CN101130766A

CN101130766A - 一种提高黄素氧化酶活力的方法

Info

Publication number: CN101130766A
Application number: CNA2006100304784A
Authority: CN
Inventors: 杨晟; 郑华宝; 陈军; 杨蕴刘; 姜卫红
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Zhejiang Huarui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2006-08-25
Filing date: 2006-08-25
Publication date: 2008-02-27
Anticipated expiration: 2026-08-25
Also published as: CN100519744C

Abstract

本发明公开了一种提高黄素氧化酶催化效率的方法，构建出用于表达VHb和用于表达VHb和DAO结合在一起的融合蛋白HVDAO的重组大肠杆菌菌株；在固定化DAO催化头孢菌素C氧化的反应体系中加入VHb；实验表明，VHb可以显著提高DAO催化头孢菌素C氧化的能力，提高葡萄糖氧化酶和醇氧化酶的活力，同时其融合蛋白HVDAO的氧化活性高于DAO，因此，VHb可以用于提高黄素氧化酶的活力。

Description

一种提高黄素氧化酶活力的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种利用血红蛋白VHb提高黄素氧化酶活力的方法。

背景技术

在氧气缺乏的环境下，一种好氧细菌透明颤菌(Vitreoscilla sp.)能够合成血红蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin，VHb)(Wakabayashi，S.，et al.Nature.l986，322，481-483；Dikshit，K.L.，et al.Nucleic Acids Res.1990，18，4149-4155)。VHb为同型二聚体，带有两个相对分子量为15,775的亚基，每个亚基含有146个氨基酸残基和两个b型血红素(Tarricone，C.，et al.Structure.1997，5，497-507)。完整的VHb是可溶性的，但是脱去血红素辅基便不可溶。VHb已在细菌，酵母，真菌和植物细胞中获得了成功表达，在低氧环境下能提高宿主细胞生长量(Kallio，P.T.and Bailey，J.E..Biotechnol.Prog.1996，12，31-39)，提高相应酶的表达量(Bhave，S.L and Chattoo，B.B..Biotechnol.Bioeng.2003，84，658-666)和有价值的中间代谢物的产量，在体内表达VHb有显著效果的例子有：大肠杆菌中α-淀粉酶活力提高了3.3倍(Khosravi，M.，et al..Plasmid.1990，24，190-194)，铁蛋白表达量提高了1.8倍(Chung，Y.J.，Kim，et al..Mol.Biol.1998，31，503-507)；产黄顶头孢霉菌(Acremoniumchrysogenum)中头孢菌素C(CPC)产量提高3.2倍(Demodena，J.A.，et al.Bio-Technology.1993，11，926-929)；促进了假单胞菌(Pseudomonas sp.)对有机污染物苯甲酸降解和伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)对2，4-二硝基甲苯降解(Kim，Y.，et al..J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2005，32，148-154)。

研究表明，当VHb在异源宿主中表达可以提高tRNAs和核糖体水平、细胞呼吸活力和ATP产量(Nilsson，M.，et al.Biotechnol.Prog.1999，15，158-163；Roos，V，et al..Biotechnol.Prog.2002，18，652-656)，但是，人们还是没有完全搞清楚新陈代谢效果和血红蛋白VHb功能之间的联系。VHb具有一个高的氧结合和释放系数(Giangiacomo，L.，et al..Biochemistry.2001，40，9311-9316)，高氧结合系数反映了VHb有较高的氧结合能力，但是更高的氧释放系数表明VHb能够更迅速释放氧(Webster，D.A..Structure and function ofbacterial hemoglobin and related proteins.In Eichorn，G.C.and Marzilli，L.G.(eds.)，Advancesin inorganic biochemistry，New York，Elsevier，1987，.pp.245-265)。

VHb与红酵母D-氨基酸氧化酶(DAO)融合后在大肠杆菌中获得成功表达，得到的融合蛋白VHb-DAO转化CPC的催化效率提高了12.5倍，稳定性提高约3倍(Khang，Y.H.，et al.Biotechnol.Bioeng.2003，82，480-488)。Khang等提出，由于VHb中潜在位点与DAO中FAD结合域存在较强的相互作用，使得VHb同时起到了一个氧供体和氧受体作用。

由于DAO是一种黄素氧化酶，其以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅因子，而VHb与红酵母DAO融合后能够提高CPC的氧化效率，因此我们推测：VHb在反应体系中起到氧载体作用，因为DAO催化过程中需要氧气，所以VHb的存在增强了DAO的催化效率。

发明内容

为了验证上述推测，本申请的发明人分别以游离的和固定化的透明颤菌血红蛋白(VHb)对三种黄素氧化酶——三角酵母D一氨基酸氧化酶(DAO)、葡萄糖氧化酶(GOD)和醇氧化酶(AOD)的催化活性的影响进行了研究。

研究结果表明，不管是游离的还是固定化的VHb，对于黄素氧化酶的催化活性都有明显的增效作用。

因此，本发明的首要目的就在于提供一种提高黄素氧化酶催化活性的方法。

本发明的另一目的在于提供一种VHb用于促进黄素氧化酶催化活性的应用。

本发明的提高黄素氧化酶催化活性的方法包括将VHb作为助催化剂用于黄素氧化酶的催化反应体系，所述VHb可以是游离的形式，也可以是固定化酶的形式。

实验表明，本发明的使用VHb作为助催化剂的方法，可以显著提高黄素氧化酶的催化氧化的能力；而且，相比现有技术报道的融合蛋白的形式，本发明的方法可以在催化氧化过程中，通过外源添加的方式补充VHb，因此，在实际应用中更有优势。

附图说明

图1为用于在重组大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组血红蛋白VHb的重组表达质粒pHVHB的构建流程图。

图2为样品不同纯化阶段的SDS-PAGE(15％)电泳图，凝胶用考马斯亮兰染色，其中1和6为Marker，2为重组菌株BL21(DE3)/pLHB-3的粗提物，3为使用含有500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱的HDAO，其分子量为41.4kDa，4为重组菌株BL21(DE3)/pHVHB的粗提物，5为使用含有500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱的HVHb，其分子量为17.9kDa。

图3显示了固定化VHb对固定化HDAO酶活性的影响。

图4显示了游离VHb对固定化HDAO酶活性的影响。

图5显示了游离VHb对固定化GOD和固定化AOD酶活性的影响。

图6显示了固定化VHb对固定化GOD和固定化AOD酶活性的影响。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。

根据本发明，HDAO为带有组氨酸纯化标签的D-氨基酸氧化酶(DAO)，HVHB为带有组氨酸标签的透明颤菌血红蛋白(VHb)。

本发明中，VHb的基因表示为vgb或者hvhb或者vhb；DAO的基因表示为hdao；融合蛋白HVDAO的基因表示为hvdao。

以下实施例中，除特别说明外，DNA片段连接、质粒的制备、化学转化导入宿主菌、克隆等操作均参照《分子克隆》(Sambrook，J.，Fritsch，E.P.，Maniatis，T.(2001)“MolecularCloning：A Laboratory Manual 3rd ed，”Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)。

以下对实施例中所用的实验材料及其来源作说明：

亲和纯化树脂Sepabeads FP-IDA-Ni²⁺购自Resindion R.S.L公司；

固定化载体为环氧型载体，其中Sepabeads EXE16，Sepabeads Ec-Ep购于ResindionR.S.L公司)；Eupergit C和Eupergit CM购于Degussa公司；Amberzyme oxirane resin购于Rohm&Haas公司。

限制性内切酶和T4 DNA连接酶购于Takara公司。

醇氧化酶(AOD)购于Sigma公司；葡萄糖氧化酶(GOD)购自TOYOBO公司，其他化学试剂都为分析纯。

质粒pET-28b(+)：Novagen公司产品，大小为5.3kb，含有组氨酸纯化标签以及卡那霉素抗性基因，启动子是T7 lac，并具有多个限制性酶切位点。

LB培养基、TB培养基中酵母膏，蛋白胨购于OXOID公司。

大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)购于Novagen公司。

实施例1、重组质粒pHVHB的构建

构建重组质粒pHVHB的过程如图1所示，具体如下：

首先设计如下扩增引物：

VHBF2(上游)：5’-GGAATTCCATATGTTAGACCAGCAAACC-3’；和

VHBR2(下游)：5’-CCCAAGCTTTTATTCAACCGCTTGAGCGTA-3’；

以pUC-6S-VHb(CGMCC 1.6352)为模板，采用pfu酶(Sangon公司)扩增Genbank序列号为X13516的vhb基因片段。

PCR反应条件为：94℃，30Sec，55℃，30Sec，72℃，30Sec，30个循环。

使用上海华舜生物工程公司试剂盒，割胶回收PCR产物。

PCR回收产物用Nde I和HindIII双酶切，割胶回收约450bp的DNA片段，与经相同酶切的载体pET-28b(Novagen公司产品，大小为5.3kb，含有组氨酸纯化标签以及卡那霉素抗性基因，启动子是T7lac，并具有多个限制性酶切位点)载体在T4DNA连接酶作用下连接，连接条件为：16℃连接4h；外源DNA与载体的摩尔比例是3∶1。

连接产物用化学转化方法转化至感受态细胞DH5α以扩增重组质粒，然后参考《分子克隆》以碱裂解法抽提质粒。

得到的重组表达质粒命名为pHVHB，该质粒大小约为5.8kb，含有组氨酸纯化标签以及卡那霉素抗性基因，启动子是T7 lac，并具有多个限制性酶切位点。

重组表达质粒pHVHB经测序验证为正确。

实施例2、重组质粒pHVHB转化大肠杆菌BL21(DE3)

将重组表达质粒pHVHB用化学转化法(CaCl₂法)转化至大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)，转化产物涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上，能在含卡那霉素的平板上生长的即为转化子，获得的转化子命名为BL21(DE3)/pHVHB。

实施例3、VHb的制备

3.1、BL21(DE3)/pHVHB的发酵

取实施例2得到的转化有重组表达质粒pHVHB的转化子BL21(DE3)/pHVHB，接种到含有50 g/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至对数生长期。然后按照5％接种量将种子液接入装有3L TB培养基的5L发酵罐中，在37℃，400rpm，1.3vvm的条件下培养至OD₆₀₀达到1.0。调节温度至30℃，加入乳糖使其终浓度为1.5％，继续培养约20h。

发酵完毕后，发酵液在5000rpm下离心10min，菌体在-20℃下保存。

3.2、VHb的分离纯化

所有蛋白质纯化操作主要在4℃进行。

3.2.1、菌体处理

取冻融的菌体，按照每克菌体加入2ml裂解缓冲液(0.1M磷酸钠，5％甘油，pH8.0)的比例，用裂解缓冲液重悬菌体，并用压榨机在2000 P.S.I的操作压力下破碎细胞，工作3个循环。破碎后的菌液在4℃，12000rpm离心1h，回收上清液。

3.2.2、蛋白质柱分离

称取经预处理的树脂FP-IDA-Ni²⁺装柱，柱的尺寸是2cm×50cm，装柱的树脂约为20ml。将上述步骤3.2.1获得的上清液上柱，上柱速度为1.0柱体积/小时(1BV/h)。

使用Washing Buffer(100mM Tris-C1，50mM咪唑，250mM NaCl，5％甘油，速度1.0BV/h)洗去杂蛋白。过程中测定过氧化氢酶(上清液中所含杂蛋白)，当过氧化氢酶活力为零时，结束Washing阶段。然后使用Elution Buffer(100mM Tris-Cl，500mM咪唑，250mM NaCl，5％甘油，速度1.0BV/h)洗脱目的蛋白。

3.2.3、电泳分析

分别取步骤3.2.1离心获得的上清液(粗酶液)和步骤3.2.2柱分离获得的纯化的蛋白样品，使用15％SDS-PAGE进行检测，结果如图2所示。

由图2的结果可见，利用树脂FP-IDA-Ni²⁺一步法纯化，可以得到纯化的重组血红蛋白HVHb。HVHb成熟蛋白的氨基酸残基数是166aa，理论分子量推算出来应该是17.9kDa；从SDS-PAGE结果可见，目的蛋白的分子量大致在14和21kDa的中间位置，与理论推算值相符。

实施例4、D-氨基酸氧化酶(DAO)的制备

4.1、DAO表达质粒转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)

本实施例中所使用的质粒pLHB-3按照刘洪波等(刘洪波等，生物工程学报，1999，15(3)：337-342)的方法构建，大小为6.4kb，含有带组氨酸纯化标签的DAO基因(HDAO基因)以及卡那霉素抗性基因，启动子是T7 lac。

以DAO的表达质粒pLHB-3转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)(Novagen公司)，转化产物涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上，能在含卡那霉素的平板上生长的即为转化子，获得的转化子命名为BL21(DE3)/pLHB-3。

4.2、重组菌株发酵获得DAO

取4.1得到的重组菌株BL21(DE3)/pLHB-3，接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至对数生长期。然后按照5％接种量将种子液接入装有3L TB培养基的5L发酵罐中，在37℃，400rpm，1.3vvm的条件下培养至OD₆₀₀达到1.0。调节温度至30℃，加入乳糖使其终浓度为1.5％，继续培养约20h。

4.3、DAO的分离纯化

4.3.1、菌体处理

取冻融的菌体，按照每克菌体加入2ml裂解缓冲液(0.1M磷酸钠，5％甘油，pH8.0)的比例，用裂解缓冲液重悬菌体，并用压榨机在2000P.S.l的操作压力下破碎细胞，工作3个循环。破碎后的菌液在4℃，12000rpm离心1h，回收上清液。

4.3.2、蛋白质柱分离

称取预处理过的树脂FP-IDA-Ni²⁺装柱，柱的尺寸是2cm×50cm，装柱的载体约为20ml。样品上柱速度是1.0柱体积/小时(1BV/h)。使用Washing Buffer(100mM Tris-Cl，50mM咪唑，250mM NaCl，5％甘油，速度1.0BV/h)去除杂蛋白。过程中测定过氧化氢酶，当过氧化氢酶活力为零时，结束Washing阶段。然后使用Elution Buffer(100mM Tris-Cl，500mM咪唑，250mM NaCl，5％甘油，速度1.0BV/h)，洗脱目的蛋白。

4.3.3、电泳分析

分别取步骤4.3.1获得的上清液(粗酶液)和步骤4.3.2柱分离获得的纯化的蛋白样品，使用15％SDS-PAGE进行检测，结果如图2所示。

HDAO成熟蛋白的氨基酸残基数是376aa，理论分子量推算出来应该是41.4KDa。由图2的结果可见，目的蛋白的分子量略小于43Kda，与理论推算值相符。

实施例5、固定化酶的制备

5.1、固定化VHb的制备

选用Amberzyme oxirane resin载体，VHb溶液的浓度为6.8mg/ml，按照每120mg蛋白使用1g载体的比例将载体投入VHb纯酶液中，再加入两倍体积的1.25M、pH8.0的磷酸钾缓冲液，在15℃，100rpm下振荡20h。然后用20ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.0)冲洗干净，并借助真空泵抽干水分，获得固定化VHb。

5.2、固定化HDAO的制备

选取5种环氧型载体：Sepabeads EXE16，Sepabeads Ec-Ep，Eupergit C，Eupergit CM和Amberzyme oxirane resin，按照每300mg蛋白使用1g载体的比例，分别投入HDAO(6.3mg/ml)的纯酶液中，处理方法与以上5.1的VHb相同，获得固定化HDAO。

5.3、固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和醇氧化酶(AOD)的制备

选用Amberzyme oxirane resin，GOD和AOD溶液的浓度均为2mg/ml。按照每20mg蛋白使用1g载体的比例将载体投入各纯酶液中，处理方法与与以上5.1的VHb相同，获得固定化GOD和AOD。

实施例6、VHb对于黄素氧化酶催化活性的影响

6.1、VHb对固定化HDAO活力影响

首先对DAO催化反应系统进行说明，反应器容积约50ml，自身有恒温装置，顶端安装有一个搅拌桨，底部有砂芯漏斗，外接一个进气管。

分别取固定化的和游离的VHb作为助催化剂逐渐加入固定化DAO的催化反应体系中，从酶反应器底部通入空气(30ml/min)，分别在2min和10min时取样测定固定化DAO的活力。

具体测定方法如下：

取0.3克固定化DAO，加入15ml 4％CPC溶液(用pH7.5，0.1M磷酸钠缓冲液配制，用3mol/L氨水调节pH7.25)，循环水浴保温20℃，400rpm搅拌，通入空气30ml/min，转化过程中用3mol/L氨水维持pH7.25。分别在2min和10min时用微量进样器取出20μl反应的样品，加入20μl酸终止液，再加入960μl重蒸水，12000rpm离心5min，上清进行HPLC测定，HPLC的具体条件如下：

流动相：乙腈∶甲醇∶1.29％(v/v)乙酸＝7.5∶15∶77.5；

流速：1ml/min；波长：260nm；

柱子：AZORBAX EclipseXDB-C8(4.6×150nm，Agilent，USA)。

酶活力定义：1个单位(U)DAO酶活力定义为每分钟产生的酮酸和GL-7-ACA微摩尔数之和所需要的酶量。

添加固定化VHb的固定化HDAO的活力测定结果如图3所示，当固定化VHb加入质量为50mg时，此时固定化HDAO活力是对照(未添加VHb)的1.7倍，当固定化VHb质量增加至300mg时，固定化HDAO活力是对照的2倍。

添加游离VHb的HDAO的活力测定结果如图4所示，当添加游离VHb的质量从0.05增加至1.0mg时，固定化HDAO活力持续增加，当加入1.0mg游离VHb后，HDAO固定化酶活力与对照(未添加VHb)相比增加了3倍。

可见，不管是游离的还是固定化的VHb，作为助催化剂都可以明显提高DAO的催化氧化活性。

6.2、VHb对固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和醇氧化酶(AOD)活力影响

首先对固定化GOD和固定化AOD催化反应系统进行说明：反应器容积约50ml，自身有恒温装置，顶端安装有一个搅拌桨，底部有砂芯漏斗，外接一个进气管。

分别取游离的和固定化的VHb作为助催化剂逐渐加入固定化GOD和固定化AOD的催化反应体系中，从反应器底部通入氮气(2ml/min)，反应10min取样测定固定化GOD和固定化AOD活力。

具体测定方法如下：

固定化GOD活力测定：取5ml溶液A(将3.5mg辣根过氧化物酶与3.5mg 4-氨基安替吡啉溶于20ml的0.2M，pH7.0磷酸钠缓冲液中，加入3％苯酚溶液1ml)与5ml溶液B(0.36mol/L葡萄糖溶液)混匀，在20℃保温5min，加入固定化GOD，反应10min后取样测定OD_500nm变化值。

酶活力定义：1个单位(U)GOD活力定义为每分钟消耗1微摩尔葡萄糖所需要的酶量。

固定化AOD活力测定：取5ml溶液A(将3.5mg辣根过氧化物酶与3.5mg 4-氨基安替吡啉溶于20ml的0.2M，pH7.0磷酸钠缓冲液中，加入3％苯酚溶液1ml)与5ml溶液B(0.2mol/L甲醇溶液)混匀，在20℃保温5min，加入固定化AOD，反应10min后取样测定OD_500nm变化值。

酶活力定义：1个单位(U)AOD活力定义为每分钟消耗1微摩尔甲醇所需要的酶量。

如图5所示为添加游离VHb的GOD和AOD的活力测定结果，可见对于固定化GOD，当加入0.5mg和1.0mg游离VHb后，GOD固定化酶活力分别是对照(未添加VHb)酶活力的1.4倍和1.6倍。同样对于固定化AOD，当加入VHb后，酶活力分别提高了1.2倍和4倍。

如图6所示为添加固定化VHb的GOD和AOD的活力测定结果，可见在反应体系中加入50mg和100mg固定化VHb，对于固定化GOD和AOD活力均有提高，当加入100mg固定化VHb后，固定化GOD和AOD活力分别提高了0.8和1.5倍。

虽然以上仅以固定化的D-氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶和醇氧化酶为材料，构建出VHb和三角酵母DAO结合在一起所形成的融合蛋白HVDAO，并且将它们用于头孢菌素C氧化的反应体系，借以对本发明的技术方案进行了验证，但是根据本发明的公开，将VHb用于提高其他种类黄素氧化酶的活力，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。因此，将VHb或者VHb和其它黄素氧化酶融合表达所形成的融合蛋白用于其他黄素氧化酶催化的反应体系，同样应属于本发明的范围。

Claims

1.一种提高黄素氧化酶活力的方法，其特征在于，在黄素氧化酶的催化反应体系中加入透明颤菌血红蛋白VHb作为助催化剂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述透明颤菌血红蛋白VHb为游离酶或固定化酶。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述黄素氧化酶包括D-氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶以及醇氧化酶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述黄素氧化酶为D-氨基酸氧化酶。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述VHb固定化酶的载体选自：SepabeadsEXE16、Sepabeads Ec-Ep、Eupergit C、Eupergit CM或Amberzyme oxirane resin。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述VHb固定化酶的载体为Amberzymeoxirane resin。

7.一种透明颤菌血红蛋白VHb用于提高黄素氧化酶的催化氧化活性的应用，其特征在于，将所述透明颤菌血红蛋白VHb用作助催化剂。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述所述透明颤菌血红蛋白VHb为游离酶或固定化酶。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述VHb固定化酶的载体选自：SepabeadsEXE16、Sepabeads Ec-Ep、Eupergit C、Eupergit CM或Amberzyme oxirane resin。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述VHb固定化酶的载体为Amberzymeoxirane resin。

11.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述黄素氧化酶包括D-氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶以及醇氧化酶。