CN101087622A - 包含生物素残基的抗血栓形成的双重抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)寡糖－间隔基－A(I)的化合物，或其药学上可接受的盐或前药或其溶剂化物，其中寡糖是带负电荷的寡糖残基，含有2至25个单糖单元，该电荷被带正电的反荷离子抵消，并且其中寡糖残基是由本身具有(AT－III介导的)抗－Xa活性的寡糖产生的；间隔基是基本上药理学上无活性的柔性连接残基，具有10至70个原子的链长；A是残基－CH[NH－SO2－R1][CO－NR2－CH(4－苄脒)－CO－NR3R4]，其中R1是苯基、萘基、1，2，3，4－四氢萘基、(异)喹啉基、四氢(异)喹啉基、3，4－二氢－1H－异喹啉基、色满基或樟脑基，这些基团可任选被一个或多个选自(1－8C)烷基或(1－8C)烷氧基的取代基取代；其中R2和R3独立地是H或(1－8C)烷基；R4是(1－8C)烷基或(3－8C)环烷基；或R3和R4与它们所连接的氮原子一起是任选含有另外杂原子的非芳香族(4－8)元环，该环任选被(1－8C)烷基或SO2－(1－8C)烷基取代；其中式I化合物进一步含有至少一个连接生物素残基或其类似物的共价键。本发明的化合物具有抗血栓形成活性，可以用于治疗或预防血栓形成或其他与凝血酶有关的疾病。本发明化合物的抗血栓形成活性可以在给予抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白及其具有高生物素亲和力的类似物的紧急情况下可以被中和。

Description

包含生物素残基的抗血栓形成的双重抑制剂
本发明涉及新的含有生物素残基或生物素衍生物的抗血栓形成的双重抑制剂、它们的制备方法、含有作为活性成分的该化合物的药物组合物、以及该化合物用于制备药物的用途。
在寻找与肝素相比时具有相似或更好抗血栓形成性质的合成活性药用物质中的最近进展，导致新的双重抑制剂(例如WO 99/65934和WO 01/42262中所述的)的设计。那些化合物通常是通过基本上药理学上无活性的间隔基与直接凝血酶抑制剂连接的寡糖残基的缀合物。分子中的寡糖残基显示了抗凝血酶III(AT-III)介导的抗-Xa活性。因此，新的缀合物具有双重、抗血栓形成和抗凝血的活性。
该类新的双重抑制剂的优异实例是用代码名称Org 42675显示的化合物，其中五糖与凝血酶的直接抑制剂连接，具有以下结构：
在实验性的血栓形成中的研究已经证明，此化合物除了有效的抗凝血和抗血栓形成的性质之外，还抑制凝块结合的凝血酶的活性。进一步，在预防闭合性动脉血栓的血栓溶解后血栓形成性再闭塞中，Org42675好像是高度有效的。与由NAPAP衍生的相应非-缀合的直接凝血酶抑制剂相比，该化合物显示了10-倍延长的半衰期。同阿加曲班、肝素和磺达肝素相比，Org 42675显示了改进的功效(Journal ofThrombosis and Haemostasis，第1卷，第9期，第1945页，2003年)。
新的双重抑制剂的临床潜力被认为是巨大的，因此已经开始了临床试验。
作为预防性措施，在抗凝血和抗血栓形成治疗的领域内，需要一种解毒剂，其能够有效地使所用的抗凝血或抗血栓形成药的活性中和或降到最低。这是因为众所周知的是，在由于任何偶然原因而进行治疗的患者中可能触发出血。而且，在进行抗血栓形成或抗凝血治疗的患者中进行手术干预可能是必要的。此外，在某些手术操作过程中，可以高剂量使用抗凝血药，以便防止血液凝固，并且在手术结束时使它们中和是必需的。因此可得到可以被中和，以便在任何时间停止抗血栓形成/抗凝血活性的抗血栓形成/抗凝血剂是有利的。
在US 2004/0024197中公开了，在紧急的情况下，使用抗生物素蛋白可以降低某些多糖的抗血栓形成活性，如果那些多糖含有至少一个与生物或生物素衍生物的共价键。
本发明涉及新的由WO 99/65934和WO 01/42262中所述的双重抑制剂衍生的可中和双重抑制剂。已经发现，某些生物素“标签”(为基团
Figure A20058004449100071
在这篇文献中也被称为“BT”(由六氢-2-氧代-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-戊酸，优选D(+)-异构体产生)或其类似物)可被连接至或引入到WO 99/65934和WO 01/42262中所述化合物的结构中，得到可中和的双重抑制剂。
因此，本发明涉及下式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐或其前药或溶剂合物
寡糖-间隔基-A    (I)，
其中，寡糖是带负电荷的寡糖残基，含有2至25个单糖单元，该电荷被带正电的反荷离子抵消，并且其中寡糖残基是由本身具有(AT-III介导的)抗-Xa活性的寡糖产生的；
间隔基是基本上药理学上无活性的柔性连接残基，具有10至70个原子的链长；
A是残基-CH[NH-SO2-R1][CO-NR2-CH(4-苄脒)-CO-NR3R4]，
其中，R1是苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘基、(异)喹啉基、四氢(异)喹啉基，3，4-二氢-1H-异喹啉基、色满基或樟脑基，这些基团可任选被一个或多个选自(1-8C)烷基或(1-8C)烷氧基的取代基取代；其中R2和R3独立地是H或(1-8C)烷基；R4是(1-8C)烷基或(3-8C)环烷基；或R3和R4与它们所连接的氮原子一起是任选含有另外杂原子的非芳香族(4-8)元环，该环任选被(1-8C)烷基或SO2-(1-8C)烷基取代；
其中，式I的化合物进一步含有至少一个连接生物素残基或其类似物的共价键。
本发明的化合物是双重抑制剂，具有非介导的、直接的抗凝血酶(因子IIa)活性和抗凝血酶III(AT-III)介导的抗-Xa活性的可调混合特性。本发明化合物的混合特性可以通过改变寡糖残基的性质和直接凝血酶抑制剂(NAPAP类似物)的效价来调节。因此可得到一系列的特性。本发明的化合物具有长的血浆半衰期，结果，与先前文献中报道的NAPAP或其衍生物相比，它们具有延长的抗凝血酶活性。此外，本发明的化合物可以避开血小板因子4(PF4)的中和作用。低毒性也是本发明的化合物的一个有利方面。
本发明的化合物适用于治疗和预防凝血酶介导和凝血酶相关的疾病。这包括大量的其中凝血级联被激活的血栓形成和血栓形成前状态，其包括但不限于深静脉血栓形成、肺栓塞、血栓性静脉炎、血栓形成或栓塞引起的动脉闭塞、血管成形术或血栓溶解过程中或之后的动脉再闭塞、动脉损伤或侵入性心脏学手术之后的再狭窄、术后静脉血栓形成或栓塞、急性或慢性动脉粥样硬化、中风、心肌梗死、癌症和转移，及神经变性疾病。本发明的化合物还可以用作体外血液循环中的的抗凝血药，如透析和手术中必需的。本发明的化合物还可以用作体外抗凝血药。
本发明化合物中的生物素标签(或其类似物)被特异性解毒剂快速识别并与其结合，该抗毒剂为抗生物素蛋白(The Merck Index，第十二版，1996，M.N.920，第151-152页)或链霉抗生物素蛋白，这两个四聚体蛋白质分别具有大约66000至60000Da的质量，其对于生物素具有非常高的亲和力。因此，在紧急的情况下，可以通过使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白快速中和双重抑制剂的作用，例如，通过注射含有它们的药物溶液。可以相似地使用具有高生物素亲和力的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的类似物。所得到的无活性解毒剂-抑制剂络合物从血液循环中清除。
生物素类似物(根据本发明其可以被用作标签)可以选自但不限于Pierce目录，1999-2000，第62-81页所示的生物素类似物，例如6-生物素酰氨基己酸酯、6-(6-生物素酰氨基己酰氨基)己酸酯和2-生物素酰氨基乙硫醇等，在这些类似物中，如先前定义的生物素残基BT是分子的特征部分。其他的类似物是例如在生物素酰胺键上被烷基化(其中烷基是(1-4C)烷基，优选是甲基)，并且对生物素酰胺酶裂解稳定的生物素类似物(Bioconjugate Chem.，第11卷，2000年，第569-583页；Bioconjugate Chem.，第11卷，2000年，第584-598页)或含有例如α连接至生物素酰胺键的羟基亚甲基、羧酸根或乙酸根的其它生物素类似物，如Bioconjugate Chem.，第12卷，第4期，2001年，第616-623页中所述的。
生物素类似物的优选残基具有式-(NH-CO)n-(CH2)p-NR-BT，其中n是0或1(尤其n是0)，p是4或5(尤其p是4)，R＝H或(1-4C)烷基，并且BT是如先前定义的。在优选的实施方案中，R是H。
在用它们相应的非生物素化的化合物的比较研究中已经发现，把生物素标签引入本发明的双重抑制剂基本上不干扰它们的直接凝血酶抑制效价，也不干扰它们的抗凝血酶III(AT-III)介导的抗-Xa活性。此外，当给予抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白时，式I化合物的抗血栓形成活性(基本上)被完全中和。
2至25个单糖单元的任何带负电荷的寡糖残基都可用于本发明的化合物中。本发明的适合化合物是其中寡糖是硫酸化的寡糖残基的化合物。优选地，寡糖残基是由本身具有(AT-III介导的)抗-Xa活性的寡糖，如EP 0,454,220、EP 0,529,715、WO 97/47659、WO 98/03554、WO 99/36443和WO 99/36428中公开的寡糖产生的。进一步优选的是具有2至16个，特别是2至6个单糖单元的寡糖残基。最优选寡糖是硫酸化的五糖残基。优选的五糖残基具有式(II)：
其中，R5独立地是生物素残基或其类似物、OSO3 -或(1-8C)烷氧基。在优选的五糖残基中，硫酸根基团的总数是4、5、6或7。
本发明优选的化合物是其中五糖残基具有以下结构的化合物：
其中R5是OCH3或OSO3 -。
特别优选的五糖残基是：
Figure A20058004449100103
本发明进一步优选的化合物是式I的化合物，其中R1式苯基或萘基，其任选被一个或多个选自甲基或甲氧基的取代基取代。更优选地，R1是4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基。在优选的化合物中，NR3R4表示哌啶基。优选地，R2是H。
间隔基是基本上药理学上无活性的柔性连接残基，优选沿着间隔基的“主链”计具有10至50个原子，不包括寡糖残基的氧。进一步优选是13至25个原子的长度，优选是16至22个原子，最优选是19个原子。
间隔基的化学性质对于本发明化合物的抗血栓形成活性具有较小的重要性。间隔基可以包含(稍微)刚性单元，如环结构和不饱和键。高度柔性间隔基比其他间隔基更适合。合适的间隔基可以被本领域技术人员容易地设计。由于合成的原因，更长的间隔基被认为是较不适合的，然而，更长的间隔基仍然可以成功地用于本发明的化合物中。优选的间隔基包含至少一个-(CH2CH2O)-单元。
本发明优选的化合物包含一个连接生物素残基或其类似物的共价键。
生物素(或其类似物)标签可以存在于式I化合物的所有部分中。因此，本发明的实施方案是其中(a)式I化合物的寡糖残基含有连接生物素残基或其类似物的共价键、(b)式I化合物的间隔基含有连接生物素残基或其类似物的共价键并且(c)式I化合物的残基A含有连接生物素残基或其类似物的共价键(其指的是在A定义中的氢原子或取代基已经被生物素残基替代)的化合物。
本发明的生物素化的双重抑制剂的代表性的实例是：
Figure A20058004449100121
和
Figure A20058004449100122
及其盐，还有其中间隔基在另一个位置与寡糖连接的式I化合物，和/或其中生物素(类似物)残基存在于分子的其他位置的化合物。优选是钠盐。
式III化合物是本发明的优选实例。
在式(I)化合物的描述中，使用以下的定义。
术语(1-4C)烷基和(1-8C)烷基是指有分支或无分支的烷基，分别具有1-4和1-8个碳原子，举例而言，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、己基和辛基。甲基和乙基是优选的烷基。
术语(1-8C)烷氧基是指具有1-8个碳原子的烷氧基，烷基部分具有如先前定义的含义。甲氧基是优选的烷氧基。
术语(3-8C)环烷基是指具有3-8个碳原子的环烷基，为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。环戊基和环己基是优选的环烷基。
间隔基长度是间隔基的原子数，沿着寡糖残基和分子的肽部分之间的最短链计算，不计算与间隔基连接的寡糖残基的氧原子。
术语“前药”是指其中例如脒基部分的氨基被保护的本发明的化合物，例如通过羟基或(1-6C)烷氧羰基进行保护。
本发明的溶剂合物包括水合物。
关于其中将生物素残基连接到式I化合物上的合成路线，化学文献提供了可以利用的多种可能性，并且通过它们可以使用本领域技术人员熟知的不同组的保护基团。包含例如活化酯、马来酰亚胺、碘代乙酰基或伯胺类型的反应基团的生物素残基将优选与胺官能团或巯基官能团、或羧酸官能团、或醛官能团反应，反应是按照文献(cf.Savage等人，Avidin-Biotin Chemistry：A Handbook；Pierce ChemicalCompany，1992)中所述的条件发生的。
生物素残基可以例如直接结合(带负电的)寡糖残基，或通过寡糖-间隔基残基的任选N-(1-4C)烷基化的氨基官能团或通过任选N-(1-4C)烷基化氨基酸残基连接式I化合物的寡糖残基的任选N-(1-4C)烷基化的胺官能团。
在本发明的另一个方面，生物素残基可以是例如直接结合残基A或通过连接残基的任选N-(1-4C)烷基化的氨基官能团，或通过任选N-(1-4C)烷基化的氨基酸残基结合式I化合物的残基A的任选N-(1-4C)烷基化的胺官能团。
然而在本发明的另一个方面，生物素残基可以例如被分步引入，首先直接结合残基A或通过式I的间隔基的一部分的任选N-(1-4C)烷基化的氨基官能团或通过任选N-(1-4C)烷基化的氨基酸残基结合式I化合物残基A的任选N-(1-4C)烷基化的胺官能团，其次，直接结合寡糖或通过式I的间隔基的一部分的任选N-(1-4C)烷基化的氨基官能团或通过任选N-(1-4C)烷基化的氨基酸残基结合式I化合物(带负电荷)的寡糖的任选N-(1-4C)烷基化的胺官能团结合，或者反之亦然。
在本发明的另一个方面，任选N-烷基化的氨基酸残基或α-N-取代的(β-)氨基酸类似物如[Bioconjugate Chem.，第12卷，第4期，2001年，第616-623页]中所述的，可以通过使用本领域已知方法的肽偶合引入。叠氮基是适合的潜在的胺官能团，其可以在式I化合物的前体中使用，用于随后引入生物素残基。制备式I化合物的优选的方法包括其中残基A的苄脒部分主前体的形式，优选是1，2，4-二唑啉-5-酮基团，接着通过脱保护，特别是通过氢化将其转化成苄脒的步骤(Bolton，R.E.等人，Tetrahedron Letters，第36卷，第25期，1995年，第4471-4474页)。
通过用半胱氨酸或赖氨酸或天冬氨酸在甘氨酸位置使用本领域熟知的方法衍生NAPAP(或NAPAP-类似物)，进一步制备本发明的化合物，该化合物随后(a)偶合至寡糖-间隔基残基或(b)偶合至间隔基，然后用巯基官能团或羧酸官能团将其衍生，接着偶合至寡糖残基。任何适合的寡糖可以用于此目的，例如文献中已知的寡糖(例如，来自EP0,454,220和EP 0,529,715，但是不限于这些来源)或商业上可购的寡糖。间隔与寡糖的偶合可以例如通过使用EP 0,649,854中所述的方法完成。
肽偶合(上述制备本发明化合物的方法中的操作步骤)可以通过本领域用于肽片段的偶合-或缩合-的常规已知的方法进行，如通过叠氮化物方法、混合酸酐方法、活化酯方法、碳二亚胺方法或，优选地在铵/脲阳离子盐如TBTU的影响下，特别是加入催化和外消旋抑制性化合物如N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑和7-氮杂-N-羟基苯并三唑。在 The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，第3卷，E.Gross和J.Meienhofer编辑(Academic Press，New York，1981)和 Peptides： Chemistry and Biology，N.Sewald和H.-D.Jakubke(Wiley-VCH，Weinheim，2002)中给出了综述。
在合成操作期间，化合物中存在的胺官能团可以通过N-保护基团来保护，N-保护基团是指肽化学中通常用于保护α-氨基的基团，如叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)或邻苯二甲酰(Phth)基，或者可以通过解蔽叠氮化物部分而被引入。在以上提到的 The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，第3卷和 Peptides：Chemistry and Biology中给出了氨基保护基团及其除去方法的综述。
可以游离碱的形式存在的本发明的化合物，可以药学上可接受的盐的形式从混合物中分离。药学上可接受的盐还可以通过用有机酸或无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、马来酸、丙二酸、甲磺酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、抗坏血酸等处理式(I)的游离碱而获得。
本发明的化合物或其中间体具有手性碳原子，因此可以纯的对映异构体或对映异构体的混合物，或者包含非对映异构体的混合物的形式获得。获得纯的对映异构体的方法是本领域熟知的，例如，由光学活性酸和外消旋混合物得到的盐的结晶，或者使用手性柱的色谱法。对于非对映异构体而言，可以使用正相或反相柱。
本发明的化合物可以肠内或胃肠外给药。这些化合物及其组合物的准确剂量和方案将必然取决于将给药的个体受试者的需要、痛苦的程度或执业医生的需求和判断。通常，胃肠外给药比更取决于吸收的其他给药方法需要更低的剂量。然而，对人而言，每日剂量优选是0.001-100mg/kg体重，更优选是0.01-10mg/kg体重。采用本发明的化合物制备的药物还可以用作急性抗凝血治疗中的助剂。在这样的情况下，该药物与适用于治疗这类疾病状态的其他化合物一起给药。
与药学上适合的辅助剂，例如标准参考书，Gennaro等人，Remington′s Pharmaceutical Sciences，(第18版，Mack PublishingCompany，1990，特别参见第8部分：Pharmaceutical Preparationsand Their Manufacture)中所述的混合，化合物可被压制成固体剂量单位如丸剂、片剂或被加工成胶囊或栓剂。采用药学上适合的液体，还可以溶液、混悬液、乳液的形式使用化合物，例如用作注射制剂或作为喷雾剂，例如用作鼻喷雾剂。
为了制备剂量单位例如片剂，考虑到常规添加剂如填充剂、着色剂、聚合物粘合剂等的使用。通常，可以使用不干扰活性化合物功能的任何药学上可接受的添加剂。可与组合物一起给药的适合载体包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物等，或其混合物，以适当的量使用它们。
附图说明
图1.通过皮下给予100nmol/kg的本发明的生物素化的化合物III(“biotin”)之后测量抗-Xa或抗-IIa活性，测定的平均血浆水平。此外，测定抗-Xa活性之后给出了Org 42675(“original”)的血浆水平。
图2.显示了皮下给予100nmol/kg化合物之后的平均血浆水平±s.e.m。在t＝2h时，向这些用本发明的化合物III(“biotin”)或Org 42675(“original”)处理的那些大鼠中静脉给予抗生物素蛋白(10mg/kg)。同原形化合物的行为相比，给予抗生物素蛋白影响了本发明化合物III的药物动力学行为。
通过以下的实施例进一步说明本发明。
实施例
所用的简写
Aq.＝含水的
ATIII＝抗凝血酶III
Boc＝叔丁氧羰基
DCM＝二氯甲烷
DiPEA＝N，N-二异丙基乙胺
DMF＝N，N-二甲基甲酰胺
Et＝乙基
fmoc＝9-芴基甲氧羰基
NMM＝N-甲基吗啉
Me＝甲基
sat.＝饱和的
PRP＝富含血小板的血浆
PPP＝少含血小板的血浆
RT＝室温
TBTU＝2-(1N-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
实施例1
方案1
Ne-(D-(+)-生物素基)-N-{4-[[4-[[(1R)-1-[[4-(1，2，4-二唑-5-酮基)苯基]甲基]-2-氧代-2-(1-哌啶基)乙基]氨基]-3-[[(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基)磺酰基]氨基]-1，4-(S)-二氧代-丁基]氨基]-丁酰基}-L-赖氨酸(3)
把根据WO 01/42262中所述的制备的化合物2(0.20g，0.27mmol)溶解于DCM(10mL)。加入DiPEA(0.14mL，0.81mmol)，接着加入TBTU(86mg，0.27mmol)。在氮气气氛下搅拌1小时之后，加入固体的化合物1(Nε-fmoc-Lys-OH，0.27mmol，Fluka)。加入DMF(5mL)以溶解Nε-fmoc-Lys-OH。混合物搅拌16小时，倾入0.5 N HCl-溶液中。溶液用DCM(3x)萃取。合并的有机层用盐水洗，干燥(MgSO4)并减压(850mbar，45℃)浓缩。粗制品通过二氧化硅柱色谱法(DCM/MeOH/AcOH，99/0/1→89/10/1，v/v/v)纯化。剩余的AcOH通过在甲苯中反复浓缩除去。使用HPLC色谱法(ACN/H2O/0.1N TFA，20∶78∶3→95∶2∶3)完成进一步的纯化，得到0.15g(53％)的纯化合物。TLC：Rf 0.5(DCM/MeOH/AcOH，90/9/1，v/v/v)。LC-MS：m/z 1089[M+H]1+。
Fmoc保护的中间体(0.15g，0.14mmol)溶解于THF(5mL)中，加入Et2NH(2mL)。使混合物在45℃下搅拌45分钟。溶液在减压下浓缩并在甲苯浓缩。ESI-MS：m/z 857[M+H]1+。
将Nε-脱保护的赖氨酸衍生物(0.14mmol)溶解于DMF(3mL)，并加入至已经在氮气氛下搅拌1小时的含D-(+)-生物素(34mg，1当量)、TBTU(45mg，1当量)和DiPEA(61μL，2.5当量)的DMF(4mL)的溶液中。所得的混合物搅拌16小时。减压除去溶剂。加入EtOAc(30mL)并搅拌。过滤收集固体产物3，用MeOH和EtOAc洗涤，并在真空下干燥。收率86mg(57％)。Rf 0.15(DCM/MeOH，9/1，v/v)。ESI-MS：1083.6[M+H]+。
制备化合物III和IV的一般方法：
羧酸衍生物(33μmol)(即，化合物3或11)通过在无水DMF(2×2mL)中重复浓缩而干燥，再溶解于DMF(1mL)，并在TBTU(11mg，33μmol)和DiPEA(5.7mL，33μmol)存在下在氮气气氛中搅拌。1小时之后，加入五糖4(31μmol)。反应混合物在室温下搅拌16小时，并用离子交换(Mono-Q)色谱法分析。浓缩(＜50℃，15mmHg)反应混合物。(粗)产品(H2O/t-BuOH，1/1，v/v中10mg/mL)通过在10％Pd/C(相对于粗产品加入重量上相等量)上氢化(H2)脱保护。16小时之后，将溶液脱气，通过0.45μM HPLC过滤器过滤，在减压(＜50℃，15mmHg)下浓缩。缀合物通过离子交换色谱法(Q-sepharose，缓冲液：H2O→2MNaCl)纯化，接着用Sephadex G25-柱(H2O)脱盐并冷冻干燥。
甲基O-2，3-二-O-甲基-4O-＜＜＜12-N-＜＜Nε-(D-(+)-生物素基)-N-＜)]-{4-[[4-[[(1R)-1-[[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]甲基]-2-氧代-2-(1-哌啶基)乙基]氨基]-3-[[(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基)磺酰]氨基]-1，4-(S)-二氧代-丁基]氨基]-丁酰基}-L-赖氨酰＞＞-12-氮杂-3，6，9-三氧杂-十二烷基＞＞＞-6O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖醛酸基(glucopyranuronosyl)-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸基(idopyranuronosyl)-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷八钠盐(III)
化合物III通过化合物3(86mg，81μmol)和化合物4(0.14g，80μmol)的缀合而制备和纯化，化合物4根据WO 01/42262中所述的，按照一般方法制得。收率0.14g(60％)。ESI/TOF-MS：880.91[M-3H]3-，888.57 [M-3H+Na]3-，660.43[M-4H]4-。
1H-NMR(D2O，600 MHz)；在4.71ppm处的参照水信号阻止了4.80-4.50ppm之间的信号的可靠整合。δ7.66(m，2H)，7.30(m，2H)，6.74(m，1H)，5.36(m，1H)，5.25(m，1H)，5.05(m，1H)，4.98(m，1H)，4，84(m，1H)，4.46(m，2H)，4.31(m，1H)，4.27-4.13(5H)，4.13-3.99(5H)，3.92(m，1H)，3.88-3.70(8H)，3.70-3.07(49H±5)，3.07-2.92(4H)，2.85(m，1H)，2.76(m，1H)，2.65(m，1H)，2.51(s，3H)，2.40(s，3H)，2.36-2.22(m，2H)，2.21-2.11(m，2H)，2.08(m，1H)，2.06-1.91(4H)，1.83-1.03(20H±2)。
方案1
Figure A20058004449100201
实施例2
方案2
15-N-(9-芴基甲氧羰基)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五酸叔丁酯(6)
将15-氨基-3，6，9，12-四氧杂-十五酸叔丁酯(5)(0.50g，1.45mmol)溶解于THF(7.5mL)和H2O(5mL)。加入4N NaOH溶液直至pH大约是9。分次加入N-9-芴基甲基氨基甲酸酯-琥珀酰亚胺(FmocOSu，0.54g，1.60mmol，1.1当量)。10分钟之后，加入另外的4N NaOH溶液以调节pH至大约9。3小时之后，反应混合物用1N HCl溶液酸化至pH6-7。向反应混合物中加入H2O，其再用EtOAc萃取三次。有机相用盐水洗，并用MgSO4干燥。过滤之后，减压(50mbar，50℃)除去溶剂。粗制的油通过二氧化硅柱色谱法(DCM/MeOH，1/0→95/5，v/v)纯化得到化合物6，为淡黄色油(0.61g，79％)。Rf 0.64(DCM/MeOH，95/5，v/v)。
15-N-(9-芴基甲氧羰基)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五酸酯(7)
将化合物6溶解于DCM(3.5mL)中，在氮气气氛下加入TFA(3.5mL)。搅拌1.5小时之后，反应混合物在减压下浓缩。然后，通过在甲苯中的重复浓缩除去过量的TFA。加入DCM/Et2O(100mL，1/2，v/v)，并用1N HCl洗。水层用DCM/Et2O(100mL，1/2，v/v)萃取。合并的有机层用盐水洗，通过MgSO4干燥。过滤之后，在大气压下(50℃)除去溶剂。粗制油通过二氧化硅柱色谱法(DCM/MeOH/AcOH，99/0/1→89/10/1，v/v/v)纯化得到化合物7。通过将粗制油状产物溶解于DCM/Et2O(1/2，v/v)中并用水(3次)和盐水洗，接着通过MgSO4干燥，除去剩余的AcOH。过滤之后，在大气压下(50℃)除去溶剂，以得到化合物7，为淡黄色油(0.37g，67％)。Rf 0.32(DCM/MeOH，89/10/1，v/v)。
叔丁基15-N-(9-芴基甲氧羰基)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五酰基-ε-N-(Z)-L-赖氨酸(8)
将化合物7(0.37mg，0.77mmol)溶解于DCM(18mL)。在氮气气氛下依次加入DIPEA(0.40μL，2.31mmol，3当量)和TBTU(0.25g，0.77mmol)，搅拌溶液10分钟。再加入ε-(Z)-L-Lys-OtBu·HCl(0.29g，0.77mmol)，混合物再搅拌1.5小时。反应混合物用DCM稀释，并用H2O、0.1N HCl、饱和的NaHCO3-溶液和盐水清洗。干燥(MgSO4)有机相，在大气压下浓缩。通过硅胶柱色谱法(DCM/MeOH，1/0→9/1，v/v)完成纯化，以得到化合物8，为淡黄色油(0.51g，83％)。Rf 0.85(DCM/MeOH，9/1，v/v)。ESI-MS：792.6[M+H]+，814.6[M+Na]+，736.4[M-tBu+H]+
叔丁基15-N-叔丁氧羰基-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五酰基-ε-N-(Z)-L-赖氨酸(9)
将化合物8(0.26g，0.32mmol)溶解于THF(5mL)。加入Et2N(1mL)，使溶液搅拌24小时。过量的Et2N和溶剂在减压(50℃)下除去。加入甲苯，并在减压(50℃，65mbar)下除去，得到N-脱保护的中间体产物(0.21g，0.32mmol)，Rf 0.23(DCM/MeOH，9/1，v/v)ESI-MS：570.4[M+H]+，514.4[M-tBu+H]+。粗产品溶解于DCM(3mL)。在氮气气氛下加入Et3N(0.11mL)，接着加入二碳酸二-叔丁酯(73mg，0.34mmol，1.1当量)。搅拌5小时之后，把混合物加入至0.1N HCl的冷(5℃)溶液，并用EtOAc萃取.有机层用盐水洗并干燥(MgSO4)。过滤之后，在减压(180mbar，50℃)下除去溶剂。通过硅胶柱色谱法(DCM/MeOH，1/0→95/5，v/v)完成纯化，以得到9，为无色油(0.17g，82％)。Rf 0.5(DCM/MeOH，9/1，v/v).  ESI-MS：670.6[M+H]+，692.4[M+Na]+，570.4 [M-Boc+H]+，514.1[M-Boc-tBu+H]+.
15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五酰基-ε-[D-(+)-生物素基]-L-赖氨酸(10)
将化合物9(0.23g，0.34mmol)溶解于EtOH(8mL)和水(1.2mL)中。用氮气冲洗溶液5分钟之后，加入Pd/C 10％(0.11g)。向溶液中通入氢气4小时。向溶液中冲入氮气10分钟以除去所有的氢气。混合物经过decalite过滤，并在减压(170mbar，50℃)下浓缩以得到N-L-赖氨酸脱保护的中间体，为无色油(0.15g，81％)。Rf 0.02(DCM/EtOAc，9/1，v/v)。
将D-(+)-生物素(75mg，0.31mmol)悬浮于DCM(7mL)。接着在氮气气氛下加入DIPEA(0.11mL，0.62mmol，2当量)和TBTU(0.10g，0.31mmol)，使溶液搅拌1小时。向反应混合物中加入上述N-L-赖氨酸脱保护的中间体的DCM(3mL)的溶液。使混合物搅拌16小时。加入水，并用DCM(3x)萃取。干燥(MgSO4)有机层，过滤并减压(850 mbar，50℃)浓缩。通过硅胶柱色谱法(洗脱剂：DCM/MeOH，1/0→9/1v/v)完成纯化，以得到油(0.13g，60％)。Rf 0.48(DCM/MeOH，9/1，v/v)。ESI-MS：762.6[M+H]，784.6[M+Na]，662.4[M-Boc+H]，606.4[M-Boc-tBu+H]。将该油溶解于无水的二烷(4mL)中的4N HCl溶液中，并搅拌。1小时之后出现不溶的油，在此之后，在减压(100mbar，50℃)下除去溶剂，以定量的收率得到化合物10。ESI-MS：606.4[M+H]+，628.4[M+Na]+。
方案2
Figure A20058004449100241
方案3
Nε-(D-(+)-生物素基)-N-{{4-[[4-[[(1R)-1-[[4-(1，2，4-二唑-5-酮基)苯基]甲基]-2-氧代-2-(1-哌啶基)乙基]氨基]-3-[[(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基)磺酰基]氨基]-1，4-(S)-二氧代-丁基]氨基]-丁酰基}-15-N-(15-氮杂-1-氧代-3，6，9，12-四氧杂-十五烷基)]}-L-赖氨酸(11)
按照关于制备化合物3所述的，将化合物10(0.12g，0.21mmol)偶合至化合物2(0.15g，0.21mmol)。粗制品通过制备型HPLC(C18，ACN/H2O，0.01％TFA)纯化，以得到纯的化合物11。收率是60mg(22％)。ESI-MS：1316.8[M+H]+
甲基O-2，3-二-O-甲基-4O-＜＜＜12-N-＜＜Nε-(D-(+)-生物素基)-N-＜[15-N-(15-氮杂-1-氧代-3，6，9，12-四氧杂-十五烷基)]-{4-[[4-[[(1R)-1-[[4-(氨基亚氨基甲基)苯基]甲基]-2-氧代-2-(1-哌啶基)乙基]氨基]-3-[[(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基)磺酰基]氨基]-1，4-(S)-二氧代-丁基]氨基]-丁酰基}＞-L-赖氨酰＞＞-12-氮杂-3，6，9-三氧杂-十二烷基＞＞＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡糖醛酸基-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸基-(1-＞4)-3-O-甲基-2，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡糖苷八钠盐(IV)
 将化合物11偶合至化合物4，中间体缀合物根据常规方法脱保护以得到化合物IV。
收率9.2mg(7.6％)。
1H-NMR(D2O，600MHz)，在4.70ppm处的参照水信号阻止了4.80-4.54ppm之间的信号的可靠整合。δ7.59(d，2H)，7.23(d，2H)，6.68(s，1H)，5.32(m，1H)，5.19(m，1H)，4.91(m，1H)，4.85(m，1H)，4.76(m)，4.53-4.31(3H)，4.30-4.05(9H)，4.04-3.90(7H)，3.89-3.62(7H)，3.61-3.42(42H±4)，3.42-3.31(18H±2)，3.31-3.14(12H)，3.14-3.05(5H)，3.03-2.94(3H)，2.93-2.84(2H)，2.81(dd，1H)，2.70(dd，1H)，2.59(d，1H)，2.44(s，3H)，2.34(s，3H)，2.22-2.08(4H)，2.06(t，2H)，1.96(s，3H)，1.72-1.01(18H±2)
ESI/TOF-MS：m/z 574.72[M-5H]5-，m/z 718.66[M-4H]4-，m/z958.56[M-3H]3-。
方案3
Figure A20058004449100261
实施例3
药理学
测定人血浆中抗-因子Xa和因子IIa活性的体外试验
分别使用S2222或S2238(Chromogenix，Chromogenics Ltd，Molndal，瑞典)作为底物，通过酰胺分解测量在人血浆中试验化合物的抗-因子Xa和IIa活性。实验设计是基于Teien和Lie所述的方法。(Teien AN，Lie M.Evaluation of an amidolytic heparin assay methodincreased sensitivity by adding purified antithrombin III.Thromb.Res.1977，10：399-410)。以IC-50(Mol/L)表示该两种活性。
表1.体外抗血栓形成活性的总结
    化合物     ORG 42675 本发明的化合物III
    抗-IIa人血浆pH7.4IC-50(M) 1.78E-08 1.62E-08
    抗-Xa人血浆pH7.4IC-50(M) 7.67E-10 8.43E-10
3.1药物动力学
在300-400gr的雄性Wistar大鼠中研究Org 42675和本发明化合物III的药物动力学性质。通过吸入O2/N2O/异氟烷的混合物使大鼠麻醉，此后，右颈静脉插管。第二天用100nmol/kg剂量皮下处理大鼠。皮下给药后，以多个时间间隔取血样。然后，离心血液，此后，虹吸出血浆，在-20℃贮存直至使用。通过酰胺分解测量试验化合物的浓度，使用S-2222或S-2238作为底物(Chromogenix，ChromogenicsLtd，Molndal，瑞典)，以分别测定抗-Xa或抗-IIa活性。两个方法都是基于Teien和Lie的方法(Teien AN，Lie M.Evaluation of an amidolyticheparin assay method increased sensitivity by adding purifiedantithrombin III.Thromb.Res.1977，10：399-410)。对照标准曲线，测定得到的血浆样品中的浓度，标准曲线由试验化合物本身的储备溶液制得。样品中的浓度以nmol/mL表示，并用WinNonlin的非房室模型计算动力学参数(参见图1)。
表2：大鼠皮下给予本发明的化合物III或Org 42675(100nmol/kg)后的药物动力学参数。以n＝3/处理进行实验。
本发明的化合物III  本发明的化合物III  Org 42675
平均值±s.e.m.抗_Xa  平均值±s.e.m.抗-IIa  平均值±s.e.m.抗_Xa
 Tmax(h) 1.2±0.4  1.5±0.5  2.3±0.2
 Cmax(nmol/mL) 1.1±0.1  1.1±0.3  1.0±0.02
 T1/2eli(h) 3.9±0.3  2.7±0.5  2.7±0.2
 AUCinf(h.nmol/mL) 7.2±0.2  5.0±0.6  5.3±03
 Vz(mL/kg) 78±4.6  78±4.2  74±4.5
 Cl(mL/h/kg) 13.9±0.4  20.6±2.4  19.1±1.1
 MRT(h) 5.9±05  4.3±0.3  4.6±0.2
结论是，在实验的变异性之内，本发明的化合物III和Org 42675在大鼠中显示了相同的药物动力学行为。
3.2药物动力学-中和实验：
大鼠用本发明的化合物III或Org 42675以皮下剂量100nmol/kg处理。t＝2h时，抽取血样，并向用本发明的化合物III或Org 42675处理的大鼠静脉内给予10mg/kg的抗生物素蛋白(来自蛋清，Sigma)。相继在0.17、0.5、1、2、3和7小时抽血样。根据药物动力学实验中所述的来处理血液，并通过测量(残留)抗-Xa或抗-IIa活性来测定样品的浓度。(参见图2)
表3：t＝2h时皮下给予100nmol/kg本发明化合物III或Org42675和抗生物素蛋白(10mg/kg)后计算的曲线下面积(AUC’s)。
从T＝2h起计算数据。以n＝3/处理进行实验。
本发明的化合物III 本发明的化合物III 化合物Org 42675
平均值±s.e.m.抗_Xa 平均值±s.e.m.抗-IIa 平均值±s.e.m.抗_Xa
AUCinf(h.nmol/mL) 1.2±0.1 0.8±0.1 4.8±0.6
结论是，皮下给予本发明化合物III(100nmol/kg)之后，通过测量(残留)抗-Xa和抗-IIa活性而测定的抗血栓形成活性，可以通过静脉内给予10mg/kg的抗生物素蛋白中和。同化合物Org 42675比较，给予抗生物素蛋白之后，抗生物素蛋白对本发明化合物III的中和反映在本发明化合物III的血浆浓度快速减少和明显减少的AUCinf。此外，非生物素化的相当化合物Org 42675的药物动力学行为不受加入抗生物素蛋白的影响。后者证实，中和与存在生物素标签相关，并且其不影响双重抑制剂的药物动力学行为。

Claims (25)

1、式(I)的抗血栓化合物或其药学上可接受的盐或前药或其溶剂化物；
寡糖-间隔基-A    (I)，
其中，寡糖是带负电荷的寡糖残基，含有2至25个单糖单元，该电荷被带正电的反荷离子抵消，并且其中寡糖残基是由本身具有(AT-III介导的)抗-Xa活性的寡糖产生的；
间隔基是基本上药理学上无活性的柔性连接残基，具有10至70个原子的链长；
A是残基-CH[NH-SO2-R1][CO-NR2-CH(4-苄脒)-CO-NR3R4]，
其中，R1是苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘基、(异)喹啉基、四氢(异)喹啉基，3，4-二氢-1H-异喹啉基、色满基或樟脑基团，这些基团可任选被一个或多个选自(1-8C)烷基或(1-8C)烷氧基的取代基取代；并且其中R2和R3独立地是H或(1-8C)烷基；R4是(1-8C)烷基或(3-8C)环烷基；或R3和R4与它们所连接的氮原子一起是任选含有另外杂原子的非芳香族的(4-8)元环，该环任选被(1-8C)烷基或SO2-(1-8C)烷基取代；
其中，式I的化合物进一步含有至少一个连接生物素残基或其类似物的共价键。
2、权利要求1的化合物，其中所述寡糖残基具有2至16个单糖单元。
3、权利要求2的化合物，其中所述寡糖是硫酸化的五糖残基。
4、权利要求3的化合物，其中所述寡糖是式(II)的五糖残基，
Figure A2005800444910002C1
其中，R5独立地是生物素残基或其类似物、OSO3 -或(1-8C)烷氧基。
5、权利要求4的化合物，其中所述五糖残基具有以下结构
Figure A2005800444910003C1
其中，R5是OCH3或OSO3 -。
6、权利要求5的化合物，其中所述五糖残基具有以下结构
Figure A2005800444910003C2
7、权利要求1至6任一项的化合物，其中所述间隔基具有10至50个原子的长度，优选是16至22个原子，最优选是19个原子的长度。
8、权利要求7的化合物，其中所述间隔基具有16至22个原子的长度。
9、权利要求1至8任一项的化合物，其中所述间隔基包含至少一个-(CH2CH2O)-单元。
10、权利要求1至9任一项的化合物，其中R1是苯基或萘基，其任选被一个或多个选自甲基或甲氧基的取代基取代。
11、权利要求10的化合物，其中R1是4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基。
12、权利要求1至11任一项的化合物，其中NR3R4表示哌啶基。
13、权利要求1至12任一项的化合物，其中R2是H。
14、权利要求1至13任一项的化合物，它含有一个连接生物素残基或其类似物的共价键。
15、权利要求1至4、7至14任一项的化合物，其中所述式I化合物的寡糖残基含有连接生物素残基或其类似物的共价键。
16、权利要求15的化合物，其中所述式I化合物的寡糖残基含有一个连接式-(NH-CO)-(CH2)5-NR-BT的生物素类似物的共价键，其中BT是残基
Figure A2005800444910004C1
其中，R是H或(1-4C)烷基。
17、权利要求1至14任一项的化合物，其中所述式I化合物的间隔基含有连接生物素残基或其类似物的共价键。
18、权利要求17的化合物，其中所述式I化合物的间隔基含有一个连接式-(CH2)4-NR-BT的生物素类似物的残基的共价键，其中R和BT具有先前所定义的含义。
19、权利要求18的化合物，它是
Figure A2005800444910004C2
或其药学上可接受的盐、其前药或溶剂合物。
20、权利要求19的化合物，它呈其钠盐的形式。
21、权利要求1至14任一项的化合物，其中式I化合物的残基A含有连接生物素残基或其类似物的共价键。
22、一种药物组合物，它含有权利要求1至21任一项的化合物和药学上适合的辅助剂。
23、制备式I化合物的方法，它包括其中残基A中的苄脒部分呈前体的形式，为1，2，4-二唑啉-5-酮基团，随后通过脱保护将其转化成苄脒的步骤。
24、权利要求1至21任一项的化合物，其用于治疗中。
25、权利要求1至21任一项的化合物在制备用于治疗或预防血栓形成或其他与凝血酶有关的疾病的药物中的用途。
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