CN101115399B - 制备蛋白水解产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种制备具有限定分子量范围的蛋白水解产物，而不进行酶或pH调节处理步骤的方法。为此目的，所述从蛋白质植物和动物材料来制备蛋白水解产物的方法的特征在于：在水性介质中，在反应室内形成的目标压力下，分裂所述材料；通过系统的特征曲线来控制温度和反应；和在分裂以后，将悬浮液分离成为包含原材料的不溶解成分的沉淀物，以及溶解了材料的分裂产物的水性上层清液。

Description

制备蛋白水解产物的方法

本发明涉及一种用于从含蛋白的植物和动物原料制备水解产物的方法。

含蛋白的植物和动物天然产物和废产物可以在用于材料应用的多种途径中制备。因此通常有必要的是，将高分子(macromole-cules)(蛋白)分裂成为氨基酸，和包含几个氨基酸的肽。

据所知，通过酸或碱的加入，采用温度效应，蛋白水解可以导致形成氨基酸的混合物。在分裂蛋白以后，必须中和该溶液，可是在酸解的过程中，重要的和具有经济意义的氨基酸色氨酸会被破坏。

还可以采用微生物来源的蛋白酶来酶促地进行蛋白分裂。同时，采用了根据它们的分裂特异性而将肽链打碎成为不同的碎片的肽链内切酶，和提供氨基酸的肽链端解酶两者。

pH值依赖的和酶促的蛋白水解的方法和过程，与其它的内容描述于GB 846682、RU 2132142和US 6221423中。

动物和植物废物的复合材料大分子，例如碳水化合物、脂肪和蛋白，还可以在加压和升温的效应下分裂。所产生的碎片可以用于微生物支持的能量应用，例如甲烷开发。

在US 6365047、ES 2162462T和DE 10117321中，关于工艺过程解决方法而阐明了压力温度水解(pressure temperature hydrolysis)的现有技术。

DE 10113537描述了对动物骨粉的压力温度处理。在基础培养基中，2.5巴的压力和150℃的温度，在至少15分钟对水性骨粉悬浮液具有影响，该影响主要是在受影响的骨粉和肉浆(flesh pulp)的BSE刺激物的失活方面。

根据EP 1406508，通过加入酸/碱液而将骨粉蛋白完全水解成为氨基酸，来分裂没有BSE的骨粉，并且如果需要，随后用蛋白酶处理。该分裂过程之后必须中和。

然而，所有的这些方法并不适合于制备限定分子量范围的水解产物。

本发明的目的是提供一种方法，通过该方法有可能制造具有限定的分子量范围的蛋白水解产物，而没有pH值设定和没有酶促的工艺过程步骤。

该问题由权利要求1的特征解决。

制造含蛋白的植物和动物原料的蛋白水解产物的方法的特征在于，在温度和通过系统特征的反应效应控制的水性介质中，并且在形成(build-up)于反应空间中的集中压力下，分裂原料；并且在于，在该分裂过程以后，将悬浮液分离成为包含原材料的不溶解成分的沉降物，和溶解有原料的分裂产物的水性上层清液(projection)，其中该分裂产物为蛋白水解产物，例如肽和氨基酸。

在独立权利要求中详细说明有利的进一步发展。

在本发明的一个构造(configuration)中，本发明方法的特征在于，分裂是优选在140℃至250℃的温度范围内，在5巴至220巴的压力下，以及在最长120分钟的反应时间内进行的。具有在10-50kDa量度内的不同规定分子量的分子由此作为分裂产物获得。

在一个进一步的构造中，本发明方法的特征在于，蛋白分子的分裂优选在180℃和220℃之间的温度范围内，在50和75巴之间的压力下，并且在25至40分钟的反应时间内进行的。在此情况下，有利结果为具有分子量＜20kDa的蛋白水解产物。

在一个进一步的构造中，分裂在管反应器(图1)中连续地发生，或者根据间歇原则进行，同时避免副产物。

在一个进一步的构造中，该分裂过程是通过对水性上层清液中肽的分子尺寸的分析来控制的。

在该方法一个进一步的构造中，该分裂过程是通过对水性上层清液中的肽的分子尺寸的实时测定(分析)来控制的。

在一个进一步的构造中，提供的是，在原料进入反应器以前，通过具有特定分裂尺寸和特定持续时间，优选15至60分钟，的胶体磨用水将该原料加工成为可倾注的悬浮液。作为优势，这导致了该分子的前期发展(pre-development)。

一个进一步的构造提供的是，该分裂的温度范围选自140℃和250℃之间，并且目标压力在各个设定温度的蒸气压力的1.1和10倍之间。这有利地保证了系统中一致的液相状态。该悬浮液的持久液态保证了它的连续的和无干扰的供应。

在本发明的一个进一步的构造中，分裂是在＞150℃的温度和＞45巴的压力下进行的。此处获得了具有＜20kDa的氨基酸和肽的分裂产物分布。

一个进一步的构造提供的是，作为原料的植物和动物材料例如面粉或骨粉，为了蛋白分裂，优选的是采用清洗或分别浸提的步骤来预处理。

一个进一步的构造提供的是，该原料经筛分以设定明确的颗粒尺寸，优选＜2mm。

在一个进一步的构造中，直接处理5至40％的水性浆液(mash)浓缩物(concentrations)，或在不溶的成分沉降以后，仅处理上层清液。

一个进一步的构造提供的是，该悬浮液通过泵的方法来循环。特别地，适合采用增压泵使该悬浮液循环。将该用于悬浮液的工艺过程用泵合适地连接。

在本发明的一个进一步的构造中，提供的是，在该反应产物退火以后，将固体从水溶性成分中去除。

用于化学处理的可溶性分裂产物可以以液体或干燥形式使用。它们进一步适合于作为培养微生物的培养基。

按照本发明，在反应器中，通过温度、压力和反应时间的参数将蛋白的分裂模式固定。同时特别的是，压力始终高于水的固有蒸汽压力，使得始终保证了在反应过程中坚持单相系统。令人意外的发现是，通过控制压力温度效应还有反应时间，而没有pH变化和没有酶的加入，就可以获得含蛋白原料的确定的肽氨基酸混合物。通过严格地坚持预设定系统特征(图2)，本发明方法制备了一种适于作为生物技术和化学合成与过程的原料的材料。

该过程是通过对肽的分子尺寸，以及分裂产物的微生物适用性的分析来控制的。通过采用保护性气体可以排除不需要的副反应。

本发明提供了一种用于骨粉的材料应用的方法，该方法可适合所需要的产品相关处理条件而变化。

如果将处理过程根据本发明如此配置，使得氨基酸肽混合物具有低于20kDa的单独成分的分子量，本发明涉及的方法就适合于同时保证对BSE刺激物的破坏。据所知，BSE刺激物的分子量为27kDa至30kDa(Prusiner，St.B.(1996)TIBS 21，482-487：分子生物学与朊病毒病的发病机理)。

该过程可以在连续运行管反应器(continuously running tube reactors)中，或者在间歇式反应器中进行。管反应器的主要优势在于，反应器的容积可以在任何时候都适合于原料变化的质量。

现在将通过实施例，依靠附图来解释本发明，其中：

图1表示程序次序的示意图，

图2表示在连续反应器中的系统特征(温度反应时间)的示例性图示，

图3表示本发明过程对反应时间和温度的依赖性的示例性图示，和

图4表示实施例R1至R5的图示。

图1通过实施例说明了本发明过程的次序。

在原料进入料仓1之前，将该原料进行筛分以去除外来成分和溢流。然后通过本身已知的排出装置2将原料排出，并且在叶轮式混合机3中与水混合，然后通过具有确定分裂宽度的胶体磨4来粉碎和悬浮。在胶体磨4中，通过粉碎将该悬浮液均匀化，并且对生物质的机械消化导致了改良的蛋白的水热分裂。为了防止沉降和沉淀，将该悬浮液在叶轮式混合机3中搅拌。

在该悬浮过程以后，通过商业增压泵5吸取该悬浮液并且将它循环回至叶轮式混合机3。将容器进一步搅拌。

对工艺过程用泵6的供给是通过增压泵5的压力管线来进行的。在设备边(equipment side)上的工艺过程用泵6设定为5-220巴，优选40-100巴的压力。悬浮液首先进入热交换器7中，在此，将它在逆流中通过离开反应器8的分裂产物加热。同时将该悬浮液从约20℃加热至120℃-140℃。将该分裂产物从约140℃-250℃冷却至30℃-60℃。

在热交换器7以后，将悬浮液输送至反应器8。该反应空间包含几个连续连接的管反应器。从外部将反应器8加热，并且将悬浮液加热至140℃-250℃的温度。在进入反应器8以后，来自原料的蛋白在压力和温度的影响下，分裂成为肽和氨基酸。

安装在热交换器7中，和/或反应器8以前，和/或反应器8中的静态混合机使得材料可以流动以实现彻底混合。

在该分裂产物已经离开反应器8并且在热交换器7中冷却以后，依靠减压阀9将它释放至周围环境。此释放可以在单一和/或两个步骤中完成，然而优选单一。将在退火箱10中集聚的气体向前运送至外部的废气清洗器15以分离出任何的香气。

然后将在退火箱10中收集的水解产物进一步通过离心机/倾析器11如此处理，使得分离出存在的沉降物。将该沉降物收集于贮蓄槽12中。通过过滤13，优选超滤，将所产生的可溶相(上层清液)进一步分离。所产生的滤液可以在干燥14中干燥，并且原样或以液体形式使用。

图2表示随着过程持续进行的温度反应时间特征。通过在预设定的反应压力下，坚持反应温度和反应时间参数的特定分布，用温度压力水解方法获得了蛋白的限定平均分子量。在该悬浮液中的设备参数和干燥物质含量据认为是附加影响的变量。反应时间和温度的清楚影响是明显的。为了获得类似产物，在采用最短反应时间必须升高温度，或分别地在最低温度的状态下，必须选择延长反应时间。在进行按照上线的过程中，获得具有平均10kDa的分子量的分子。在进行按照中线的过程中，获得具有平均15kDa的分子量的分子，在进行按照下线的过程中，获得具有25kDa的平均分子量的那些分子。

图3表示了本发明方法(蛋白分裂)对反应时间和分裂温度的依赖性。以下依赖性是明显的：

1.随着温度升高，肽的平均分子量下降。因而更多的蛋白被分裂，并且获得更小的蛋白碎片(肽和氨基酸)。

2.随着反应时间增加，平均分子量在相同的温度下降。因此，更长的反应时间的效应促进了蛋白成为更小碎片的分裂。

3.在某些压力设定下，已经采用了装置特定化(equipment-specific)的数据。对这些影响变量的变化的效果会偏离高压水解的分裂结果。

图4说明了实施例R1、R2、R3、R4和R5。表示了不同的过程参数(压力、温度、反应时间)。通过实施例可以证明，从对装置中的压力、温度和反应时间的详细而精确的调节，可以获得不同平均分子量。

现在将依靠进一步的实施例来更详细地解释本发明。

实施例1

将屠场副产品的处理工厂生产的骨粉用作原料。将该骨粉筛分以去除外来成分和溢流(＞2mm)。通过搅拌，采用胶体磨4，在叶轮式混合机3中制备30％的骨粉水悬浮液。工艺过程用泵6将该悬浮液从预贮蓄槽输运，并且将它加压至＞50巴

的压力。反应器8中的温度为＞200℃，反应时间30分钟，和吞吐量100kg/h。在分裂以后，将水解产物悬浮液在单一步骤中从过程压力释放至环境压力。

然后通过分离和过滤将所收集的水解产物从沉降物分离。其次，进行具有20kDa的截止值的超滤13。优选将滤液在喷雾干燥器14中干燥。在300℃的进气温度和95℃的废气温度下，获得了干燥的可倾注的粉末。

相对于原料的干燥物质，该干燥粉末的产率为35％。该蛋白化合物(proteinogenic compounds)(肽、氨基酸)为产物的干燥物质的89％。该产物的凝胶色谱法表明该样品的平均分子量为7kDa。

实施例2

将屠场副产品的处理工厂生产的种类II骨粉用作原料。在350ml水中的70g骨粉来制备浆液。将此浆液放置于间歇反应器中。在搅拌的情况下，设定200℃的温度。在氮气气氛中建立100巴的压力。反应时间为120分钟。

将样品在离心机中，在3.000g分离20分钟。将不溶性成分(沉降物)分离出，并且将上层清液作为用于进一步分析的反应产物。相对于原材料的干燥物质，该产物具有58％的产率。蛋白化合物为产物的干燥物质的81％。该产物的凝胶色谱法表示100％的该样品具有＜20kDa的分子量。

实施例3

将屠场副产品的处理工厂生产的种类III骨粉用作原料。在350ml水中的70g骨粉来制备浆液。将此浆液放置于间歇反应器中。在搅拌的情况下，设定140℃的温度。在氮气气氛中建立100巴的压力。反应时间为120分钟。

将样品在离心机中，在3.000g分离20分钟。将不溶性成分(沉降物)分离出，并且将上层清液作为用于进一步分析的反应产物。相对于原材料的干燥物质，该产物具有40％的产率。产物的蛋白物质(肽/氨基酸)比例为分裂产物的干燥物质的84％。该产物的凝胶色谱法表示56.2％的该样品具有＜20kDa的分子量。

实施例4

将面粉用作初级产品。在350ml水中的87.5g骨粉来制备浆液。将此浆液放置于间歇反应器中。在搅拌的情况下，设定180℃的温度。在氮气气氛中建立50巴的压力。反应时间为30分钟。

将样品在离心机中，在3.000g分离20分钟。将不溶性成分(沉降物)分离出，并且用0.45μm的过滤器将上层清液过滤作为反应产物，并且将该产物用于进一步分析。相对于原材料的干燥物质，该产物具有79.5％的产率。蛋白化合物的比例为分裂产物的干燥物质的6％。该产物的凝胶色谱法表示99.5％的该样品具有＜20kDa的分子量。

以上实施例由以下方法分析辅助并且控制：

用于测定成品收率的干燥物质的测定

干燥重量包括在103℃样品干燥后，剩余的溶解的不溶解的内含物。进行干燥直至达到恒定重量。该重量涉及用于估定的体积。

为了测定干燥重量，采用了根据DIN 38409-H 1-1的标准方法。该干燥重量是通过80ml的分裂骨粉悬浮液的20ml的上层清液和沉降物来测定的。

蛋白化合物的测定

在碱性介质中，通过用过氧硫酸氢盐消化，将无机和有机键合氮氧化为硝酸盐。硝酸根离子在硫酸和硝酸溶液中与2，6-二甲基苯酚反应生成硝基酚。采用DIN EN ISO 11905-1通过细胞试验(Dr.Lange，LCK 338)进行类似的处理。在去除无机氮部分以后，可以从总氮含量计算蛋白化合物(肽、氨基酸)的量。

凝胶色谱法

凝胶色谱法是一种根据分子的尺寸，通过多孔凝胶材料来分离分子的方法。首先洗脱更大的分子，然后是更小的分子。以具有确定分子尺寸的合适标准为基础，有可能通过对比来测定分子的尺寸。凝胶色谱法是在具有柱(直径：1.6cm，长度：30cm，柱容积：60.3ml)的Pharmacia设备上进行的。在280nm检测蛋白和肽。将柱材料Sephadex G-100(4-150kDa的分离区)用作固定相。将PBS缓冲液用作流动相。将来自Biorad的凝胶色谱法标准物作为用于测定分子尺寸的标记物质。

微生物生长的测定

为了检验该蛋白水解产物的微生物适用性，采用该样品作为营养物质测定了微生物的生长。在具有营养液的摇篮(shaker basket)中，在培养琼脂上，通过微生物培养法来培植单一菌落，并且在相应的条件下培养18h。将在500ml的摇篮中的100ml介质用作主培养基。用1％的预培养物接种每个单独的介质。在相应的温度和通气(摇动器)下培养这些主要的培养基。生长过程曲线是通过光度计测定浊度，和通过每小时地测定物种生长指数(living germination index)，然后评估而获得的。

通过浊度测量来测定生长指数

通过光度计浊度测量的生长指数测定是一种用于间接地测定微生物悬浮液的生长指数的方法。在光度计中测量样品的期间，特定波长(600nm)的可见光被部分吸收和部分分散，并且可以作为光密度(OD)而在光度计的刻度上很快读出。该光密度与生长指数成比例地增加。对于测量，需要5×10⁶KBE/ml的最小生长指数。由于测量的OD与细胞计数成线性比例仅至最大约0.3，因此在更高的OD必须稀释该样品。

通过刮铲法(spatula method)测定物种生长指数

通过测定物种生长指数而测定能够形成菌落的那些细菌。该结果以“菌落形成单位”(KBE)给出。通过样品的1∶10的因子稀释来制备具有最大预期细胞计数(例如10⁸个细胞/ml)的一系列稀释液，并且用刮铲法涂布最后三个稀释液。将该板养育24h，并且计数菌落的数目和计算至KBE/ml。

图例：

1  料仓

2  排出装置

3  叶轮式混合机

4  胶体磨

5  增压泵

6  工艺过程用泵

7  热交换器

8  反应器

9  减压阀

10 退火箱

11 离心机/倾析器

12 贮蓄槽

13 过滤

14 干燥

15 废气清洗器

Claims (10)

1.一种用于从含蛋白植物和动物原料制造水解产物的方法，其特征在于，在水性介质中并且在反应空间内形成的目标压力下，通过依靠系统特征控制的温度和反应效应将原料分裂；并且在于，在180℃至220℃之间的温度范围内，和在50巴至75巴的压力以及25至40分钟的反应时间下进行蛋白分子的分裂；并且在于，在分裂过程以后，将悬浮液分离成为包含不溶解的原材料成分的沉降物，和溶解了原料的分裂产物的水性上层清液，其中所述含蛋白植物和动物原料为面粉或骨粉。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于分裂是在管反应器中连续或根据间歇原则进行的，同时避免副产物。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述分裂过程是通过对水性上层清液中的肽分子尺寸的实时测定控制的。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于通过在50巴至75巴之间的预设定的压力下保持温度反应时间特征来控制分裂过程。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于在所述面粉或骨粉进入反应空间以前，将所述面粉或骨粉与水混合以获得悬浮液，该悬浮液通过在具有确定分裂宽度的胶体磨中粉碎均匀化并且然后处理。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于将所述原料筛分以设定＜2mm的颗粒尺寸。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于处理5至40％的水性浆液的浓缩液，和/或在不溶的成分沉降以后，处理上层清液。

8.按照权利要求5至7中的任何一项所述的方法，其特征在于所述悬浮液是循环的。

9.一种按照权利要求1所述的方法的可溶解的分裂产物的用途，以液体或干燥形式用于化学过程。

10.按照权利要求9所述的用途，其特征在于所述可溶解的分裂产物混合物以液体或干燥形式用于培养微生物的培养基。

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