CN101113456A - 一种利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法。包括亚克隆载体的构建，用于快速筛选过程中的siRNA的合成方法，对含有siRNA的阳性克隆的快速筛选方法等步骤。相对于常规的载体构建方法，此方法能够更有效，更快速，更经济的获得所需要的小干扰基因载体，尤其适用于对基因芯片，SSH，SAGE等大规模基因初筛结果的功能验证分析，以及寻找有效的抑制序列siRNA等的RNA干扰机制的研究。

Description

一种利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法

技术领域

本发明涉及一种快速构建siRNA载体的方法，尤其涉及一种在pSilencer载体系统中利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法。

技术背景

RNA干扰技术是研究基因功能的一种强大工具，《Science》杂志将RNAi称为“2002年的重大突破”(Couzin，2002)。Andrew Fire和Craig Mello更是因此发现而获得2006年诺贝尔医学奖。小干扰RNA的制备技术主要包括：化学合成法，siRNA表达载体的构建，体外转录法，制备siRNA混合物，siRNA表达盒子，其中载体构建法生成的siRNA能够在细胞内持续表达几周甚至更长的时间，而且也容易被分子生物学实验人员所接受。Ambion公司产品pSilencer系列质粒是携带siRNA的常用载体。它含有RNA聚合酶III启动子，氨苄青霉素抗性基因，大肠杆菌的复制起始点。把需要沉默的基因片段插入RNA聚合酶III启动子位点后，转入哺乳动物细胞中，能够高效表达发卡状RNA，从而抑制目的基因的表达，在利用小干扰技术抑制目的基因的研究中有广泛的应用，尤其适合长周期的研究。但在构建携带目的基因的新的载体过程中却常常暴露出其自身的缺点：

1，由于在选择siRNA靶点过程中，很难一次达到最佳的抑制效果，因此，在实际的应用过程中，常选择几个靶点进行抑制，从而必须合成几个siRNA片段。若每次构建一个siRNA都去买公司做好的线形化质粒试剂盒是非常不经济的。

2，现有的常规构建方法是，通过HindIII和BamH1双酶切将pSilencer切开，再利用连接酶将siRNA片段和线形化载体连接起来。而在实施过程中，有很多细节不得不考虑到。事实上，由于两种限制性内切酶的酶切效率的不同，很难将质粒彻底双酶切，在后续连接过程中导致自身环化率增加，给阳性克隆的筛选带来极大的困难；另外，由于原pSilencer质粒本身携带有长约60-70bp的DNA片段，从而增加了阳性克隆筛选的困难，用酶切或PCR的方法在普通的Agarose胶甚至SDS-PAGE胶电泳都很难区分出只有约10bp差异的DNA条带，而且通过测序的方法筛选阳性克隆更是极不经济的。

3，siRNA基因片段的合成的常规做法是分别合成约70bp的上下游引物，通过退火，继而产生HindIII和BamHI的酶切位点，再将其连接到pSilencer质粒中。由于合成的片段较长，通过上述方法合成的siRNA成本较高。

鉴于此，建立一种能够快速有效的、省时的、并且能够大大降低构建siRNA载体成本的、达到载体构建的目的、新型的siRNA载体构建方法十分必要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法。此种siRNA载体构建方法，能够快速有效地达到载体构建的目的，并且能够大大降低构建siRNA载体的成本。

本发明所述利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法，由如下步骤组成：

(1)siRNA基因片段的合成和补齐反应：

在siRNA基因片段的内部设计互补序列，在siRNA两端加入HindIII和BamHI的酶切位点和保护性碱基，用高保真的PCR酶一次性补齐短DNA片段；并且避免siRNA基因靶序列中含有HindIII和BamHI的酶切位点；

(2)亚克隆载体的制备：

选择如下方案之一：①在原pSilencer载体上插入长片段，通过PCR或酶切产物的差异性筛选阳性克隆；②含有特异酶切位点的片段，通过酶切产物的差异性筛选阳性克隆；③通过连接反应产生亚克隆；

(3)siRNA基因片段与亚克隆载体的一步法连接：

将亚克隆载体与合成的siRNA基因片段按摩尔浓度比值为1∶2-10放置于同一酶切反应体系中，酶切结束后，65℃灭活限制性内切酶，减低T4 DNA连接酶缓冲液的盐浓度，进行连接反应；

(4)含有siRNA载体的阳性克隆的筛选：

通过PCR或酶切的方法将插入70±4bp片段的siRNA载体与亚克隆载体区分开。

上述利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法中：上下游基因3’端部分的碱基序列互补，如步骤(1)涉及的上游基因序列是：

5’-GCGGATCCGCTGGGCATCAGTGAGGACATTCAAGAGATGTCCTCACTGATGCC-3’

下游基因序列是：

5’-GCAAGCTTTTCCAAAAAACTGGGCATCAGTGAGGACATCTCTTGAATGTCCTC-3’

其中：PCR反应由95℃至55℃逐步降温以达到退火，补齐siRNA基因片段的目的。

上述利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法中：步骤(2)所述亚克隆载体构建方案的选择原则是：含有HindIII和BamHI的双酶切位点以利于构建，在后续的siRNA载体筛选过程中能够用简单的电泳技术将阳性克隆筛选出来。

上述利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法中：步骤(3)所述亚克隆载体与合成的siRNA基因片段按摩尔浓度比值优选为1∶3-7混合。

上述利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法中：步骤(4)所述PCR反应条件优选是：95℃，5min；95℃，30s；58℃，45s，72℃，45s；72℃，10min；共35个循环。

利用本发明所述方法构建的siRNA载体与常规方法获得的pSilencer系列的siRNA载体相同。但是，

1)由于缩短了合成的基因片段，使得siRNA基因片段合成的费用至少减少66％；

2)通过亚克隆的构建，解决了阳性克隆siRNA载体难以筛选的问题，通过一次PCR反应筛选出携带siRNA基因的阳性克隆；

)节省了载体构建的步骤，从而减少了出错的几率，节省了构建时间。

总之，发明所述方法相对于常规的载体构建方法，能够更有效，更快速，更经济的获得所需要的小干扰基因载体，尤其适用于对基因芯片，SSH，RACE等大规模基因初筛结果的功能验证分析，以及寻找有效的抑制序列siRNA等的RNA干扰机制的研究。

附图说明

图1亚克隆载体的构建与siRNA载体构建的技术路线

首先通过双酶切将329bp大小的基因片段构建入pSilencer3.1-H-neo表达载体中，做为筛选siRNA表达载体的亚克隆，然后，通过高保真的PCR酶将siRNA基因片段补齐，最后，通过双酶切和一次连接反应将siRNA构建到表达载体中。

图2双酶切产生329bp片段

1，DL2000，DNA marker；2，双酶切质粒mU6pro产生329bp的片段。

图3亚克隆的测序图

插入329bp的无关序列后的亚克隆测序图谱。

图4携带siRNA载体的阳性克隆PCR筛选过程

1-10为待测载体的PCR产物，从中挑选分子量大小约为300bp的克隆做为阳性克隆进行测序。

图5 pSilencer-bcl2l2表达载体的测序图

插入bcl2l2的siRNA序列后的pSilencer-bcl2l2表达载体测序结果与合成的siRNA序列一致。

具体实施方式

实施例1

1，siRNA基因片段的合成和PCR补齐反应：

1)根据bcl2l2基因的序列找到其干扰基因的作用靶点(GCTGGGCATCAGTGAGGAC)，按照pSilencer质粒构建的说明书合成上，下游基因序列。包括在序列的中间加入环型碱基序列，在上下游加入HindIII和BamHI的酶切位点，并在酶切位点两端加上保护性碱基以便于后续的酶切(由上海博亚公司合成)。

上游基因序列(53bp)：

5’-GCGGATCCGCTGGGCATCAGTGAGGACATTCAAGAGATGTCCTCACTGATGCC-3’

下游基因序列(53bp)：

5’-GCAAGCTTTTCCAAAAAACTGGGCATCAGTGAGGACATCTCTTGAATGTCCTC-3’

2)PCR反应补齐siRNA基因片段：

Pyrobest DNA Polymerase(购于Takara公司)：2.5U/0.5ul

上游基因序列：       5ug

下游基因序列：       5ug

10×Pyrobest Buffer：10ul

10mM dNTP：          3ul

补充去离子水至终体积 100ul

PCR程序：95℃，5min；93℃，1min；91℃，1min；89℃，1min……57℃，1min；55℃10min；

取5ul siRNA基因片段，在2％的Agarose胶中电泳鉴定。

2，亚克隆的制备：

1)pSilencer3.1-H-neo和mU6pro载体的扩增和提取；

1、取150ml培养液倒入离心管中，4℃下12000g离心30秒；

2、弃上清，倒置并使液体流尽；

3、菌体沉淀重悬浮于200μl溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/LTris-HCL；10mmol/L EDTA)中(需剧烈振荡)，室温下放置5-10分钟；

4、加入新配制的溶液II(0.2mol/L NaOH；1％SDS)400μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物，冰浴5分钟；

5、加入300μl预冷的溶液III(5mol/L醋酸钠；冰醋酸)，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟；

6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿(1∶1)，振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟；

7、将水相移入干净eppendorf管中，加入等体积的5M LiCL₂，4℃下12000g离心10分钟；

8、取上清，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟；

9、弃上清，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5分钟；

10、吸除上清液，真空干燥10分钟；

11、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg/ml RNaseA)中。

2)HindIII和BamHI的双酶切产生线形化pSilencer-H-neo载体和329bp的基因片段；

BamHI           10ul

HindIII         10ul

10×K Buffer    30ul

pSilecer3.1-H-neo/mU6pro各10ug

补充去离子水至300ul

37℃水浴，酶切4h

3)线形化pSilencer-H-neo载体和329bp的基因片段的回收和定量分析；实验操作严格参照QIAquick Gel Extraction Kit(50)(Cat.No.28740 Lot No.12188435)的protocol进行；

4)亚克隆pSilencer329的构建和鉴定。

线形化pSilencer-H-neo载体50ng

329bp的基因片段     100ng

PEG4000             2.5ul

10×ligase Buffer   2.5ul

T4 DNA连接酶(MBI)   1ul

补充去离子水至25ul，22℃连接1小时后转化DH5α感受态菌，铺板。37℃孵箱中培养16小时，筛选阳性克隆，并进行测序鉴定。

3，siRNA片段和亚克隆的连接

siRNA基因片段200ng

pSilencer329载体    50ng

BamHI               10ul

HindIII             10ul

10×K Buffer         5ul

补充去离子水至50ul，37℃水浴作用12h后，65℃，30min；12000rpm离心10min，取上清20ul，加入Ligase Bufferl 5ul，PEG4000 2.5ul，T4 DNA连接酶1ul；22℃，1h。

4，菌落PCR鉴定并筛选阳性克隆——siRNA载体的筛选

将连接产物转入感受态菌DH5a中，热休克，震摇120min，铺与LBA平板上，置于37℃孵箱中16h。将菌板上生长的单克隆无菌接种到50ulLB溶液中，煮沸5min后，8000rpm离心10min，取上清做为待测DNA溶液。

待测DNA溶液(未知浓度)1ul

M13F(-40)(10nM)：    1ul

3.0rev(10nM)：       1ul

10mM dNTP：           3ul

补充去离子水至       50ul

95℃，5min；95℃，30s；58℃，45s，72℃，45s；72℃，10min；共35个循环，浓度为1％的Agarose胶电泳鉴定。

挑选阳性克隆所在的菌种，进行测序鉴定，载体上插入的siRNA序列与原合成序列比对完全相符。

Claims (5)

1.一种利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法，由如下步骤组成：

(1)siRNA基因片段的合成和补齐反应：

在siRNA基因片段的内部设计互补序列，在siRNA两端加入HindIII和BamHI的酶切位点和保护性碱基，用高保真的PCR酶一次性补齐短DNA片段；并且避免siRNA基因靶序列中含有HindIII和BamHI的酶切位点；

(2)亚克隆载体的制备：

选择如下方案之一：①在原pSilencer载体上插入合适的片段，通过PCR或酶切产物的差异性筛选阳性克隆；②含有特异酶切位点的片段，通过酶切产物的差异性筛选阳性克隆。

(3)siRNA基因片段与亚克隆载体的一步法连接：

将亚克隆载体与合成的siRNA基因片段按摩尔浓度比值为1∶2-10放置于同一酶切反应体系中，酶切结束后，65℃灭活限制性内切酶，减低T4 DNA连接酶缓冲液的盐浓度，进行连接反应；

(4)含有siRNA载体的阳性克隆的筛选：

通过PCR或酶切的方法将插入70±4bp片段的siRNA载体与亚克隆载体区分开。

2.如权利要求1所述利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法，其特征是：上下游基因3’端部分的碱基序列互补，如步骤(1)涉及的上游基因序列是：5’-GCGGATCCGCTGGGCATCAGTGAGGACATTCAAGAGATGTCCTCACTGATGCC-3’下游基因序列是：

5’-GCAAGCTTTTCCAAAAAACTGGGCATCAGTGAGGACATCTCTTGAATGTCCTC-3’

3.如权利要求1所述利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法，其特征是：步骤(2)所述亚克隆载体构建方案的选择原则是：含有HindIII和BamHI的双酶切位点以利于构建，在后续的siRNA载体筛选过程中能够用简单的电泳技术将阳性克隆筛选出来。

4.如权利要求1所述利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法，其特征是：步骤(3)所述亚克隆载体与合成的siRNA基因片段按摩尔浓度比值为1∶3-7混合。

5.如权利要求1所述利用pSilencer质粒快速构建siRNA载体的方法，其特征是：步骤(4)所述PCR反应条件是：95℃，5min；95℃，30s；58℃，45s，72℃，45s；72℃，10min；共35个循环。

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