CN101312747B - 包括生物素标记的抗血栓形成双重抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式I的化合物低聚糖-间隔子-GpIIb/IIIa拮抗剂(I)，其中低聚糖是包括四到二十五个单糖单位的带负电荷的低聚糖残基，所述电荷由带正电荷的平衡离子平衡，并且其中低聚糖残基衍生自本身具有(AT-III介导的)抗Xa活性的低聚糖；间隔子是化学键或基本上药理学无活性的连接残基；GpIIb/IIIa拮抗剂是模拟纤维蛋白原的RGD和/或K(QA)GD片段的残基，包括位于该残基内彼此距离为10-20

Description

包括生物素标记的抗血栓形成双重抑制剂
本发明涉及新的包括生物素标记或生物素衍生物的抗血栓形成双重抑制剂、它们的制备方法、包含该化合物作为活性成分的药物组合物、以及所述化合物用于生产药物的用途。
在探索具有可预测的抗血栓形成作用的GPIIb/IIIa拮抗剂，优选具有更长的半衰期(以实现血小板凝聚抑制的稳定水平)的最新进展产生了具有混合药理学特征的新的抗血栓形成双重抑制剂。这些新的化合物抑制凝结级联(因子Xa)和血小板凝聚途径(GpIIb/IIIa)二者中的两个关键靶(描述在EP 1574516中)。
作为预防性措施，在抗凝血剂和抗动脉粥样化血栓形成治疗领域中，需要能够有效地将使用的抗凝血剂或抗动脉粥样化血栓形成药物的活性中和或使其最小化的解毒剂。这是因为，公知由于任何偶然原因可以引起被治疗患者出血。另外，有必要在抗动脉粥样化血栓形成或抗凝结处理的情况下对患者进行手术介入。另外，在一些外科手术过程中，可以以高剂量使用抗凝血剂，以预防血液凝固并且有必要在手术结束时将它们中和。此外，在其中使用GpIIb/IIIa抑制剂的抗血小板治疗中仍没有临床上有效的解毒剂。因此，具有可以在任何时候为了中止抗动脉粥样化血栓形成和/或抗凝结活性的抗动脉粥样化血栓形成剂和/或抗凝血剂是有利的。
在US 2004/0024197(WO02/24754)中公开了在紧急状况下可以使用抗生物素蛋白部分地降低某些聚糖的抗凝结活性，条件是那些聚糖包含至少一个与生物素或生物素衍生物的共价键。
O.Roger等人在Carbohydrate Polymers 50(2002)273-278中讨论了通过还原胺化进行碳水化合物的衍生化，包括生物素化的试剂。该公开涉及多分散性天然聚糖的非选择性变体。
本发明涉及新的可被中和的双重抑制剂，其衍生自EP 1574516描述的双重抑制剂。已经发现可以将某些生物素“标记”连接于EP1574516中所述化合物的结构或被引入到所述化合物的结构中，产生可被中和的双重抑制剂，所述生物素标记为如下基团：
Figure S2006800435030D00021
，在本文中也被称为“BT”(衍生自六氢-2-氧代-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-戊酸，优选D(+)-异构体)。
因此，本发明涉及式(I)的化合物
低聚糖-间隔子-GpIIb/IIIa拮抗剂(I)，
其中
低聚糖是包括四到二十五个单糖单位的带负电荷的低聚糖残基，所述电荷由带正电荷的平衡离子平衡，并且其中低聚糖残基衍生自本身具有(AT-III介导的)抗Xa活性的低聚糖；
间隔子是化学键或基本上药理学无活性的连接残基；
GpIIb/IIIa拮抗剂是模拟纤维蛋白原的RGD和/或K(QA)GD片段的残基，包括位于该残基内彼此距离为10-20
Figure S2006800435030D00022
的羧化物部分和碱性部分；
或其可药用盐或其前体药物或溶剂化物；
其中式I的化合物另外包括至少一个与生物素标记或其类似物的共价键。
通过ATIII介导的凝固因子Xa抑制和通过拮抗纤维蛋白原与其受体的结合而抑制血小板凝聚，本发明的化合物是有效的抗血栓形成剂。它们可用于治疗和(可能用于)预防血栓性疾病。这包括其中凝结级联被激活的许多血栓形成状态和前血栓形成状态，其包括但不限于深静脉血栓形成、肺栓塞、血栓性静脉炎、由血栓形成或栓塞引起的动脉阻塞、血管成形术过程中或之后的动脉再阻塞、动脉损伤或侵入性心脏操作过程之后的再狭窄、手术后的静脉血栓形成或栓塞、中风和心肌梗死。
本发明的化合物中的生物素标记(或其类似物)迅速被特异解毒药识别并且与之结合，所述特异解毒药为抗生物素蛋白(The Merck Index，第十二版，1996，M.N.920，第151-152页)或链霉抗生物素蛋白，质量分别等于约66000和60000Da的两种四聚体蛋白质，具有非常高的生物素亲合力。因此，在紧急情况中，可以通过使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白迅速中和本发明的双重抑制剂的作用，例如通过注射包含抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的药物溶液进行。可同样地使用具有高生物素亲合力的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白类似物。产生的无活性的解毒剂-抑制剂复合物被从血液循环清除。
已经在使用相应的非生物素化的化合物的比较研究中发现，将生物素标记引入到双重抑制剂中不会妨碍它们的血小板凝聚抑制活性，也不妨碍它们的抗凝血酶III(AT-III)介导的抗Xa能力。另外，给予抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白引起快速的并且最高为定量的式I化合物的抗血栓形成活性中和。
可用作本发明的标记的生物素类似物可选自但不限于在Piercecatalogue，1999-2000，第62到81页中所示的生物素类似物，例如6-生物素酰胺基己酸酯(biotinamidohexanoate)、6-(6-生物素酰胺基己酰胺基)己酸酯、和2-生物素酰胺基乙硫醇等。在这种类似物中，前述定义的生物素标记BT是该结构的特征部分。其它类似物为例如在生物素酰胺键上烷基化的生物素类似物(其中烷基为(1-4C)烷基，优选甲基)，其对于生物素化物酶裂解是稳定的；或者在生物素酰胺键的α位包括例如羟基亚甲基、羧化物、或乙酸根的其它生物素类似物。
优选的生物素类似物为式-(NH-CO)n-(CH2)p-X-BT，其中n为0或1，p为4或5，X＝NH、N(1-4C)烷基、-NH-CH(CH2OH)-CH2-C(O)-NH-、-NH-CH(CH3)-CH2-C(O)-NH-、-NH-CH(COOH)-CH2-C(O)-NH-、-NH-CH(CH2COOH)-CH2-C(O)-NH-，和BT如前述定义的。
具有四到二十五个单糖单位的任何带负电荷的低聚糖残基都可用于本发明的化合物中。适合的本发明化合物是其中低聚糖为硫酸化低聚糖残基的低聚糖。优选地，低聚糖残基衍生自本身具有(AT-III介导的)抗-Xa活性的低聚糖，例如在EP 0,454,220、EP 0,529,715、WO 97/47659、WO 98/03554和WO 99/36443中公开的低聚糖。另外优选的是具有四到十六个单糖单位的低聚糖残基。最优选地，低聚糖是硫酸化的五糖残基。优选的五糖残基为结构A
其中R1独立地为生物素标记或其类似物、OSO3 -或(1-8C)烷氧基。
特别优选的五糖具有结构B
Figure S2006800435030D00042
其中R1为OCH3或OSO3 -。在最优选的结构B的五糖中，R1为OSO3 -。
间隔子是键或基本上药理学无活性的、可弯曲的连接残基；本文中使用的术语“基本上药理学无活性的”是指间隔子不含本身在本发明化合物的为治疗有效的剂量表现出药理学活性的原子或基团。因此，在本发明化合物用作抗血栓形成剂的剂量，间隔子的性质不会引起明显的药理学副作用。在优选的实施方案中，间隔子是基本上药理学无活性的连接残基，优选具有沿着间隔子的“骨架”计数为1-50个原子，低聚糖残基的氧未包括在内。间隔子可以包括(在一定程度上)刚性单元，例如环状结构和不饱和键。优选本发明的化合物的间隔子是可弯曲的。可以由本领域技术人员容易地设计适合的间隔子。更优选的间隔子长度是10-35个原子，特别是10-28个。由于合成的原因，认为更长的间隔子不太适合，然而，更长的间隔子仍可以成功地用于本发明的化合物。非常适合的间隔子包括至少一个-(CH2CH2O)-单元。更优选的间隔子包括更多个、优选六个-(CH2CH2O)-单元。
间隔子与GpIIb/IIIa拮抗剂残基的连接位置可以实质上任意选择，只要不消除GpIIb/IIIa拮抗剂活性。因此，典型地存在的羧化物部分(任选地被酯化)和碱性部分必须保持不受影响。
在本发明优选的化合物中，GpIIb/IIIa拮抗剂残基选自衍生自以下的残基：Ro 435054、SC 54701(珍米洛非班)、RWJ 50042、西拉非班(Ro 443888)、拉米非班(Ro 449883)、GPI 562、FK 633、替罗非班(MK 383)、奥波非班(SC 57101)、埃替非巴肽(C6822)、罗昔非班(XV 459)、艾罗非班(RWJ 53308)、SR 121787、来达非班(BIBU 52)、洛曲非班(SB 214857)、更托非班(YM 028)、T-250、EF 5077、ZD 2486、TAK 029、TP 9201、L 703014、SR 121566(SR 121787的活性形式)和UR-3216。所述残基的衍生物还包括化学修饰的残基，其中包括(任选地被酯化的)羧化物部分和碱性部分(或被保护的碱性部分)的部分得到保留。在优选的实施方案中，选择SR 121566(SR 121787的活性形式)。最优选的是其中GpIIb/IIIa拮抗剂残基衍生自替罗非班的化合物。
本发明优选的化合物包括一个与生物素标记或其类似物的共价键。
生物素(或其类似物)标记可存在于式I化合物的所有部分中。因此，本发明的实施方案是如下的化合物，其中：(a)式I的化合物的低聚糖残基包括与生物素标记或其类似物的共价键，(b)式I的化合物的间隔子包括与生物素标记或其类似物的共价键，(c)式I的化合物的GpIIb/IIIa拮抗剂残基包括与生物素标记或其类似物的共价键。
优选的是包括一个与生物素类似物的共价键的化合物，其中式I的化合物的低聚糖残基包括一个与式-(NH-CO)n-(CH2)p-X-BT的生物素类似物的共价键，其中n为0或1(在这些化合物中，优选n＝1)，p为4或5(在这些化合物中，优选p＝5)，X和BT如前述定义。
其它优选的本发明的化合物是包括一个与生物素类似物的共价键的化合物，其中式I的化合物的间隔子包括一个与式-(CH2)4-X-BT的生物素类似物的共价键，其中X和BT如前述定义。
本发明的生物素化双重抑制剂的代表性实例具有以下结构
Figure S2006800435030D00061
和
Figure S2006800435030D00071
以及式I的化合物，其中间隔子在另一个位置连接于低聚糖，和/或其中在分子的其它位置存在生物素(类似物)标记的化合物。式II的化合物是本发明优选的实例。
带正电荷的平衡离子是指H+、Na+、K+、Ca2+等等。优选地，式I的化合物为其钠盐形式。
术语碱性部分是指任何公知的碱性部分，例如胺、脒、胍、哌啶等等。
短语“彼此距离为10-20”是指两个基团相对于另一个的空间取向，不仅是指沿着键测量的。本领域技术人员可用公知的模拟技术(modelling techniques)测定该距离。(参见例如J.Med.Chem.1994，37，2537-2551)。
术语(1-8C)烷基是指具有1-8个碳原子的支链或无支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、己基和辛基。甲基和乙基是优选的烷基。
在术语(1-8C)烷氧基中，烷基残基如前述定义的。
术语“前体药物”是指在体内代谢为活性化合物的化合物，例如，其中式I的化合物的GpIIb/IIIa拮抗剂残基中的碱性部分(例如氨基或苯甲酰胺基)被例如，羟基、(1-6C)烷氧基或(1-6C)烷氧基羰基保护的化合物。前体药物的另外的实例是其中GpIIb/IIIa拮抗剂残基的羧化物基团被酯化的式I的化合物。
本发明的溶剂化物包括水合物。
本发明的化合物可以通过使用本领域通常已知的方法用氨基酸、素拟肽(peptidomimetics)或另外的官能团(例如，-COOH、-NH2、-SH、-OH、-N3、末端炔等)修饰先前描述的GPIIb/IIIa拮抗剂制备，所述GPIIb/IIIa拮抗剂为例如，衍生自替罗非班、SR 121566、Ro 435054、RWJ 50042或SC 54701(珍米洛非班的药理学活性形式)、拉米非班、或其类似物。合成这种修饰的RGD类似物的实例在BioorganicChemistry 29，357-379(2001)中描述，其中该化合物被建议作为靶向药物递送的有效载体。根据本发明，任选地修饰的GPIIb/IIIa拮抗剂部分(a)直接连接于低聚糖或(b)与低聚糖-间隔子残基连接或(c)与间隔子连接，其随后与低聚糖-间隔子-残基连接(例如，通过从WO99/65934、WO 01/42262已知的方法)。任何适合的低聚糖都可以用于这个目的，例如在文献中已知的低聚糖(例如，从EP 0,454,220和EP0,529,715已知的，但是不限于这些来源)或市售的低聚糖。低聚糖可以及时地在适当的点通过本领域已知的方法磷酸化，例如通过Buijsman，R等人(Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9，2013-2018)所述的方法。间隔子对低聚糖的连接可以例如通过使用在EP0,649,854或EP 04005343.1中所述的方法进行。
对于其中将生物素标记连接于式I的化合物的方法，化学文献提供了几种可利用的可能性，并且由此可以使用本领域技术人员公知的保护基的不同组。优选生物素标记，包括活性基团例如活化酯、马来酰亚胺、碘代乙酰基或伯胺类型的，与胺官能团、或硫醇官能团、或羧酸官能团、或醛官能团反应，反应根据在文献中描述的条件进行(参考Savage等人，Avidin-Biotin Chemistry：A Handbook；PierceChemical Company，1992)。
生物素标记可以例如直接与(带负电荷的)低聚糖残基结合，或者通过低聚糖-间隔子残基的任选被N-(1-4C)烷基化的氨基官能团，或者通过任选被N-(1-4C)烷基化的氨基酸残基与式I的化合物的低聚糖残基的任选被N-(1-4C)烷基化的胺官能团结合。
在本发明的另一个方面中，生物素标记可以例如直接与GpIIb/IIIa拮抗剂残基，或者通过连接残基的任选被N-(1-4C)烷基化的氨基官能团，或者通过任选被N-(1-4C)烷基化的氨基酸残基与式I的化合物的GpIIb/IIIa拮抗剂残基的任选被N-(1-4C)烷基化的胺官能团结合。
在本发明的另一个方面中，生物素标记可以例如逐步引入，通过首先与GpIIb/IIIa拮抗剂残基直接结合、或通过式I的间隔子的一部分的任选被N-(1-4C)烷基化的氨基官能团、或者通过任选被N-(1-4C)烷基化的氨基酸残基与式I的化合物的GpIIb/IIIa拮抗剂残基的任选被N-(1-4C)烷基化的胺官能团结合，并且第二步直接与低聚糖结合、或通过式I的间隔子的一部分的任选被N-(1-4C)烷基化的氨基官能团、或者通过任选被N-(1-4C)烷基化的氨基酸残基与式I的化合物的(带负电荷的)低聚糖的任选被N-(1-4C)烷基化的胺官能团结合，或者反之亦然。
在本发明的另一个方面中，可以使用本领域已知的方法通过肽偶联引入任选被N-烷基化的氨基酸残基或α-N-取代的(β-)氨基酸类似物。叠氮基是适合的潜在胺官能团，其可用于式I的化合物的前体用于随后引入生物素标记。
此外，可用作本发明的化合物的(作为基础)GpIIb/IIIa拮抗剂部分的已知的GpIIb/IIIa拮抗剂的其它实例为(但不限于这些实例)：化合物Ro 438857、Ro 483657、BIBL 12、FK 633、GR 144053、EMD76334、SR 121566、SB 208651、SC 54684、SC 52012、DMP 754、FR 158999、GR 200976、XV 788、MK 383(替罗非班)、RWJ 53308、ZD 2486、L 709780、RGD 891、T 250、C 6822、BIBU 104、SB 214857、SC 57101、G 7453、TAK 029、XV 454、XV 459、L 734217、DMP 802、SR 121787、TP 9201、DMP 757、SC 52012、RPR 109891、YM 68128、ME 3229、ME 3230、CT 50352、MK 852、S 1197、DMP 728、SC 57345、L 738167、GR 233548、Ro 438857、TA 993、YM 337、BIBW 194、BIBU 129、BIBW 98、tetrafibricin、L 703014、BIBU 251、GR 91669、RG 13965、G 7446、PS 028、XR 300、NSL 9403、L 756568、S 1762、L 746223、L 767685、NSL 95301、G 4120、SB 207043、GR 83895、P246、L 739758、XR 299、SV 873、RWJ 50228、XQ 870、EF 5154、AR 0510、G 7570、G 7442、G 7464、RWJ 52656、TAK 024、MS 180、MS 28168、XU 063、XU 065、L 734115、SM 20302、TS 943、NSL 96184、UR 12947、XU 057、L 750034、UR 3216、UR 2922、CP 4632、AR 0598、SC 79992、SC 4992、RGD 039、ME 3277、T 250、SC 57099B、SKF 106760、SKF 107260、RWJ 52654、PSA 0613、CGH 400、NSL 95317、XT 111、RWJ 27755、L 736622、SC 46749、SM 20302、YM 570029、CY 311176；和在以下文献中描述的GpIIb/IIIa拮抗剂：EP 0,529,858，WO96/20172，EP 0,496,378，EP 0,530,505，Bioorg.& Med.Chem.3，539(1995)，WO 93/08174，J.Am.Chem.Soc.115，8861(1993)，J.Med.Chem.43，3453(2000)，Bioorg.Med.Chem.3，337(1995)，US 5,239,113，US 5,344,957，US 5,973,003，US 5,703,125，WO96/37464，WO 93/07867，US 5,378,712，EP 445,796，US5,273,982，US 5,770,575，WO 01/602813，EP 656,348，US5,726,185，EP 505,868，EP 560,730，US 5,561,112，EP 513,675，US 5,574,016，WO 94/09030，EP 478,363，US 5,292,756，US5,206,373，WO 93/16994，US 5,312,923，EP 743,302，US5,658,929，US 5,880,136，US 5,814,643，US 6,040,317，ExpertOpin.Ther.Patents 13(8)，1173-1188(2003)和Curr.Pharm.Design 14，1567-1609(2004)。
包括新设计的模拟纤维蛋白原的RGD和/或K(QA)GD片段的GpIIb/IIIa拮抗剂残基，典型地包括位于该残基内彼此距离为10-20
Figure S2006800435030D00111
的羧化物部分和碱性部分的化合物也包括在本发明中。
上述用于制备本发明的化合物的方法中的程序步骤-肽偶联，可以通过本领域通常已知的用于肽片段的偶联或缩合的方法进行，例如通过叠氮化物方法、混合酸酐方法、活化酯方法、碳二亚胺方法、或者优选地在铵/脲阳离子盐如TBTU的影响下进行，特别是在加入催化性和消旋化抑制化合物如N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑和7-氮杂-N-羟基苯并三唑的情况下。综述参见The Peptides，Analysis， Synthesis ，Biology，Vol 3，E.Gross和J.Meienhofer，eds.(Academic Press，New York，1981)和Peptides：Chemistry and Biology，N.Sewald和H.-D.Jakubke(Wiley-VCH，Weinheim，2002)。
可以在合成操作过程中该N-保护基是指将存在于化合物中的胺官能团可以用N-保护基保护起来，该N-保护基是指通常在肽化学用于保护α-氨基的基团，如叔丁氧羰基(Boc)基团、苄氧羰基(Z)基团、9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团或邻苯二甲酰基(Phth)基团，或者可通过叠氮化物部分的解屏蔽(demasking)引入。氨基保护基和它们的除去方法的综述在上述的The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol 3和Peptides：Chemistry and Biology中给出。
在偶联步骤中，脒官能团，如果存在，可不用保护，或者可使用氨基甲酸酯例如烯丙氧基羰基或苄氧羰基保护。脒官能团优选在温和条件下使用1，2，4-噁二唑啉-5-酮部分作为前体引入。
羧酸基团可用通常在肽化学中用于保护α-羧酸基团的基团保护，例如叔丁酯。修饰的GPIIb/IIIa拮抗剂的羧酸基团优选作为苄基酯保护。保护基的除去可以以不同的方法进行，取决于那些保护基的性质。通常，脱保护在酸性条件下并且在清除剂的存在下或在还原条件下例如催化氢化下进行。
GPIIb/IIIa拮抗剂与低聚糖结合的前提是存在有正交(orthogonally)反应性的结合团例如羧化物基团，其可以直接结合于低聚糖残基或结合于低聚糖-间隔子衍生物或通过间隔子结合于低聚糖-间隔子衍生物。为了允许这种结合，在大多数情况中需要另外的GPIIb/IIIa拮抗剂修饰。
用于合成式I的化合物的间隔子来源的结构单元的构建可以使用本领域已知的方法以多种方式得到，例如通过逐步引入氨基酸、它们的衍生物或素拟肽以直线的方式，或者通过中间体构建物的砌块偶联以会聚(convergent)的方式。
本发明的化合物(其可作为游离碱形式存在)可以以可药用盐的形式从反应混合物分离。还通过用有机或无机酸处理式(I)的游离碱得到可药用盐，所述有机或无机酸例如盐酸、氢溴、氢碘酸、硫酸、磷酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、马来酸、丙二酸、甲烷磺酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸和抗坏血酸等。
本发明的化合物或其中间体可具有手性碳原子，因此可作为纯的对映体或作为对映体混合物、或作为包含非对映体的混合物存在。得到纯的对映体的方法是本领域中公知的，例如，使由光学活性的酸和外消旋混合物得到的盐的结晶、或使用手性柱的色谱法。对于非对映体，可使用正相或反相柱。
本发明的化合物可经肠道或非胃肠道给予。这些化合物及其组合物的确切剂量和给予方案必须取决于正在给予药物的个体受试者的需要、疾患或需要的程度和执业医生的判断。通常，非胃肠道给予比更多依赖于吸收的其它给予方法需要更低的剂量。然而，用于人类的日剂量优选为0.0001-10每公斤体重，更优选为0.001-1mg每公斤体重。
使用本发明的化合物生产的药物还可以用作(急性)抗血栓形成治疗中的辅助药。在这种情况下，将该药物与可用于治疗这种疾病状态的其它化合物给予，例如阿司匹林、氯吡格雷或他汀类。
通过与例如在标准参考文献(Gennaro等人，Remington′sPharmaceutical Sciences，(18th ed.，Mack Publishing Company，1990，特别是参见Part 8：Pharmaceutical Preparations and TheirManufacture))中所述的药学适合的助剂混合，化合物可以被压缩为固体剂量单位，例如丸剂、片剂，或者被加工为胶囊或栓剂。通过使用药学适合的液体，化合物还可以作为溶液、悬浮液、乳剂形式施用，例如作为注射剂施用。
对于生产剂量单元例如片剂，考虑了使用常规的添加剂，例如填料、着色剂、聚合物粘合剂等。通常，可使用不会妨碍活性化合物功能的任何可药用添加剂。
用于给予组合物的适合的载体包括以适当量使用的乳糖、淀粉、纤维素衍生物等，或其混合物。
图例
图1：抗生物素蛋白对由化合物12抑制血小板凝聚的影响。将化合物和抗生物素蛋白预先温育。
图2：抗生物素蛋白对由化合物10抑制血小板凝聚的影响。将化合物和抗生物素蛋白预先温育。
图3：抗生物素蛋白对化合物12抑制豚鼠血小板凝聚的影响(在ADP-诱导血小板凝聚9分钟之后加入抗生物素蛋白)。
图4：抗生物素蛋白对化合物10抑制血小板凝聚的影响(在ADP-诱导血小板凝聚9分钟之后加入抗生物素蛋白)。
图5：抗生物素蛋白对化合物17抑制人血小板凝聚的影响(在ADP-诱导血小板凝聚9分钟之后加入抗生物素蛋白)。
图6：表示在s.c.给予500nmol/kg化合物之后的平均数据。
图7：表示在s.c.给予100nmol/kg化合物之后的平均数据。
图8：表示在s.c.给予100nmol/kg化合物之后的平均数据。在t＝1小时，将抗生物素蛋(10mg/kg)i.v.给予用化合物10或12处理的那些大鼠。为了比较描述了不存在抗生物素蛋白的化合物27(五糖部分)的药代动力学行为。
图9：表示在s.c.给予500nmol/kg化合物10、17或26之后的平均数据。在T＝24小时，i.v.给予抗生物素蛋白(10mg/kg)，其后在T＝25和26小时收集血样。为了比较，将化合物17的s.c.100nmol/kg的数值归一化为500nmol/kg的剂量。
通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例
使用的缩写
ADP＝腺苷5’-二磷酸
Aq.＝含水
ATIII＝抗凝血酶III
Bn＝苄基
Boc＝叔丁氧羰基
DCM＝二氯甲烷
DiPEA＝N，N-二异丙基乙胺
DMF＝N，N-二甲基甲酰胺
fmoc＝9-芴基甲基氨基甲酸酯
NMM＝N-甲基吗啉
Me＝甲基
sat.＝饱和的
PRP＝血小板富集的血浆
PPP＝贫血小板的血浆
RT＝室温
TBTU＝2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓  四氟硼酸盐
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
TRAP＝凝血酶受体激动剂肽
Z＝苄氧羰基
实施例1
15-N-(9-芴基甲氧羰基)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁基酯(2)
将如EP 1574516中所述制备的15-氨基-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸叔丁基酯(1)(0.50g，1.45mmol)溶解于THF(7.5mL)和H2O(5mL)中。加入4N NaOH溶液直到pH为约9。分多个份地加入N-9-芴基甲基氨基甲酸琥珀酰亚胺酯(FmocOSu，0.54g，1.60mmol，1.1当量)。在10分钟之后，加入另外的4N NaOH溶液以调节pH到约9。在3小时之后，反应混合物用1N HCl溶液酸化到pH 6-7。向反应混合物加入H2O，然后将其用EtOAc提取3次。有机相用盐水洗涤并且用MgSO4干燥。在过滤之后减压除去溶剂(50mbar，50℃)。粗的油状物通过硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH，1/0→95/5，v/v)，得到化合物2，为黄色油状物(0.61g，79％)。Rf 0.64(DCM/MeOH，95/5，v/v)。
实施例2
15-N-(9-芴基甲氧羰基)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酸酯(3)
将化合物2溶解于DCM(3.5mL)并且在氮气气氛下加入TFA(3.5mL)。在搅拌1.5小时之后，将反应混合物减压浓缩。然后通过在甲苯中重复浓缩除去过量的TFA。加入DCM/Et2O(100mL，1/2，v/v)并将溶液用1N HCl洗涤。水层用DCM/Et2O(100mL，1/2，v/v)提取。合并的有机层用盐水洗涤并且用MgSO4干燥。在过滤之后常压除去溶剂(50℃)。粗的油状物通过硅胶柱色谱法(DCM/MeOH/AcOH，99/0/1→89/10/1，v/v/v)纯化，得到化合物3。通过将粗的油状产物溶解于DCM/Et2O(1/2，v/v)并且用H2O(3x)和盐水洗涤除去过量的AcOH，随后用MgSO4干燥。在过滤之后常压除去溶剂(50℃)，得到化合物3，为黄色油状物(0.37g，67％)。Rf 0.32(DCM/MeOH/AcOH，89/10/1，v/v)。
实施例3
叔丁基15-N-(9-芴基甲氧羰基)-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰基-ε-N-(苄氧羰基)-L-赖氨酸(4)
将化合物3(0.37mg，0.77mmol)溶解于DCM(18mL)。随后在N2气氛下加入DIPEA(0.40μL，2.31mmol，3当量)和TBTU(0.25g，0.77mmol)并将溶液搅拌10分钟。然后加入ε-(Z)-L-Lys-OtBu·HCl(0.29g，0.77mmol)并将混合物搅拌另外的1.5小时。反应混合物用DCM稀释并用H2O、0.1N HCl、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。将有机相干燥(MgSO4)并且常压浓缩。通过硅胶柱色谱法进行纯化(DCM/MeOH，1/0→9/1，v/v)，得到化合物4，为黄色油状物(0.51g，83％)。Rf 0.85(DCM/MeOH，9/1，v/v)。ESI-MS：792.6[M+H]+，814.6[M+Na]+，736.4[M-tBu+H]+
实施例4
叔丁基15-N-叔丁基氧羰基-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰基-ε-N-(苄氧羰基)-L-赖氨酸(5)
将化合物4(0.26g，0.32mmol)溶解于THF(5mL)。加入E t2NH(1mL)并将溶液搅拌24小时。减压除去过量的Et2N和溶剂(50℃)。加入甲苯并且减压除去(50℃，65mbar)，得到N-脱保护的产物(0.21g，0.32mmol)，Rf 0.23(DCM/MeOH，9/1，v/v)。ESI-MS：570.4[M+H]+，514.4[M-tBu+H]+。
将粗的产物溶解于DCM(3mL)。加入E t3N(0.11mL)，随后在N2气氛下加入二-叔丁基二碳酸酯(73mg，0.34mmol，1.1当量)。在搅拌5小时之后，将混合物加入到冷却的(5℃)0.1N HCl溶液中并且用EtOAc提取。有机层用盐水洗涤并且干燥(MgSO4)。在过滤之后，减压除去溶剂(180mbar，50℃)。通过硅胶柱色谱法进行纯化(DCM/MeOH，1/0→95/5，v/v)，得到无色的油状物(0.17g，82％)。Rf0.5(DCM/MeOH，9/1，v/v)。ESI-MS：670.6[M+H]+，692.4[M+Na]+，570.4[M-Boc+H]+，514.1[M-Boc-tBu+H]+
实施例5
15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰基-ε-[D-(+)-生物素酰基]-L-赖氨酸(6)
将化合物5(0.23g，0.34mmol)溶解于EtOH(8mL)和H2O(1.2mL)。在用氮气吹扫溶液5分钟之后，加入Pd/C 10％(0.11g)。使氢气通过溶液4小时。用氮气吹扫溶液溶液10分钟以除去所有氢气。将混合物通过Decalite过滤并且减压浓缩(170mbar，50℃)，得到N-L-赖氨酸脱保护的中间体，为无色的油状物(0.15g，81％)。Rf0.02(DCM/EtOAc，9/1，v/v)。
将D-(+)-生物素(75mg，0.31mmol)悬浮于DCM(7mL)。随后在N2气氛下加入DiPEA(0.11mL，0.62mmol，2当量)和TBTU(0.10g，0.31mmol)并将溶液搅拌1小时。将上述ε-N-L-赖氨酸脱保护的中间体的DCM(3mL)溶液加入到反应混合物中。将混合物搅拌16小时。加入H2O并且用DCM提取(3x)。将有机层干燥(MgSO4)，过滤并且减压浓缩(850mbar，50℃)。通过硅胶柱色谱法进行纯化(洗脱剂：DCM/MeOH，1/0→9/1，v/v)，得到油状物(0.13g，60％)。Rf 0.48(DCM/MeOH，9/1，v/v)。ESI-MS：762.6[M+H]+，784.6[M+Na]+，662.4[M-Boc+H]+，606.4[M-Boc-tBu+H]+。将油状物溶解于无水的4N HCl在二氧杂环己烷(4mL)中的溶液并且搅拌。在1小时之后，出现不溶性油状物，其后减压除去溶剂(100mbar，50℃)，以定量的收率得到化合物6。ESI-MS：606.4[M+H]+，628.4[M+Na]+。
实施例6
苄基N-＜3-{[-ε-(D-(+)-生物素酰基)-L-赖氨酸-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰基]-羰基}-苯磺酰基＞-4-O-{4-(N-苄氧羰基-4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酸(8)
将如EP 1574516中所述制备的化合物7(0.10g，0.16mmol)溶解于DMF(4mL)。随后在N2气氛下加入DIPEA(56μL，0.32mmol，2当量)和TBTU(51mg，0.16mmol)并将溶液搅拌45分钟。将化合物6(0.17mmol)溶解于DMF(1mL)，并且将DiPEA(28μL，0.16mmol，1当量)加入到反应混合物中。将混合物搅拌16小时。反应混合物用DCM稀释并用1N HCl溶液洗涤。有机相用H2O(3x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并且减压浓缩(850mbar，50℃)。通过硅胶柱色谱法进行纯化(洗脱剂：DCM/MeOH/AcOH，99/0/1→79/20/1v/v)，得到化合物8(56mg，27％)。Rf 0.15(DCM/MeOH，9/1，v/v)。ESI-MS：1316.6[M+H]+，1338.8[M+Na]+，1182.6[M-Z+H]+，1204.6[M-Z+Na]+.1314.8[M-H]+
实施例7
制备化合物10、12、17和26的一般方法：
通过重复在无水DMF中浓缩(2×2mL)将羧酸衍生物(33μmol)(即，化合物8、11、16或25)干燥，溶解于DMF(1mL)并且在TBTU(11mg，33μmol)和DiPEA(5.7μL，33μmol)的存在下在N2气氛下搅拌。在1小时之后，加入五糖9(31μmol)。将反应混合物在RT搅拌过夜并且通过离子交换(Mono-Q)和反相(Luna C18)色谱法分析。将反应混合物浓缩(＜50℃，15mmHg)。(粗的)产物(10mg/mL，在H2O/t-BuOH，1/1，v/v中)通过在10％Pd/C(加入量与粗产物的重量相等)上氢化(H2)脱保护。在16小时之后，将溶液脱气。过滤通过0.45μM HPLC过滤器并且减压浓缩(＜50℃，15mm Hg)。结合物通过离子交换色谱法(Q-sepharose，缓冲液：H2O→2M NaCl)纯化，随后用Sephadex G25-柱(H2O)脱盐并且冻干。
实施例8
甲基O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜＜＜12-N-＜＜Nε-(D-(+)-生物素酰基)-N-＜3-{[15-N-(15-氮杂-1-酮-3，6，9，12-四氧杂-十五烷基)]-羰基}-苯磺酰基＞-4-O-{4-(4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酰基＞-赖氨酰基＞＞-12-氮杂-3，6，9-三氧杂-月桂基＞＞＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖酸基(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖酸基(1-＞4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖苷九钠盐(10)
使羧酸8(37.8mg，28.7μmol)与五糖9(51.7mg，27.4μmol)[其可通过使WO 01/42262中所述的衍生化的单糖5与US2004/0024197中所述的四糖48偶联制备，使用与这些专利申请中所述相似的方法，包括脱保护和硫酸化]结合，随后通过一般方法进行纯化和脱保护。得到结合物10，为白色固体，收率13.6mg(16％，2步)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：δ7.85(d，1H)，7.78(d，1H)，7.63(d，1H)，7.42(t，1H)，6.85(d，1H)，6.50(d，1H)，5.39(d，1H)，5.33(d，1H)，5.13(b s，1H)，5.08(d，1H)，4.58(m，1H)，4.58(d，1H)，4.49(m，1H)，4.48(m，1H)，4.33(m，1H)，4.29(m，1H)，4.28(dd，1H)，4.22(dd，1H)，4.21(m，2H)，4.20(m，1H)，4.17(m，2H)，4.09(m，1H)，4.07(m，1H)，4.05(d，1H)，4.02(m，1H)，3.96(s，2H)，3.89(m，1H)，3.86(m，1H)，3.85(m，2H)，3.79(m，2H)，3.73(m，1H)，3.69(m，1H)，3.65(m，1H)，3.61-3.51(m，26H)，3.60-3.38(8x s，34H)，3.48(m，2H)，3.42(m，1H)，3.38(m，1H)，3.32(m，1H)，3.19(m，3H)，2.92-2.2.89(m，1H)，2.67(d，1H)，2.48(m，1H)，2.13(t，2H)，1.91(d，1H)，1.70(m，2H)，1.65-1.37(m，5H)。
ESI-MS：实测值：m/z 1381.3[M+H]2-，1392.3[M+Na]2-，1402.8[M+2Na]2-，1413.8[M+3Na]2-，920.2[M-3H]3-，927.5[M-3H+Na]3-，934.5[M-3H+2Na]3-，690.2[M-4H]4-，694.7[M-4H+Na]4-
实施例9
甲基O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜＜12-N-＜3-{[15-N-(15-氮杂-1-酮-3，6，9，12-四氧杂-十五烷基)]-羰基}-苯磺酰基＞-4-O-{4-(4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酰基＞-12-氮杂-3，6，9-三氧杂-月桂基＞＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖酸基-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖酸基-(1-＞4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖苷九钠盐(12)
根据一般方法，通过使化合物9(101mg，53.9μmol)与如EP1574516中所述制备的化合物11(60.0mg，56.6μmol)偶联制备化合物12。收率72mg(52％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：δ7.84(m，1H)，7.75(m，1H)，7.62(m，1H)，7.42(t，1H)，6.83(d，2H)，6.48(d，2H)，5.38(d，1H)，5.33(m，1H)，5.08(d，1H)，5.02(bs，1H)，4.58(d，1H)，4.46(b s，2H)，4.28(m，2H)，4.17(m，1H)，4.22(m，1H)，4.20(m，2H)，4.11(m，2H)，4.04(d，1H)，4.03(m，1H)，4.02(m，1H)，3.88(m，2H)，3.84(m，2H)，3.82(m，1H)，3.79(m，1H)，3.72(1H，m)，3.66(m，2H)，3.62-3.33(m，54H)，3.20(dd，1H)，3.18(m，1H)，2.92(m，2H)，1.92(m，2H)，1.70(m，2H)，1.58(m，1H)，1.44(m，2H)，1.33(m，4H)。ES I-MS：m/z 1225.2[M+5H+2Na]2-，823.8[M+3Na+3H]3-，816.5[M+2Na+4H]3-，809.1[M+Na+5H]3-.
实施例10
[D-(+)-生物素酰基]-L-天冬氨酸α-苄基酯(14)
向D-生物素(2.0g，8.19mmol)在DMF(52mL)的悬浮液加入五氟苯酚(1.6g，15.6mmol)，随后加入DCC(2.5g，12.3mmol)。将反应混合物在氮气气氛下在RT搅拌过夜。反应混合物保持为悬浮液，将其过滤并且浓缩。将残余物集在Et2O并且搅拌几分钟，其后将悬浮液过滤并且真空干燥，得到白色固体(2.58g)ESI-MS：411[M+H]+。将固体溶解于溶解于DMF(90mL)并且加入Et3N(1.24mL，8.82mmol，1.4当量)。分多个部分加入固体H-Asp-OBn。在约15分钟之后，反应混合物变得澄清，将其搅拌另外的2小时。将反应混合物减压浓缩并且加入水，随后加入MeOH(3∶1)。将形成的固体过滤，用Et2O洗涤并且真空干燥，得到化合物14，为白色固体(2.92g，77％)ESI-MS：450[M+H]+。
实施例11
N-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰基-ε-＜N-[D-(+)-生物素酰基]-L-天冬氨酰基α-苄基酯＞-L-赖氨酸(15)
将如上述合成化合物6所述得到的化合物13(3.60g，6.72mmol，1.07当量)和化合物14(2.92g，6.30mmol)溶解于DMF(80mL)。在氮气气氛下加入DiPEA(2.2mL，12.6mmol，2当量)，随后加入TBTU(2.53g，7.88mmol，1.25当量)。将反应混合物搅拌过夜，其后减压除去溶剂。使用HPLC(ACN/H2O)纯化，得到带黄色的油状物(2.31g)。ESI-MS：967[M+H]+。在DCM/TFA(1∶1，60mL)中在RT搅拌2小时进行脱保护。加入DCM(150mL)并且通过加热(45℃，常压)除去溶剂。重复这个操作三次，随后在甲苯中重复浓缩(3x)。得到化合物15，为带黄色的固体(3.29g，30％)。ESI-MS：811[M+H]+
实施例12
ε-N-(D-(+)-生物素酰基-β-L-天冬氨酰基)-N-＜3-{[15-N-(15-氮杂-1-酮-3，6，9，12-四氧杂-十五烷基)]-羰基}-苯磺酰基＞-4-O-{4-(4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酰基＞-L-赖氨酸(16)
在氮气气氛下向7(1.41g，1.94mmol)的DMF(50mL)溶液加入DiPEA(1.0mL，5.8mmol，3当量)，随后加入TBTU(685mg，2.1mmol，1.1当量)并且搅拌1小时。然后加入15的DMF(20mL)溶液并且搅拌3小时。将反应混合物减压浓缩并将粗产物通过HPLC(ACN/H2O/TFA)纯化，得到带黄色的固体(783mg，26％)。ESI-MS：1522[M+H]+
实施例13
甲基2，3-二-O-甲基-4-O-＜＜＜12-N-＜＜ε-N-(D-(+)-生物素酰基-β-L-天冬氨酰基)-N-＜3-{[15-N-(15-氮杂-1-酮-3，6，9，12-四氧杂-十五烷基)]-羰基}-苯磺酰基＞-4-O-{4-(4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酰基＞-L-赖氨酰基＞＞-12-氮杂-3，6，9-三氧杂-月桂基＞＞＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖酸基-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖酸基-(1-＞4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖苷九钠盐(17)
基本上根据一般方法进行化合物17的合成。由此，在氮气下向16(768mg，0.505mmol)的DMF(50mL)溶液加入DiPEA(106μL，0.61mmol，1.2当量)，随后加入TBTU(178mg，0.56mmol，1.1当量)。在搅拌溶液1小时之后，加入化合物9(906mg，0.48mmol)并且继续搅拌16小时。将反应混合物减压浓缩并且在Q-sepharose上纯化(H2O→2M NaCl)。在Sephadex-G25上进行脱盐，得到澄清的油状物(1.5g)。将油状物溶解于H2O(37mL)和t-BuOH(37mL)，并且在氮气气氛下加入10％Pd/C(670mg)。使氢气通过溶液16小时。在通过过滤除去Pd/C催化剂之后，将化合物再次在Q-sepharose上纯化并且在Sephadex-G25上脱盐，得到化合物17，收率为465mg(34％)。
1H-NMR(D2O，600MHz，HH-COSY)：δ7.94(m，1H)，7.86(t，1H)，7.71(m，1H)，7.52(t，1H)，6.93(d，1H)，6.58(d，1H)，5.45(d，1H)，5.42(d，1H)，5.18(bs，1H)，5.15(d，1H)，4.56(m，1H)，4.33-4.41(m，2H)，4.30-4.21(m，4H)，4.13-4.05(m，4H)，3.89-3.96(m，5H)，3.87-3.82(m，3H)，3.81-3.70(m，7H)，3.69-3.60(m，39H)，3.59-3.48(m，13H)，3.47-3.35(m，8H)，3.30-3.24(m，3H)，3.11(t，2H)，3.06-2.93(m，4H)，2.79-2.73(m，2H)，2.60-2.52(m，2H)，2.26(t，2H)，2.01-1.96(m，2H)，1.81-1.74(m，3H)，1.71-1.25(m，20H)。ESI-MS：m/z 1481.9[M+4Na-4H]2-，1471.0[M+3Na-3H]2-，980.7[M+3Na-3H]3-M+Na+5H]3-
实施例14
ε-N-甲基-ε-N-三氟乙酰基-L-赖氨酸(19)
将化合物18(1.26g，3.2mmol)溶解于DMF(15mL)并且加入K2CO3(2.2g，16mmol，5当量)，随后加入碘甲烷(1.6mL，25.6mmol，8当量)。将溶液加热到100℃并且在密封的烧瓶中搅拌24小时。将反应混合物冷却并且用EtOAc稀释。将得到的固体过滤，用盐水洗涤并且用MgSO4干燥。粗产物通过硅胶柱色谱法纯化(DCM/MeOH，95/5)，得到油状物(1.18g)，将其溶解于DCM(5mL)和TFA(5mL)的混合物中并且搅拌1小时。然后减压除去溶剂并将粗的产物在甲苯中浓缩(3x)，得到化合物19(1.57g，87％)ESI-MS：m/z 271.2[M+H]+
实施例15
甲基15-叠氮基-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰基-ε-N-甲基-ε-N-三氟乙酰基-L-赖氨酸(21)
使化合物19(1.57g，2.16mmol)和通过EP 1574516中所述的相应的叔丁基酯脱保护制备的化合物20(0.60g，2.16mmol)如合成化合物4所述偶联，得到化合物21，收率86％(980mg，1.85mmol)。ESI-MS：m/z 530.2[M+H]+，552.2[M+Na]+
实施例16
15-叠氮基-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰基-ε-N-甲基-L-赖氨酸(22)
将化合物21(0.98g，1.85mmol)溶解于THF(6mL)，加入1NLiOH(6mL)并将得到的溶液在RT将搅拌2小时。通过加入1N HCl将反应混合物中和，随后减压浓缩，得到粗的脱保护的化合物22，其不经进一步纯化用于下一个反应。ESI-MS：m/z 420.2[M+H]+
实施例17
15-叠氮基-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰基-ε-N-[D-(+)-生物素酰基]-ε N-甲基-L-赖氨酸(23)
如上述制备化合物6所述使化合物22(1.85mmol，粗产物)与D-(+)-生物素(0.54g，2.22mmol，1.2当量)偶联，得到生物素酰基化的赖氨酸衍生物23，其不经进一步纯化用于下一个反应。ESI-MS：m/z 646.4[M+H]+，668.6[M+Na]+
实施例18
15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰基-ε-N-[D-(+)-生物素酰基]-ε N-甲基-L-赖氨酸(24)
将化合物23(1.85mmol，粗产物)溶解于t-BuOH(50mL)和H2O(50mL)中。在氮气气氛下加入10％Pd/C(750mg)。使氢气通过溶液约4小时。通过Decalite过滤除去Pd/C并用EtOH洗涤。减压除去溶剂(50mbar，50℃)，得到粗的化合物24，为油状物(＞100％，残余溶剂)。ESI-MS：m/z 620.4[M+H]+
实施例19
苄基N-＜3-{[-ε-(D-(+)-生物素酰基-ε-N-甲基)-L-赖氨酸-15-氮杂-3，6，9，12-四氧杂-十五烷酰基]-羰基}-苯磺酰基＞-4-O-{4-(N-苄氧羰基-4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酸(25)
如上述合成化合物8所述进行化合物24(0.58g，0.93mmol，粗产物)与化合物7(0.50g，0.68mmol)的偶联。通过硅胶柱色谱法和制备性HPLC纯化，得到ε-N-甲基化的赖氨酸衍生物25，产量77mg(8.5％，从化合物21开始的后四个步骤)。ESI-MS：m/z 1330.6[M+H]+
实施例20
甲基O-2，3-二-O-甲基-4-O-＜＜＜12-N-＜＜Nε-(D-(+)-生物素酰基-ε-N-甲基)-N-＜3-{[15-N-(15-氮杂-1-酮-3，6，9，12-四氧杂-十五烷基)]-羰基}-苯磺酰基＞-4-O-{4-(4-哌啶基)-丁基}-L-酪氨酰基＞-赖氨酰基＞＞-12-氮杂-3，6，9-三氧杂-月桂基＞＞＞-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-β-D-吡喃葡萄糖酸基-(1-＞4)-O-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-＞4)-O-2，3-二-O-甲基-α-L-吡喃艾杜糖酸基-(1-＞4)-2，3，6-三-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖苷九钠盐(26)
如一般方法所述使化合物25(77mg，58μmol)与五糖衍生物9(0.10g，55μmol)偶联。如一般方法中所述将粗的产物纯化和脱盐，随后冻干，得到目标的结合物26，收量50mg(27％)。ESI-MS：m/z2762.5[M+H]+
反应路线1a
Figure S2006800435030D00261
反应路线1b
Figure S2006800435030D00271
反应路线2
Figure S2006800435030D00281
反应路线3a
Figure S2006800435030D00291
反应路线3b
Figure S2006800435030D00301
反应路线4a
Figure S2006800435030D00311
反应路线4b
Figure S2006800435030D00321
参考化合物
Figure S2006800435030D00331
实施例21
药理学
1.1抑制由ADP诱导的豚鼠血小板凝聚的体外试验
在体外向人或豚鼠的血小板富集的血浆(PRP)加入腺苷二磷酸(ADP)诱导血小板凝聚。这种凝聚可以通过测量PRP的光密度(OD)改变来评价。以下体外试验用于评价试验化合物妨碍豚鼠的ADP诱导的凝聚。
材料
血小板富集的血浆(PRP)：从健康的志愿者或豚鼠取得自由流动的血液并且收集在0.1体积的含柠檬酸钠.2H2O，3.8％的蒸馏水(w/v)中。最终浓度为0.38％柠檬酸钠。将柠檬酸盐血在室温下在HettichRotanta/AP中以1,600N/kg(160g，即900rpm)离心。在15分钟之后，通过关上制动停止离心，并且收集上清液(＝PRP)。立即使用在含0.9％NaCl的MQ水中的ADP(分析级)50μM的新鲜溶液。
在这个测定法中，作为用于i.v.输注的0.25mg/mL浓缩物购得的替罗非班(AGGRASTAT
Figure S2006800435030D00341
(MSD)在30-60nM(IC50)的浓度以50％抑制由5μM ADP诱导的人血小板凝聚。
设备
1.Sysmex血细胞计数器KX-21型。
2.具有620nm过滤器的Labsystems iEMS读取器MF，设置为1000rpm和37℃恒温的定轨振荡器。使用Labsystems iEMS程序测量吸收。
3.带针art P4203(NPBI)的血液收集系统600mL。
4.96孔平底微板(Greiner Labortechnik)。
操作
使用Sysmex血细胞计数器计数上清液(PRP)中的血小板，并将上清液用PPP(贫血小板的血浆)稀释，以得到包含约400,000±50,000plt/mL的PRP。PRP应在室温下稳定至少20分钟，但不要超过3小时。
将150μL PRP用移液管转移到微板的孔中。加入不同浓度的30μL的试验化合物(每个化合物7个浓度)或媒介物并将微板置于37℃的Labsystems iEMS读取器MF中。然后在620nm测量光密度(OD620)。在读取器中摇动2分钟(1,000rpm)之后，再次测量OD。这是用于验证血小板的稳定性(不存在自发的血小板凝聚)。然后，加入20μL的50μM ADP溶液并且在620下每分钟动力学(kinetically)测量OD，持续14分钟。在两次测量之间将板以1,000rpm摇动40秒。每个试验化合物至少在使用得自不同志愿者的PRP的2个实验中进行试验。
响应的评价
在t＝0分钟和t＝10分钟计算每个化合物浓度(包括媒介物)的平均OD。使用下式计算每个浓度的百分比抑制：
Figure S2006800435030D00351
试验化合物的IC50为ADP诱导的血小板凝聚减少50％时的浓度。为此，将百分比抑制数值对化合物浓度绘图，并且使用Graphpad Prism3.0(带可变斜率)计算IC50。
1.2抑制由TRAP诱导的人血小板凝聚的体外试验
在体外向洗涤过的人或豚鼠的血小板(WPL)加入凝血酶受体激动剂肽(TRAP)诱导血小板凝聚。这种凝聚可以通过测量WPL的光密度来测定。本文所述的体外试验用于分析试验化合物抑制TRAP诱导的人血小板凝聚的活性。使用微板读取器同时测量几种化合物的活性。
材料
*Watson缓冲液的组成：
NaCl            7.83g (134mmol)
KCl             0.22g (2.9mmol)
NaHCO3           1.01g(12mmol)
Na2HPO4.2H2O    0.06g (0.34mmol)
MgCl2.6H2O      0.20g (1mmol)
葡萄糖          0.90g (5mmol)
HEPES           1.19g (5mmol)
H2O             到1L
用NaOH(1mol/L)TNP缓冲液调节pH到7.4。
*TNP缓冲液的组成：
三羟甲基氨基甲烷(Tris)6.057g(50mmol)
NaCl      5.844g(100mmol)
PEG6000   3.0g
H2O       到1L
在37℃使用HCl(10mol/L)调节溶液的pH到7.4。
*PGI2溶液：
将在KOH(1mol/L)中的1mg/mL的前列腺素I2储备溶液在-20℃储存。在即将使用之前，制备在冰冷的NaCl(9.0g/L)中的5μg/mL的溶液。
*血小板富集的血浆(PRP)：
从健康的志愿者或豚鼠取得自由流动的血液并且收集于0.1体积的含柠檬酸钠.2H2O，3.8％的MQ水(w/v)中。最终浓度为0.38％柠檬酸钠。将柠檬酸盐血在室温下在Hettich Rotanta/AP离心机中以1,600N/kg(160g)离心。在15分钟之后，通过关上制动停止离心。收集上清液(＝PRP)并且用贫血小板的血浆稀释，以得到含约400000血小板/mL的悬浮液。
*贫血小板的血浆(PPP)：
将柠檬酸盐血在RT以约20000N/kg离心10分钟并且将PPP虹吸出来。
*洗涤的血小板(WPL)：
将1μL PGI2溶液的等分试样加入到1mL PRP中，然后在RT在20000N/kg离心10分钟。将血浆虹吸出去并且向血小板颗粒加入包含5ng/mL PGI2的Watson缓冲液，并且通过用塑料棒温和地搅动而将血小板以原始体积再悬浮。将血小板悬浮液再次在20000N/kg离心。将血小板再悬浮于Watson缓冲液，以便得到含约400000血小板/mL的悬浮液。
*TRAP溶液：
将TRAP溶解于H2O中，得到含50μmol/L的溶液。必须每天制备新鲜的溶液。对于所有的水溶液，使用超纯的H2O(Milli-Q质量)。
*人纤维蛋白酶原(Kordia/ERL，art nr：FIB 2粉末)：在真空下将0.5g纤维蛋白原粉末溶解于50mL MQ水。将这个储备溶液以100μL的等分试样在-20℃储存。在即将使用之前，制备在盐水中的0.5mg/mL溶液。
在这个测定法中，作为用于i.v.输注的0.25mg/mL浓缩物购得的替罗非班(AGGRASTAT
Figure S2006800435030D00371
(MSD)在30-60nM(IC50)的最终浓度以50％抑制由5μM TRAP诱导的人血小板凝聚。
操作
在Sysmex血细胞计数器中计算WPL浓度，并将悬浮液用Watson缓冲液稀释，得到约400,000plt/mL的浓度。在使用之前，使WPL在室温下稳定至少20分钟，但不超过3-4小时。
将150μL WPL用移液管转移到微板的孔中。加入15μL的试验化合物溶液或媒介物和15μL的纤维蛋白原溶液，并将微板置于37℃的微板读取器中。然后，在405nm测量光密度(OD)，并且在读取器中摇动2分钟之后，再次测量OD405，以验证血小板的稳定性(不存在自发的血小板凝聚)。加入20μL的50μM TRAP溶液并且在405nm下每分钟动力学测量OD405，持续14分钟。在两次测量之间，将板以1,000rpm摇动40秒。为了测定试验化合物的IC50，使用得自不同志愿者的WPL，每种化合物至少在2个实验中试验。
反应的评价：
在t＝0分钟和t＝10分钟计算每个浓度(包括媒介物)的平均OD。使用Microsoft Excel用下式计算每个浓度的百分比抑制：
将化合物的浓度对百分比抑制绘图。使用Graphpad Prism 3.0(带可变斜率)计算IC50。试验化合物的IC50为TRAP诱导的血小板凝聚减少50％时的浓度。
1.3在人血浆中测定抗因子Xa活性的体外试验
使用Teien和Lie(Teien AN，Lie M.Evaluation of anamidolytic heparin assay method increased sensitivity by addingpurified antithrombin III.Thromb.Res.1977，10：399-410)所述的方法用S2222(Chromogenix，Chromogenics Ltd，Molndal，Sweden)通过酰胺基水解(amidolytically)测量试验化合物在人血浆中的抗因子Xa活性。在将酰胺基水解活性与标准肝素的校准曲线比较之后，将抗Xa活性表示为U/μmol。
表1.体外抗血栓形成活性的总结
化合物   抗XaU/μmol人血浆pH 7.4   人血小板凝聚的抑制(ADP)IC50(nm)   人血小板凝聚的抑制(TRAP)IC50(nm)   豚鼠血小板凝聚的抑制(ADP)IC50(nm)
  28   -   43   41   493
  27   1268   -   -   -
  12   1392   92   65   127
  10   927   74   72   225
  17   1411   49   74   66
2.1抗血栓形成活性的体外中和
A.血小板凝聚抑制的体外中和
(化合物与抗生物素蛋白预先温育)
如上述对于ADP诱导的血小板凝聚所述的规程进行。在225nM化合物12或450nM化合物10的存在下进行凝聚，分别为实现豚鼠血小板凝聚最大抑制的浓度。在通过加入ADP诱导豚鼠血小板凝聚之前，将不同浓度的化合物和抗生物素蛋白(得自蛋清，Sigma)在室温下预先温育2分钟(图1和2)。
B.血小板凝聚抑制的体外中和
(在延迟加入抗生物素蛋白之后)
如上述对于ADP诱导的血小板凝聚所述的规程进行。在225nM化合物12或450nM化合物10的存在下进行凝聚，分别为实现豚鼠或人血小板凝聚最大抑制的浓度。在7分钟之后，中断血小板凝聚的检测并且在t＝9分钟加入不同浓度的抗生物素蛋白(得自蛋清，Sigma)。在1分钟内重新开始检测血小板凝聚(图3和4)。
在图5中表示了抗生物素蛋白对化合物17抑制人血小板凝聚的影响(在ADP-诱导血小板凝聚9分钟之后加入抗生物素蛋白)。
结论：将抗生物素蛋白给予到含化合物10的豚鼠血小板凝聚测定中引起血小板凝聚的立即恢复(＝抗血栓形成、抗GPIIb IIIa活性的中和)，而未生物素化的等价物抗血栓形成化合物12的抑制活性不能恢复。将抗生物素蛋白给予化合物17引起人血小板凝聚的完全恢复。
3.1药代动力学
在300-400克的雄性Wistar大鼠中研究化合物10、12、17和27的药代动力学性质。通过吸入O2/N2O/异氟烷的混合物将大鼠麻醉，其后将右颈静脉插套管。第二天，大鼠用s.c.100或500nmol/kg的剂量处理。在s.c.给予之后，在几个时间间隔进行血液采样。然后将血液离心，然后将血浆虹吸出去并且在使用前在-20℃储存。通过基于Teien和Lie(Teien AN，Lie M.Evaluation of an amidolytic heparinassay method increased sensitivity by adding purifiedantithrombin III.Thromb.Res.1977，10：399-410)的方法测定的在获得的血浆样本中的抗Xa活性，相对于由试验化合物本身的储备溶液得到的校准曲线，通过使用S2222(Chromogenix，ChromogenicsLtd，Molndal，Sweden)的酰胺基水解测量试验化合物的浓度。样品中的浓度表示为nmol/mL，并且使用WinNonlin的非房室模型计算动力学参数。(图6和7)
表2.在s.c.给予大鼠化合物10或12(500nmol/kg)之后的药代动力学参数。以n＝3/处理组进行的实验。
  化合物10   化合物12
  平均±s.e.m.   平均±s.e.m.
  Tmax(h)   1.3   2.5
  Cmax(nmol/mL)   4.5±0.4   5.0±0.4
  T1/2eli(h)   10.7±1.5   9.3±0.2
  AUCinf(h.nmol/mL)   76.2±2.8   75.3±3.2
  Vz(mL/kg)   103±9   90±5
  Cl(mL/h/kg)   6.6±0.3   6.7±0.3
表3.在s.c.给予大鼠化合物12、17或27(100nmol/kg)之后的药代动力学参数。以n＝3/处理组进行的实验。
  化合物12(双重抑制剂参考)   化合物17   化合物27(五糖参考)
  平均±s.e.m.   平均±s.e.m.   平均±s.e.m.
  Tmax(h)   1.3   1.7   0.9
  Cmax(nmol/mL)   1.26±0.02   1.24±0.01   0.92±0.05
  T1/2eli(h)   9.8±0.4   10.4±0.5   12.6±0.8
  AUCinf(h.nmol/mL)   16.8±0.5   15.9±0.9   11.5±0.6
  Vz(mL/kg)   84±2   95±6   159±11
  Cl(mL/h/kg)   6.0±0.2   6.3±0.3   8.8±0.5
结论是在实验的可变性范围内，化合物10、12、17和27在大鼠中表现出相同的药代动力学行为。
3.2药代动力学-中和实验：
大鼠用100nmol/kg剂量的化合物10、12、或27s.c处理。在t＝1小时，取得血样并且对用化合物10或12处理的大鼠i.v.给予10mg/kg的抗生物素蛋白(得自蛋清，Sigma)。随后在0.5-1-3-6和23小时取得血液样本。血液如药代动力学实验中所述进行处理，并且通过测量(残余的)抗Xa活性测定样品的浓度。(图8)
表4.在s.c.给予大鼠100nmol/kg的化合物10或12和在t＝1小时给予抗生物素蛋白(10mg/kg)之后的药代动力学参数。以n＝3/处理组进行实验。
  化合物10(在t＝1小时加入抗生物素蛋白)  化合物12(在t＝1小时加入抗生物素蛋白)(双重抑制剂参考)
  平均±s.e.m.  平均±s.e.m.
  Tmax(h)   1.0  1.3
  Cmax(nmol/mL)   1.03±0.1  1.21±0.08
  T1/2eli(h)   0.9±0.05  11.7±1.1
  AUCinf(h.nmol/mL)   1.6±0.2  15.7±0.4
  Vz(mL/kg)   82±6  107±7
  Cl(mL/h/kg)   61.7±5.6  6.4±0.2
结论是，在s.c.给予化合物10(100nmol/kg)之后，可以通过i.v.给予10mg/kg的抗生物素蛋白来中和抗血栓形成活性，该活性通过测量(残余的)抗Xa活性测定。化合物10被抗生物素蛋白中和表现为与化合物12相比为强烈降低的总T1/2eli、强烈降低的总AUCinf和强烈升高的Cl。此外，非生物素化的等价的化合物12的药代动力学行为没有受到加入抗生物素蛋白的影响(在与表现出相似特征的参考五糖27相比时，也是这样)。后者证实了中和与生物素标记的存在有关，并且其不影响双重抑制剂的药代动力学行为。
在单独的实验中，化合物10、17或26以500nmol/kg的剂量s.c.给予，其后，在24小时收集血液。然后静脉内给予10mg/kg的抗生物素蛋白并且在25和26小时收集血液。(图9)
表5.在s.c.给予500nmol/kg的化合物10、17和26之后在24小时、和在t＝24小时给予抗生物素蛋白(10mg/kg i.v.)之后2小时的血浆水平。以n＝3/处理组进行实验，数值以平均±sem给出。
Figure S2006800435030D00431
结论是，在给予抗生物素蛋白(10mg/kg)之后2小时内，化合物10、17和26的血浆浓度分别降低75、83和66％。实验在s.c.给予生物素化的化合物之后24小时进行，其显示，在生物素部分和抗血栓形成化合物之间的连接物在体内是稳定的。
4.抗血栓形成活性的体内中和
血管内输注胶原蛋白悬浮液在大鼠中诱导血小板凝聚并且引起暂时的血小板减少。这个试验用于评价试验化合物对大鼠中由胶原蛋白诱导的血小板减少的严重程度的影响。
在第一个实验中，在胶原蛋白输注之前4小时，将雄性豚鼠用75nmol/kg的化合物10或媒介物s.c.处理。在第二个实验中，在相同的时间点s.c.给予100nmol/kg剂量的化合物12和17。通过i.m.给予氯胺酮+Sedamun(分别为90+10mg/kg)将雄性豚鼠麻醉。在15分钟之后，将相同的颈动脉的一个剖解出来并且用PE 50套管(ClayAdams)插管。在包含25μL 0.20M Na2EDTA溶液的塑料小瓶中收集两个0.5mL的血样。然后将套管连接到包含0.25mg/mL胶原蛋白悬浮液(Hormon Chemie，Munich，West Germany，用pH 2.8的等渗缓冲液稀释)的注射器。将这个悬浮液在30秒过程中通过225μL的输注给予。然后断开注射器并且在开始胶原蛋白输注之后的85和95秒取得两个0.5mL的血样。然后通过安乐死处死动物，其后用Sysmex血细胞计数器KX-21型计数每个样本的血小板数。在使用抗生物素蛋白的情况中，在s.c.给予化合物10、12或17之后的t＝4小时i.v.给予10mg/kg的抗生物素蛋白，其后在5分钟内输注胶原蛋白。
在计数收集的血样中的血小板数之后，通过用t＝85和95秒得到的血样中的平均血小板数除以t＝0得到的血样的平均值计算减少的血小板数。这个试验以n＝4进行。
表6.在基于胶原蛋白诱导的血小板凝聚的体内(豚鼠)模型中在有或没有抗生物素蛋白的存在下在给予化合物10(75nmol/kg)之后的血小板计数
  处理(75nmol/kg)   血小板数t＝0   血小板数t＝90sec   ％剩余的血小板   ％抑制
  对照组   390±23   158±42   39.2±7.6   0
  化合物10   386±31   328±18   85.3±2.5   76±4
  化合物10+抗生物素蛋白   384±20   152±26   40.4±7.8   2±13
表7.在基于胶原蛋白诱导的血小板凝聚的体内(豚鼠)模型中在有或没有抗生物素蛋白的存在下在给予化合物12或17(100nmol/kgs.c.)之后的血小板计数
  处理(100nmol/kg)   血小板数t＝0   血小板数t＝90sec   ％剩余的血小板   ％抑制
  对照组   391±12   192±13   49.0±3.9   0
  化合物12   426±6   360±7   84.5±2.2   70±4
  化合物12+抗生物素蛋白   379±6   329±11   86.5±1.7   74±3
  化合物17   424±11   348±7   82.5±2.0   66±4
  化合物17+抗生物素蛋白   367±16   181±12   46.5±7.8   -5±15
在化合物10的75nmol/kg s.c.剂量或化合物12或17的100nmol/kg s.c.剂量，这些化合物在给予之后的4小时对胶原蛋白诱导的血小板凝聚的抑制超过66％。在即将输注胶原蛋白之前给予10mg/kg的抗生物素蛋白引起化合物10和17的血小板抑制活性被直接和定量的中和，但是化合物12的血小板抑制活性没有被中和，该化合物不含生物素部分。这些结果表明，化合物10和17的抗GPIIb/IIIa介导的抗血小板活性的中和只由生物素标记介导，并且基于与抗生物素蛋白的特异性结合。此外，将由化合物10、12和17影响的血小板计数的相对降低进行比较显示，生物素标记不妨碍双重抑制剂固有的抗血小板活性。
另外的药理学
通过给予抗生物素蛋白(i.v.10mg/kg)，在给予化合物17之后在豚鼠中诱导的剂量依赖性出血立即停止。

Claims (5)

1.下式的抗血栓形成化合物或其可药用盐，
Figure FSB00000944858100011
2.权利要求1的化合物，为其钠盐形式。
3.权利要求2的化合物，为
Figure FSB00000944858100021
4.药物组合物，包括权利要求1到3中任一项的化合物和药学上适合的助剂。
5.权利要求1到3中任一项的化合物的用途，用于生产用于治疗或预防血栓形成的药物。
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