CN101130794A - 固定化微生物发酵丙酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了固定化微生物发酵丙酸的生产方法，它是采用费氏丙酸杆菌试管斜面菌种，摇瓶放大培养，种子罐扩大培养等步骤，离心收集菌体，制成菌悬液，加入玉米芯粉吸附，加入4％～6％海藻酸钠溶液，再加3％～5％的聚乙烯醇，搅拌1～2h。随后滴到2％～4％的氯化钙溶液中固定化，发酵液经孔径为1～2μm膜过滤、阴离子交换树脂静态吸附、洗脱树脂、浓缩结晶得到纯度≥95％丙酸产品。本发明采用吸附－包埋结合的固定化丙酸菌细胞发酵丙酸，解除了产物反馈抑制，提高了菌体使用率，有利于丙酸的提取，使发酵生产丙酸的水平得到较大提高，更适合丙酸的大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，特别涉及一种固定化微生物发酵生产丙酸的方法。
背景技术
丙酸(propiornic acid以下简称PA)及其盐是理想的饲料抗真菌剂，在食品、医药、香料，除草剂以及可生物降解塑料等领域也具有重要用途。我国作为世界饲料生产大国，对丙酸的需求量很大，并且呈现逐年递增的态势。
固定化细胞技术是20世纪70年代兴起的一种生物技术。所谓固定化细胞技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持催化活性、反复使用的方法。细胞被固定化后细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、能实现连续操作，可以大大提高生产能力等优势。
丙酸的生产方法分为化学合成法和微生物发酵法。现有公开的化学合成法包括：①轻质烃氧化合成醋酸副产法，②乙烯碳基合成法(Reppe工艺)，③乙醇羰基化法，④丙烯酸加氢法，丙醛氧化法，化学合成法污染重、成本高、操作条件苛刻，不符合全球环保意识不断增强的潮流，因此，人们逐渐把注意力投向了微生物发酵法。从上世纪20年代起，人们开展了大量发酵法生产丙酸的研究，取得了不少进展，但是发酵法却始终未能完全替代化学合成法。主要原因由于丙酸菌的生长会受到发酵终产物(丙酸、乙酸)的抑制，因此发酵液中丙酸浓度较低以及副产物乙酸的存在，增加了丙酸提取的难度；发酵法的总成本高于化学合成法。多年来，业界人士围绕上述问题进行了大量研究工作。
固定化细胞方法按照固定化载体与作用方式的不同，可分为吸附法、包埋法、共价结合法、交联法。其中的吸附法又叫载体结合法，是依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和粘附力的作用，而使微生物细胞固定在载体表面和内部形成生物膜的方法，可分为物理吸附法和离子吸附法两种。此法较为简便，活力损失较小，但细胞与载体作用力小，易脱落。
包埋法是将微生物细胞包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜聚合物的超滤膜内。根据载体材料和方法的不同，包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两种。凝胶包埋法是将细胞包埋在各种凝胶内部的微孔中而使细胞固定的方法；半透膜包埋法是将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内而使细胞固定的方法。此法简单，条件温和，稳定性好，包埋细胞容量高。
共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。此法的优点是细胞与载体结合紧密，不易脱落，但制备较难，且活力损失较大。
交联法是利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团(如氨基酸、羟基、硫基、咪唑基)发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其结合力是共价键。此法制备麻烦，活力损失较大，但细胞与载体结合较紧。
固定化细胞技术的关键在于所采用的固定化载体材料的性能。理想的固定化载体应具有对微生物无毒性、传质性能好、性质稳定、寿命长、价格低廉等特性。目前所采用的固定化载体材料主要包括：有机高分子载体、无机载体和复合载体三类。有机高分子载体又可分为天然高分子载体(如琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶等)和合成有机高分子凝胶载体(如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光硬化树脂等)。天然高分子凝胶载体一般对生物无毒性，传质性能好，但强度低，厌氧下易被微生物分解，寿命短；合成高分子凝胶载体一般而言强度较大，但传质性能较差，进行细胞固定时对细胞活性有影响。无机载体(如陶珠、活性炭、沙粒等)大多具有多孔结构，与微生物接触时利用吸附和电荷效应把微生物固定。具有机械强度大、对微生物无毒性、不易生物分解、耐酸碱、成本低等特性且制作简单易行，只需把载体放入含有微生物一定浓度的溶液中浸泡一段时间即可。复合载体是由有机载体材料和无机载体材料结合而成，使两类材料在许多性能上互补。
固定化细胞方式在有机酸发酵中应用广泛，用于生产丙氨酸，L(+)酒石酸等有机酸。首次获得生产丙氨酸的细胞固定化工艺条为：1.2％的聚乙烯亚胺和0.9％的戊二醛分别处理20min和10min，在以CaCO3为中和剂时，固定化细胞生产丙氨酸时比发酵过程产生更少的副产物，转化液的色度降低了75.6％，而糖酸转化率从60.5％提高到76.4％，丙氨酸产量也从58.2g/L提高到68g/L。固定化细胞的半衰期约670h。进行固定化细胞清洁生产丙氨酸的中试结果表明清洁生产不仅比化学合成法极大地减少了污染物的排放(每吨产品减少废水40t，废渣4.5t，而且比发酵法生产中减少了酸碱和溶剂的用量和废水的产生(每吨产品至少减少废水45t).
发明内容
本发明的目的在于采用吸附和包埋结合的固定化丙酸菌细胞发酵丙酸，解除产物反馈抑制，并提高菌体使用率，也用利于丙酸的提取，使发酵生产丙酸的水平达到较大提高。
为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下：
固定化微生物发酵丙酸的生产方法，其特征在于包括以下步骤：(1)菌种培养(2)固定化费氏丙酸菌(3)液体深层发酵(4)丙酸的提取工艺，其中：
(1)菌种培养：以为生产菌种采用费氏丙酸菌Propionibacteriafreudenreichii试管斜面菌种，摇瓶放大培养，种子罐扩大培养；
(2)固定化费氏丙酸菌：将放大培养菌种，无菌管道输入到连续离心机离心收集菌体，然后加入种子罐原种子发酵液体积1/20-1/15体积的无菌水制成菌悬液，再加入菌悬液体积(升)1/8-1/6的玉米芯粉(公斤)或“加入菌悬液体积(升)重量(公斤)比1∶8-1∶6的玉米芯粉”，搅拌吸附时间1-2h；加入4％-6％浓度无菌的海藻酸钠溶液，加入体积为菌悬液体积的1.5-2.5倍，然后再加无菌3％-5％浓度的聚乙烯醇，加入体积为菌悬液体积的0.5-1.5倍，搅拌1-2h；无菌输入滴注器连续滴入菌悬液体积5-10倍的2％-4％浓度的氯化钙溶液中，无菌常温静置2-3h，放出氯化钙溶液，将固定化好的菌体无菌输入倒液体发酵罐终。
(3)液体深层发酵：液体发酵培养基(g/L)：蛋白胨2-4g，蔗糖5-15g，酵母膏2-4g，甘油5-15ml，磷酸铵2-6g，碳酸钙4-8g，硝酸铵1-3g，乳酸钠2-6ml，pH＝7.2-7.4；控制罐内温度30-35℃，罐压0.01-0.02MPa，连续搅拌，发酵时间36-48h，丙酸含量达20-40g/L发酵液，然后将发酵液放出，进入提取工序，再于发酵罐中再补充无菌新发酵液，液体发酵液体积为固定化菌体体积的10-50倍；
(4)丙酸提取工序：发酵液经孔径为1-2μm，膜过滤去处微生物菌体和大分子杂质，过滤操作压力为0.02-0.03MPa，操作温度25-30℃；滤液调节pH值到6.0-6.5，然后进行阴离子交换树脂静态吸附，滤液与阴离子树脂体积重量比为10∶1-15∶1，搅拌速率为20-50转/分钟，吸附温度25-30℃，吸附时间3.5-4.5小时；去除上清液，洗脱树脂，洗脱液经超滤膜超滤浓缩，采用截留分子量为5000-6000道尔顿的超滤膜进行错流过滤，超滤操作压力为0.2-0.6MPa，温度15-30℃，经结晶得到无色透明的晶体粉末，丙酸纯度≥95％丙酸产品。
本发明所述的生产方法中斜面菌种培养：是将丙酸杆菌使用相应培养基并加入15-25g琼脂，在28-35℃条件下静止培养20-48时，放入4℃冰箱保存；其中摇瓶培养条件：温度25-40℃，转速80-180转/分钟，时间19-30h；种子罐培养条件：温度25-40℃，通风量9-13m3/h，罐压0.02-0.09MPa，时间19-60小时。
本发明所述的生产方法中玉米芯粉是经过40目筛粉碎合高温灭菌制得。本发明所采用的阴离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂例如D301、D311、D330、D201等等。
本发明所用菌种和菌种相应使用的培养基见下表：
菌种及所用培养基 表1
| 序号 | 菌名(中文、拉丁文) | 编号 | 斜面培养基 |
| 1 | 费氏丙酸杆菌Propionibacteriafreudenreichii | IFFI.10019 | 基本培养基(g/L)：蛋白胨10，蔗糖20，酵母膏10，磷酸铵5(pH＝7.2-7.4) |
本发明采用吸附和包埋结合的固定化丙酸菌细胞发酵丙酸的生产发法的积极效果在于：采用吸附-包埋联合方法克服了丙酸菌生长受到发酵终产物(丙酸、乙酸)抑制的不利因素，提高了发酵液中丙酸的浓度，减低了副产物乙酸的存在，增加了丙酸提取的效率。同时采用本发明的固定化细胞清洁生产丙氨酸不仅比化学合成法极大地减少了污染物的排放，而且减少了发酵法生产中酸碱和溶剂的用量，减少了废水的排放，更适应大规模的工业化生产。
说明书附图：
图1为固定化微生物发酵丙酸的生产工艺流程图。
具体实施方式
下面结合实施例及工艺流程图进一步的说明本发明的实施方式。
实施例1
菌种及所用培养基 表1
| 序号 | 菌名(中文、拉丁文) | 编号 | 斜面培养基 |
| 1 | 费氏丙酸杆菌Propionibacteriafreudenreichii | IFFI.10019 | 基本培养基(g/L)：蛋白胨10，蔗糖20，酵母膏10，磷酸铵5(pH＝7.2-7.4) |
固定化丙酸菌发酵丙酸的生产方法，包括以下步骤：(1)菌种培养(2)固定化费氏丙酸菌(3)液体深层发酵(4)丙酸的提取工艺：
(1)其中菌种培养工序：以为生产菌种采用费氏丙酸菌Propionibacteria freudenreichii试管斜面菌种，摇瓶放大培养，种子罐扩大培养方法。斜面菌种培养：基本培养基(g/L)：蛋白胨10，蔗糖20，酵母膏10，磷酸铵5(pH＝7.2-7.4)。上述菌种使用相应培养基并加入15g琼脂，在28℃条件下静止培养20小时，放入4℃冰箱保存；其中摇瓶培养条件：温度25℃，转速80转/分钟，时间19h；种子罐培养条件：温度25℃，通风量9m3/h，罐压0.02MPa，时间19小时。
(2)固定化费氏丙酸菌工序：由种子罐放大培养，无菌管道输入到连续离心机离心收集菌体。然后加入种子罐原种子发酵液体积1/20体积的无菌水制成菌悬液，加入菌悬液体积(升)1/8的玉米芯粉(公斤)或“加入菌悬液体积(升)重量(公斤)比1∶8的玉米芯粉”，玉米芯粉经过40目筛粉碎合高温灭菌，然后进行搅拌吸附时间1h。吸附完成后加入4％浓度无菌的海藻酸钠溶液，加入体积为菌悬液体积的1.5倍，然后再加无菌3％的聚乙烯醇，加入体积为菌悬液体积的0.5倍，搅拌1h。无菌输入滴注器连续滴入菌悬液体积5倍的2％浓度的氯化钙溶液中，无菌常温静置2h，然后放出氯化钙溶液，将固定化好的菌体无菌输入倒液体发酵罐。
(3)液体发酵工序：液体发酵培养基(g/L)：蛋白胨2g，蔗糖5g，酵母膏2g，甘油5ml，磷酸铵2g，碳酸钙4g，硝酸铵1g，乳酸钠2ml，pH＝7.2。控制罐内温度30℃，罐压0.01MPa，连续搅拌，发酵时间36h，丙酸含量达20g/L发酵液，然后将发酵液放出，进入提取工序，再于发酵罐中在补充无菌新发酵液。液体发酵液体积为固定化菌体体积的10倍。
(4)丙酸提取工序：发酵液经膜过滤去处微生物菌体和大分子杂质，滤膜孔径为1～2μm，过滤操作压力为0.02MPa，操作温度25℃。滤液调节pH值到6.0，然后进行阴离子交换树脂(D301或D311)静态吸附，滤液与阴离子树脂体积重量比为10∶1，搅拌速率为20转/分钟，吸附温度25℃，吸附时间3.5小时。去除上清液，洗脱树脂，洗脱液经超滤膜超滤浓缩，采用截留分子量为5000～6000道尔顿的超滤膜进行错流过滤，超滤操作压力为0.2MPa，温度15℃。经结晶得到丙酸产品。丙酸产品：无色透明的晶体粉末，丙酸纯度≥95％(HPLC方法检测)。
实施例2
菌种及所用培养基表1
| 序号 | 菌名(中文、拉丁文) | 编号 | 斜面培养基 |
| 1 | 费氏丙酸杆菌Propionibacteriafreudenreichii | IFFI.10019 | 基本培养基(g/L)：蛋白胨10，蔗糖20，酵母膏10，磷酸铵5(pH＝7.2-7.4) |
(1)菌种培养工序：以为生产菌种采用费氏丙酸菌Propionibacteriafreudenreichii试管斜面菌种→摇瓶放大培养→种子罐扩大培养方法。斜面菌种培养：上述菌种使用相应培养基并加入25g琼脂，在35℃条件下静止培养48小时，放入4℃冰箱保存；其中摇瓶培养条件：温度40℃，转速180转/分钟，时间30h；种子罐培养条件：温度40℃，通风量13m3/h，罐压0.09MPa，时间60小时。
(2)固定化费氏丙酸菌工序：由种子罐放大培养，无菌管道输入到连续离心机离心收集菌体。然后加入种子罐原种子发酵液体积1/15体积的无菌水制成菌悬液，加入菌悬液体积(升)1/6的玉米芯粉(公斤)或“加入菌悬液体积(升)重量(公斤)比1∶6的玉米芯粉”，玉米芯粉经过40目筛粉碎合高温灭菌，然后进行搅拌吸附时间2h。吸附完成后加入6％无菌海藻酸钠溶液，加入体积为菌悬液体积的2.5倍，然后再加无菌5％浓度的聚乙烯醇，加入体积为菌悬液体积的1.5倍，搅拌2h。无菌输入滴注器连续滴入菌悬液体积10倍的4％浓度的氯化钙溶液中，无菌常温静置3h，然后放出氯化钙溶液，将固定化好的菌体无菌输入到液体发酵罐。
(3)液体发酵工序：液体发酵培养基(g/L)：蛋白胨4g，蔗糖15g，酵母膏4g，甘油15ml，磷酸铵6g，碳酸钙8g，硝酸铵3g，乳酸钠6ml，pH＝7.4。控制罐内温度35℃，罐压0.02MPa，连续搅拌，发酵时间48h，丙酸含量达40g/L发酵液，然后将发酵液放出，进入提取工序，再于发酵罐中在补充无菌新发酵液。液体发酵液体积为固定化菌体体积的50倍。
(4)丙酸提取工序：发酵液经膜过滤去处微生物菌体和大分子杂质，滤膜孔径为1～2μm，过滤操作压力为0.03MPa，操作温度30℃。滤液调节pH值到6.5，然后进行阴离子交换树脂(D330或D201)静态吸附，滤液与阴离子树脂体积重量比为15∶1，搅拌速率为50转/分钟，吸附温度30℃，吸附时间4.5小时。去除上清液，洗脱树脂，洗脱液经超滤膜超滤浓缩，采用截留分子量为5000～6000道尔顿的超滤膜进行错流过滤，超滤操作压力为0.6MPa，温度30℃。经结晶得到丙酸产品。丙酸产品：无色透明的晶体粉末，丙酸纯度≥95％(HPLC方法检测)。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术方案范围之内。
Claims (4)
1.一种固定化微生物发酵丙酸的生产方法，其特征在于包括以下步骤：菌种培养、固定化费氏丙酸菌、液体深层发酵、丙酸的提取工艺其中：
(1)菌种培养：以为生产菌种采用费氏丙酸菌Propionibacteriafreudenreichii试管斜面菌种，摇瓶放大培养，种子罐扩大培养；
(2)固定化费氏丙酸菌：将放大得到的培养菌种，无菌管道输入到连续离心机，离心收集菌体，然后加入种子罐原种子发酵液体积1/20-1/15体积的无菌水制成菌悬液，再加入菌悬液体积1/8-1/6公斤的玉米芯粉，搅拌吸附1-2h；加入4％-6％浓度无菌的海藻酸钠溶液，加入体积为菌悬液体积的1.5-2.5倍，然后再加3％-5％浓度的聚乙烯醇，加入体积为菌悬液体积的0.5-1.5倍，搅拌1-2h；采用无菌输入连续滴注器滴入菌悬液体积5-10倍的2％-4％浓度的氯化钙溶液中，无菌常温静置2-3h，放出氯化钙溶液，将固定化好的菌体无菌输入倒液体发酵罐中。
(3)液体深层发酵：液体发酵培养基(g/L)：蛋白胨2-4g，蔗糖5-15g，酵母膏2-4g，甘油5-15ml，磷酸铵2-6g，碳酸钙4-8g，硝酸铵1-3g，乳酸钠2-6ml，pH＝7.2-7.4；控制罐内温度30-35℃，罐压0.01-0.02MPa，连续搅拌，发酵时间36-48h，丙酸含量达20-40g/L发酵液，然后将发酵液放出，进入提取工序，再于发酵罐中再补充无菌新发酵液，液体发酵液体积为固定化菌体体积的10-50倍；
(4)丙酸提取工序：发酵液经孔径为1-2μm膜过滤去处微生物菌体和大分子杂质，过滤操作压力为0.02-0.03MPa，操作温度25-30℃；滤液调节pH值到6.0-6.5，然后进行阴离子交换树脂静态吸附，滤液与阴离子树脂体积重量比为10∶1-15∶1，搅拌速率为20-50转/分钟，吸附温度25-30℃，吸附时间3.5-4.5小时；去除上清液，洗脱树脂，洗脱液经超滤膜超滤浓缩，采用截留分子量为5000-6000道尔顿的超滤膜进行错流过滤，超滤操作压力为0.2-0.6MPa，温度15-30℃，经结晶得到无色透明的晶体粉末，丙酸纯度≥95％丙酸产品。
2.如权利要求1所述的生产方法，其中的斜面菌种培养：是将丙酸杆菌使用相应培养基并加入15-25g琼脂，在28-35℃条件下静止培养20-48小时，放入4℃冰箱保存；其中摇瓶培养条件：温度25-40℃，转速80-180转/分钟，时间19-30h；种子罐培养条件：温度25-40℃，通风量9-13m3/h，罐压0.02-0.09MPa，时间19-60小时。
3.如权利要求1所述的生产方法，其中的玉米芯粉是经过40目筛粉碎合高温灭菌制得。
4.如权利要求1所述的生产方法，其中的阴离子交换树脂为大孔弱碱性阴离子交换树脂。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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