg)小(2.5mg/kg)三个剂量组。

各组动物以3％水合氯醛作腹腔麻醉后，背部固定于镜下手术台。将腹部毛剪净，于右侧腹壁作3cm切口，轻轻拉出一段空肠绊，铺于恒温水淤池中。以有机玻璃板轻压固定，池中温度保持在37℃。依次大鼠尾静脉注射给药，5分钟后，舌静脉注射6ml/kg 10％高分子右旋糖酐，镜下观察给药后不同时间的大鼠肠系膜动静脉管径、流速、网交点及流态变化程度。以给药前变化程度作为百分之百，计算变化％。

结果显示，人参皂甙Rg₂羟丙基β环糊精包合物对大鼠肠系膜动、静脉血流速度明显增加，且其动、静脉管径均也明显扩张，网焦点数增加，粒流改善为线流。表明，人参皂甙Rg₂羟丙基β环糊精包合物改善微循环障碍。

表9人参皂甙Rg2羟丙基β环糊精包合物大鼠肠系膜动脉流速的影响(x±s。n＝8)

与溶媒组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与生理盐水组比较^#P＜0.05  ^##P＜0.01  ^###P＜0.001

表10人参皂甙Rg2羟丙基β环糊精包合物大鼠肠系膜静脉流速的影响(x±s。n＝6)

与溶媒组比较：*＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与生理盐水组比较^#P＜0.05  ^##P＜0.01  ^###P＜0.001

表11人参皂甙Rg2羟丙基β环糊精包合物大鼠肠系膜动脉管径的影响(x±s。n＝6)

与溶媒组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与生理盐水组比较^#P＜0.05  ^##P＜0.01  ^###P＜0.001

表12人参皂甙Rg2羟丙基β环糊精包合物大鼠肠系膜静脉管径的影响(x±s。n＝6)

与溶媒组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与生理盐水组比较^#P＜0.05  ^##P＜0.01  ^###P＜0.001

实验例7人参皂苷Rg₂羟丙基β环糊精包合物对家兔心肌缺血再灌注损伤的影响

纯种大耳白兔56只，雌雄各半，体重2.0-3.0kg，由，均分为7组，每组8只。生理盐水组、溶媒、对照组，用2％戊巴比妥钠20mg/kg经耳缘静脉缓慢注入，麻醉后固定于兔台，去胸前毛，沿胸正中线剪开皮肤，从剑突上沿胸骨正中线开胸，以小型开胸器扩开切口使心脏暴露良好，勿破坏胸膜，以眼科镊轻提起心包，小心剪开，用止血钳提起左心耳，用3×8圆针，0000号丝线，于左冠脉前降支(LAD)与冠脉出口下方3mm处结扎LAD(线下放一细硅胶管)，造成心肌缺血，30min后结扎处打开，再灌注前5min静注各种药物，然后再灌注120min。实验分7组：正常对照组不开胸，至实验结束时迅速开胸心脏采血；假手术组：开胸LAD下穿线不结扎；模型组：静注羟丙基β环糊精22.86mg/kg；人参皂甙Rg₂羟丙基β环糊精包合物以人参皂苷Rg₂提取物为计，大(5.2mg/kg)、中(2.6mg/kg)小(1.3mg/kg)三个剂量组；阳性对照组(盐酸尼卡地平注射液0.25mg/kg)。用药体积按2ml/kg计。

血心肌酶测定每组均从心脏左心室采血(肝素防凝)，3000rpm离心15min，取上清，用自动生化分析仪检测血CPK(MB)，LDH和AST的水平。

心肌MDA、NEFA含量、SOD活性测定  试验结束、取血后迅速剪取心脏，沿冠状沟剪开取左室肌，用4℃生理盐水冲净血迹后，取心肌加入4℃0.1M PBS制成10％的心肌组织匀浆，3000rpm离心15min，取上清液按试剂盒要求测MDA、NEFA含量及SOD活性。并同时测定心肌组织总蛋白(TP)。

所有试验数据以均值±标准差(x±s)表示，应用t检验判断组间均数差异显著性。结果见表13、14。

结果显示，人参皂甙Rg₂羟丙基β环糊精包合物三个用药组与模型组比较可明显降低CK-MB、LDH、AST和MDA含量，提高SOD活性，降低游离脂肪酸含量，与对照组相比教差异显著。表明人参皂甙Rg₂羟丙基β环糊精包合物对对家兔心肌缺血再灌注损伤具有显著的保护作用。

表13包合物对缺血/再灌注损伤后血心肌酶的影响(X±S，n＝8)

与模型组比较，^#P＜0.01，*P＜0.05

表14包合物对缺血/再灌注损伤后抗自由基的作用(X±S，n＝8)

与模型组比较，^#P＜0.01，*P＜0.05

实验例8人参皂苷Rg₂羟丙基β环糊精包合物对犬急性心肌缺血模型的影响

健康杂种犬42只，随机分为7组，每组6只，将背位固定，用烧灼器切开颈部皮肤，分离气管进行气管插管，连接呼吸机，正压2.8-4kPa。分离右侧颈动脉，插管连接压力换能器，测定动脉血压(BP)。分离右侧股动脉，插心室导管，连接压力换能器，记录LVSP。经耦合放大器，记录LVEDP，经微分处理器记录±dp/dt。分离右侧股静脉以备给药用。连接心电电极，记录标II导联心电图(ECG)，计算心率(HR)；犬右侧卧位，于第4肋间开胸，暴露心脏；分离冠状动脉前降支下、中、上部备线待结扎，分离主动脉根部和冠状动脉左旋支放置适宜电磁流量计探头，测量主动脉流量(CO)和冠状动脉血流量(CBF)。用湿布式电极，测量心外膜电图(EECG)；按文献方法，分离冠状动脉前降支(LDA)，从LDA下1/3开始结扎，以EECG的ST段抬高＞2mv以上为心肌缺血模型。

药物治疗：模型组静脉滴注生理盐水溶液2ml/kg；溶剂组给予羟丙基β-环糊精溶液17.2mg/kg，用生理盐水配制2ml/kg；阳性对照组给予硝酸甘油注射液0.015mg/kg加入生理盐水溶液2ml/kg；人参皂甙Rg₂羟丙基β环糊精包合物大、中、小剂量组分别为4.3，8.6，17.2mg/kg加入生理盐水溶液2ml/kg给药。

记录正常、缺血和给药后5，10，20，30，60，120，180，240，300，360分钟的变化。观察冠脉流量、心输出量和以ST段升高总mv数(Σ-ST)表示心肌缺血程度，以ST段抬高≥2mv的导联数表示心肌缺血范围(N-ST)。缺血360分钟时，取动脉血10ml分离血清，用722-分光光度计待测血清中LA、AST、CK、SOD、MDA、含量。实验结束摘取心脏称全心重。然后将左心室横切成1cm厚的心肌片，将心肌片放入0.5％的氯化硝基四氮唑兰溶液中染色，测量左心室、梗塞区心肌组织面积，计算梗塞心肌组织面积占左心室面积百分率。

所有实验数据用均值±标准差(x±s)表示，进行组间实测值及变化百分率显著性t检验。

试验结果：模型组心肌缺血后CBF、CO、均下降，与对照组比较差异显著；溶剂组与模型组相似；人参皂甙Rg₂羟丙基β环糊精包合物各剂量组和硝酸甘油组改善CBF、CO。

模型组心肌缺血后∑-ST和N-ST明显升高，各剂量组在给药后均能明显降低，；各剂量组心肌梗塞组织面积占左心室面积百分率明显低于模型组；

模型组心肌缺血后血清中AST、CK、LA、和MDA明显增加，SOD含量显著降低，而大、中剂量组给药后明显降低AST、CK、LA、和MDA的含量，增加血清SOD水平。

表19参力宝对心肌缺血犬血清酶等的影响(^x±s，n＝6)

与对照组比较^#P＜0.05  ^##P＜0.01与模型组比较*P＜0.05  **P＜0.01

实验例9包合物对大鼠血栓形成的影响实验

体重180-250g雄性大鼠48只，均分6组，生理盐水组、溶媒对照组(羟丙基β环糊精43)、阳性对照组(丹参注射液g/kg)和人参皂甙Rg₂羟丙基β环糊精包合物大(43mg/kg)、中(21.5mg/kg)小(11.5mg/kg)三个剂量组。所试药物静脉注射3天后，在戊巴比妥钠麻醉下，分离茎动脉，放置刺激电极，给予1.5mV直流电7分钟以损伤动脉内皮细胞，使血管内逐渐形成血栓，再用体内血栓形成议，测定血栓形成时间

表20包合物对大鼠血栓形成的影响

结果显示，人参皂苷Rg₂羟丙基β环糊精包合物明显延长血栓形成时间，且其作用强度随剂量增加而增强.表明，该包合物有明显的抗血栓作用.

实验例10人参皂苷Rg₂急性毒性试验

(1)、人参皂苷Rg₂腹腔注射(ip)小鼠急性毒性试验

药物配制：

称取人参皂苷Rg₂600mg，加入2.0ml 1，2-丙二醇，再加入1.0ml吐温-80，充分研磨，然后逐滴加注射用水配成30mg·ml^-1的人参皂苷Rg₂溶液，备用。

另取包合物2.15g(内含Rg₂量500mg)，加生理盐水至10ml，即Rg₂50mg·ml^-1，备用。

分组及给药：将小鼠均分7组，每组10只，药液按1∶0.8的比例，分别ip人参皂苷Rg₂或包合物。观察小鼠的外观、行为，死亡数，连续观察14天。用Bliss法计算小鼠的LD₅₀。

实验结果：ip人参皂苷Rg₂或包合物后，中毒严重的小鼠15～30min开始，出现烦躁不安、继而呼吸急促，20～35min抽搐，死亡。中毒较轻的小鼠25～40min开始，出现轻微烦躁不安、继而倦怠，2～4h开始恢复，24h后完全恢复。所测得的包合物LD50明显高于人参皂苷Rg₂，表明包合物对小鼠的腹腔急性毒性明显低于人参皂苷Rg₂。结果见表21。

(2)、人参皂苷Rg₂静脉注射(iv)大鼠急性毒性试验

药物配制：

称取人参皂苷Rg₂1680mg，用1，2-丙二醇和聚乙二醇400各7.0ml，然后逐滴加5％注射用葡萄糖溶液至42ml，加热使之溶解，配成40mg·ml^-1溶液，灭菌，备用。

另取包合物2.15g(内含Rg₂量500mg)，加生理盐水至10ml，即Rg₂50mg·ml^-1，备用。

分组及给药：将大鼠均分6组，按1∶0.9的比例，分别iv人参皂苷Rg₂。观察大鼠的外观、行为，死亡数连续观察14天。用Bliss法计算大鼠的LD₅₀。

实验结果：iv人参皂苷Rg₂或包合物后，中毒严重的大鼠4～6min开始，出现倦怠、呼吸急促，10～15min四肢松弛，50～80min死亡。中毒较轻的大鼠6～8min开始，出现倦怠、呼吸略急促，30～35min呼吸平稳，2～2.5h开始恢复，24h后完全恢复。

对中毒死亡的大鼠心、肝、脾、肺、肾等器官肉眼观察均未见异常。所测得的包合物LD50明显高于人参皂苷Rg₂，表明包合物对大鼠的急性毒性明显低于人参皂苷Rg₂。结果见表21。

(3)、人参皂苷Rg₂静脉注射(iv)Beagle犬急性毒性试验

药物配制：

称取人参皂苷Rg₂20g，用1，2-丙二醇和聚乙二醇400各250ml，加入5％的注射用葡萄糖溶液配成40mg·ml^-1浓度，灭菌，临用前用上述灭菌溶媒稀释成所需浓度，备用。

取Rg₂包合物冻干粉128.98g(内含Rg₂量30g)，用生理盐水配Rg₂100mg·ml^-1浓度，临用前用上述灭菌羟丙基倍他环糊精溶液稀释成所需浓度。

分组及给药：在预试的基础上分成4组，每组雌雄各半：另设溶媒组。给药体积为5ml/kg，iv推注速度为10ml/min.

观察记录：试验按ALD法测得犬的近似致死量范围。见表。

给药后立即观察犬的外观、行为，并记录所有动物中毒症状、死亡及尸解情况，连续观察14天。

实验结果：iv人参皂苷Rg₂或包合物后，中毒时2～3min开始，出现呼吸急促，垂头、四肢松弛，呕吐，3h内均死亡。溶媒及羟丙基倍他环糊精溶液组无明显症状及死亡，

对中毒死亡的犬心、肝、脾、肺、肾等器官肉眼观察均未见异常。

所测得的包合物ALD明显高于人参皂苷Rg₂，表明包合物对犬的急性毒性明显低于人参皂苷Rg₂。结果见表21。

表21人参皂苷Rg₂及其包合物的LD50测定

实验例11人参皂苷Rg₂冻干粉指纹图谱相似度分析实验

选用指纹图谱相似度评价软件(FP-CASE)，由湖南中南大学梁逸曾教授领衔开发，为药典会认可的两个软件之一。将指纹图谱得到的积分数据经软件计算处理，得到人参皂苷Rg₂冻干粉指纹图谱相似度评价结果如下。指纹图谱的全谱相似度分析结果

图3为10批人参皂苷Rg₂冻干粉的指纹图谱，对10批样品取其平均色谱或中位数色谱作为对比的标样，进行相似度分析，结果示于图3，从图3的结果可以看出，10批人参皂苷Rg₂冻干粉具有较好的相似度，相关系数≥0.9。

指纹图谱的谱峰面积相似度分析结果：为进一步证实用全谱进行相似度分析结果，又对图谱峰峰面积的相似度也进行了分析，分析结果见图5，其相关系数均在0.9～1之间。

下列实施例均能实现上述实验例的效果。

具体实施方式

实施例1：取人参皂苷Rg₂提取物15kg，羟丙基-β-环糊精50kg，按常规工艺制成胶囊剂，每粒0.45g。

实施例2：取人参皂苷Rg₂提取物11kg，羟丙基-β-环糊精62kg，按常规工艺制成片剂，每片0.45g。

实施例3：取人参皂苷Rg₂提取物18kg，羟丙基-β-环糊精46kg，按常规工艺制成口服液，每支10ml。

实施例4：取人参皂苷Rg₂提取物15kg，羟丙基-β-环糊精60kg，按常规工艺制成颗粒剂，每袋6g。

实施例5：取人参皂苷Rg₂提取物15kg，羟丙基-β-环糊精50kg，制备9％羟丙基β环糊精水溶液；在羟丙基β环糊精溶液保持50-60℃水浴，加入人参皂苷Rg₂提取物，搅拌1小时，包合；

获得液态包合物，冷冻干燥得包合物。。

实施例6：取人参皂苷Rg₂提取物11kg，羟丙基-β-环糊精62kg，制10％羟丙基β环糊精水溶液；在羟丙基β环糊精溶液保持40～90℃水浴，加入人参皂苷Rg₂提取物，搅拌1.5小时，包合；获得液态包合物，喷雾干燥得包合物。

实施例7：取人参皂苷Rg₂提取物18kg，羟丙基-β-环糊精46kg，制备11％羟丙基β环糊精水溶液；在羟丙基β环糊精溶液保持70～90℃水浴，加入人参皂苷Rg₂提取物，搅拌2小时，包合；获得液态包合物，减压干燥得包合物。

实施例8：取人参皂苷Rg₂提取物15kg，羟丙基-β-环糊精60kg，制备12％羟丙基β环糊精水溶液；在羟丙基β环糊精溶液保持40～90℃水浴，加入固体或液态人参皂苷Rg₂提取物，搅拌2.5小时，包合；获得液态包合物，干燥得包合物。

实施例9：人参皂苷Rg₂提取物冻干粉针剂的制备工艺

人参皂苷Rg₂提取物    15g

羟丙基-β-环糊精     50g

注射用水             500ml

取人参皂苷Rg₂提取物，分次加入到10％羟丙基-β-环糊精溶液中(80～90℃水浴)，边加边搅拌，加完后，继续搅拌半小时，冷却，加注射用水至500ml，用G3垂熔漏斗滤至澄明，再用微孔滤膜(0.2μm)滤过，得澄明滤液，灌装(每瓶0.5ml)，冻干，封盖，即得。

实施例10：本发明人参皂苷Rg₂冻干粉指纹图谱检测

仪器：LC-2010高效液相色谱仪，CLASS-VP工作站。色谱柱：Luna C₁₈(4.6mm×250mm)色谱分析柱。

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，B为水，按0.01分钟32∶68；60分钟42∶58；60.01分钟32∶68比例进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；检测波长为203nm。理论板数按20(R)-人参皂苷Rg₂峰计算应不低于9000；参照物溶液的制备：精密称取20(R)-人参皂苷Rg₂对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.6mg的溶液，即得；供试品溶液的制备：本发明人参皂苷Rg₂包合物干燥粉末50mg或含人参皂苷Rg₂15mg的冻干粉针剂1支，加3ml甲醇溶解进样；测定法：照高效液相色谱法，分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪测定，记录10～60分钟内各峰的保留时间和积分面积，检测阈值(最小峰面积)设定为总峰面积的0.5％；应有2个共有峰，以4号峰为参照峰S，计算各指纹峰相对面积及相对保留时间，非共有峰总面积占总峰面积的百分比应小于5％；相对保留时间0.937，相对峰面积比值为0.9529。

表22 10批人参皂苷Rg₂冻干粉指纹图谱绝对保留时间

表23 10批人参皂苷Rg₂冻干粉指纹图谱相对保留时间

以上10批注射液的相对保留时间的平均值，作为标准指纹图谱的相对保留时间，以平均值的±5％作为相对保留时间允许变动范围，。供试品指纹图谱中各共有峰的相对保留时间应在此范围内。

表24人参皂苷Rg₂冻干粉指纹图谱相对保留时间及允许范围

表25 10批本发明人参皂苷Rg₂冻干粉指纹图谱单峰面积占总峰面积百分比

表26 10批人参皂苷Rg₂冻干粉指纹图谱相对峰面积比值

由上述10批注射液的指纹图谱，确定本发明人参皂苷Rg₂冻干粉标准指纹图谱。

实施例11：取按常规工艺制成胶囊剂。

实施例12：取实施例6的人参皂苷Rg2包合物，按常规工艺制成片剂。

实施例13：取实施例7的人参皂苷Rg2包合物，按常规工艺制成口服液。

实施例14：取实施例8的人参皂苷Rg2包合物，按常规工艺制成颗粒剂。

Claims (17)

1.一种含有人参皂苷Rg₂的包合物，其特征在于该包合物的原料如下：人参皂苷Rg₂提取物3重量份、羟丙基-β-环糊精10重量份；该包合物由如下方法制备：

a、制备8-12％羟丙基β环糊精水溶液；

b、在羟丙基β环糊精溶液保持40～90℃水浴，加入人参皂苷Rg₂提取物干粉或用溶媒溶解后的液态人参皂苷Rg₂提取物，搅拌0.5-3小时，包合；

c、获得液态包合物，干燥得包合物。

2.如权利要求1所述的包合物，其特征在于人参皂苷Rg₂是C-20(S)人参皂苷Rg₂单一构型、C-20(R)人参皂苷Rg₂单一构型和/或C-20(RS)人参皂苷Rg₂混合构型。

3.如权利要求1所述的包合物，其特征在于人参皂苷Rg₂提取物的纯度为50％以上。

4.如权利要求1、2或3所述的包合物，其特征在于包合物按常规方法，加入常规辅料，制成片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液体剂、缓释制剂、滴丸、注射剂或冻干粉针剂。

5.如权利要求1、2或3所述的包合物的制备方法，其特征在于该方法为：

a、制备8-12％羟丙基β环糊精水溶液；

b、在羟丙基β环糊精溶液保持40～90℃水浴，加入人参皂苷Rg₂提取物干粉或用溶媒溶解后的液态人参皂苷Rg₂提取物，搅拌0.5-3小时，包合；

c、获得液态包合物，干燥得包合物。

6.如权利要求5所述包合物的制备方法，其特征在于该方法中C步骤的干燥为喷雾干燥、减压干燥或冷冻干燥。

7.如权利要求4所述包合物中冻干粉针剂的制备方法，其特征在于该方法为：取人参皂苷Rg₂提取物，加入到8-12％羟丙基-β-环糊精溶液中，溶液保持80～90℃水浴，边加边搅拌，加完后，继续搅拌0.5-2小时，冷却，加注射用水至450-550体积份，用G3垂熔漏斗滤至澄明，再用0.2μm的微孔滤膜滤过，得澄明滤液，灌装，冷冻干燥，封盖。

8.如权利要求7所述包合物中冻干粉针剂的制备方法，其特征在于该方法为：取人参皂苷Rg₂提取物，加入到10％羟丙基-β-环糊精溶液中，溶液保持80～90℃水浴，边加边搅拌，加完后，继续搅拌0.5小时，冷却，加注射用水至500体积份，用G 3垂熔漏斗滤至澄明，再用0.2μm的微孔滤膜滤过，得澄明滤液，灌装，冻干，封盖。

9.如权利要求4所述的包合物的质量检测方法，其特征在于其中冻干粉针剂的指纹图谱的检测方法如下：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，B为水，按0.01分钟32∶68；60分钟42∶58；60.01分钟32∶68比例进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；检测波长为203nm，理论板数按20(R)-人参皂苷Rg2峰计算应不低于9000；参照物溶液的制备：精密称取20(R)-人参皂苷Rg₂对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.6mg的溶液，即得；供试品溶液的制备：本发明人参皂苷Rg₂包合物干燥粉末50mg或含人参皂苷Rg₂15mg的冻干粉针剂1支，加3ml甲醇溶解进样；测定法：照高效液相色谱法，分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪测定，记录10～60分钟内各峰的保留时间和积分面积，检测阈值(最小峰面积)设定为总峰面积的0.5％；应有2个共有峰，以4号峰为参照峰S，计算各指纹峰相对面积及相对保留时间，非共有峰总面积占总峰面积的百分比应小于5％；相对保留时间0.890～0.984，相对峰面积比值为0.762～1.142。

10.如权利要求9所述的包合物的质量检测方法，其特征在于其中所述相对保留时间为0.937，相对峰面积比值为0.9529。

11.如权利要求1、2或3所述的包合物在制备具有增加心脏灌流量、增加血流速度、扩张动、静脉管径，改善微循环障碍、改善心肌缺血或抗血栓作用的药物中的应用。

12.如权利要求1所述的包合物，其特征在于该包合物由如下方法制备：

a、制备10％羟丙基β环糊精水溶液；

b、在羟丙基β环糊精溶液保持80℃水浴，加入人参皂苷Rg₂提取物干粉或用溶媒溶解后的液态人参皂苷Rg₂提取物，搅拌1小时，包合；

c、获得液态包合物，干燥得包合物。

13.如权利要求5或6所述包合物的制备方法，其特征在于该方法中搅拌速度为100-140rpm。

14.如权利要求13所述包合物的制备方法，其特征在于该方法中搅拌速度为120rpm。

15.如权利要求7或8所述包合物中冻干粉针剂的制备方法，其特征在于该方法中搅拌速度为100-140rpm。

16.如权利要求15所述包合物中冻干粉针剂的制备方法，其特征在于该方法中搅拌速度为120rpm。

17.如权利要求5或6所述包合物的制备方法，其特征在于该方法为：

a、制备10％羟丙基β环糊精水溶液；

b、在羟丙基β环糊精溶液保持80℃水浴，加入人参皂苷Rg₂提取物干粉或用溶媒溶解后的液态人参皂苷Rg₂提取物，搅拌1小时，包合；

c、获得液态包合物，干燥得包合物。

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