CN101074427A - 对鳞翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株及其杀虫基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明披露了对鳞翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株及其杀虫基因和应用，属于生物防治技术领域。本发明涉及一株具有多种高效杀虫基因的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，经PCR检测表明，它同时含有cry1Ac、cry1Ab、cry1C以及cry1V等多个基因。进一步，本发明涉及对鳞翅目高毒力的cry1Ac基因的核苷酸序列和其编码的蛋白质的氨基酸序列，同时还涉及包含此基因的穿梭表达载体pCA－1Ac及其构建方法。本发明通过将该序列应用于转化微生物和植物，从而表现出了对鳞翅目害虫的高毒性，克服或延迟了对工程菌和转基因植物抗药性的产生。

Description

对鳞翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株及其杀虫基因和应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体的，本发明涉及一株含有多种cry基因的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，它至少具有cry1Ac、cry1Ab、cry1C以及cryV重要杀虫基因的优良组合，对农业生产中的一些主要害虫，特别是蔬菜、棉花、玉米、水稻、以及森林等鳞翅目害虫具有较高的活性。进一步，本发明涉及对鳞翅目有高毒力的Bt cry1Ac基因的核苷酸序列和其编码的蛋白质氨基酸序列，涉及在植物中表达的穿梭表达载体pCA-1Ac。

背景技术

在农业生产过程中，虫害是造成农业生产损失的一个重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。为了减少这些损失，普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来(Adang M.J et al，Characterized full-length and truncated plasmid clones of the crystalprotein of Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sexta，Gene，1985，36(3)：289～300.)，人们已经分离克隆了300多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N，Zeigler D R，Feitelson J，et al.Revision of the nomenclature for the Bacillusthuringiensis pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev，1998，62：807-813；http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。其中cry1类是一群同源性较高的基因，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，对鳞翅目害虫有特异毒性，并且许多基因目前已被广泛应用于植物的抗虫基因工程研究中，转基因植物已获得较好的抗虫性(Kozie M G，Beland G L，Bowman C，et al.Field performance of elite transgenic maizeplants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis.Bio/Technology，1993，11：194-200；Perlak FJ，Deaton R W，Armstrong T A，et al.Insect resistant cotton plants.bio/technology，1990；8：939-943；黄其満，毛立群，黄卫红等，转人工GFM cry1A基因烟草表现明显杀虫活性。植物学报，1998，40：228-233)。Cry1Ac基因最初由Adang MJ和Staver MJ等人克隆，他们发现苏云金芽孢杆菌菌株HD-73产生的晶体蛋白对鳞翅目幼虫有极高的毒力，并将编码此晶体蛋白的基因从75kD的质粒上分离克隆出来。由于cry1Ac基因编码的晶体蛋白对鳞翅目中的粉纹夜蛾、烟芽夜蛾以及棉铃虫的毒力是最高的，所以有不少实验室都在对其进行研究。孙明、吴岚等人于1995年从菌株218中克隆了我国第一个cry1Ac基因，被国际命名委员会命名为cry1Ac10(孙明等，苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry218的克隆和表达，农业生物技术学报，1996)。1996年郭三堆等人将人工合成的调控序列和cry1Ac基因成功地导入多个棉花栽培品种，使我国成为国际上第二个独立开发成功转基因抗虫棉并获得知识产权的国家(崔洪志，郭三堆，中国农业科学，1996，29(1)：93)。多年来，有关高毒力和新型杀虫活性的cry基因的开发和研究一直是国内外对Bt基因研究和利用的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种对农业生产中的一些主要害虫，特别是蔬菜、棉花、玉米、水稻、以及森林等鳞翅目害虫具有较高毒力的苏云金芽孢杆菌Rpp02，以及来自于菌株Rpp02中的cry1Ac基因的序列及其编码的氨基酸序列，并将此序列用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性。

本发明的目的是通过实施如下的技术方案来实现的：

1.含有多种cry基因的苏云金芽孢杆菌的筛选与鉴定

本发明自行分离了Bt菌株Rpp02，土壤采自四川省成都温江地区。采用醋酸钠-抗生素分离法，称取10g土样放入装有50ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400μg/ml，摇床培养(200r/min，30℃)4h。培养结束后取土壤悬液10ml，加入无菌的离心管3000r/min离心15min，取上层混浊液2ml于65℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1ml涂平板，将平板置30℃培养箱中培养。48h后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片。发现一株含有菱形晶体形态的Bt菌株。该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)，苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种RPP02，已于2006年9月5日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 206086。经用光学显微镜和电子显微镜观察，该菌株细胞呈杆状，两端钝圆，菌株大小为0.9-1.1μm×2.7-4.0μm，通常单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体，孢子囊不膨大。革兰氏染色为阳性(G+)，抗酸染色为阴性。

2.菌株Rpp02中cry基因的鉴定

根据cry1类基因保守序列设计几对特异引物：

cry1Ab：5’-CGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTG-3’

        5’-GAGCCAAGATTAGTAGATTTTGTTAA-3’

cry1Ac：5’-ATCACTGAGTCGGTTCGCATGTTTGACTTTATC-3’

        5’-TCACTTCCCATCGACATCTACC-3’

cry1C：5’-CCACAGTTACACTCTGTAGCTC-3’

       5’-CACTTAATCCTGTGACGCCT-3’

根据cryV类基因设计一对通用引物：

cryV：5’-ATGAAACTAAAGAATCAAGA-3’

      5’-ACCTGTGCTATACAATTTCA-3’

用下列PCR反应体系鉴定：

10×buffer          2.5ul

MgCl₂(25mM)         1.5ul

Taq酶               0.2ul

dNTPs(2.5mM)        2ul

引物                2ul

模板                5ul

最终反应体积        25ul

热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火温度根据引物而定，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃停止反应。扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。

3.菌株Rpp02中cry1Ac基因的克隆

采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株Rpp02的总DNA，根据Genbank中cry1Ac的序列，设计其全长基因引物P1、P2(引物序列如下)，以菌株Rpp02总DNA为模板，扩增cry1Ac全长基因，得到长约4kb的片断，将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，转化，筛选到1个阳性克隆pGF10，经测序，得到序列SEQ ID NO1。

P1：5’AACCTGAGTTTGCATGAGAC3’

P2：5’ATAATGGGCGAGAAGTAAGT3’

4.cry1Ac基因的序列分析

序列SEQ ID NO1的全长为3734bp，分析表明，其含有一个较大的开放阅读框ORF，位置是181-3714，GC含量为39.3％，编码1177个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。在softberry网站采用bacterial sigma7.0 promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列。该基因序列与已报道的cry1Ac序列同源性皆高达99％，彼此之间仅存在着少数几个核苷酸以及编码氨基酸的差别，被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ac20。本发明进一步分析了cry1Ac20蛋白的氨基酸组成(见表1)。

           表1  cry1Ac20蛋白的氨基酸组成

氨基酸	百分比％	氨基酸	百分比％
				Ala(A)：	5.6	Met(M)：	0.8
Cys(C)：	1.4	Asn(N)：	7.1
				Asp(D)：	5.2	Pro(P)：	4.5
Glu(E)：	7.7	Gln(Q)：	3.8
				Phe(F)：	4.5	Arg(R)：	6.2
Gly(G)：	7.0	Ser(S)：	7.8
				His(H)：	1.9	Thr(T)：	5.8
Ile(I)：	6.2	Val(V)：	7.1
				Lys(K)：	2.9	Trp(W)：	1.6
Leu(L)：	8.0	Tyr(Y)：	4.8

5.cry1Ac20基因的表达

将重组菌株DHF10在液体LB培养基(含60μg/ml氨苄青霉素)中37℃ 200r/min振荡培养过夜，收集培养物，离心获得菌体，加入10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)重悬，超声波破碎15min，离心收集沉淀，再用1/10体积的Na₂CO₃(50mmol/L，pH9.5)溶解，按常规SDS-PAGE方法检测表达产物。

6.cry1Ac20蛋白的活性检测

将重组菌株DHF10在液体LB培养基(含60μg/ml氨苄青霉素)中37℃ 200r/min振荡培养3d；选老嫩适中的卷心菜叶片洗净，晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm²大小，分放在菌液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB浸泡叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；选放健康的2-3龄菜青虫试虫30头，重复3次，置室内，于1、2d后调查幼虫死亡情况，并计算其死亡率及校正死亡率。校正死亡率＝(试验组死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率)。结果见表2，表明工程菌株对菜青虫具有极高的毒杀活性。

                 表2  工程菌DHF10对菜青虫的室内杀虫活性(48h)

样品	处理(稀释倍数)	重复	总虫数	死虫数	死亡率	校正死亡率(％)
							对照	1x10x	33	9090	10	1.110	//
DHF10	1x10x	33	9090	8075	88.8983.33	88.7883.33

7.cry1Ac20基因植物表达载体的构建

本发明进一步根据克隆的cry1Ac基因全长序列，设计了在真核生物中表达此基因的引物P5和P6(引物序列如下)，引物P5和P6分别引入酶切位点Bgl II和Bst II，以质粒pGEM-F10为模板扩增，得到目的片断。再以pCAMBIA1301为骨架，用限制性内切酶Bgl II和BstE II双酶切将载体pCAMBIA1301上的GUS基因切除，再与相同双酶切后的目的片断连接，利用pCAMBIA1301上GUS基因的启动子启动目的基因的表达，构建了cry1Ac基因的遗传转化载体pCA-1Ac。

P5：5’AGT  AGATCT(Bgl II)TTAACACCCTGGGTCA3’

P6：5’GTG  GGTAACC(BstE II)TGAGTTTGCATGAGA3’

菌种保藏信息：

菌种名称：芽孢杆菌属、苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种RPP02

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏日期：2006年9月5日

保藏编号：CCTCC NO：M 206086

附图说明

图1为Rpp02菌株的菱形伴孢晶体、芽孢及营养细胞(2500×)；

图2为Rpp02菌株的营养细胞及稀疏的鞭毛(15000×)；

图3为Rpp02菌株中cry基因型的PCR鉴定，其中：

M为DNA Marker DL2,000

1为cry1Ab扩增产物

2为cry1C扩增产物

3为cryV扩增产物

4为cry1Ac扩增产物；

图4为重组质粒pGF10的PCR扩增产物，其中：

M为DNA分子量标准，

1为cry1Ac PCR产物，

2为ck；

图5为重组菌株DHF10的SDS-PAGE分析，其中：

M为Molecular weight marker

1为E.coli.DH5α without plasmid

2为DHF10 with pGF10；

图6为重组质粒pCA-1Ac的PCR扩增产物和酶切分析，其中：

M为λ-Hind III DNA Marker

1为cry1Ac PCR扩增产物

2为pCA-1Ac-Bgl II/BstE II

3为pCAMBIA1301-Bgl II/BstE II。

具体实施方式

实施例1 含有多种cry基因的苏云金芽孢杆菌的筛选与鉴定

土壤采自四川省成都温江地区。采用醋酸钠-抗生素分离法，称取10g土样放入装有50ml醋酸钠培养基的摇瓶中，分别加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素各400μg/ml，摇床培养(200r/min，30℃)4h。培养结束后取土壤悬液10ml，加入无菌的离心管3000r/min离心15min，取上层混浊液2ml于65℃水浴15min，取热处理后的混浊液0.1ml涂平板，将平板置30℃培养箱中培养。48h后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片。发现一株含有菱形晶体形态的Bt菌株(见附图1)。经用光学显微镜和电子显微镜观察，该菌株细胞呈杆状，两端钝圆，菌株大小为0.9-1.1μm×2.7-4.0μm，通常单个、或两个、或短链细胞存在，一个营养细胞为一个孢子囊，每个孢子囊内含有一个芽孢，次端生，另一端有一个伴孢晶体，孢子囊不膨大。革兰氏染色为阳性(G+)，抗酸染色为阴性(见附图2)。

实施例2 菌株Rpp02中cry基因的鉴定

根据cry1类基因保守序列设计几对特异引物：

cry1Ab：5’-CGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTG-3’

        5’-GAGCCAAGATTAGTAGATTTTGTTAA-3’

cry1Ac：5’ATCACTGAGTCGGTTCGCATGTTTGACTTTATC-3’

        5’-TCACTTCCCATCGACATCTACC-3’

cry1C：5’-CCACAGTTACACTCTGTAGCTC-3’

       5’-CACTTAATCCTGTGACGCCT-3’

根据cryV类基因设计一对通用引物：

cryV：5’-ATGAAACTAAAGAATCAAGA-3’

      5’-ACCTGTGCTATACAATTTCA-3’

用下列PCR反应体系鉴定：

10×buffer          2.5ul

MgCl₂(25mM)         1.5ul

Taq酶               0.2ul

dNTPs(2.5mM)        2ul

引物                2ul

模板                5ul

最终反应体积        25ul

热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火温度根据引物而定，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃停止反应。扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果(见附图3)。

实施例3 菌株Rpp02中cry1Ac基因的克隆

采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株Rpp02的总DNA，根据Genbank中cry1Ac的序列，设计其全长基因的引物P1和P2(引物序列如下)，以菌株Rpp02总DNA为模板，扩增cry1Ac全长基因，得到长约4k的片断，将纯化后的PCR产物与pGEM-T载体连接，转化，筛选到1个阳性克隆pGF10(见附图4)，经测序，得到SEQ ID NO1，该序列的全长为3734bp，分析表明，含有一个较大的开放阅读框ORF，其位置是181-3714，GC含量为39.3％，编码1177个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列的组成如SEQ ID NO2所示。在softberry网站采用bacterial sigma7.0 promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列。该基因序列与已报道的cry1Ac序列同源性皆高达99％，彼此之间仅存在着少数几个核苷酸以及编码氨基酸的差别，被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ac20。本发明进一步分析了此蛋白的氨基酸组成(见表1)，得知其分子量为133.144kDa，等电点为pH4.952。

P1：5’AACCTGAGTTTGCATGAGAC3’

P2：5’ATAATGGGCGAGAAGTAAGT3’，

实施例4 cry1Ac20基因的表达

将重组菌株DHF10在液体LB培养基(含60μg/ml氨苄青霉素)中37℃ 200r/min振荡培养过夜，收集培养物，离心获得菌体，加入10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)重悬，超声波破碎15min，离心收集沉淀，再用1/10体积的Na₂CO₃(50mmol/L，pH9.5)溶解，按常规SDS-PAGE方法检测表达产物(见附图5)。

实施例5 cry1Ac20蛋白的活性检测

将重组菌株DHF10在液体LB培养基(含60μg/ml氨苄青霉素)中37℃ 200r/min振荡培养3d；选老嫩适中的卷心菜叶片洗净，晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm²大小，分放在菌液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB浸泡叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；选放健康的2-3龄菜青虫试虫30头，重复3次，置室内，于1、2d后调查幼虫死亡情况，并计算其死亡率及校正死亡率。校正死亡率＝(试验组死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率)。结果见表2，表明工程菌株对菜青虫具有极高的毒杀活性。

实施例6 cry1Ac20基因植物表达载体的构建

本发明进一步根据克隆的cry1Ac基因全长序列，设计了在真核生物中表达此基因的引物p3和p4(引物序列如下)，引物p3和p4分别引入酶切位点Bgl II和BstE II，以质粒pGEM-F10为模板扩增，得到目的片断。再以pCAMBIA1301为骨架，用限制性内切酶Bgl II和BstE II双酶切将载体pCAMBIA1301上的GUS基因切除，再与相同双酶切后的目的片断连接，利用pCAMBIA1301上GUS基因的启动子启动目的基因的表达，构建了cry1Ac基因的遗传转化载体pCA-1Ac(见附图6)。

P5：5’AGT  AGATCT(Bgl II)TTAACACCCTGGGTCA3’

P6：5’GTG  GGTAACC(BstE II)TGAGTTTGCATGAGA3’

                             序列表

<110>李平  谭芙蓉  郑爱萍

<120>对鳞翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株及其杀虫基因和应用

<140>200610022151.2

<141>2006-10-31

<160>2

<170>PatentIn 3.1

<210>1

<211>3734

<212>DNA

<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<220>

<221>CDS

<222>(181)...(3714)

<400>1

ataatgggcg agaagtaagt agattgttaa caccctgggt caaaaattga tatttagtaa   60

aattagttgc actttgtgca tttt ttcata agatgagtca tatg ttttaa attgtagtaa120

                          -35box                  -10box

tgaaaaacag tattatatca taatgaattg gtatcttaat aaaagagatg gaggtaactt  180

atggataaca atccgaacac caatgaatgc attccttata attgtttaag taaccctgaa 240

ORF →

gtagaagtat taggtggaga aagaatagaa actggttaca ccccaatcga tatttccttg  300

tcgctaacgc aatttctttt gagtgaattt gttcccggtg ctggatttgt gttaggacta  360

gttgatataa tatggggaat ttttggtccc tctcaatggg acgcatttct tgtacaaatt  420

gaacagttaa ttaaccaaag aatagaagaa ttcgctagga accaagccat ttctagatta  480

gaaggactaa gcaatcttta tcaaatttac gcagaatctt ttagagagtg ggaagcagat  540

cctactaatc cagcattaag agaagagatg cgtattcaat tcaatgacat gaacagtgcc  600

cttacaaccg ctattcctct tttggcagtt caaaattatc aagttcctct tttatcagta  660

tatgttcaag ctgcaaattt acatttatca gttttgagag atgtttcagt gtttggacaa  720

aggtggggat ttgatgccgc gactatcaat agtcgttata atgatttaac taggcttatt   780

ggcaactata cagattatgc tgtacgctgg tacaatacgg gattagaacg tgtatgggga   840

ccggattcta gagattgggt aaggtataat caatttagaa gagaattaac actaactgta   900

ttagatatcg ttgctctgtt cccgaattat gatagtagaa gatatccaat tcgaacagtt   960

tcccaattaa caagagaaat ttatacaaac ccagtattag aaaattttga tggtagtttt  1020

cgaggctcgg ctcagggcat agaaagaagt attaggagtc cacatttgat ggatatactt  1080

aacagtataa ccatctatac ggatgctcat aggggttatt attattggtc agggcatcaa  1140

ataatggctt ctcctgtcgg tttttcgggg ccagaattca cgtttccgct atatggaacc  1200

atgggaaatg cagctccaca acaacgtatt gttgctcaac taggtcaggg cgtgtataga  1260

acattatcct ctacttttta tagaagacct tttaatatag ggataaataa tcaacaacta  1320

tctgttcttg acgggacaga atttgcttat ggaacctcct caaatttgcc atccgctgta  1380

tacagaaaaa gcggaacggt agattcgctg gacgaaatac caccacagaa taacaacgtg  1440

ccacctaggc aaggatttag tcatcgatta agccatgttt caatgtttcg ttcaggctct  1500

agtagtagtg taagtataat aagagctcct atgttctctt ggatacatcg tagtgctgaa  1560

tttaataata taattgcatc ggatagtatt actcaaatcc ctgcagtgaa gggaaacttt  1620

ctttttaatg gttctgtaat ttcaggacca ggatttactg gtggggactt agttagatta  1680

aatagtagtg agaataacat tcagaataga gggtatattg aagttccaat tcacttccca  1740

tcgacatcta ccagatatcg agttcgtgta cggtatgctt ctgtaacccc gattcacctc  1800

aacgttaatt ggggtaattc atccattttt tccaatacag taccagctac agctacgtca  1860

ttagataatc tacaatcaag tgattttggt tattttgaaa gtgccaatgc ttttacatct  1920

tcattaggta atatagtagg tgttagaaat tttagtggga ctgcaggagt gataatagac  1980

agatttgaat ttattccagt tactgcaaca ctcgaggctg aatataatct ggaaagagcg  2040

cagaaggcgg tgaatgcgct gtttacgtct acaaaccaac tagggctaaa aacaaatgta  2100

acggattatc atattgatca agtgtccaat ttagttacgt atttatcgga tgaattttgt  2160

ctggatgaaa agcgagaatt gtccgagaaa gtcaaacatg cgaagcgact cagtgatgaa  2220

cgcaatttac tccaagattc aaatttcaaa gacattaata ggcaaccaga acgtgggtgg  2280

ggcggaagta cagggattac catccaagga ggggatgacg tatttaaaga aaattacgtc  2340

acactatcag gtacctttga tgagtgctat ccaacatatt tgtatcaaaa aatcgatgaa  2400

tcaaaattaa aagcctttac ccgttatcaa ttaagagggt atatcgaaga tagtcaagac  2460

ttagaaatct atttaatccg ctacaatgca aaacatgaaa cagtaaatgt gccaggtacg  2520

ggttccttat ggccgctttc agcccaaagt ccaatcggaa agtgtggaga gccgaatcga  2580

tgcgcgccac accttgaatg gaatcctgac ttagattgtt cgtgtaggga tggagaaaag  2640

tgtgcccatc attcgcatca tttctcctta gacattgatg taggatgtac agacttaaat  2700

gaggacctag gtgtatgggt gatctttaag attaagacgc aagatgggca cgcaagacta  2760

gggaatctag agtttctcga agagaaacca ttagtaggag aagcgctagc tcgtgtgaaa  2820

agagcggaga aaaaatggag agacaaacgt gaaaaattgg aatgggaaac aaatatcgtt  2880

tataaagagg caaaagaatc tgtagatgct ttatttgtaa actctcaata tgatcaatta  2940

caagcggata cgaatattgc catgattcat gcggcagata aacgtgttca tagcattcga  3000

gaagcttatc tgcctgagct gtctgtgatt ccgggtgtca atgcggctat ttttgaagaa  3060

ttagaagggc gtattttcac tgcattctcc ctatatgatg cgagaaatgt cattaaaaat  3120

ggtgatttta ataatggctt atcctgctgg aacgtgaaag ggcatgtaga tgtagaagaa  3180

caaaacaacc aacgttcggt ccttgttgtt ccggaatggg aagcagaagt gtcacaagaa  3240

gttcgtgtct gtccgggtcg tggctatatc cttcgtgtca cagcgtacaa ggagggatat  3300

ggagaaggtt gcgtaaccat tcatgagatc gagaacaata cagacgaact gaagtttagc  3360

aactgcgtag aagaggaaat ctatccaaat aacacggtaa cgtgtaatga ttatactgta  3420

aatcaagaag aatacggagg tgcgtacact tctcgtaatc gaggatataa cgaagctcct  3480

tccgtaccag ctgattatgc gtcagtctat gaagaaaaat cgtatacaga tggacgaaga  3540

gagaatcctt gtgaatttaa cagagggtat agggattaca cgccactacc agttggttat  3600

gtgacaaaag aattagaata cttcccagaa accgataagg tatggattga gattggagaa  3660

acggaaggaa catttatcgt ggacagcgtg gaattactcc ttatggagga a tagtctcat 3720

                                                        End codon

gcaaactcag gtta                                                    3734

<210>2

<211>1177

<212>PRT

<213>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400>2

Met Asp Asn Asn Pro Asn Thr Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys

1                5                  10                  15

Leu Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu

                20                  25                  30

Thr Gly Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe

                35                  40                  45

Leu Leu Ser Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu

                50                  55                  60

Val Asp Ile Ile Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala

                65                  70                  75

Phe Leu Val Gln Ile Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu

                80                  85                  90

Phe Ala Arg Asn Gln Ala Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn

                95                  100                 105

Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp

                110                 115                 120

Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn

                125                 130                 135

Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala Ile Pro Leu Leu Ala Val

                140                 145                 150

Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val Gln Ala Ala

                155                 160                 165

Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser Val Phe Gly Gln

                170                 175                 180

Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg Tyr Asn Asp

                185                 190                 195

Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp Tyr Ala Val Arg Trp

                200                 205                 210

Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg Asp

                215                 220                 225

Trp Val Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

                230                 235                 240

Leu Asp Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Arg Tyr

                245                 250                 255

Pro Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn

                260                 265                 270

Pro Val Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln

                275                 280                 285

Gly Ile Glu Arg Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu

                290                 295                 300

Asn Ser Ile Thr Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Tyr Tyr Tyr

                305                 310                 315

Trp Ser Gly His Gln Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly

                320                 325                 330

Pro Glu Phe Thr Phe Pro Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala

                335                 340                 345

Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg

                350                 355                 360

Thr Leu Ser Ser Thr Phe Tyr Arg Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile

                365                 370                 375

Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp Gly Thr Glu Phe Ala Tyr

                380                 385                 390

Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val Tyr Arg Lys Ser Gly

                395                 400                 405

Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asn Asn Asn Val

                410                 415                 420

Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His Val Ser Met

                425                 430                 435

Phe Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Val Ser Ile Ile Arg Ala Pro

                440                 445                 450

Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Ile

                455                 460                 465

Ala Ser Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Ala Val Lys Gly Asn Phe

                470                 475                 480

Leu Phe Asn Gly Ser Val Ile Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly

                485                 490                 495

Asp Leu Val Arg Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ile Gln Asn Arg

                500                 505                 510

Gly Tyr Ile Glu Val Pro Ile His Phe Pro Ser Thr Ser Thr Arg

                515                 520                 525

Tyr Arg Val Arg Val Arg Tyr Ala Ser Val Thr Pro Ile His Leu

                530                 535                 540

Asn Val Asn Trp Gly Asn Ser Ser Ile Phe Ser Asn Thr Val Pro

                545                 550                 555

Ala Thr Ala Thr Ser Leu Asp Asn Leu Gln Ser Ser Asp Phe Gly

                560                 565                 570

Tyr Phe Glu Ser Ala Asn Ala Phe Thr Ser Ser Leu Gly Asn Ile

                575                 580                 585

Val Gly Val Arg Asn Phe Ser Gly Thr Ala Gly Val Ile Ile Asp

                590                 595                 600

Arg Phe Glu Phe Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu Ala Glu Tyr

                605                 610                 615

Asn Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser

                620                 625                 630

Thr Asn Gln Leu Gly Leu Lys Thr Asn Val Thr Asp Tyr His Ile

                635                 640                 645

Asp Gln Val Ser Asn Leu Val Thr Tyr Leu Ser Asp Glu Phe Cys

                650                 655                 660

Leu Asp Glu Lys Arg Glu Leu Ser Glu Lys Val Lys His Ala Lys

                665                 670                 675

Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln Asp Ser Asn Phe Lys

                680                 685                 690

Asp Ile Asn Arg Gln Pro Glu Arg Gly Trp Gly Gly Ser Thr Gly

                695                 700                 705

Ile Thr Ile Gln Gly Gly Asp Asp Val Phe Lys Glu Asn Tyr Val

                710                 715                 720

Thr Leu Ser Gly Thr Phe Asp Glu Cys Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr

                725                 730                 735

Gln Lys Ile Asp Glu Ser Lys Leu Lys Ala Phe Thr Arg Tyr Gln

                740                 745                 750

Leu Arg Gly Tyr Ile Glu Asp Ser Gln Asp Leu Glu Ile Tyr Leu

                755                 760                 765

Ile Arg Tyr Asn Ala Lys His Glu Thr Val Asn Val Pro Gly Thr

                770                 775                 780

Gly Ser Leu Trp Pro Leu Ser Ala Gln Ser Pro Ile Gly Lys Cys

                785                 790                 795

Gly Glu Pro Asn Arg Cys Ala Pro His Leu Glu Trp Asn Pro Asp

                800                 805                 810

Leu Asp Cys Ser Cys Arg Asp Gly Glu Lys Cys Ala His His Ser

                815                 820                 825

His His Phe Ser Leu Asp Ile Asp Val Gly Cys Thr Asp Leu Asn

                830                 835                 840

Glu Asp Leu Gly Val Trp Val Ile Phe Lys Ile Lys Thr Gln Asp

                845                 850                 855

Gly His Ala Arg Leu Gly Asn Leu Glu Phe Leu Glu Glu Lys Pro

                860                 865                 870

Leu Val Gly Glu Ala Leu Ala Arg Val Lys Arg Ala Glu Lys Lys

                875                 880                 885

Trp Arg Asp Lys Arg Glu Lys Leu Glu Trp Glu Thr Asn Ile Val

                890                 895                 900

Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Val Asp Ala Leu Phe Val Asn Ser

                905                 910                 915

Gln Tyr Asp Gln Leu Gln Ala Asp Thr Asn Ile Ala Met Ile His

                920                 925                 930

Ala Ala Asp Lys Arg Val His Ser Ile Arg Glu Ala Tyr Leu Pro

                935                 940                 945

Glu Leu Ser Val Ile Pro Gly Val Asn Ala Ala Ile Phe Glu Glu

                950                 955                 960

Leu Glu Gly Arg Ile Phe Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg

                965                 970                 975

Asn Val Ile Lys Asn Gly Asp Phe Asn Asn Gly Leu Ser Cys Trp

                980                 985                 990

Asn Val Lys Gly His Val Asp Val Glu Glu Gln Asn Asn Gln Arg

                995                 1000                1005

Ser Val Leu Val Val Pro Glu Trp Glu Ala Glu Val Ser Gln Glu

               1010                1015                1020

Val Arg Val Cys Pro Gly Arg Gly Tyr Ile Leu Arg Val Thr Ala

               1025                1030                1035

Tyr Lys Glu Gly Tyr Gly Glu Gly Cys Val Thr Ile His Glu Ile

               1040                1045                1050

Glu Asn Asn Thr Asp Glu Leu Lys Phe Ser Asn Cys Val Glu Glu

               1055                1060                1065

Glu Ile Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys Asn Asp Tyr Thr Val

               1070                1075                1080

Asn Gln Glu Glu Tyr Gly Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Asn Arg Gly

               1085                1090                1095

Tyr Asn Glu Ala Pro Ser Val Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Val Tyr

               1100                1105                1110

Glu Glu Lys Ser Tyr Thr Asp Gly Arg Arg Glu Asn Pro Cys Glu

               1115                1120                1125

Phe Asn Arg Gly Tyr Arg Asp Tyr Thr Pro Leu Pro Val Gly Tyr

               1130                1135                1140

Val Thr Lys Glu Leu Glu Tyr Phe Pro Glu Thr Asp Lys Val Trp

               1145                1150                1155

Ile Glu Ile Gly Glu Thr Glu Gly Thr Phe Ile Val Asp Ser Val

               1160                1165                1170

Glu Leu Leu Leu Met Glu Glu

               1175     1177

Claims (6)

1、一种对鳞翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，其保藏编号为CCTCC NO：M 206086。

2、如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，其特征在于该菌株至少具有cry1Ac、cry1Ab、cry1C以及cryV杀虫基因组合。

3、如权利要求1或2所述的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，其特征在于从中分离克隆的cry1Ac基因包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。

4、如权利要求3所述的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，其特征在于所述cry1Ac基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。

5、如权利要求3所述的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02，其特征在于构建的用于植物转基因的穿梭表达载体pCA-1Ac含有所述cry1Ac基因的核苷酸序列。

6、如权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株Rpp02在防治蔬菜、棉花、玉米、水稻以及森林鳞翅目害虫中的应用。

Images