CN101084990A - 鼠尾草多糖及其酯类的制备和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鼠尾草多糖及其酯类的制备和应用，其特征是糖链中含有由山梨醇、鼠李糖、半乳糖，通过1→6(或非还原末端)、1→4及1→3糖苷键连接。本发明提供的鼠尾草多糖及其酯类是以植物鼠尾草为原料，或鼠尾草经提取脂溶性有效成分或(和)水溶性酚酸类成份过程中的废弃物经热水浸提、浓缩、乙醇沉淀、脱蛋白处理得鼠尾草多糖，多糖经酯化处理得鼠尾草多糖酯(硫酸酯、磷酸酯、硝酸酯和醋酸酯)。本发明所得的鼠尾草多糖及其酯类均具有较强的抗人艾滋病毒和单纯疱疹病毒活性，对人体细胞的毒性低，可用于制备预防或治疗人艾滋病病毒和单纯疱疹病毒感染的制剂。
Description
技术领域
本发明涉及鼠尾草多糖及其酯类的制备和用途。该鼠尾草多糖及其酯类均具有较高的抗人艾滋病病毒和人单纯疱疹病毒的活性，且选择指数高，在制备预防或治疗人艾滋病病毒感染和单纯疱疹病毒感染的制剂方面有良好的应用前景。
背景技术
据《中国药物志》记载中国鼠尾草属(Salvia)植物有83种，25变种，9变型，其中药用的有30余种(含变种、变型)，大多数以根入药作丹参用。如白花鼠尾草(Salvia miltiorrhiza，即丹参)、南丹参草(S.bowleyana)、甘西鼠尾草(S.przewalskii)、云南鼠尾草(S.yunnanensis，即滇丹参)、三叶鼠尾草(S.trijuga)、长冠鼠尾草(S.plectranthoides)和毛地黄鼠尾草(S.digitaloides)(腾艳芬，等.中国野生植物资源，2001，2：1-3)，以及土丹参(S.kiaomaidiensis)、雪山鼠尾草(S.evansiana)、洱源鼠尾草(S.lardcongensis)(钱子刚，等.中药材，2002，25(9)：628-9)等。本属植物药用种类多、药效范围广。药用主要成份为脂溶性的二萜醌类和水溶性的缩酚酸类。按结构可分为精油、萜类化合物、多酚类化合物、甾类化合物等，其中二萜类占90％以上，而二萜醌类占50％以上(屈英薇，等，河北医科大学学报，2005，6：701-2)。丹参(S.miltiorrhiza)为中国药典2000年版收载。丹参制剂对许多疾病，如冠心病、脑血栓、肝炎、肝硬化等有显著疗效。在临床上应用最广的制剂为丹参水针剂，脂溶性成份经磺酸化可制成疗效相近的水针剂使用(中国医学科学院药物研究所：《中草药现代研究》第二卷，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1996)。
在中国发明专利ZL95105902.5中，滇丹参的冷水提取物(有效部位D1)及热水提取物(有效部位E1)抗HIV-1IIIB的半数有效浓度IC50为1.5-20.4μg/mL，选择指数39-167，但没有有关组分化学特性的任何描述。在中国发明专利CN1546504A中，介绍了从丹参提取的迷迭香酸苷新化合物及其制备方法和在抗艾滋病中的应用。在中国发明专利CN1546504A中，介绍了一种新酚酸类化合物丹酚酸N，其抗HIV的IC50为0.649μg/mL，选择指数5.7。在中国发明专利ZL 200410074360.2中，丹参的水提取物经大孔树脂吸附低级醇解析物(有效部位A)及有效部位A的乙醇沉淀物(有效部位B)以及有效部位B的凝胶层析分离物(丹参寡糖混合物)抗HIV-1的半数有效浓度IC50为0.76-1.06μg/mL，选择指数7.6-13.6；其寡糖混合物中含有分子量分别为504、666和904道尔顿的物质，寡糖混合物的单糖组成为甘露糖、半乳糖、葡萄糖，三者的比例为1∶8∶7。
寡糖是单糖残基数低于7的低聚糖的统称(沈同《生物化学》上册)，分子量较低。多糖则是高聚糖的通称，分子量较高。人们曾发现红树多糖[Premanathan，et al.Antiviral Res，1999，44：113-22]、藻类多糖[Hoshino，et al.Biol Pharm Bull，1998，21(7)：730-4]和人工硫酸酯化的一些来源于其它植物的多糖具有抗HIV活性[蒋岩，等.中华实验和临床病毒学杂志，2000，14(1)：56-9]。但未见有关鼠尾草多糖及其抗HIV-1活性的研究报道和专利申请。
本发明从鼠尾草提取鼠尾草多糖，分子量大于5000道尔顿，单糖组成为山梨醇、半乳糖、鼠李糖，三者的比率为5∶2∶2。未酯化和酯化的鼠尾草多糖均具有抗艾滋病病毒和人单纯疱疹病毒的作用，例如，抗HIV-1的半数有效浓度IC50为0.4-14μg/mL，选择指数大于200，故本发明的鼠尾草多糖及其酯类在分子量、单糖组成和抗病毒活性方面均与已有的专利及文献报道的不同，是一类新的具有较高抗HIV-1和单纯疱疹病毒活性的化合物。
发明内容
本发明以鼠尾草植物(Salivia)为原料，或以鼠尾草经提取脂溶性有效成分或(和)水溶性的酚酸类成份过程中的废弃物为原料，提取和制备鼠尾草多糖及其酯类(包括硫酸酯、磷酸酯、硝酸酯和乙酸酯)。其制备方法是以上述原料经热水浸提、浓缩、乙醇沉淀、脱蛋白处理、冷冻干燥即得本发明的鼠尾草多糖。进一步经酯化处理、中和、醇沉、透析、减压蒸馏浓缩、醇沉、真空干燥即得本发明的鼠尾草多糖酯。其特征是：单糖组成为山梨醇、半乳糖、鼠李糖，糖苷键连接方式有1→6(或非还原末端)、1→4及1→3糖苷键，分子量大于5000道尔顿。
本发明对所得鼠尾草多糖及其酯类进行了抗人艾滋病病毒和人单纯疱疹病毒的活性的实验检测。药效学试验证明鼠尾草多糖及其酯类具有较高的抗人艾滋病病毒和单纯疱疹病毒的作用，对人体细胞毒性低，抗病毒的活性稳定，可制备成预防或治疗人艾滋病病毒感染和单纯疱疹病毒感染的制剂。
具体实施方式
通过以下实施例可进一步说明本发明的实质内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一：本发明中化合物鼠尾草多糖的一种制备方法
取云南鼠尾草(Salivia yunnanensis C.H.Wright)，经热水浸提、浓缩、乙醇沉淀、脱蛋白处理、冷冻干燥即得本发明的鼠尾草多糖。经分子筛层析测得分子量为26000道尔顿，经HPLC分析表明，单糖组成为山梨醇、半乳糖、鼠李糖，三者的比例为5∶2∶2，通过Smith降解分析表明鼠尾草多糖中没有1→2糖苷键，进一步根据多糖高碘酸消耗的规律，推知由1→6(或非还原末端)、1→4及1→3糖苷键连接，三者的比例为1∶3∶1。红外光谱分析表明在905cm-1和847cm-1左右有吸收峰，分别为α-D-吡喃山梨醇和β-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰。
实施例二：本发明中鼠尾草多糖硫酸酯的一种制备方法
取磺化剂80mL置于250mL三口瓶中，控制温度75℃，加入鼠尾草多糖8克，搅拌反应3h，反应结束后取出烧瓶冷至室温，用6mol NaOH溶液中和，乙醇沉淀、离心，沉淀用蒸馏水溶解后于蒸馏水中透析，透析内液减压蒸馏浓缩，乙醇沉淀，离心，干燥，即得本发明的鼠尾草多糖硫酸酯。经分子筛层析测得分子量为18000道尔顿，经HPLC分析表明，单糖组成为山梨醇、半乳糖、鼠李糖，三者的比例为5∶2∶2，硫酸酯化度1.7。根据多糖高碘酸消耗的规律，推知由1→6(或非还原末端)、1→4(2)及1→3糖苷键连接，三者的比例为1∶3∶1。通过Smith降解分析表明鼠尾草多糖硫酸酯中没有1→2糖苷键。红外光谱分析表明在905cm-1和847cm-1左右有吸收峰，分别为α-D-山梨醇和β-D-半乳吡喃糖的特征吸收峰，以及较强的S＝O伸缩振动的特征吸收(～1240cm-1)和C-O-S伸缩振动的特征吸收(820cm-1)。
实施例三本发明中鼠尾草多糖及其硫酸酯的药理作用
1.以MTT法测定鼠尾草多糖硫酸酯的细胞毒性，以荧光测定技术测定鼠尾草多糖硫酸酯的抗HIV-1Ba-L(R5病毒)活性。
TZM-b1细胞是一种表达CD4、CXCR4和CCR5等HIV-1受体和辅助受体以及由HIV-1启动子控制表达的萤火虫素酶的HeLa细胞系(AIDS Research and References Reagent Program，NIAID，NIH)。首先，测定鼠尾草多糖硫酸酯对TZM-b1细胞的毒性。方法是：在96孔平底培养板上，将鼠尾草多糖硫酸酯用RPMI-1640培养基进行2倍系列稀释。共6个稀释度，每孔100μl，设3个重复孔，设细胞对照组和空白对照组。然后，每个培养孔加入100μ1含有3×103 TZM-b1细胞的培养基。于37℃培养48小时。第3天，将96孔细胞培养板低速离心后(1000rpm，10min)，吸弃150μl培养上清，加人20μl二甲基四氮唑盐(3，(4，5-dimethylthiazol-2yl)-，5-iphenyl tetrazolium bromide，MTT)(Sigma公司)溶液(5mg/ml)，置37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时，再加入100μl 20％十二烷基磺酸钠(SDS)(Sigma公司)-50％N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)(pH4.7)，孵育过夜；酶标仪测定各孔的OD值(测定波长595nm，参考波长655nm)。
取3×103TZM-b1细胞接种于96孔平底细胞培养板(Coming)内。第二天，吸去细胞培养孔内的培养基，每孔加入含有约1000感染单位的HIV-1 Ba-L和以新鲜培养基经过系列稀释的含有不同浓度的鼠尾草多糖硫酸酯，于37℃培养48小时。第3天，每孔加入100μl1×细胞溶解缓冲液(Promega)。然后，取60μl细胞溶解物，以LucLite萤火虫素酶测定试剂盒(Packard)在Fusion Universal Microplate Analyser(Packard)上进行测定。以Graphpad Prism 4软件计算各受试样品在体外对病毒的50％抑制率(IC50)和对不同细胞株增殖的半数抑制浓度(CC50)值及绘制量-效曲线图。选择指数SI(Selective index)＝CC50/IC50。尾草多糖硫酸酯对TZM-b1细胞的毒性和对HIV-1 Ba-L(R5)的抑制活性的剂量-反应曲线见图1、图2。以Graphpad Prism4软件计算出鼠尾草多糖硫酸酯对TZM-b1细胞的CC50为120.1μg/ml，对HIV-1 Ba-L的IC50为0.467μg/ml，SI为257.2。
2.以P24抗原测定技术，XTT测定和细胞-细胞融合技术分别测定鼠尾草多糖和鼠尾草多糖硫酸酯对HIV-1IIIB(X4病毒)的抑制活性。
在96孔培养板上，将鼠尾草多糖或鼠尾草多糖硫酸酯的贮存液以完全培养基分别作5倍比稀释，共8个梯度，每个梯度设4孔，每孔100μl。同时设置AZT阳性对照组和空白对照组。然后每孔加入100个TCID50的HIV-1IIIB和1×104MT-2细胞悬液，每孔的总液体量为200μl。在37℃培养2小时后，离心洗细胞，以去除游离的病毒和化合物。加入不含化合物的新鲜培养基。在感染后的第四天，每孔收集100μl的细胞培养上清用作P24抗原测定。为此，加入等量的5％Triton X-100溶解病毒(病毒裂解液)，进行定量ELISA测定。测定用的酶标板(Immulon 1B，Dynex Technology，Chantilly，VA)先以0.85 M碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制的HIVIG铺板，4℃过夜。接着以PBS-T缓冲液洗涤，以含1％脱脂奶粉的PBS封闭。加入上述培养孔上清液的病毒溶解液，37℃保温1小时，充分洗涤之后，先后加入抗P24单抗和生物素标记的抗小鼠抗体(Santa Cruz Biotech.，Santa Cruz，CA)。然后，依次加入SA-HRP和TMB。以1N硫酸终止反应，以ELISA仪(Ultra 384)阅读。
上述病毒感染的细胞再培养2天，每个细胞培养孔内加入50μl XTT溶液(1μg/ml)(PolySciences，Inc.，Warrington，PA)，于37℃保温4小时。可溶性细胞内甲臢化合物以酶标仪在450nm测定。
将加入和不加入被检化合物的HIV-1IIIB慢性感染的H9细胞(H9/HIV-1IIIB)，以钙荧光素AM(MolecularProbes，Inc.，Eugene，Oregon)标记，与MT-2细胞(H9/MT-2为1∶5)一起，在96孔培养板上于37℃保温2小时。然后，在倒置荧光显微镜下计数融合的和未融合的钙荧光素AM标记的HIV-1感染的细胞。
以Graphpad Prism 4软件分别计算出不同方法获得的鼠尾草多糖和鼠尾草多糖硫酸酯对HIV-1IIIB的抑制活性(IC50)。其结果如表1所示。以CPE(XTT)、P24测定和细胞-细胞融合技术测定得到的鼠尾草多糖硫酸酯抗HIV-1IIIB(X4病毒)的IC50的平均值±标准差分别为3.05±0.44、13.42±0.09、7.35±0.34μg/ml。以CPE(XTT)技术测定得到的鼠尾草多糖抗HIV-1IIIB(X4病毒)的IC50的平均值±标准差分别为6.17±1.34μg/ml，对病毒未感染细胞的半数细胞毒性CC50的均值±标准差为4315±56μg/ml，其SI值为699。
表1以P24抗原测定技术，XTT测定和细胞-细胞融合技术分别测定鼠尾草多糖和鼠尾草多糖硫酸酯对HIV-1IIIB(X4病毒)的抑制活性(IC50)。
| 化合物名称 | CPE(XTT)(μg/ml±SD) | p24测定(μg/ml±SD) | 细胞-细胞融合(μg/ml±SD) |
| 鼠尾草多糖硫酸酯鼠尾草多糖 | 3.05±0.446.17±1.34 | 13.42±0.09ND | 7.35±0.34ND |
注：ND：未测定。
实施例四鼠尾草多糖硫酸酯抗人单纯疱疹病毒(HSV)活性
按常规方法进行Vero细胞培养，HSV病毒培养以及HSV的最适感染复数的确定。将Vero细胞悬液加入24孔板(2-4×105细胞/well)，置37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，待细胞长成致密单层，铺满24孔板板底。加入滴定过的200μl病毒上清，使病毒稀释液和细胞单层充分接触，置37℃，5％CO2培养箱中孵育1小时；洗去培养上清，加入1ml未凝固的琼脂糖覆盖培养基和稀释好的待测样品。设阿昔洛韦(acyclovir，ACV)阳性及无化合物阴性对照。置37℃，5％CO2培养箱中培养。培养3天后，移出培养基，并每孔加入1ml 2％的甲醛以固定细胞。以龙胆紫染色，自来水洗涤3次，倒置晾干。在倒置显微镜下计数空斑，并进一步计算对HSV的抑制率。结果表明，ACV对HSV的IC50为0.15±0.04(M±SD)μg/ml，CC50(M±SD)为264±58.9μg/ml，选择指数为1760(表2)；鼠尾草多糖硫酸酯对HSV-I和II的IC50为85.6±0.85μg/ml，CC50(M±SD)为9420±66μg/ml，选择指数(SI)为110。提示鼠尾草多糖硫酸酯还具有抗单纯疱疹病毒活性。
表2.鼠尾草多糖硫酸酯对人单纯疱疹病毒I和II型的抑制作用
| 化合物 | HSV-I和II | ||
| IC50(M±SD)(μg/ml) | CC50(M±SD)(μg/ml) | SI | |
| ACV鼠尾草多糖硫酸酯 | 0.15±0.0485.6±0.85 | 264±58.99420±66 | 1760110 |
附图说明
图1鼠尾草多糖硫酸酯对TZM-b1细胞的毒性的剂量-反应曲线。
图2对HIV-1 Ba-L(R5病毒)的抑制活性的剂量-反应曲线。
Claims (8)
1、鼠尾草多糖，其特征是以鼠尾草植物(Salivia)，或鼠尾草经提取脂溶性有效成分或(和)水溶性酚酸类成份过程中的废弃物为原料经热水浸提、浓缩、乙醇沉淀、脱蛋白等公知方法处理而得鼠尾草多糖。
2、鼠尾草多糖酯(硫酸酯、磷酸酯、硝酸酯和醋酸酯)，其特征是以鼠尾草多糖为原料，经酯化、中和、2-4倍无水乙醇沉淀、蒸馏水溶解、然后用蒸馏水透析、减压蒸馏浓缩、2-4倍无水乙醇沉淀、真空干燥等公知方法处理即得本发明的鼠尾草多糖酯类化合物。
3、权利要求1所述鼠尾草多糖的特征组成：山梨醇40％-80％、鼠李糖15％-30％、半乳糖15％-30％。
4、权利要求1所述鼠尾草多糖的结构特征：通过1→6(或非还原末端)、1→4及1→3糖苷键连接。
5、权利要求1所述鼠尾草多糖在治疗或预防人艾滋病病毒或(和)单纯疱疹病毒感染的制剂中的应用。
6、权利要求1所述鼠尾草多糖的制剂，其特征是制备药物的制剂形式可选择口服制剂、注射制剂、外用制剂以及阴道和直肠用制剂。
7、权利要求2所述鼠尾草多糖酯(硫酸酯、磷酸酯、硝酸酯和醋酸酯)在治疗或预防人艾滋病病毒或(和)单纯疱疹病毒感染的制剂中的应用。
8、权利要求2所述鼠尾草多糖酯(硫酸酯、磷酸酯、硝酸酯和醋酸酯)的用途，其特征是制备药物的制剂形式可选择口服制剂、注射制剂、外用制剂以及阴道和直肠用制剂。
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