CN101126756A - 心脏肌钙蛋白作为晚期冠状动脉疾病及其并发症的指示物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于诊断晚期缺血性冠心痛的方法，包括步骤：a)测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白的量；b)通过比较步骤a)中测定的量与参考量来诊断所述疾病。

Description

心脏肌钙蛋白作为晚期冠状动脉疾病及其并发症的指示物
技术领域
本发明涉及一种诊断受试者晚期缺血性冠心病的病理状态的方法，优选涉及冠状血管病，特别是多血管病。该方法包括测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白的量和通过比较所测定的量与参考量来诊断所述冠心病的步骤，优选冠状血管病，特别是多血管病。本发明也包含完成这些方法的设备和试剂盒。
背景技术
现代医学的目标之一就是提供个人化的或者个性化的治疗方案。那些治疗方案考虑到患者的个人需要或风险。一个特别大的风险是心血管并发症尤其是未识别的心血管并发症的存在，或者是这些心血管并发症的流行。在西半球，心血管并发症，尤其心脏病，是发病率和死亡率的最主要的原因。心血管并发症能在长时间内保持无症状。因此，对心血管并发症的存在进行可靠的鉴别诊断比通常认为的要更困难和容易出错。
特别地，患有急性心血管事件(例如，心肌梗塞MI)的症状诸如胸痛的患者，目前接受的是以肌钙蛋白T为基础的诊断。为此，要测定患者肌钙蛋白T的水平。如果血液中肌钙蛋白T的量升高，即高于0.1ng/ml，则认定是心血管事件和对患者进行相应的治疗。
MI被分类为属于冠心病(CHD)，并位于其它也被分类为属于CHD的事件如不稳定型心绞痛(UAP)之后。UAP的症状是能够通过硝化甘油的舌下用药减轻的胸痛。UAP是由引起血氧不足和心肌缺血的冠状血管的局部闭塞导致的。一旦这种闭塞过于严重或者是全面性的，就会造成心肌坏死(其为心肌梗塞的潜在病理状态)。MI可以在没有明显症状的情况下发生，也就是说，受试者不表现任何不适，同时MI之前没有稳定型或不稳定型心绞痛。
然而，UAP是MI之前的有症状的事件。受试者的CHD也可能无症状的发生，就是该受试者可能没有感到不适和表现出任何CHD征兆，诸如呼吸短促、胸痛或者其它本领域技术人员已知的CHD的征兆。可是，受试者也许是病态的，患有可以导致MI和/或充血性心力衰竭(CHF)的冠状血管的障碍，意即心脏不再具备为了确保对受试者身体血液的必需供应所需去运行的能力。这也许会导致严重的并发症，一个例子就是心跳停止。
众所周知，属于风险组(例如，吸烟者和/或糖尿病患者)的受试者比没有受到风险因素影响的受试者(健康的受试者)更容易患CHD或CHF。通常，无症状形式的CHD/CHF发生，导致仍然未被识别的病理状态。CHD存在的提示是Framingham得分或者PROCAM得分。迄今为止，冠状血管的病理条件一般通过冠状血管造影术(侵入式的或者实际的(virtual))来评价，其价格昂贵而且需要精细和费时的程序。通常不会对不是高度被怀疑患有冠状血管并发症的受试者进行冠状血管造影术。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的测试以测定晚期缺血性冠心病，优选涉及冠状血管病，特别是多血管病。该测试易于进行，不需要昂贵的设备/仪器，并且优选的，不属于心血管病领域专家的知识。
具体实施方式
本发明通过一种诊断晚期缺血性冠心病的方法来解决该问题，包括步骤：
a)测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白的量；
b)通过比较步骤a)所测定的量与参考量来诊断该病。
优选的，该冠心病涉及冠状血管病，特别是多血管病。
特别地，晚期缺血性冠心病是无症状的。
本发明的方法，优选的，是一种体外的方法。而且，它还可以包括除了那些上文明确提及的步骤之外的步骤。例如，进一步的步骤可以涉及样品的预处理或诊断数据的评价。
这里所用的术语“诊断”指评估与受试者患有晚期缺血性冠心病或者任何其它本说明书中所提及的疾病相符的可能性。如本领域技术人员所能理解的，这样的一种评估对受诊断的受试者通常并不是100％的正确。然而，该术语要求统计学上显著部分的受试者能够被诊断出(例如，群组研究中的一群)患有心力衰竭或有将来患上此病的风险。本领域的技术人员通过使用各种众所周知的统计评估工具，例如置信区间测定，p值(p-value)测定，斯氏t检验，Mann-Whitney检验等，不用再费周折就能确定一部分是否是统计学上显著的。详细描述见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，纽约，1983。优选的置信区间是至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。优选的p值是0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。
根据本发明的诊断包括对相关疾病、症状或风险的监控、确定、亚分类和预测。监控涉及弄清一种已经被诊断的疾病或并发症，例如，分析该疾病的进展或者一种特定的治疗对该疾病或并发症的进展的影响。确定涉及巩固或证实一种已经使用其它指示物或标记进行的诊断。亚分类涉及根据已被诊断的疾病的不同的亚分类来进一步规定一种诊断，例如，根据疾病的轻微或严重状况来规定。在目前的情况下，这就涉及到区分单血管病和多血管病。预测涉及在其它症状或标记已经变得明显或已经发生显著的变化之前预测出疾病或并发症。
特别地，本发明涉及监控、确定和亚分类。
如上面所述，CHD可以无症状发生，或者有关的受试者可能表现症状。本发明有助于测定患有CHD的无症状受试者。受试者通常属于风险组诸如吸烟者，糖尿病患者，肥胖患者，患有高血脂的受试者，患有动脉高血压的受试者，有冠心病、心肌梗塞或中风家族史的受试者，患有伴随升高频率的冠心病的基础性疾病如类风湿性关节炎的人。
优选地，受试者患有由冠状血管病引起的CHD。特别地，该血管病是多血管病，也就是由心血管的局部闭塞引起的，例如由斑块沉积，血栓症和/或痉挛引起。局部的血管闭塞导致可以引起有或没有症状的进一步并发症的心肌缺血。冠状血管对本领域的技术人员来说是已知的。在本发明的上下文中，术语“冠状血管”包括(三个)大的冠状血管，另外也包括相连的中等大小的血管和小血管。因此，在本发明的上下文中，冠状血管病可以，例如，以影响大的冠状血管的大血管病变的形式发生，但是也能以联合大血管和微血管病变的形式发生。
一旦发生全面的心血管闭塞，导致的病理状态是被定义为作为心肌梗塞(MI)的基础状态的心肌坏死。在本领域中描述了通过测定受试者体液中的心脏肌钙蛋白T(下文中的TnT)或肌钙蛋白I(TnI)的量来诊断MI。如果该值升高，则怀疑出现了MI。诊断MI(同样是一种冠心病)的方法不是本发明的一部分。
在本发明的上下文中，术语“冠心病”CHD表示任何由冠状动脉粥样硬化，即冠状血管的部分或全面闭塞引起的冠状功能紊乱(病理状态)。术语CHD包括大范围的不同的急性的和慢性的病理状态，包含稳定型和不稳定型心绞痛(分别为SAP和UAP)，左心室功能紊乱(LVD)，(充血性)心力衰竭(CHF)，心肌死亡。更一般的，在本发明的上下文中，该术语涉及心肌供血不足和因此导致的每一种病理状态。
通常，SAP，UAP和MI被认为是一种急性的病理状态或急性病，而LVD和CHF被认为是一种慢性的状态或慢性病。本发明尤其适合于测定没有症状的CHD。因此，并非无症状的SAP和UAP由于表现出特有的症状例如胸痛，通常不利用本发明的教导来诊断。MI的诊断同样不是本发明的目的。本发明适合于诊断导致病理状态如LVD和/或CHF的慢性心血管病。
在本发明的上下文中“无症状”表示受试者不表现任何CHD的明显的症状。“明显的症状”是那些本领域的技术人员(医师)公认的对于各自的病理状态(这里指CHD或一个CHD的子群)来说是特有的症状。在本发明的上下文中，一个无症状的患者不表现出身体活动的限制，普通的身体活动不会导致不适当的疲劳，心悸呼吸困难(呼吸短促)，恶心，呕吐，或焦虑。当然，受试者不表现象胸痛一样严重的症状。
术语“明显的症状”不包括那些在深入的和/或靶向的医学检查例如血管造影术或ECC之后发现的症状，这对本领域的技术人员来说是清楚的。必须记住的是，如果医学检查进行得足够认真的话(以一种深入的方式进行)，每一种病理状态导致的症状通常是能被识别的。
冠心病CHD可以导致急性心血管事件，即突然出现的、也就是没有之前的临床征兆或症状的事件，该事件严重的影响心脏舒张或收缩的血流速度。在组织病理学说上，这里所提及的急性心血管事件由突发的心肌细胞缺血并伴有严重的所述细胞的坏死所导致。通常，患有急性心血管事件的受试者也会经受典型的症状例如胸的、腹上部的、手臂的、手腕的或者颌的不适或疼痛，进而胸痛可以辐射到手臂、背或肩。急性心血管事件更进一步的症状可能是莫名的恶心或呕吐，持续的呼吸短促、虚弱、眩晕、头昏或昏厥以及任何它们的组合。通常，急性心血管事件被称为急性冠状综合症(ACS)，也就是，不稳定型心绞痛(UAP)或是心肌梗塞(MI)。在许多情况下，急性心血管事件就是MI，其包括ST-升高的MI和非ST-升高的MI。此外，心血管事件也包括中风。症状和临床的病征例如心电图病征在定义方面的进一步详细描述见Joint European Society ofCardiology/American Society of Cardiology，2000，J American college of Cardiology，Vol，36，No.3：959-969。
在本发明的上下文中，有或者没有前期经过急性心血管事件阶段或LVD状态，冠心病通常都导致心力衰竭，其被分成好几个类别。症状可以根据纽约心脏协会(New York Heart Association)分类系统进行分类。类别I的患者没有明显的心血管病的症状。身体活动不受限制，日常的身体活动不会导致不适当的疲劳，心悸或呼吸困难(呼吸短促)。类别II的患者受到轻微的身体活动限制。他们在休息时是舒适的，但是日常的身体活动会导致疲劳，心悸或呼吸困难。类别III的患者表现出显著的身体活动的限制。他们在休息时是舒适的，但是低于日常程度的活动也会导致疲劳，心悸或呼吸困难。类别IV的患者在进行任何身体活动时都会感到不适。他们在休息中表现出心脏功能不足的症状。如果进行任何的身体活动，不适都会增加。因此，患者能够被分成不表现临床症状的受试者和那些表现症状的受试者(例如，呼吸困难)。
在本发明的一个优选的具体实施方式中，除了心脏肌钙蛋白，特别是TnT之外，还测定了利钠肽的量，该肽选自由ANP，NT-proANP，BNP和NT-proBNP组成的组，优选的是BNP和NT-proBNP，尤其是NT-proBNP，或者所述肽的变体。
利钠肽，尤其是NT-proBNP，已知为所谓的神经体液标记，指示与例如心力衰竭、心肌缺血和/或心肌坏死有关的心肌上的壁压力。
在本发明的上下文中，对利钠肽或它的衍生物，尤其是NT-proBNP的量的测定，使得可以获得关于缺血性冠心病发展程度的额外信息，特别是在受试者个体的多血管病即将发生时。
这里所使用的术语“受试者”涉及动物，优选哺乳动物，更优选的是人。然而，必须注意的是，在本发明中，受试者优选的不表现已知与CHD或急性心血管事件即胸痛、呼吸困难和其它上面所描述的那些相联系的症状。更优选地，受试者不表现出依照NYHA分类II，III或IV的症状。在本发明的一个优选具体实施方式中，受试者是NYHA分类I受试者。
依照本发明测定利钠肽或心脏肌钙蛋白的量涉及测定量或浓度，优选半定量或定量测定。测定能够直接或间接地进行。直接测定涉及在获自利钠肽或心脏肌钙蛋白本身且强度与样品中存在的所述肽的分子数直接相关的一种信号的基础上，测定利钠肽或心脏肌钙蛋白的量或浓度。这样的信号，有时这里称为强度信号，可以例如通过测定利钠肽或心脏肌钙蛋白的一种特定的物理或化学性质的强度值获得。间接的测定包括测定一种信号，它来自于第二组分(也就是一种非利钠肽本身的组分)或生物学可读系统，该信号如可测量的细胞反应、配体、标记或酶反应产物。
依照本发明，测定利钠肽或心脏肌钙蛋白的量可以通过所有用于测定样品中肽的量的已知工具(means)获得。所说的工具包括免疫测定装置和可以把标记的分子用于不同的夹心式、竞争或其它分析模式的方法。所说的分析将形成一种信号，指示利钠肽或心脏肌钙蛋白的存在或缺乏。而且，信号的强度，优选的，与样品中存在的所述多肽的量直接地或间接地(例如反比例)相关。更适合的方法包括测定利钠肽的物理或化学特性，例如它准确的分子量或NMR光谱。所说的方法优选地包括生物传感器，与免疫测定连结的光学设备，生物芯片，质谱仪、NMR-分析仪或色谱仪等分析设备。更进一步，方法包括以微板ELISA为基础的方法，全自动的或机器人的免疫测定(例如可用ElecsysTM分析仪)，CBA(一种酶促钴结合试验(Cobalt Binding Assay)，例如可用Roche-HitachiTM分析仪)，和乳胶凝集试验(例如可用Roche-HitachiTM分析仪)。用于测定的方法和工具还包括即时检验(Point-of-care)设备例如Cardiac-ReaderTM(可从Roche Diagnostics得到)。
即时检验设备通常被理解为能够在患者的床旁进行测定的设备。一个例子就是Cardiac-ReaderTM(可从Roche Diagnostics得到)，与例如测定NT-proBNP的测试条(可作为“Cardiac proBNP”从Roche Diagnostics得到)相结合。这样的测试可以采用抗所感兴趣的肽(例如一种BNP类型的肽)的两种(优选单克隆的)抗体。这些抗体可以与用于例如ElecsysTM或CobasTM分析的抗体是相同的，例如，第一抗体用生物素标记而第二抗体用金粒子标记。该测试可以通过将少量(例如150μl)的血液样品加入到测试条(例如测试条中的样品孔)上开始。在加入到测试条之前或之后，例如，如果样品流过合适的毛丛(fleece)时(例如玻璃纤维毛丛)，样品中的红血球就可以与剩余的血浆分离。所说的分离工具(例如毛丛)优选是测试条的一部分。抗体(优选是已经存在于测试条上)溶解于剩余的血浆中。抗体能与感兴趣的肽或多肽相结合，形成一种三组分的夹心式复合物。抗体(结合的或未结合的)流经测试条进入到检测区。该检测区包括用于检测已结合的复合物的工具，例如它可以包括链霉亲和素。它固定住复合物并将固定的复合物通过金标记的抗体以紫色的带显现出来。优选地，剩余的游离的金标记的抗体然后继续沿着测试条移动，至包含含有要检测的BNP型肽的表位的合成的肽或多肽的区域被捕获，以一条分隔的紫色的带显现出来。这种第二条带的出现能够作为对照，因为它指示了样品是按正确操作流动以及抗体是完好无损的。测试条可以包含标记，以指示哪种感兴趣的肽或多肽能够用该测试条进行检测。它也可以包含条形码或其它可以通过设备来阅读的编码，该设备用于光学测量检测区中可检测到的标记的量。这样的条形码可以包括指示哪种感兴趣的肽或多肽能够用该测试条进行检测的信息。该条形码也可以包括关于测试条的批次特异(lot-specific)的信息。
本发明中所使用的测试对于检测心脏肌钙蛋白，特别是肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I，有很高的灵敏性。各测试可以在低至大约0.001ng/ml或甚至更低的浓度下检测到肌钙蛋白T。能够在99％或更高的再现率条件下检测到大约0.01ng/ml的浓度。相应的值应用于其它的心脏肌钙蛋白如肌钙蛋白I，这些值对本领域的技术人员是已知的，或可从文献中公开的数值推导出。
高灵敏性的测试建立在与之前的分析使用基本相同的试剂和成分的基础上。灵敏性通过改变几何条件和/或温育时间已经得到提高。
Cardiac-Reader本身包含能够从光学上记录测试条上的检测区的照相机(例如电荷耦合器件，CCD)。信号带和对照带可以通过一个模式识别运算法则来鉴别。信号带中标记的强度典型与感兴趣的肽或多肽的量成比例。光学信号可以通过批次特异的标度曲线转化为浓度，它可以被储存于一个编码芯片中。标度码和测试批次的一致可以通过测试条上的条形码来检查。
在一个优选的具体实施方式中，测定利钠肽或心脏肌钙蛋白的量的方法包括步骤a)将能够引起强度用于指示肽的量的细胞反应的细胞与该肽进行足够长时间的接触，b)检测细胞反应。
为了检测细胞反应，样品或处理过的样品，优选地，加入到细胞培养基中和检测内在的或外在的细胞反应。细胞反应可以包括报告基因的可检测的表达或物质的分泌，例如肽，多肽，或小分子。该表达或物质会产生一种与肽的量相关的强度信号。
在另一个优选的具体实施方式中，测定利钠肽或心脏肌钙蛋白的量的方法包括测量可获自样品中利钠肽或心脏肌钙蛋白的特定强度信号的步骤。
如上面所述，这样的信号可以是在质谱中观测到的特异于利钠肽或心脏肌钙蛋白的m/z变量或特异于利钠肽或心脏肌钙蛋白的NMR光谱上观察到的信号强度。
在另一个优选的具体实施方式中，测定利钠肽量的方法包括如下步骤(a)将肽与特定的配体接触，(b)(任选地)移走未结合的配体，(c)测定结合的配体的量。结合的配体将产生一种强度信号。依照本发明的结合包括共价的和非共价的结合。依照本发明的配体可以是与这里所述的利钠肽或心脏肌钙蛋白相结合的任意的化合物，例如肽、多肽、核酸或小分子。优选的配体包括抗体、核酸、肽或多肽，例如利钠肽的受体或心脏肌钙蛋白的结合配偶体和它们的片段，包括肽的结合结构域，和适体，例如核酸或肽的适体。准备这些配体的方法是本领域公知的。例如，合适的抗体或适体的鉴定和生产也可以由商业化的供应商提供。获得具有更高亲和力或特异性的这些配体的衍生物的方法是本领域的技术人员所熟知的。例如，在核酸、肽或多肽中引入随机突变。然后，这些衍生物可以通过本领域已知的筛选过程例如噬菌体展示来检测结合。这里所提及的抗体包括多克隆和单克隆抗体，也包括它们的片段，例如能够结合抗原或半抗原的Fv，Fab和F(ab)2片段。本发明也包括人源化杂合抗体，其中表现出所需抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的氨基酸序列结合。供体序列通常至少包括供体的抗原结合氨基酸残基，但是也可以包括供体抗体的其它结构上和/或功能上相关的氨基酸残基。这样的杂合体可以通过几种本领域已知的方法制备。优选地，所述配体或试剂与利钠肽特异结合。依照本发明的特异结合表示配体或试剂不会与用于分析的样品中存在的其它肽、多肽或物质实质上结合(“交叉反应”)。优选地，特异结合利钠肽的结合亲合性应当是与任何其它有关的肽或多肽的结合亲和性的至少3倍，更优选至少10倍和甚至更优选至少50倍。非特异结合在如果它仍然能被区别和明确地测定时是可以接受的，例如，根据蛋白质印迹上它的尺寸或通过它在样品中相对高的丰度。与配体的结合能够通过任何本领域已知的方法测定。优选地，所说的方法是半定量或定量的。适合的方法在下文中描述。
首先，与配体的结合可以直接测定，例如，通过NMR或表面等离子体谐振。
其次，如果配体也作为感兴趣的肽或多肽的酶活性的底物，酶反应产物可以被检测(例如，蛋白酶的量可以通过测定所裂解的底物的量来检测，例如，用蛋白质印迹)。可选择地，配体本身可以表现酶的特性，配体/利钠肽或配体/心脏肌钙蛋白复合物或与利钠肽或心脏肌钙蛋白结合的配体分别可以与适合的底物接触，从而允许通过产生强度信号来测定。要测定酶反应的产物，优选底物的量是饱和的。底物也可以在反应之前被可探测的标记来进行标记。优选取地，样品与底物接触进行一段足够的时间。一段足够的时间指产生可检测到(detectable)的、优选可测量(measurable)的产物量所必需的时间。代替测量产物的量，指定(例如可检测到的)产物量出现所必需的时间可以被测量。
第三，配体可以共价或非共价地结合能够允许检测和测量配体的标记。标记方法可以采用直接或间接的方式。直接标记包括标记直接(共价或非共价地)与配体结合。间接标记包括二级配体与第一配体结合(共价或非共价地)。二级配体应当特异地与第一配体结合。所说的二级配体可以结合适当的标记和/或成为结合二级配体的三级配体的靶(受体)。通常使用二级，三级或甚至更高级的配体是为了增加信号。适合的二级和更高级的配体可以包括抗体、二级抗体和已知的链霉亲和素-生物素系统(Vector Laboratories，Inc.)。配体或底物也可以用一个或多个本领域已知的标签“标识”。这样的标签然后可以成为更高级配体的靶。适合的标记包括生物素，digoxygenin，组氨酸标签(His-Tag)，谷胱甘肽-S-转移酶，FLAG，GFP，myc-标签，流行性感冒A病毒血凝素(HA)，麦芽糖结合蛋白等等。如果是肽或多肽，标签优选位于N末端和/或C末端。适合的标记是通过一种适合的检测方法能够检测到的任何标记。典型的标记包括金粒子，乳胶小珠，acridan酯，鲁米诺，钌，酶活性标记，放射活性标记，磁性标记(“例如，磁性珠子”，包括顺磁性的和超顺磁性的标记)和荧光标记。酶活性标记包括例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶和它们的衍生物。用于检测的适合的底物包括2-氨基-联苯胺(DAB)，3，3′-5，5′-N-四甲联苯胺，NBT-BCIP(4-硝基兰四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸，Roche Diagnostics有现成的贮液)，CDP-StarTM(Amersham Biosciences)，ECFTM(Amersham Biosciences)。适合的酶-底物的结合可以产生有色的反应产物、荧光或化学发光，这能通过本领域已知的方法测量(例如，使用感光胶片或适合的照相系统)。至于测定酶反应，上面给出的标准同样适用。典型的荧光标记包括荧光蛋白(例如GFP和它的衍生物)，Cy3，Cy5，德克萨斯红(Texas Red)，荧光素(Fluorescein)和Alexa染料(例如Alexa568)。更进一步的可用荧光标记是例如，来自Molcular Probes(Oregon)。预期量子点(quantum dots)也能作为荧光标记。典型的放射标记包括35S，125I，32P，33P等等。放射标记可以通过任何已知的和适合的方法来检测，例如，感光胶片或磷光图像仪。依照本发明的适合的测定方法也包括沉淀反应(尤其是免疫沉淀反应)，电化学发光(由电产生的化学发光)，RIA(放射性免疫测定)，ELISA(酶联免疫吸附测定)，夹心式酶免疫检测，电化学发光夹心式免疫测定(ECLIA)，解离放大镧系荧光免疫分析(DELFLA)，闪烁亲近测定法(SPA)，直射批浊法，散射测浑法，乳胶增强直射比浊法或散射测浑法，或固相免疫测定。更进一步的本领域已知的方法(例如凝胶电泳，2D凝胶电泳，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白质印迹法和质谱分析法)，能够单独使用或者与其它上面所述的标记或测定方法联合使用。
在另一个优选的具体实施方式中，测定心脏肌钙蛋白或利钠肽的量的方法包括(a)将含有如前面所述的利钠肽或心脏肌钙蛋白配体的固相支持物与含有利钠肽或心脏肌钙蛋白的样品接触和(b)测定与支持物结合的利钠肽或心脏肌钙蛋白的量。配体优选由核酸、肽、多肽、抗体和适体组成的组中选择，优选以固定的形式存在于固相支持物上。制造固相支持物的原材料是本领域已知的，包括，尤其是，商业上可得到的柱子材料，聚苯乙烯珠，乳胶小珠，磁性珠子，胶体的金属粒子，玻璃和/或硅的片和表面，硝化纤维素条，膜，薄片，duracytes，反应盘的孔和壁，塑料管等。配体或试剂可以与许多不同的载体结合。已知载体的例子包括玻璃，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，聚碳酸酯，右旋糖苷，尼龙，直链淀粉，天然的和改性的纤维素，聚丙烯酰胺，琼脂糖和磁石。用于本发明目的载体的性质可以是可溶的也可以是不溶的。适合的固定(fix/immobilize)所述配体的方法是已知的，包括但不限于离子的、疏水的、共价的作用等。预期也可以用“悬浮阵列”作为根据本发明的阵列(Nolan JP，Sklar LA.(2002).，Suspension arraytechnology：evolution of the flat-array paradigm，Trends Biotechnol，20(1)：9-12)。在这样的悬浮阵列中，载体，例如微珠或微球体，存在于悬浮液中。阵列由可能被标记的携带不同配体的不同的微珠或微球体组成。生产这些阵列的方法，例如基于固相化学和光不稳定保护基团的方法，是普遍已知的(US5744305)。
这里所用的术语“量”包含利钠肽或心脏肌钙蛋白的绝对量，利钠肽或心脏肌钙蛋白的相对量或浓度，也包括任何与它们相关的值或参数。这些值或参数包括采取直接测定法得到的来自所述的肽的所有特定的物理或化学性质的强度信号，例如质谱或NMR光谱中的强度值。此外，包含通过本说明书其它地方描述的间接测定法所得到所有值或参数，例如，由生物学读数系统中测定得到的响应所述肽的表达水平或从特异结合配体获得的强度信号。应当理解与前述的量或参数相关的值也可以通过所有标准的数学运算得到。
术语“心脏肌钙蛋白”涉及所有在心脏细胞和优选心内膜下细胞中表达的肌钙蛋白同种型。这些同种型的特征在本领域被很好地描述，如在例如，Anderson1995，Circulation Research，Vol.76，No.4：681-686和Ferrieres 1998，ClinicalChemistry，44：487-493。
优选的，心脏肌钙蛋白指肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I。
在本发明的上下文中，肌钙蛋白T通常要比肌钙蛋白I优选。然而，本领域的技术人员明白在许多或大多数的情况下，来自测定肌钙蛋白I的量的信息与来自测定肌钙蛋白I的信息同样有价值，因为两种肽都来自于心脏的肌肉细胞，即心肌，并都在相同事件(细胞的损伤)的情况下被释放。
因此，两种肌钙蛋白可以用本发明的方法一起测定，即同时地或相继地测定，或分别地测定，也就是根本不测定其它的同种型。
人肌钙蛋白T的氨基酸序列和人肌钙蛋白I的氨基酸序列公开于Anderson，引文和Ferrieres 1998，Clinical Chemistry，44：487-493。术语“心脏肌钙蛋白”也包含前述的特定肌钙蛋白的变体，即优选肌钙蛋白T和肌钙蛋白I的变体。这些变体至少与特定的肌钙蛋白具有相同的基本生物学和免疫学性质。特别地，如果它们使用本说明书中所提及的相同的特异的测定能够被检测到，那么它们具有相同的基本生物学和免疫学的性质，例如，通过使用特异识别所述心脏肌钙蛋白的多克隆或单克隆抗体进行ELISA测定。此外，应当理解依照本发明的变体具有的氨基酸序列有因至少一个氨基酸的取代，缺失和/或添加的不同，其中，变体的氨基酸序列仍然优选与所述特定的肌钙蛋白的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％同一性。变体可以是等位基因变体或任何其它物种特异性同系物(homolog)、横向同源物(paralog)或直向同源物(ortholog)。此外，这里所提及的变体包括特定的心脏肌钙蛋白的片段或前述类型的变体的片段，只要这些片段具有上文提及的基本免疫学和生物学的性质。这些片段可以是，例如，肌钙蛋白的降解产物。进一步包括那些由于转译后修饰例如磷酸化或十四烷基化而不同的变体。
术语“利钠肽”包括心房利钠肽(ANP)-型和脑利钠肽(BNP)-型的肽和它们的具有相同的预期潜力的变体。根据本发明的利钠肽包括ANP-型和BNP-型肽和它们的变体(参见例如Bonow，R.O.，1996，New insights into the cardiacnatriuretic peptides，Circulation 93：1946-1950)。
ANP-型肽包括pre-proANP，proANP，NT-proANP和ANP。
BNP-型肽包括pre-proBNP，proBNP，NT-proBNP和BNP。
前肽原(pre-pro peptide)(当为pre-proBNP时有134个氨基酸)包括一段短的信号肽，其被酶切后释放出前体肽(pro peptide)(当为proBNP时有108个氨基酸)。前体肽被进一步剪切成N-末端前体肽(NT-pro肽，当为NT-proBNP时有76个氨基酸)和活性激素(当为BNP时有32个氨基酸，当为ANP时有28个氨基酸)。
优选的根据本发明的利钠肽是NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP和它们的变体。ANP和BNP是有活性的激素并且比它们各自的无活性的相应物NT-proANP和NT-proBNP具有更短的半衰期。BNP在血液中发生代谢，而NT-proBNP作为完整的分子在血中进行循环并原样被肾清除。NT-proBNP的体内半衰期比BNP的半衰期长120分钟，BNP的半衰期是20分钟(Smith MW，Espiner EA，Yandle TG，Charles CJ，Richards AM，Delayed metabolism of human brain natriureticpeptide reflects resistance to neutral endopeptidase，J Endocrinol，2000，167：239-46)。
用NT-proBNP的前分析物(preanalytics)更为强健，使得能够容易地将样品运输到中心实验室(Mueller T，Gegenhuber A，Dieplinger B，Poelz W，Haltmayer M，Long-term stability of endogenous B-type natriuretic peptide(BNP)and amino terminalproBNP(NT-proBNP)in frozen plasma samples，Clin Chem Lab Med 2004，42：942-4)。血样能在室温储存好几天或者可以被邮寄或般运环造成回收损失。相反的，BNP在室温或摄氏4度下储存48小时会导致至少20％的浓度损失(Mueller T，Gegenhuber A，et al.，Clinical Chem Lab Med 2004，42：942-4，supra；Wu AH，，Packer M，Smith A，Bijou R，Fink D，Mair J，Wallentin L，Johnston N，FeldcampCS，Haverstick DM，Ahnadi CE，Grant A，Despres N，Bluestein B，Ghani F，Analyticaland clinical evalution of the Bayer ADIVA Centaur automated B-type natriuretic peptideassay in patients with heart failure：a multisite study，Clin Chem 2004，50：867-73.)。因此，根据所感兴趣的时间过程或性质，测定活性形式和无活性形式的利钠肽中的任一个都是有利的。
根据本发明的最优选的利钠肽是NT-proBNP或它的变体。与上面简要讨论的一样，本发明所提及的人NT-proBNP是一段多肽，包含优选相应于人NT-proBNP分子N末端部分的76个氨基酸长度。人BNP和NT-proBNP的结构在已有技术中已经被描述得很详细，例如WO02/089657，WO02/083913和Bonow
1996，New Insights into the cardiac natriuretic peptides，Circulation 93：1946-1950。优选地，这里使用的人NT-proBNP是在EP0648228B1中所公开的人NT-proBNP。这些已有技术文献中公开的关于NT-proBNP的特定序列及其变体在这里都一并引入作为参考。
按照本发明的NT-proBNP进一步包含上文讨论的人NT-proBNP的特定序列的等位基因和其它的变体。特别地，预期变体多肽在氨基酸水平上与人NT-proBNP有至少60％的同一性，更优选至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性。仍然能通过诊断工具或通过针对全长肽的配体来识别的蛋白水解降解产物是实质上相似的并且也被预期在内。与人NT-prroBNP的氨基酸序列相比较具有氨基酸缺失、取代和/或添加的变体多肽也包含在内，只要所述多肽具有NT-proBNP的性质。这里所提及的NT-proBNP的性质指免疫学的和/或生物学的性质。优选的，NT-proBNP变体具有与NT-proBNP可比的免疫学性质(即抗原决定簇组成)。因此，变体对前述的用于测定利钠肽量的工具或配体是可识别的。生物学和/或免疫学的NT-proBNP性质能够通过以下文献描述的测定方法进行检测，Karl et al.(Karl 1999，Development of a novel，N-Terminal-proBNP (NT-proBNP)assay with a low detection limit，Scand J Clin Invest 59：177-181)，Yeo et al.(Yeo 2003，Multicenter evaluation of the Roche NT-proBNP assay and comparison to the BiositeTriage assay，Clinical Chimica Acta 338：107-115)，和下述实施例1中所述的。变体也包括转译后修饰的肽例如糖基化的肽。
依照本发明的变体也指在样品采集后已经被修饰过的肽或多肽，例如通过将标记共价或非共价地连接到肽，优选放射性或荧光标记与肽连接。
术语“样品”涉及体液样品，涉及分离的细胞样品或涉及取自组织或器官的样品。体液样品能够通过已知的技术获得，优选包括血液、血浆、血清或尿的样品。组织或器官样品可以取自任何组织或器官，通过例如，活组织切片检查。分离的细胞取自体液或组织或器官，通过分离技术例如离心或细胞分选。优选地，细胞的、组织的或器官的样品取自那些表达或产生这里所述的肽(即利钠肽和心脏肌钙蛋白)的细胞、组织或器官。
这里所用的“比较”包含将待分析的样品中利钠肽或心脏肌钙蛋白的量与说明书中任意地方描述过的合适的参考源的量进行比较。可以理解这里所用的比较涉及相应的参数或值的比较，例如，绝对量与绝对参考量相比较，而浓度与参考浓度相比较或来自测试样品的强度信号与参考样品中同样类型的强度信号相比较。本发明方法中步骤b)所涉及的比较可以人工或计算机辅助进行。对于计算机辅助比较，可以通过一个计算机程序将测定量的值与对应于存储于数据库中的适合的参考物的值相比较。计算机程序可以进一步评价比较的结果，即以一种适合的输出格式来自动提供所需的诊断。
这里所用的术语“参考量”涉及能够通过上面所述的比较来评估一个受试者是否患有晚期缺血性心脏病或另一种在本说明书中所提及的疾病的量，晚期缺血性心脏病优选是无症状的。因此，该参考物可以要么来自属于上文所描述的风险组的受试者，和/或至少在晚期缺血性心脏病方面而言健康的受试者。对受试者可用的参考量可以依赖于不同的生理学的参数而变化，例如年龄、性别或亚人群。因此，一个适合的参考量可以根据本发明的方法由将被分析的参考样品与测试样品一起即同时地或相继地确定。大体上，依照本发明已经发现在缺血性心脏病的发展过程中，心脏肌钙蛋白的量如在血浆中的量将也会增加。而且，缺血性心脏病变得越严重，血浆中利钠肽的量将会越高。
因此，对于一个健康的受试者，血浆中心脏肌钙蛋白和利钠肽量的提高将会联系到有很高的患有急性心血管事件或更严重形式的慢性心力衰竭的可能性。更优选地，依照本发明已经发现指示着晚期缺血性冠心病的心脏肌钙蛋白的参考量为至少0.003ng/ml，优选0.1ng/ml，特别是0.5ng/ml。而且，前面所引用的心脏肌钙蛋白的参考量与利钠肽的参考量组合也指示了(即与更高的进展可能性相联系)晚期缺血性冠心病，其中利钠肽的参考量为至少150pg/ml，优选350pg/ml，特别是500pg/ml。
上文和下文所作的术语的定义和解释因此应用于本说明书中的所有具体实施方式以及所附的权利要求书。
由上面所述得出在本发明方法的一个优选的具体实施方式中，心脏肌钙蛋白的参考量为至少0.003ng/ml，其任选地与任何所引用的利钠肽的参考量组合用于指示晚期缺血性冠心病。
在一个优选的具体实施方式中，本发明允许区别单血管冠心病和多血管冠心病。
在本发明的上下文中，术语“多血管冠心病”指一种比“单血管冠心病”更严重的血管闭塞。
这里所用的术语“区别”表示区分患有单血管冠心病的受试者和患有多血管冠心病的受试者。
这里所用的术语“慢性心力衰竭”涉及慢性的、即持久的心力衰竭。心力衰竭的特征是减弱的心脏舒张或心肝收缩血液流动速率和因此减弱的心脏功能。然而，不是表现出伴随着严重的心肌细胞坏死的突然的局部缺血，这里所涉及的慢性心力衰竭优选伴随着导致连续发展的心脏功能损伤的连续的心肌细胞坏死事件。
有利地，本发明通过提供上述区别性诊断急性心血管事件和慢性心力衰竭的方法，从而允许可靠地和时间、费用均有效地区分所述的疾病状况。因此，患有所述疾病的受试者能够通过特异的和有效的疗法被容易地治疗，而不是采用非特异的和无效的疗法。
已经发现肌钙蛋白T的水平升高但还没有症状的受试者将接受更深入的诊断，特别是导管血管造影术，一种实际的(virtual)血管造影术，使用对比媒介同一个电脑断层图相连以鉴别缩窄，所述缩窄可被展开，在情况可能时，可以借助气囊扩张或支架。通过这些，MI可以被避免，和心脏功能能被维持。
已经发现肌钙蛋白T的水平提高但还没有症状的受试者也可以接受降低心肌内壁上压力的治疗并因此降低发生坏死的可能性。
本发明的方法特别优选的具体实施方式如下所述：
在一个本发明方法的优选的具体实施方式中，至少0.003ng/ml的心脏肌钙蛋白的参考量和至少150pg/ml的利钠肽的参考量指示了严重的晚期冠状动脉疾病。在一个更优选的具体实施方式中，心脏肌钙蛋白的参考量是至少0.1ng/ml和利钠肽的参考量是至少350pg/ml。在一个特别优选的具体实施方式中，心脏肌钙蛋白的参考量是至少0.5ng/ml和利钠肽的参考量是至少500pg/ml。
在一个本发明方法的优选的具体实施方式中，利钠肽是BNP，更优选是NT-proBNP。
在一个进一步优选的本发明方法的具体实施方式中，利钠肽是ANP，更优选是NT-proANP。
在一个更进一步优选的本发明方法的具体实施方式中，所述的心脏肌钙蛋白是肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I。
同样，在一个优选的本发明方法的具体实施方式中，所述的受试者是人。
本发明进一步涉及一种诊断晚期缺血性冠心病的设备，包括：
a)测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白量的工具；
b)任选地，测定样品中利钠肽量的工具；
这里所用的术语“设备”涉及许多工具组成的系统，其至少包含前述彼此之间可操作地连接以进行预测的工具。优选的测定利钠肽或心脏肌钙蛋白量的工具和进行比较的工具在上文中本发明的方法部分已经公开了。怎样以一种操作的方式把这些工具连接起来将取决于该设备中所包括的工具的种类。例如，当应用了自动测定肽的量的工具，由所述自动运行的工具获得的数据就能够通过例如计算机程序处理，以诊断急性心血管事件或其它这里所提及的疾病。优选的，在这种情况下，该工具由单一的设备组成。所述的设备可以包括用于测定样品中肽的量的分析单元和用于处理不同诊断结果的数据的计算机单元。可选择的，当例如测试条的工具被用于测定肽的量，用于该诊断的工具就可以包括对照条或tables，其将测定出的量分配给一个已知与急性心血管事件或其它这里所提及的疾病相伴随的量或一个已知指示健康受试者的量。该测试条，优选与特异结合利钠肽或心脏肌钙蛋白的配体相连。该测试条或设备，优选包括检测所述肽与所述配体结合的工具。优选的检测工具在上述本发明方法中相关的具体实施方式中公开。在这种情况下，工具被操作地连接，使得系统的使用者将得出量的测定结果与其诊断值根据手册上的指导和解释联在一起。在这样的一个具体实施方式中，这些工具可以以单独的设备出现和优选包装在一起成试剂盒。本领域的技术人员将理解怎样不费周折地把这些工具连接起来。优选的设备是那些能够在没有特殊的专业临床医生知识的条件下应用的设备，例如，只需要加入样品的测试条或电子设备。结果可以以需要临床医生解释的诊断原始数据的形式输出。然而优选的，设备的输出是不需要专业医生解释的经处理过的诊断原始数据，也就是，输出必然清楚显示受试者是否患有轻微的或是中等的心力衰竭。进一步优选的设备包含分析单元/装置(例如，生物传感器，阵列，结合了特异识别利钠肽的配体的固相支持物，等离子体表面谐振装置，NMR分光计，质谱仪等)或上文所提及的依照本发明方法的评估单元/装置。
此外，本发明也包含设备用以诊断受试者中晚期缺血性冠心病(优选是无症状的)的用途，所述设备包括：
a)测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白的量的工具；
b)任选地，测定样品中利钠肽的量的工具。
最后，本发明涉及一种用于完成本发明方法的试剂盒，包括：
a)测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白的量的工具；
b)任选地，测定样品中利钠肽的量的工具。
这里所使用的术语“试剂盒”涉及前述工具的集合，优选以分隔的或装入一个单一的容器中的形式提供。该容器，也优选包含完成本发明方法的用法说明。
任选地，该试剂盒可以另外包含用于解释任何关于诊断晚期冠状动脉疾病和/或它的并发症的测定结果的使用者手册。特别地，该手册可以包含关于什么测定水平相应于什么等级的风险的信息。这在本说明书的其他地方进行了详细的概括。另外，该使用者手册可以提供关于正确地使用试剂盒中的组件来测定各自的生物标记水平的指导。
关于所有本说明书引用的参考文献的完整公开内容以及在本说明书中特别指出的公开内容都一并引入作为参考。
下述的实施例将只是举例说明本发明。它不能被解释为，在任何情况下，限制本发明的范围。
实施例
实施例1：
总共235个无症状的被怀疑有动脉硬化风险的个体接受了EGC，超声心动描记术连同冠状血管造影。
根据超声心动描记术的结果，如果LVEF低于40％则被诊断为心脏收缩功能的紊乱。患者具有高于60％的LVEF被认为不存在心脏收缩功能紊乱，患者具有40-60％的LVEF被认为关于心脏收缩的功能紊乱是不确定的。另外测定了左心房的尺寸和隔膜的厚度。
冠状动脉疾病被分为单、二和三血管病。如果有一条或多条的血管狭窄使得缩小血管体积至少50％则认定是血管病。
除了这些检查，还要获取关于风险行为的医学史，其包括吸烟、糖尿病、动脉高血压、先前心肌梗塞，也包括血脂异常，尤其是胆固醇水平、LDL水平和甘油三酯水平。
敏感的肌钙蛋白通过一种新发展的灵敏的肌钙蛋白T测定(RocheDiagnostics，曼海姆，德国)来检测，NT-proBNP也通过免疫测定来检测(RocheDiagnostics，曼海姆，德国)，血浆样品中的CD40配体通过德国曼海姆的RocheDiagnostics的免疫测定检测，以及NT-proBNP通过奥地利维也纳的Biomedica生产的微量滴定板免疫测定来检测。
所有的测定都按照生产厂商的用法说明来进行。
下面的表1中给出了结果。
表1：记录有冠状动脉疾病的患者的高灵敏TnT四分位数(quartile)
  Hs-TnT [ng/ml]N＝235
  诊断组I
  1.Quartil   2.Quartil   3.Quartil   4，Quartil
  N   49   59   58   69
  中值Hs-TnT ng/ml范围   00-0.00069   0.002920.0008-0.00541   0.009540.00555-0.0176   0.050220.0183-0.7079
  年龄，中值   64   67   67   69
  男(n)女(n)   2227   3722   3117   5118
  身高(m)，中值   1,69   1,70   1,69   1,70
  体重(kg)   75,5   77,0   82,0   82,0
  LVEF(％)
  ＞60％   42   51   38   21
  40-60％   2   3   3   15
  ＜40％   5   5   17   33
  p＜0.0001***
  LA(nm)，中值   39.0   40.0   41.0   40.0
  SEP(mm)，中值   12.0   12.0   13.0   12.0
  冠状动脉疾病
  1-血管病   8   11   7   14
  2-血管病   15   12   12   11
  3-血管病   9   14   26   27
  p＝0.0290*
  吸烟者(n)   16   32   28   39
  p＞0.05(n.s.)
  糖尿病(n)   9   10   23   25
  动脉高血压(n)   34   43   44   43
  心率   67   62   70   73
  先前MI(n)   9   14   24   38
  ECG(n)   47   53   54   61
  中值胆固醇mg/dl   233.0   229.0   224.0   214.0
  中值LDL mg/dl   149.9   138.6   145.6   133.0
  中值甘油三酯mg/dl   143.5   156.0   169.0   151.0
  p＜0.0001
  中值NT-proBNP pg/ml范围   116.85.0-5942   175.611.2-12703   359.75.0-14953   1046.016.3-21116
  p＜0.0001
  中值NT-proANP pg/ml范围   2016.0540-11640   2555.9901-9536   3485.01189-11955   5364.21185-27978
  p＞0.05(n.s.)
  中值sCD40L ng/ml范围   1.1550.212-5.818   1.0230.184-3.621   1.1040.009-7.454   1.5500.080-5.482
实施例2：
一个具有2型糖尿病史的57岁的男性有反复的短期的胸痛，所述胸痛大多数与运动无关。他经受了冠状血管造影术以进行进一步澄清(没有发生病理变化)。肌钙蛋白T是＜0,01，NT-proBNP是92pg/ml。
实施例3：
一个具有心肌梗塞家庭史且身体健康状况良好的42岁的男性同意接受医学检查。在超声心动描记术中发现25％的降低的LVEF，冠状血管造影术显示其具有两狭窄≥90％的三血管病，通过支架移植来治疗。肌钙蛋白T是0,04和NT-proBNP是920pg/ml。
实施例4：
总共26个患有晚期心血管病以及存在可检测的灵敏的肌钙蛋白T的患者被追踪了12个月。12个月的观察期以后，所有的患者仍然保持着肌钙蛋白T阳性并且在检查之前无症状。中值TNT水平最初是＜0,009ng/ml和12个月后仍保持0,009ng/ml。数据表明，独立于血液收集的时间点，肌钙蛋白T阳性保持了一个稳定的结果并且正确的与所定义的风险组的联系性。

Claims (18)

1.一种用于诊断晚期缺血性冠心病的方法，其包括如下步骤：
a)测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白的量；
b)通过比较步骤a)中测定的量与参考量来诊断所述疾病。
2.根据权利要求1的方法，其中冠心病涉及冠状血管病。
3.根据权利要求2的方法，其中冠心病是多血管病。
4.根据权利要求1或2的方法，其中晚期缺血性冠心病是无症状的。
5.根据权利要求1或2的方法，其中至少0.003ng/ml的心脏肌钙蛋白的参考量指示严重的晚期冠状动脉疾病。
6.根据权利要求5的方法，其中参考量是0.1ng/ml。
7.根据权利要求1或2的方法，其中所述的心脏肌钙蛋白是肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I。
8.根据权利要求1至7中任一的方法，其中除了心脏肌钙蛋白之外，还测定了利钠肽的量。
9.根据权利要求8的方法，其中利钠肽是BNP。
10.根据权利要求9的方法，其中BNP是NT-proBNP。
11.根据权利要求8的方法，其中利钠肽是ANP。
12.根据权利要求11的方法，其中ANP是NT-proANP。
13.根据权利要求1或2的方法，其中所述的受试者是人。
14.根据权利要求1或2的方法，其中至少150pg/ml的利钠肽的参考量指示严重的晚期冠状动脉疾病。
15.根据权利要求14的方法，其中参考量是350pg/ml。
16.一种用于诊断急性心血管事件的设备，其包括：
a)测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白的量的工具；
b)测定一份样品中利钠肽的量的工具；和
c)比较所述量与适合的参考量以此来诊断急性心血管事件的工具。
17.一种设备用以诊断受试者的晚期缺血性冠心病、优选是无症状的晚期缺血性冠心病的用途，所述设备包括：
a)测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白的量的工具；
b)任选地，测定样品中利钠肽的量的工具。
18.用于完成本发明方法的试剂盒，其包括：
a)测定受试者的样品中心脏肌钙蛋白的量的工具；
b)任选地，测定样品中利钠肽的量的工具。
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