CN101105457B - 一种改良bca-紫外结合法测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法 - Google Patents

一种改良bca-紫外结合法测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法 Download PDF

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Abstract

一种改良BCA-紫外结合法测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法，它是将BCA(bicinchoninic acid二喹啉甲酸)测定蛋白质方法与紫外分光光度法相结合，利用吸光度的加合性原理，测定青霉素人工抗原的偶联率。其优点是：成功测定了氨苄青霉素人工抗原的偶联率，使得对氨苄青霉素人工抗原的免疫原性评价达到定量，本发明方法准确，重复性好，对实验设备、操作要求低。

Description

一种改良BCA-紫外结合法测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法
技术领域
本发明涉及一种改良BCA-紫外结合法测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法。
背景技术
氨苄青霉素(别名：氨苄西林、氨苄青、安比西林、沙维西林、赛米西林、氨苄西、潘别丁)。英文名：ampicillin，是β-内酰胺类抗生素中青霉素类的一种，其核心基团为闭合噻唑环、β内酰胺环。氨苄青霉素的分子式为C16H19N304S1，分子量为349.41，是目前较常用的广谱半合成青霉素，毒性低，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有作用，具有较强的杀菌作用。被广泛应用于动物的各种疾病的治疗和饲料添加剂中，因而造成食物中的残留。长期饮用含有青霉素类抗生素残留的牛奶会使人体产生耐药性和过敏反应等，对人体造成危害。因此，各国都对牛奶中各种抗生素的最大残留(MRL)作出了限量标准。
目前国内检测青霉素类抗生素残留最简单、快速、灵敏的方法是免疫分析方法。免疫分析方法的核心试剂是全抗原和检测用抗体，而制备高质量抗体的前提是有高免疫原性的全抗原。氨苄青霉素是小分子物质，属于半抗原，不具有免疫原性，需要将其与蛋白质载体偶联制成人工抗原才能刺激动物体产生抗体。氨苄青霉素人工抗原偶联率的高低直接反应其免疫原性的强弱，决定其抗体的质量。有研究表明在5～30之间，偶联率越高，其免疫原性越强。
对人工抗原的偶联率的测定一般采用的方法是紫外分光光度法，其原理是根据半抗原的特征吸收峰，通过分别测定半抗原和载体蛋白的吸光度，通过与各自的标准曲线的判定浓度，得出的浓度比。本试验通过在280nm和254nm(中华人民共和国药典HPLC检测波长)下分别测定BSA和AMP的浓度，当起始摩尔比为20∶1时，按照此方法算出的偶联率为67.82∶1，这与实际不符。我们通过扫描氨苄青霉素标准品，发现它在紫外下从250～270nm均有吸收，但是没有特征吸收峰，因此不能采用一般紫外方法来测定。也有报道采用SDS-PAGE电泳通过分子量来计算偶联率的大小，但载体蛋白和氨苄青霉素的分子量相差200多倍数量级，测定难度较大，操作技术复杂，准确性比较差。因此，尚未有一种相对准确的测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法报道。
BCA(bicinchoninic acid二喹啉甲酸)法是一种测定微量蛋白质的方法，其原理是基于蛋白质中的游离氨基将该试剂中的Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸光度值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度，是一种常用的测定微量蛋白质的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种改良BCA-紫外结合法测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法。
本发明采用如下技术方案：通过紫外的方法测定人工抗原中牛血清白蛋白的浓度；根据氨苄青霉素和牛血清白蛋白分子结构中均具有还原性的氨基，都能与BCA试剂反应显色，而且氨苄青霉素在偶联的过程中开环，偶联之后其还原能力基本保持不变；将人工抗原与BCA试剂反应，测定总的吸光度，根据吸光度的加合性原理，减去此浓度的牛血清白蛋白在BCA试剂下的吸光度，间接得出人工抗原中氨苄青霉素的浓度；计算氨苄青霉素和牛血清白蛋白的分子数之比即为偶联率，偶联率＝CAMP/CBSA。
本发明的操作步聚是：(1)分别制定一系列浓度的标准曲线：标曲①为BSA 280nm；标曲②为BSA-BCA562nm；标曲③为AMP-BCA 562nm；(2)测定氨苄青霉素人工抗原在280nm，562nm下的吸光度ABSA280，A总562，由ABSA280经标曲①得出人工抗原中BSA的浓度CBSA，再由CBSA经标曲②判定CBSA浓度BSA在562nm下的吸光度ABSA562；(3)人工抗原偶联物中AMP在562nm下的吸光度为AAMP562＝A总562-ABSA562，再由标曲③判定AMP的浓度CAMP；(4)偶联率＝CAMP/CBSA。
本发明的氨苄青霉素人工抗原偶联物是通过物理法制备，即将BSA和AMP加入到碱性的缓冲液中，在37℃，24小时的条件下直接偶联合成。
为了证明氨苄青霉素在偶联之后其还原能力基本保持不变，本发明在研究过程中采用一组对照实验进行验证，试验条件是：人工抗原的起始物料比与试验组完全一致，对照组以蒸馏水代替碱性缓冲体系，使得AMP与BSA不能偶联，测定并比较对照组和试验组的A562，以此证明人工抗原在反应前后吸光值基本保持不变，从而说明AMP在偶联过程中由于开环，还原能力基本保持不变，进一步证明可以采用本发明的方法，间接测定人工抗原中AMP的浓度。
本方法的特征是：本方法通过改良的BCA法和紫外可见分光光度法相结合，间接的测定了偶联物中AMP的含量；创造性的将BCA试剂与AMP反应显色，通过实验证明了在562nm AMP的浓度与吸光度有良好的线性关系，解决了AMP不能采用传统的紫外方法测定AMP人工抗原偶联率的问题，使得对氨苄青霉素人工抗原的免疫原性评价得以实现，本发明方法准确，重复性好，对实验设备、操作要求低。通过设计验证实验，测定反应前后的与BCA试剂显色在562nm的吸光度值差异。结果通过配对t检验，t＝1.021，P＝0.354，P＞0.05，两组吸光度之间的差异不显著，证明AMP在偶联之后还原性基本保持不变，可以采用本发明的方法来间接测定偶联物中AMP的含量，进而测定氨苄青霉素人工抗原的偶联率。
本发明的优点是：本方法将改良的BCA法和紫外可见分光光度法相结合，解决了不能采用传统的紫外方法测定氨苄青霉素人工抗原的偶联率的问题，使得对氨苄青霉素人工抗原免疫原性的评价得以实现。本发明方法准确，重复性好，对实验设备、操作要求低。
具体实施方式
本发明按照如下步聚实现：
1、人工抗原的制备：将AMP和BSA按照起始摩尔比10∶1(0.1BSA和0.0051g AMP)和20∶1(0.1BSA和0.0103g AMP)，加入到2ml的碱性缓冲液中，37℃恒温摇床中反应3小时，取出于0.015M，PH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中4℃透析3天，每4～6小时更换一次透析液。
2、标准曲线的配制
标曲①：BSA280nm
配制0.45mM的BSA母液，分别取0，40，60，80，100μl于5个试管中，分别加入2mL PBS缓冲液，混匀，以PBS为空白调零，在280nm测定各管的吸光度，制定标准曲线。
标曲②：BSA-BCA562nm
配制0.037mM的BSA母液，分别取0，4，8，16，20μl于96孔板的标准孔中，各孔加PBS补足到20μl，然后每孔加入200μlBCA试剂，37℃放置30分钟，酶标仪562nm下测定吸光度值，制定标准曲线。
标曲③：AMP-BCA562nm
配制1.6mM的氨苄母液，分别取0，4，8，16，20μl于96孔板的标准孔中，各孔加PBS补足到20μl，然后每孔加入200μlBCA试剂，37℃放置30分钟，酶标仪562nm下测定吸光度值，制定标准曲线。
测定各标曲的结果见表1.
表1.标准曲线的制备结果
 编号   1   2   3   4   5
 CBSA(10-6M)   0.00   8.570   12.86   17.14   21.43
 A280   0   0.336   0.510   0.688   0.859
 CBSA(10-6M)   0.00   0.21   0.42   0.63   0.84
 A562   0.00   0.315   0.574   0.849   1.084
 CAMP(10-6M)   0.00   5.04   10.08   15.12   20.16
 A562   0.00   0.508   0.986   1.493   1.921
标曲①BSA280nm的曲线方程为：Y＝0.207X-0.1424 R2＝0.9762
标曲②BSA-BCA562nm的曲线方程为：Y＝1.2527X+0.0335 R2＝0.9976
标曲③AMP-BCA562nm的曲线方程为：Y＝0.9605X-0.952 R2＝0.9998
由标曲③实验结果可以证明：BCA法能用于AMP的含量测定，且线性良好。
3、人工抗原偶联率的测定和计算
测定人工抗原在280nm下的吸光度值，由标曲①得出CBSA，由CBSA返回到标曲②，得出ABSA562；测定人工抗原在562nm下的吸光度值A总562：由于在用BCA法测定时，BCA试剂的加入使得样品被稀释11倍，因此需要返回方程算出样品未被稀释前的总吸光度值A562，因此由标曲②(或标曲③)得出C，再乘以稀释的倍数按照标曲②(或标曲③)得出样品在562nm下的总吸光度值A总562；根据吸光度的加合性原理，AMP在562nm下的吸光度为：AAMP562＝A总562ABSA562；将AAMP562返回到标曲③，得出AMP的浓度CAMP；偶联率＝CAMP/CBSA。具体实验结果见下表2.
表2.氨苄青霉素偶联率的测定结果
  编号   样品A280   CBSA  ABSA562   样品A562   A总562  AAMP562   CAMP   偶联率
  1   0.537   3.282  4.145   1.172   22.412  18.267   20.009   6.096
  2   0.546   3.326  4.199   1.178   22.478  18.279   20.021   6.022
  3   0.542   3.306  4.175   1.170   22.39  18.215   19.955   6.035
  4   0.425   2.741  3.467   1.875   30.145  26.678   28.766   10.494
  5   0.431   2.77  3.503   1.882   30.222  26.718   28.808   10.399
  6   0.423   2.731  3.455   1.874   30.134  26.679   28.767   10.532
4.验证实验步骤
试验组按照起始物料比10∶1，20∶1，物理法制备人工抗原，反应完之后不透析；对照组以蒸馏水代替碱性缓冲液，其他条件与试验组完全相同。样品均与BCA试剂反应，测定562nm的吸光度值，比较两组的差值。
表3.证实验结果
  物料起始比   10∶1   10∶1   10∶1   20∶1   20∶1   20∶1
  实验组A562   1.173   1.204   1.226   1.374   1.404   1.419
  对照组A562   1.217   1.251   1.272   1.354   1.389   1.403
运用统计软件SPSS对结果进行配对t检验，结果发现：t＝1.021，P＝0.354，P＞0.05，两组吸光度之间的差异不显著，表明氨苄青霉素人工抗原在反应前与反应后在562nm的吸光度差异很小，这证明AMP在偶联之后还原性基本保持不变，可以采用本发明的方法，利用吸光度的加和性原理，接测定偶联物中AMP的含量，进而测定氨苄青霉素人工抗原的偶联率。

Claims (1)

1.一种改良BCA-紫外结合法测定氨苄青霉素人工抗原偶联率的方法，通过紫外的方法测定人工抗原中牛血清白蛋白的浓度；根据氨苄青霉素和牛血清白蛋白分子结构中均具有还原性的氨基，都能与BCA试剂反应显色，BCA为bicinchoninic acid二喹啉甲酸，而且氨苄青霉素在偶联的过程中开环，偶联之后其还原能力基本保持不变；其特征是方法步聚如下：（1）将人工抗原与BCA试剂反应，测定总的吸光度，根据吸光度的加合性原理，减掉此浓度的牛血清白蛋白在BCA试剂下的吸光度，间接得出人工抗原中氨苄青霉素的浓度；（2）计算氨苄青霉素和牛血清白蛋白的分子数之比即为偶联率，偶联率等于 氨苄青霉素的浓度与牛血清白蛋白浓度比。
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