FR2974478A1 - Conjugues d'oligosaccharides en prevention des lesions d'ischemie-reperfusion - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un composé de formule (I) son sel, solvate, énantiomère, diastéréoisomère et mélange racémique pour traiter ou prévenir les troubles associés aux lésions d'ischémie-reperfusion au cours des interventions chirurgicales ou des greffes d'organes internes. Elle concerne également une solution pour protéger des lésions ischémiques les organes internes déconnectés de l'appareil circulatoire et qui comprend comme principe actif le composé de formule I ou son sel, solvate, énantiomère, diastéréoisomère et mélange racémique.

Description

La présente invention concerne l'utilisation de conjugués d'oligosaccharides biotinylés dans le but de préserver les organes solides en vue d'une greffe et notamment pour prévenir et traiter une lésion d'ischémie ou de reperfusion.

La greffe d'organes solides est une modalité de traitement efficace et est devenue le traitement de choix des maladies au stade terminal des reins, du pancréas, du foie, du coeur, des poumons et des intestins. La greffe est définie en tant que processus destiné à restaurer certaines fonctions du corps humain en transférant sur un receveur un organe provenant d'un donneur. Les objectifs ultimes d'une greffe d'organes solides sont l'amélioration de la survie et de la qualité de vie. Par exemple, des patients souffrant d'insuffisance rénale chronique et d'insuffisance rénale terminale (IRT) doivent être dialysés ou greffés pour continuer à vivre.

Au cours des 50 dernières années, la greffe d'organes est devenue une pratique répandue dans le monde, apportant d'immenses bénéfices à des centaines de milliers de patients. L'utilisation d'organes humains en vue d'une greffe â régulièrement augmenté au cours des deux dernières décennies. La greffe d'organes est à présent le traitement le plus rentable dans le cas de l'insuffisance rénale terminale tandis que pour une insuffisance terminale concernant des organes tels que le foie, les poumons et le coeur, elle représente le seul traitement disponible. L'utilisation croissante d'organes humains en vue d'une greffe au cours des dernières décennies a abouti à une pénurie d'organes. Ce fait est largement reconnu comme étant le facteur le plus critique entravant le succès total des greffes d'organes solides. A ce jour par exemple, le nombre de patients atteints d'IRT en attente d'une greffe de rein dépasse le nombre de donneurs de rein. En France, 2826 greffes de rein ont été réalisées en 2009 pour 9675 patients sur liste d'attente. Cela signifie que seul environ un tiers des patients sur liste d'attente chaque année recevront un rein tandis que les autres resteront sous dialyse, ce qui retentira considérablement sur leur qualité de vie.

La pénurie d'organes transplantables a conduit à définir de nouveaux critères moins drastiques pour la qualification des organes transplantables. Ainsi, aux donneurs standards (donneurs vivants, donneurs en état de mort cérébrale), on a d'abord ajouté les donneurs à critères élargis (DCE, donneurs décédés de plus de 60 ans ou donneurs décédés entre 50 et 59 ans hypertendus/insuffisants rénaux légers ou bien donneurs décédés des suites d'un AVC) et, lors d'une autre étape, on a ajouté les donneurs à coeur arrêté (DCA).

Cependant, les organes issus de DCE ou de DCA sont plus sensibles aux lésions d'ischémie-reperfusion (LIR) ou à des détériorations aiguës ou à long terme et la survie de l'allogreffe est moins bonne avec les greffons de DCA comparé à un don effectué après mort cérébrale (Vieira, 2009). Au cours d'une greffe, les organes peuvent souffrir de lésions d'ischémie-reperfusion (LIR). Une LIR désigne une lésion tissulaire provoquée par la revascularisation d'un tissu après un épisode ischémique. Elle est associée à toute greffe d'organes solides (Kosieradzki et Rowinski, 2008) et on a démontré qu'elle jouait un rôle majeur dans le pronostic de survie de l'organe aigu et à long terme. La LIR est directement liée à une inflammation. En état d'hypoxie, les cellules endothéliales stressées produisent et/ou libèrent des médiateurs de l'inflammation comme le facteur d'activation plaquettaire (PAF), le facteur de nécrose tumorale (TNF) et un panel d'interleukines (IL). Les molécules d'adhésion cellulaire des leucocytes sont également exprimées sur la surface cellulaire et conjointement avec une réduction de la production d'oxyde nitrique (NO) induisent la sténose de la lumière vasculaire et le phénomène de non-reflux (Sutton, 2009), ce qui réduit l'apport d'oxygène au parenchyme et aggrave la lésion. Les cellules immunitaires envahissantes libèrent d'autres espèces réactives de l'oxygène (ROS), des protéases et des médiateurs de l'inflammation aggravant également la lésion.

La LIR touche tous les organes et sa manifestation la plus évidente dans le contexte d'une greffe est le retard de fonction du greffon (RFG) et la réduction de la survie du greffon. Le RFG est défini comme étant une divergence temporaire entre la capacité fonctionnelle de l'organe greffé et la satisfaction des besoins physiologiques du receveur. Par exemple, dans le cas d'une greffe de rein, le RFG est défini comme étant la nécessité de dialyser puisque le rein greffé ne peut pas produire d'urine et filtrer le sang dans les une à deux semaines suivant l'intervention. Le pronostic de la greffe s'est avéré corrélé à l'étendue et à l'intensité des lésions associées aux LIR : à court terme eu égard au taux de RFG et de rejet aigu (Mikhalski et al., 2008), à long terme eu égard au développement d'une fibrose interstitielle du greffon et à une survie réduite (Pratschke et al., 2008). Une partie importante et toujours plus grande d'organes atteints de RFG provient de DCA et de DCE et ces organes sont fortement prédisposés aux LIR. Les organes prélevés sur des DCA subissent en effet une période variable d'ischémie chaude entre l'arrêt de la fonction cardio-respiratoire et la perfusion avec une solution de conservation froide. Cela entraîne des lésions d'ischémie chaude, ce qui augmente l'incidence du RFG. Il n'existe actuellement aucun médicament autorisé pour traiter les LIR associées à la greffe d'organes solides. Actuellement, les organes en attente de greffe sont conservés au froid, dans une solution spéciale dans le but d'inhiber le métabolisme par hypothermie. L'organe est rincé avec la solution et conservé à 0-4 °C avant d'être implanté. Il existe plusieurs solutions de conservation des organes et certaines d'entre elles ont été comparées au cours d'études cliniques ; à ce jour toutefois, aucune d'elles ne semble sortir du lot (Yuan et al., 2010). Les composants que l'on retrouve dans les solutions de conservation sont des électrolytes, des sucres, des tampons, des antioxydants et des sels. Chacune des solutions varie sensiblement en termes de composition mais leurs fonctions sont similaires : prévenir l'oedème cellulaire, retarder la destruction cellulaire et optimiser la fonction de l'organe une fois la perfusion rétablie. Cependant, aucune de ces solutions n'est autorisée pour traiter ou prévenir les lésions d'ischémie-reperfusion associées à la greffe d'organes solides. Bien que la conservation statique reste la pratique standard pour tous les organes solides, on assiste à un regain d'intérêt pour la perfusion machine. La perfusion est une technique qui a été développée il y a 40 ans et qui a disparu lorsque les solutions de conservation ont été suffisamment améliorées pour permettre une conservation statique. La perfusion entraîne la circulation continue de substrats énergétiques et l'élimination des déchets pour permettre la réhabilitation et la récupération de l'organe et pour évaluer le métabolisme et la viabilité des tissus en mesurant les paramètres des liquides de conservation. Dans le cas d'une perfusion hypothermique sur machine, après avoir d'abord éliminé le sang, le rein est relié à un dispositif de perfusion et une solution est pompée en continu dans les vaisseaux rénaux à une température comprise entre 1 et 10 °C. La conservation des reins sur machine de perfusion hypothermique est aujourd'hui plus populaire, notamment pour les organes prélevés sur des donneurs sub-optimaux présentant un risque accru de RFG (Feng, 2010).

Ainsi, maintenir la viabilité de l'organe durant sa conservation est un prérequis important au bon pronostic post-greffe. Avec la pratique courante consistant à accepter des organes de donneurs plus âgés et plus atteints, l'amélioration des techniques de conservation est maintenant devenue un must. A ce jour, la plupart des centres ont recours à la conservation statique au froid pour conserver les organes. Ce procédé de conservation a toutefois été développé à une époque où les donneurs étaient plus jeunes et dont les organes étaient de bonne qualité. Avec l'introduction des critères élargis en termes de donneurs, on a probablement atteint les limites de la conservation au froid, les LIR restant encore problématiques pour la greffe d'organes solides.

Il est par conséquent nécessaire d'améliorer la solution de conservation de l'art antérieur et notamment d'obtenir une solution pouvant être utilisée pour une perfusion hypothermique sur machine et des solutions contenant un agent capable de prévenir les LIR.

On a démontré que plusieurs composés anticoagulants prévenaient les LIR. Selon W094/08595, on sait utiliser l'héparine ou l'héparine non anticoagulante pour traiter et prévenir les LIR. L'héparine n'a toutefois jamais été autorisée pour cette application. Le fondaparinux, un anticoagulant oligosaccharidique de synthèse, s'est avéré améliorer les lésions de type LIR sur les organes tout en réduisant la coagulation, l'inflammation et l'accumulation des neutrophiles (Frank et al., 2005). Dans cette étude, on a analysé l'effet du fondaparinux sur un modèle murin létal de LIR rénale. Plus récemment, dans une préparation de coeur de rat de Langendorff modifiée, il s'est avéré que le fondaparinux avait amélioré l'insuffisance cardiaque post-IR et les lésions vasculaires (Montaigne et al., 2008). Les résultats ont suggéré que les mécanismes de ces effets cardioprotecteurs pouvaient entraîner une altération des interactions leucocytes/cellules endothéliales et une production de ROS réduite. Les effets à court et long terme dus à l'emploi de melagatran, inhibiteur direct de la thrombine, durant la conservation au froid d'un greffon rénal ont été décrits chez un modèle DCA porcin (Giraud et al., 2009). Il a été démontré que le melagatran (i) protégeait directement contre l'activité des cellules endothéliales et les lésions histologiques, (ii) réduisait l'expression de la thrombospondine-1 (Tsp-1), de la sélectine P, de l'IL R-1 et de la protéine chimioattractive monocytaire-1 (MCP-1), (iii) protégeait les cellules mononucléaires et (iv) améliorait le pronostic de survie du greffon et sa récupération fonctionnelle.

Un autre inhibiteur direct de la thrombine, l'hirudine, s'est avéré protéger contre les LIR dans le cas d'un modèle de décès par AVC (Karabiyikoglu et al., 2004) et enfin, protéger contre la vasculopathie chronique de l'allogreffe (Holschermann et al., 2000). Toutefois, l'activité anticoagulante de l'héparine, du fondaparinux, du melagatran et de l'hirudine ne peut être neutralisée si besoin est, ce qui peut poser problème dans le cas où une certaine quantité de produit reste dans l'organe après avoir été conservé dans la solution de conservation. En outre, le melagatran a été retiré du marché en raison d'effets secondaires graves. On sait aussi que divers anticoagulants présentent des effets différents sur les différentes enzymes de la cascade de la coagulation et sur la coagulation sanguine dans son ensemble. De la même manière, ces composés présentent divers effets inhibiteurs sur diverses autres protéases (plus ou moins parentes). On sait aussi que l'héparine, le fondaparinux et le melagatran n'ont pas le même effet sur les modèles de LIR. Ainsi, le profil d'inhibition global d'une molécule donnée peut avoir un effet différent sur un système biologique donné. En outre, aucun de ces composés n'a été signalé 25 comme ayant été testé dans le cadre d'une perfusion hypothermique sur machine. On a donc besoin d'un anticoagulant pouvant être neutralisé si nécessaire et qui pourrait être utilisé pour une perfusion hypothermique sur machine. 30 On connaît des anticoagulants neutralisables. On peut par exemple neutraliser par injection d'avidine, une protéine dérivée de l'oeuf, des oligosaccharides biotinylés ou des conjugués d'oligosaccharides biotinylés ayant un effet anticoagulant.

Le groupe biotinyle, dérivé de la biotine (nom IUPAC : acide 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thiéno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoïque également connu sous le nom de vitamine B7) représente le groupe suivant . HO Biotinyle (gauche) et biotine (droite)

La présence du résidu biotine peut cependant influer sur l'activité de l'oligosaccharide et par conséquent, l'homme du métier aurait pensé que ce type de composé ne pourrait pas être utilisé pour traiter ou prévenir les lésions de reperfusion et notamment ne pas être utilisé pour la conservation d'organes dans l'optique d'une greffe d'organes solides. Les inventeurs ont toutefois découvert de manière surprenante que le composé de formule I qui contient un résidu biotine est fortement actif pour prévenir et/ou traiter les lésions d'ischémie-reperfusion lorsqu'on l'ajoute à une solution de conservation employée pour conserver les organes, et notamment lorsque ce type de solution est utilisé conjointement avec une perfusion hypothermique sur machine : (I) Ce composé est représentatif d'une nouvelle classe d'anticoagulants de synthèse à double mécanisme d'action. Il combine en une seule molécule un inhibiteur indirect du facteur Xa (pentasaccharide se liant à l'antithrombine) et un inhibiteur direct de la thrombine (facteur IIa) (peptidomimétique) (Petitou et al., 2009 ; WO2006/067173). Toutefois, ces documents n'ont jamais suggéré ni décrit que ce composé pouvait être utile pour traiter ou prévenir les lésions de reperfusion et notamment pour conserver les organes en vue d'une greffe d'organes solides.

Du fait de la présence d'un fragment biotine lié à une lysine inséré entre la séquence de liaison tétraéthylène et le fragment peptidomimétique, son activité anticoagulante peut être inhibée en employant de l'avidine qui est un antidote spécifique se liant au groupe biotine et empêchant ainsi le composé de produire son effet sur ses cibles.

Les (CI50 = 11,68 (CI50 = 11,26 été évaluées d'hydrolyse fibrinogène, activités anti-facteur Xa ± 0,95 nM) et anti-facteur IIa ± 1,44 nM) du composé de formule I ont dans du plasma de rat en mesurant le taux d'un substrat chromogène (imitant le un substrat naturel). Par conséquent, la présente invention concerne un composé de formule (I), ses sel, solvate, énantiomère, diastéréomère et mélange racémique pour traiter ou prévenir les troubles associés aux lésions d'ischémiereperfusion au cours des interventions chirurgicales ou des greffes d'organes internes.

Le composé de formule I a été décrit dans WO 2006/067173 incorporé dans la présente à titre de référence. En particulier WO 2006/067173 décrit son procédé de préparation. De manière avantageuse, le composé de formule (I) 25 est un mélange 60/40 de deux diastéréomères, provenant de l'épimérisation au niveau d'un carbone de la lysine (flèche sur la formule I ; rapport 60/40 de L/D- lysine). Les deux diastéréomères ont présenté des effets pharmacodynamiques (PD) in vitro similaires sur 30 l'inhibition des facteurs Xa et IIa et sur les profils pharmacocinétiques (PK) in vivo du chien et du rat. Par conséquent, la configuration du motif lysine dans la structure du composé (1) n'a que peu d'influence, voire pas du tout, sur le profil PK/PD des deux isomères 35 distincts.

Dans un mode de réalisation particulier, le composé de formule (I) se présente sous la forme d'une composition pharmaceutique qui est avantageusement une solution aqueuse transparente, incolore et isotonique.

Elle est notamment formulée dans un tampon phosphate 13 mM pH 6,0. Elle est fournie en flacon de 1 ml à une concentration de 10 mg/ml. Dans un mode de réalisation particulier, les troubles associés aux lésions d'ischémie-reperfusion sont des lésions sur les organes, un retard de fonction du greffon, une survie réduite du greffon, un rejet du greffon, un dysfonctionnement du greffon, une inflammation, une fibrose interstitielle du greffon et une perte du greffon à court ou long terme.

De manière avantageuse, les lésions d'ischémiereperfusion se sont produites lors de la greffe d'organes internes, notamment avant de retirer l'organe du corps du donneur décédé (ischémie chaude) ou durant la phase de conservation avant d'implanter l'organe dans le corps du receveur (ischémie froide) ou pendant la reperfusion de l'organe greffé. Les lésions d'ischémie-reperfusion peuvent également se produire au cours d'interventions chirurgicales sur les organes sous circulation extracorporelle, par exemple au cours d'un pontage coronarien. En particulier, les organes internes sont des organes solides avantageusement choisis dans le groupe comprenant les reins, le pancréas, le foie, le coeur, les poumons et les intestins. Les reins sont davantage préférés. Les organes internes sont avantageusement des organes internes de mammifères, notamment des organes internes humains.

La présente invention concerne également une solution destinée à protéger les organes internes déconnectés de l'appareil circulatoire de lésions ischémiques et comprenant comme principe actif le composé de formule I tel que défini ci-dessus ou ses sel, solvate, énantiomère, diastéréoisomère et mélange racémique. Avantageusement, les organes sont tels qu'indiqués ci-dessus.

Le composé de formule I est avantageusement présent dans la solution à une concentration comprise entre 1 mg/1 et 100 mg/l, de préférence 5 mg/1 et 50 mg/l, de manière préférée 10 à 20 mg/1. De manière plus avantageuse, la solution selon la 15 présente invention comprend une solution de cardioplégie ou une solution de conservation des organes. La solution de cardioplégie est une solution aqueuse ou sanguine utilisée afin de protéger le coeur 20 déconnecté au cours de l'intervention chirurgicale. Le coeur est baigné par cette solution pendant qu'il est arrêté, par exemple lors d'un pontage coronarien. La solution de conservation des organes est employée pour protéger de toute lésion l'organe 25 déconnecté de l'appareil circulatoire avant la greffe. La solution de conservation des organes selon la présente invention contient avantageusement un sel de potassium, par exemple le chlorure de potassium ou l'hydroxyde de potassium. 30 Dans un autre mode de réalisation avantageux, la solution de conservation selon la présente invention contient un antioxydant comme l'allopurinol, le glutathion ou le mannitol. La solution de cardioplégie et la solution de 35 conservation des organes sont avantageusement choisies dans le groupe constitué de la solution Celsior, de la solution de Krebs-Henseleit, des solutions de St Thomas II, de la solution de Collins, de la solution de Stanford, de la solution de l'Université de Wisconsin (UW) ou de la solution d'histidine-tryptophanecétoglutarate, de manière préférée, choisies parmi la solution de l'Université de Wisconsin ou la solution d'histidine-tryptophane-cétoglutarate (HTK). La solution de l'Université de Wisconsin est encore plus avantageusement choisie. La composition de la solution UW est décrite dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1. Composition de la solution UW Nom du composant Masse du composé à Concentration ajouter (g) (mM) Poly(0-2-hydroxyéthyl)amidon 50,000 Acide lactobionique (sous forme 35,830 105 de lactone) Hydroxyde de potassium 56 % 14,500 100 Hydroxyde de sodium 40 % 3,679 27 Adénosine 1,340 5 Allopurinol 0,136 1 Dihydrogénophosphate de 3,400 25 potassium Sulfate de magnésium-7H20 1,230 5 Raffinose-5H2O 17,830 30 Glutathion 0,922 3 La composition de la solution HTK est décrite dans le tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2. Composition de la solution HTK Nom du composant Masse du composé à Concentration ajouter (g) (mM) Chlorure de sodium 0,8766 15 Chlorure de potassium 0,6710 9 Hydrogéno-2-cétoglutarate de 0,1842 1 potassium Chlorure de magnésium-6H20 0,8132 4 Histidine-HCI-H2O 3,7733 18 Histidine 27,9289 180 Tryptophane 0,4085 2 Mannitol 5,4651 30 Chlorure de calcium-2H2O 0,0022 0,015 Eau stérile pour solution jusqu'à 1 I - injectable Dans un mode de réalisation avantageux, la solution protectrice selon la présente invention est maintenue à une température comprise entre 0 et 10 °C, avantageusement entre 1 et 10 °C, de manière plus avantageuse entre 1 et 8 °C, de manière encore plus avantageuse entre 3 et 5 °C et de manière encore plus avantageuse aux alentours de 4 °C. La présente invention consiste également en un procédé pour protéger des lésions ischémiques les organes internes prélevés sur le corps et qui comprend la mise en contact des tissus et des cellules des organes avec la solution protectrice comme défini ci-dessus. La mise en contact est avantageusement effectué 15 par dispositif de perfusion hypothermique. Un dispositif de perfusion hypothermique correspond à tout dispositif mécanique pouvant être utilisé pour perfuser un organe avec la solution protectrice selon la présente invention. 20 Dans un mode de réalisation particulier, le dispositif de perfusion hypothermique est un réservoir, par exemple une seringue, destiné à contenir la solution protectrice et relié à une veine et/ou une artère de l'organe par une tubulure ou une canule. 25 Dans un autre mode de réalisation, le dispositif de perfusion hypothermique est un dispositif commandé et actionné électriquement, comprenant divers dispositifs de commande du débit et de la température, et qui permet d'administrer la solution protectrice à 30 des débits et températures contrôlés. Le débit est avantageusement de 30 ml/min.

De manière plus avantageuse, le dispositif de perfusion hypothermique est le Lifeport® d'Organ Recovery System ou le RM3® de Waters Instruments/IGL group.

La solution protectrice selon la présente invention est compatible avec le dispositif de perfusion hypothermique et ne précipite ni ne s'accumule dans l'organe au cours de la perfusion.

Définitions

Le composé de la présente invention peut également se présenter sous la forme de sels pharmaceutiquement acceptables. Pour un usage médical, les sels du composé de la présente invention font référence à des « sels pharmaceutiquement acceptables » non toxiques. Les formes de sels pharmaceutiquement acceptables approuvés par la FDA comprennent les sels pharmaceutiquement acceptables acides/anioniques ou basiques/cationiques (Gould, 1984 ; Berge, et al., 1977). Les sels pharmaceutiquement acceptables du composé acide ou basique de l'invention peuvent être bien entendu préparés selon des procédures conventionnelles, par exemple en faisant réagir la base ou l'acide libre avec au moins une quantité stoechiométrique de l'acide ou de la base formant un sel souhaité(e). Les sels pharmaceutiquement acceptables du composé acide de l'invention comprennent les sels avec des cations inorganiques tels que le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, le zinc, l'ammonium et les sels avec des bases organiques. Les bases organiques adaptées comprennent la N-méthyl-D-glucamine, l'arginine, la benzathine, la diolamine, l'olamine, la procaïne et la trométhamine.

Les sels pharmaceutiquement acceptables du composé basique de l'invention comprennent les sels dérivés d'acides organiques ou inorganiques. Les anions adaptés comprennent l'acétate, l'adipate, le bésylate, le bromure, le camsylate, le chlorure, le citrate, l'édisylate, l'estolate, le fumarate, le gluceptate, le gluconate, le glucuronate, l'hippurate, l'hyclate, le bromhydrate, le chlorhydrate, l'iodure, l'iséthionate, le lactate, le lactobionate, le maléate, le mésylate, le bromure de méthyle, le sulfate de méthyle, le napsylate, le nitrate, l'oléate, le pamoate, le phosphate, le polygalacturonate, le stéarate, le succinate, le sulfate, le sulfosalicylate, le tannate, le tartrate, le téréphtalate, le tosylate et le triéthiodure. On préfère notamment les sels de sulfate. Dans les procédés de traitement de la présente invention, le terme « administration » doit comprendre le traitement des divers troubles décrits avec le composé spécifiquement. divulgué ou avec un composé qui peut ne pas être spécifiquement divulgué mais qui se transforme in vivo en le composé spécifié après avoir été administré au sujet. Le composé selon la présente invention peut être notamment administré avant la greffe au sujet chez lequel l'organe doit être greffé afin d'éviter les lésions d'ischémie-reperfusion occasionnées lors de la reperfusion de l'organe et/ou pour traiter les lésions d'ischémie-reperfusion occasionnées avant le prélèvement de l'organe et/ou durant la phase de conservation de l'organe. Dans un autre mode de réalisation, le composé selon la présente invention peut être administré au sujet après avoir greffé l'organe afin de traiter les lésions d'ischémie-reperfusion occasionnées lors de la reperfusion de l'organe et/ou avant le prélèvement de l'organe et/ou durant la phase de conservation de l'organe. Dans un autre mode de réalisation, le composé selon la présente invention peut être administré au sujet donneur de l'organe destiné à la greffe afin d'éviter les lésions d'ischémie-reperfusion occasionnées lors de la reperfusion de l'organe et/ou avant le prélèvement de l'organe et/ou durant la phase de conservation de l'organe.

Dans un autre mode de réalisation, le composé selon la présente invention peut être administré au sujet durant l'intervention chirurgicale (avant ou après le prélèvement de l'organe) dans le but d'éviter les lésions d'ischémie-reperfusion occasionnées lors de la reperfusion de l'organe et/ou avant le prélèvement de l'organe et/ou durant la phase de conservation de l'organe. On a anticipé le fait que le composé de l'invention puisse être administré par voie parentérale comprenant l'administration intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale, sous-cutanée, transdermique, rectale et topique. On préfère notamment l'administration par voie intraveineuse et sous-cutanée du composé de la présente invention.

Pour un usage parentéral comprenant l'usage intramusculaire, intrapéritonéale, sous-cutané et intraveineux, le composé de l'invention sera généralement proposé sous forme de solutions aqueuses stériles tamponnées pour avoir un pH et une isotonicité appropriés. Les véhicules aqueux adaptés comprennent la solution de Ringer ainsi que le chlorure de sodium isotonique et le phosphate de sodium. Les suspensions aqueuses selon l'invention peuvent comprendre des agents de mise en suspension tels que les dérivés de la cellulose, l'alginate de sodium, la polyvinylpyrrolidone et la gomme adragante ainsi qu'un agent mouillant tel que la lécithine. Les conservateurs adaptés aux suspensions aqueuses comprennent le phydroxybenzoate d'éthyle et de n-propyle.

Modes d'administration

Le composé de la présente invention peut être administré directement ou bien dans des compositions 10 pharmaceutiques contenant des excipients (voir ci-dessus) comme on le sait bien dans l'art. Les traitements de la présente invention impliquent l'administration à un sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé de la présente 15 invention. Les termes « quantité thérapeutiquement efficace » ou « dose thérapeutiquement efficace » tels qu'utilisés dans la présente font référence à une quantité de composé selon la présente invention nécessaire pour 20 traiter, améliorer ou prévenir la pathologie ciblée, avoir un effet thérapeutique ou préventif détectable et prolonger la survie du patient. On peut déterminer la toxicité et l'efficacité thérapeutique de ces molécules grâce à des procédures pharmaceutiques standards dans 25 des cultures cellulaires ou bien sur des animaux expérimentaux, par exemple en déterminant la DL50 (dose létale pour 50 % de la population) et la DE50 (dose thérapeutiquement efficace chez 50 % de la population). Le rapport des doses des effets toxiques à 30 thérapeutiques est l'indice thérapeutique qui peut être exprimé en tant que rapport DL50/DE50. On préfère les agents présentant des indices thérapeutiques élevés. La quantité thérapeutiquement efficace ou la dose thérapeutiquement efficace désigne la quantité de 35 composé ou de composition pharmaceutique qui induira la réponse biologique ou médicale d'un tissu, d'un système, d'un animal ou d'un être humain étudié par le chercheur, un vétérinaire, un médecin ou tout autre clinicien.

Les dosages se situent de préférence dans une fourchette de concentrations circulantes qui comprend la DE50 avec peu ou pas de toxicité. Les dosages peuvent varier dans cette fourchette en fonction de la forme galénique employée et/ou de la voie d'administration utilisée. Il convient de choisir les exacts formulation, voie d'administration, dosage et intervalle posologique selon des procédés connus dans l'art au vu des spécificités de l'état du patient. La dose et l'intervalle posologique peuvent être ajustés individuellement pour fournir des niveaux plasmatiques de fraction active suffisants pour obtenir les effets désirés, à savoir la concentration minimale effective (CME). La CME va varier pour chaque composé mais on peut par exemple l'estimer à partir de données in vitro et d'expériences sur les animaux. Les dosages nécessaires pour obtenir la CME vont dépendre des caractéristiques individuelles et de la voie d'administration. Dans les cas d'une administration locale ou d'une prise sélective, la concentration effective locale du médicament peut ne pas être liée à la concentration plasmatique. En général, la dose/quantité thérapeutiquement efficace peut être estimée en employant des procédés et des techniques conventionnels connus dans l'art. Les doses initiales employées lors d'études sur l'animal (par exemple, des primates non humains, des souris, des lapins, des chiens ou des porcs) peuvent être basées sur les concentrations effectives établies lors des analyses de cultures cellulaires. On peut également recourir au modèle animal pour déterminer la fourchette de concentrations et la voie d'administration appropriées. On peut ensuite exploiter ces informations pour déterminer les doses et voies d'administration utiles pour l'administration à des patients humains.

Le niveau de dosage spécifique requis pour chaque patient particulier va dépendre d'un certain nombre de facteurs, parmi lesquels la gravité de l'état traité, la voie d'administration, l'état de santé général du patient (à savoir, son âge, son poids et son alimentation), le sexe du patient, la durée et la fréquence d'administration, le jugement du médecin prescripteur et la tolérance/réponse au traitement. Toutefois, en général, la dose journalière (qu'elle soit administrée en dose unique ou en doses fractionnées) va se situer dans la fourchette allant de 0,01 à 500 mg par jour, de manière plus habituelle de o, l à 50 mg par jour et de manière la plus habituelle entre toutes de 1 à 10 mg par jour. En variante, les doses peuvent être administrées par unité de poids corporel et, dans ce cas, une dose typique se situera entre 0,001 mg/kg et 3 mg/kg, notamment entre 0,01 mg/kg et 0,2 mg/kg, entre 0,02 mg/kg et 0,1 mg/kg. Une voie d'administration efficace et pratique ainsi qu'une formulation adaptée du composé de l'invention dans des compositions pharmaceutiques (voir ci-dessus) peuvent être également facilement déterminées par des expériences de routine. Divers formulations et systèmes d'administration de médicaments sont disponibles dans l'art (voir par exemple Gennaro AR (éd.). Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins. 21eme édition. 3 juillet 2005 et Hardman JG, Limbird LE, Alfred G Gilman, AG. Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. McGraw-Hill; 1Oeme édition. 13 août 2001).

Comme susmentionné, les voies d'administration adaptées peuvent par exemple inclure l'administration par voie vaginale, rectale, intestinale, orale, nasale (intranasale), pulmonaire ou sinon muqueuse, topique, transdermique, oculaire, auriculaire et parentérale. Un avantage du composé de la présente invention est qu'il se prête particulièrement à l'administration orale. Les principales voies d'administration parentérale comprennent l'administration par voie intraveineuse, intramusculaire et sous-cutanée. Les voies d'administration secondaires comprennent l'administration par voie intrapéritonéale, intra- artérielle, intra-articulaire, intracardiaque, intracisternale, intradermique, intralésionnelle, intra-oculaire, intrapleurale, intrathécale, intra- utérine et intraventriculaire. L'indication de traitement, conjointement avec les propriétés physiques, chimiques et biologiques du médicament, dicte le type de formulation et la voie d'administration à employer ainsi que le fait de privilégier une administration locale ou systémique. Les présentes compositions peuvent, si on le désire, être présentées dans un conditionnement ou dans un dispositif distributeur contenant une ou plusieurs formes galéniques contenant le principe actif. Ce type d'emballage ou de dispositif peut par exemple comprendre une feuille métallique ou plastique, comme un emballage sous blister ou être en verre avec des bouchons en caoutchouc comme des flacons. Le conditionnement ou le dispositif distributeur peut être accompagné d'instructions pour l'administration. Des compositions comprenant un agent de l'invention formulé dans un véhicule pharmaceutiquement compatible peuvent être également préparées, placées dans un récipient adapté et étiquetées pour traiter un état précis. Une autre utilisation du composé de la présente invention nécessite que le composé soit ajouté à la solution de conservation. Il s'agira d'une solution ou d'une poudre fournie avec son solvant afin de la diluer. Dans le processus de greffe, on a généralement recours à la conservation statique au froid afin de préserver l'allogreffe rénale. Mais la conservation machine est nécessaire pour conserver les organes issus de donneurs tels que les donneurs à coeur arrêté ou les donneurs marginaux. Des données récentes ont montré que la perfusion hypothermique sur machine était associée à un risque réduit de retard de fonction du greffon et à une meilleure survie du greffon après la greffe (Moers et al., 2009) (Watson CJ et al., 2010) (Vaziri et al., 2011). Le composé I pourrait être utilisé lors de la conservation sur machine de perfusion afin d'améliorer la distribution vasculaire du médicament. Les études cliniques ont démontré les bénéfices apportés par l'utilisation de machines de perfusion dans la conservation des reins prélevés sur des DCA (Maathuis, Manekeller et al., 2007 ; Moers, Smits et al., 2009 ; Pirenne, Smits et al., 2009). Ces machines réduisent l'incidence du RFG et donc la nécessité de dialyser les patients nouvellement greffés, ce qui se traduit par une réduction des coûts de soins de santé sur le long terme, non seulement pour les DCA (Wszola, Kwiatkowski et al., 2009) mais aussi pour les donneurs à critères standards et élargis (Garfield, Poret et al., 2009). Ces observations ont amené les autorités sanitaires françaises à imposer la perfusion machine (PM) pour la conservation des reins prélevés sur des DCA (http://www.urgences-serveur.fr/prelevements-de- reins-sur-des,1418.html).

Les exemples et figures suivants illustrent 5 l'invention mais ne sont pas limitatifs. La figure 1 représente la créatininémie post-greffe en fonction du jour après la greffe de rein chez le porc dans une étude in vivo au cours de laquelle le rein de porc a été conservé avant la greffe et après 10 ischémie chaude en utilisant les solutions UW, UW+HNF et UW+composé (I) sous la forme d'un mélange 60/40 de L/D-lysine. La figure 2 représente la courbe de Kaplan-Meier de la survie des porcs après greffe de rein dans 15 l'étude in vivo. La figure 3 représente le pourcentage de libération de LDH dans une étude in vitro sur le modèle de cellules endothéliales primaires porcines.

20 EXEMPLE 1 - Etudes in vivo Afin d'imiter les conditions des reins de DCA, on a induit une ischémie chaude rénale chez des porcs Large White en clampant le pédicule rénal droit pendant 60 min à l'aide d'un clamp vasculaire atraumatique. Les 25 porcs mâles Large White (INRA/GEPA, Surgères, France) ont été préparés comme décrit précédemment (Hauet et al., 2000) et conformément aux directives françaises du Comité d'éthique pour les études sur les êtres humains et les animaux. 30 Le rein a ensuite été prélevé, lavé à froid et conservé pendant 24 heures à basse température dans une solution de conservation de l'Université de Wisconsin (UW) (témoin) ou avec de la solution UW contenant soit de l'héparine non fractionnée (HNF), soit le 35 composé (I) sous la forme d'un mélange 60/40 de L/D- lysine (appelé composé 1) préparé comme indiqué in WO2006/067173 avant implantation. Le composé (1) a été comparé à la HNF puisque la plupart des donneurs sont traités à l'héparine dans le cadre des soins intensifs qu'ils reçoivent avant de décéder. Le rein a ensuite été greffé sur le même animal et suivi durant 3 mois. Dans chaque groupe expérimental, le rein gauche a été prélevé durant la greffe afin d'imiter la masse néphronique dans les paramètres du receveur humain greffé. Temps d'anastomose : 30 ± 5 min. Les animaux ont été séparés en 3 groupes expérimentaux : UW : les reins ont subi une ischémie chaude de 60 min, puis ils ont été conservés à 4 0C pendant 24 h dans de la solution UW (n=5) ; UW+HNF : on a d'abord administré la HNF (125 UI/kg) aux porcs par voie IV 10 min avant l'ischémie chaude de 60 min et les reins ont ensuite été conservés à 4 °C pendant 24 h dans de la solution UW à laquelle on a ajouté de la HNF (5000 UI/l) (n=11) ; UW+composé (1) . les reins ont subi une ischémie chaude de 60 min puis ils ont été conservés à 4 °C pendant 24 h dans de la solution UW à laquelle on a ajouté le composé 1 (16,3 mg/1) (n=5) La restauration de la fonction rénale a été mesurée par dosage de la créatinine sérique (figure 1).

Pour l'analyse statistique des groupes UW+HNF vs. UW+composé 1, on a utilisé le logiciel NCSS (NCSS LLC, Etats-Unis) avec le test t dans l'hypothèse des variances égales afin de comparer les tests pour deux échantillons en cas de normalité (tests d'asymétrie, d'aplatissement et omnibus) et d'égalité des variances (test de Levene modifié sur l'égalité des variances) ou le test d'Aspin-Welch sur l'inégalité des variances en cas de normalité et de variance inégale. La signification statistique a été acceptée pour p<0,05 (* p<0,05, ** p<0,01 et *** p<0,001).

Les résultats des études in vivo étaient les suivants : ^ Aucune survie après 1 semaine dans le groupe UW en raison d'une non-fonction primaire (NFP, aucune reprise de la production d'urine) qui a conduit à une euthanasie ultérieure des animaux. ^ Parmi les 11 reins conservés avec la solution UW supplémentée en HNF, 6 reins ont présenté une NFP après 1 semaine et ont été euthanasiés selon les réglementations éthiques. Dans ce groupe, la créatinine sérique a augmenté régulièrement jusqu'au jour 5 puis a légèrement baissé sans atteindre les taux d'avant la greffe. ^ Le remplacement de la HNF par le composé 1 a permis une restauration plus rapide de la fonction (commençant au jour 3) suivie d'une baisse significative de la créatinémie jusqu'à revenir aux taux avant la greffe avant le jour 30. Ces résultats ont clairement démontré que le RFG pouvait être inhibé par le traitement avec le composé 1.

25 En plus des 6 NFP observées après 1 semaine sur les reins conservés dans de la solution UW supplémentée avec de la HNF, on a signalé à 4 et 6 semaines 2 pertes d'animaux supplémentaires dont le mauvais état général nous a amenés à les euthanasier. L'examen des greffons 30 rénaux à ces moments de référence a révélé une invasion massive des tissus par les cellules immunitaires et une nécrose du parenchyme. Le remplacement de la HNF par le composé 1 a considérablement amélioré la survie puisque tous les reins ont recouvré leur fonction et les 10 15 20 animaux ont pu survivre jusqu'à la fin de l'expérience (figure 2) (3 mois, p<0,05, test du log rank). Pour l'analyse statistique des groupes UW+HNF vs. UW+composé 1, afin de comparer les distributions de survie, on a fait appel au test du log rank avec le logiciel GraphPad Prism. La signification statistique a été acceptée pour p<0,05 (* p<0,05). En résumé, dans le modèle de greffe de rein prélevé sur DCA, il a été impossible d'utiliser la conservation avec la solution UW de référence pour préserver l'intégrité du rein durant sa conservation au froid et permettre la restauration de la fonction rénale. L'addition de HNF a permis une certaine protection des tissus en améliorant légèrement la restauration de la fonction rénale ainsi qu'une survie de 27 % à la fin du suivi. L'utilisation du composé 1 au lieu de la HNF a permis une totale restauration de la fonction de tous les reins ainsi qu'un meilleur retour aux niveaux d'avant la greffe.

Pour conclure, ces résultats préliminaires ont démontré la supériorité du composé 1 sur la HNF standard pour améliorer la conservation et la qualité des reins en optimisant le pronostic à long terme. En tenant compte de la nature universelle des LIR au cours d'une greffe d'organes et le fait que l'impact des LIR sur les cellules endothéliales est similaire quel que soit l'organe, le composé 1 devrait être par conséquent efficace pour prévenir les LIR sur d'autres organes.

EXEMPLE 2 - Etudes in vitro Une étude définissant les bénéfices du composé I sous la forme d'un mélange 60/40 de L/D-lysine (appelé composé 1) pour lutter contre les LIR a été menée sur un modèle de cellules endothéliales primaires porcines.

Le but de cette étude a été d'imiter la conservation des organes en utilisant des cellules endothéliales qui sont les premières cellules affectées par les LIR au cours d'une greffe de rein. Les cellules ont été placées sous atmosphère hypoxique pendant 24 h dans une solution UW à 4 °C avec ou sans ajout de composé 1 à 16,3 mg/l. Après l'hypoxie, on a procédé à une quantification extracellulaire de la lactate déshydrogénase (LDH) afin de déterminer le niveau de mort cellulaire à l'aide du kit d'analyse toxicologique in vitro de Sigma-Aldrich et comprenant la LDH. L'analyse est basée sur la réduction du NAD par la LDH. Le NAD (NADH) réduit obtenu est utilisé dans la conversion stoechiométrique du colorant tétrazolium. Le composé coloré obtenu est mesuré spectrophotométriquement. Le degré d'activité LDH peut être exploité comme indicateur de la viabilité cellulaire relative ainsi que de l'intégrité de la membrane cellulaire. Les résultats ont été exprimés sous forme de 20 pourcentage de libération de LDH, à savoir : [(libération de LDH) / (libération de LDH) + (LDH intracellulaire)] x 100. Avec cette approche, une importante libération de LDH implique une mort cellulaire accrue. 25 Trois groupes ont été comparés et se composaient de . - Cellules témoins (n=8) : cellules endothéliales porcines cultivées dans un milieu adéquat sans hypoxie ni solution UW. 30 - Solution UW (n=8) : cellules endothéliales porcines incubées sous atmosphère hypoxique durant 24 h dans de la solution UW. - Solution UW+composé 1 (n=8) : cellules endothéliales porcines incubées sous atmosphère hypoxique durant 24 h dans de la solution UW+composé 1 à 16,3 mg/1 (voir figure 3). Les résultats sont exprimés en tant que Moyenne ± erreur-type. Pour l'analyse statistique des groupes UW vs. UW+composé 1, on a utilisé le logiciel NCSS (NCSS LLC, Etats-Unis) avec le test t dans l'hypothèse des variances égales afin de comparer les tests à deux échantillons en cas de normalité (tests d'asymétrie, d'aplatissement et omnibus) et d'égalité de variance (test de Levene modifié sur l'égalité des variances). La signification statistique a été acceptée pour p<0,05 (*** p<0,001). Cette expérience a montré que l'utilisation du composé 1 à 16,3 mg/1 préservait l'intégrité des cellules au moment des LIR comme cela a été démontré par la réduction par moitié de la libération de LDH dans le compartiment extracellulaire comparé au procédé de conservation standard (solution UW uniquement) (p<0,001) (figure 3).

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Claims (9)

1. REVENDICATIONS1. Composé de formule (I) (I) son sel, solvate, énantiomère, diastéréoisomère et mélange racémique pour traiter ou prévenir les troubles associés aux lésions d'ischémie-reperfusion au cours 10 des interventions chirurgicales ou des greffes d'organes internes.
2. 2. Composé selon la revendication 1, dans lequel l'ischémie-reperfusion s'est produite pendant une 15 greffe d'organes internes.5
3. 3. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel l'organe interne est le rein.
4. 4. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les organes internes sont des organes internes de mammifères, notamment des organes internes humains.
5. 5. Solution pour protéger des lésions ischémiques les organes internes déconnectés de l'appareil circulatoire, comprenant comme principe actif le composé de formule I comme défini dans la revendication 1 ou son sel, solvate, énantiomère, diastéromère et mélange racémique.
6. 6. Solution protectrice selon la revendication 5, dans laquelle le composé de formule I est présent à une concentration comprise entre 10 et 20 mg/1 de solution.
7. 7. Solution selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, dans laquelle la solution de perfusion comprend une solution de conservation des organes avantageusement choisie entre la solution de l'Université de Wisconsin ou la solution d'histidinetryptophane-cétoglutarate.
8. 8. Procédé pour protéger des lésions ischémiques des organes internes déconnectés du corps comprenant la mise en contact des tissus et des cellules des organes avec la solution protectrice selon l'une quelconque des revendications 5 à 7. 2974.478 34
9. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la mise en contact avec la solution protectrice est effectué par perfusion hypothermique sur machine.