CN101070547A - 主动运载外源基因的重组蛋白载体PEAⅡ－HPhA及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了主动运载外源基因的重组蛋白载体核心区PEAⅡ－HphA及制备方法和应用，还公开了主动运载外源基因的重组蛋白载体核心基因片段PEAⅡ－HphA；主动运载外源基因的重组蛋白载体是由导向分子－PEA毒素跨膜转位区PEAⅡ－超嗜热古菌组蛋白HphA组成的蛋白；在导向分子的引导下，载体与靶细胞上的受体特异性结合体现了其靶向性，在受体介导下通过PEA Ⅱ跨膜转运主动进入细胞内的内吞作用穿越细胞膜，体现了其主动性，有效地提高了基因转运效率。HphA结合DNA能力强，可以与外源基因组成复合物，在载体的主动转运过程中，使外源基因到达核区，增加其表达效率，对细胞无毒性，更安全；优于传统的病毒载体和脂质体，能广泛地应用在基因治疗及转基因动物的研究上。

Description

主动运载外源基因的重组蛋白载体PEAⅡ－HPhA及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及主动运载外源基因的重组蛋白载体及其制备方法和药物的用途。

背景技术

基因治疗是二十世纪九十年代发展起来的一种全新的疾病治疗模式。其定义比较广泛，从广义地说，基因治疗是应用基因或基因产物，治疗疾病的一种方法。从狭义地说，基因治疗是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，改善疾病的一种治疗手段。基因治疗是一种根本性的治疗，它可以通过取代突变的致病基因，也可以通过改变病变细胞的基因结构，或者通过导入基因能增强人体免疫能力等方式，来达到治疗的目的。与传统的药物治疗相比，以上这些措施，都是从根本上对疾病进行控制。1990年，美国国立卫生研究院实施了第一例人类基因治疗，对两例ADA缺乏症的女性患儿进行了ADA基因转移，从此开创了人类基因治疗的先河。10多年来，基因治疗的发展历史曲折，虽然有成功的报道，但从总体上看，仍处于试验阶段，尚未达到理想的疗效。

基因治疗主要有体外和体内两种途径。体外途径指通过选择适当的靶细胞，在体外进行基因转移，筛选可表达外源基因的细胞，再将这些细胞转移至体内。这是基因治疗前期最常用的方法，其优点在于可将细胞移植回体内前，可以对细胞进行检查和优化，易于操作；而且细胞在扩增过程中，对外源的添加物质大量稀释，易于清除；同时，人体细胞，尤其是自体细胞，加工后应用于人体自身，易于解决安全性问题。但该方法仅局限于可移植细胞，如淋巴细胞和骨髓细胞等，同时仍需对可能发生的免疫反应进行检查。该方法的另一缺陷是面临着如何长期保持移植细胞功效的问题及细胞移植回体内后其基因表达关闭，必需开发和寻找合适的启动子。另外，这种方法在工业化方面，载体系统不易形成规模，而且必须有固定的临床基地。

体内途径则是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接的将治疗基因导入患者体内。这种方式的导入，无疑有利于大规模工业化生产。但是，对这种方式导入的治疗基因及其载体必须证明安全性，而且导入人体内后必须能够进入靶细胞，有效地表达并达到治疗目的。因此，在技术上要求很高，其难度明显高于体外途径。目前，对其研究日益增多，可能将成为基因治疗最有前途的方法。

基因治疗步骤：(1)选择治疗基因；主要是依据病因和发病学选定，对于某一种疾病治疗基因可以有多种，可通过优化组合来确定，这将有赖于人类基因组计划，尤其是功能基因组学的发展。(2)选择治疗基因导入系统(包括基因转移载体和基因导入途径)；是基因治疗的核心技术，是基因治疗是否能够进入临床和获得疗效的关键，因而始终是基因治疗的重点和难点。(3)治疗基因的表达。

载体的选择十分重要，它决定基因转移后基因表达的靶向性、有效性、表达的持续时间以及转导的细胞类型。目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性。事实上，自1995年以来，全世界基因治疗领域的科学家们在改善基因导入系统和载体方面作了大量的努力，新思路、新技术和新方法层出不穷。目前，在基因导入载体方面出现了两大主流：一是病毒载体系统；二是非病毒载体系统。

病毒载体充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性，已被广泛而有效地得到了应用。但是病毒载体存在许多不足，主要体现在无靶向性、免疫原性高、毒性大、目的基因容量小等。

非病毒载体由于在不同的实验与治疗方面，非病毒载体系统表现出多种潜在的优越性，越来越多的实验室选择非病毒载体基因转移系统作为研究方向。将非病毒载体大体分为两种，物理方法和化学方法。

介导质粒DNA转染的物理方法包括：裸DNA介导的基因转移和基因枪。

裸DNA是最简单的一种基因治疗形式。它是由编码生物活性物质的基因及作为其载体的质粒组成。1990年，Wolff JA等人发现，当将纯化的质粒DNA直接注射到小鼠骨骼肌细胞中后，该基因能够表达，并且在接种两个月后，编码的酶仍然具有生物学活性。这是人们首次发现DNA免疫现象。自此，许多人致力于开发将可编码蛋白抗原的质粒直接导入动物组织，诱导动物的免疫系统对所表达的蛋白质产生体液免疫或细胞免疫，这也就是我们常说的基因疫苗。除了导入编码蛋白质抗原的基因外，也可以导入编码其他具有药理活性的基因分子，如表达促红细胞生成素(EPO)，以用于恶性肿瘤的治疗。裸DNA在体外不能转染细胞，但在体内原位注射时(尤其是肌肉和皮肤)，它能有较高的转染效率。但至今人们对裸DNA到底是如何转染细胞，在体内发挥机制的具体过程仍不清楚。但人们发现，当向小鼠门静脉或尾静脉以较大体积注射入质粒时，能引起较高效率表达，这为我们利用裸鼠研究基因功能提供了一种简单手段。裸DNA作为基因载体的优点是可利用细菌比较廉价地大量生产带有药物基因的质粒。但其稳定性和转染效率均不高，也很难有靶向性。

基因枪是指将质粒DNA包被在金微粒子表面，利用高压氦粒子流装置的仪器将DNA加速，有效地将DNA带入靶组织。这种装置可将DNA直接打入细胞核内，可避免药物DNA被酶降解。Degano等人研究表明，几十纳克的DNA即可获得较强烈的免疫应答。其缺点是操作较复杂，对设备有特殊要求。且基因枪仅使金属颗粒深入组织中几毫米，限制其应用。

电穿孔法是指在电流刺激下，细胞膜瞬时出现孔洞，从而使DNA进入细胞。应用电穿孔进行体外DNA的转染研究已经有许多年了，最初只是将其用作一种实验手段，用于真核细胞或细菌的转化实验，后来被用于基因治疗，实验证实这种方法可提高DNA对小鼠皮肤细胞及肿瘤细胞的转染效率。

介导质粒DNA转染的化学方法包括：阳离子脂质体介导的基因转移、用合成或天然的物质与DNA结合、纳米控释系统。

阳离子脂质体作为基因治疗的载体是目前研究的热点之一，其转染率比pH敏感脂质体高了150倍。自1987年，Felgner等人首次报道了阳离子脂质体可介导基因的体外转染。其后，人们做了大量工作来研究阳离子脂质体作为基因载体。阳离子脂质体本身带有正电荷，可以与带有负电荷的质粒DNA通过静电作用紧密结合，形成脂质体与DNA的复合物，其可保护DNA不受DNA酶降解。研究表明，阳离子脂质体可以包裹任意大小的DNA，现已成为将外源基因导入真核细胞的常规载体。脂质体已经有商品化产品，其中以Lipofection公司的产品最为著名。脂质体与DNA的复合物进入细胞及在胞内发挥作用的机制也是近年来研究的热点。研究发现，细胞表面的蛋白聚糖(PGs)对复合物进入细胞起重要作用，因为合成PGs缺陷的细胞难于转染。另外，在脂质体与DNA的复合物上加入配基或加入有助于融合的脂，如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，也可提高其转染效率。阳离子脂质体易于大量制备，不自我复制，且对它的不断改进提高了其转化的效率，已经通过美国国立卫生研究院(NIH)和重组DNA咨询委员会(RAC)的批准作为基因治疗的载体进入II期临床实验，用于某些癌症的治疗，但其缺点是表达时间短和靶向性低。

用合成或天然的物质来与DNA结合，以模仿病毒组分，有效的压缩DNA长链分子，以提高其转染效率，这就是DNA包装颗粒所介导的基因治疗。DNA包装颗粒的主要形式是多聚阳离子，例如多聚赖氨酸、多聚精氨酸，组蛋白、脱乙酰壳多糖、聚乙烯亚胺(PEI)等。由于DNA带负电荷，多聚阳离子带正电荷，它们可通过电荷作用紧密结合，使DNA由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子。Legendre等人报道N-端取代的不同长度和序列的寡聚甘氨酸可压缩质粒DNA至50-100nm的粒子。与阳离子脂质体介导的系统相比可提高其转染效率。在众多的DNA包装颗粒中，PEI受到了人们的广泛关注。已经通过不同的给药途径如肺滴注、肾融合、颅内注射、静注等用PEI进行体内基因转移的实验。对PEI的研究还发现，不同分子量或不同异构体的PEI在体内转染效率及毒性均不同，这个发现揭示人们可通过研究物质结构与功能的关系，从而寻找新型载体系统。天然多聚物明胶和壳多糖早已被用于做载药微球体。近期有研究表明，它们可与DNA形成纳米粒子，这为DNA纳米粒子作成口服疫苗提供了可能。DNA包装颗粒的优点是易于大量生产、加入目标配基后可实现靶向转移、较低的免疫原性等。其缺点是体内转染效率不高和基因的表达时间短。

纳米控释系统包括纳米粒子和纳米胶囊，这种技术主要用于单碱基突变的基因病。有报道表明此方法可在血细胞中达到10％改正率，在大鼠肝细胞达到40％改正率。RNA/DNA寡核苷酸链相对较小，其所用的基因载体很广泛，可以与阳离子脂质体、阳离子多聚物和中性、阴性的脂质体形成复合物。反义药物易被内源性核酸酶降解，因而稳定性不高，这是影响其应用的重要缺陷。

非病毒基因治疗已经发展十几年了，取得了一定的成就，但仍然存在一些问题：(1)载体如何携带DNA进入细胞内？DNA是如何进入细胞核内并发挥作用的具体过程？如何表达药物蛋白，以及基因又是如何被关闭等，人们仍不十分清楚。(2)非病毒转移系统面临着表达时间短、表达效率低的难题。基因转移系统表达效率的高低取决于基因从给药部位到达目标细胞的细胞核内的这一过程所遇到的各种障碍。这些障碍包括有免疫系统、血液循环系统、枯氏细胞及内质网细胞之间的孔状结构的限制性大小、核膜等。其中核膜是一个重要的障碍，一般情况下，进入细胞质的基因也只有一小部分能最终进入核内。血清效应也是非病毒基因载体所面临的一个重大难题。例如，当脂质体与DNA的复合物注射到瘤内时，其物理性质到达靶细胞时改变不大。相反，当静脉注射脂质体与DNA的复合物时，到达靶细胞时，其大小、结构及电荷都有极大的改变。(3)尽管安全性是非病毒基因治疗的一大优点，但其无靶向性、表达时间短、表达效率低、整体应用受限等缺点以及长期应用的安全性还有待于进一步考察。

所以，为构建理想的载体系统，仍需科学工作者的大量的基础研究。人们仍需根据具体的疾病种类，给药途径等，选择治疗该疾病适宜的载体系统及治疗方法。在基因治疗发展的初期，曾遇到许多困难，有些人对其持有怀疑态度，但事实证明，基因治疗正一步步向着好的方向发展。从长远上来说，非病毒基因治疗的方法由于载体具有高安全性、低免疫原性和容易大规模生产等优点，越来越受到人们的重视。非病毒载体系统的研究，必定会使基因药物的研究向前迈进一大步。

非病毒系统导入基因的效率相对较差，故在基因治疗临床试验中的使用率不到20％；但非病毒载体的生物安全性较好，特别是靶向性的脂质体、靶向性的多聚物，以及脂质体/多聚物/DNA复合物等新产品的出现，结合电脉冲、超声等新技术，明显提高了导入效率和靶向性，是今后非病毒载体发展的重要方向。

绿脓杆菌外毒素A简称PEA，它的三维结构由四个二硫键，三个功能性亚基组成，分别为I、II、III区。其中I区包含Ia和Ib区，Ia区靶细胞表面受体结合区，负责细胞结合功能；Ib区功能目前尚不清楚。II区为中央区毒素跨膜转位功能单位，包括第253-364位氨基酸，有6个连续的α螺旋，负责转膜功能，结构域II(253～364aa)足以完成转膜作用。Taupiac等实验证明截短的结构域II(253～358aa)转位效率更高。而将结构域II进一步截短为253～345aa，仍未丧失其转位功能。III区具有ADP-核糖基化作用-酶催化功能和指导毒素进入内质网的功能。

组蛋白是真核生物细胞核中遗传结构物质——染色质的基本组成成分，在进化上十分保守。几乎所有的DNA都与组蛋白结合折叠形成染色质纤维。

古菌组蛋白单体具有典型的组蛋白折叠，即为三个α螺旋(α₁，α₂，α₃)中间夹有两个β链环(L1，L2)结构。位于中间的α₂螺旋是包括有8个转角的较长的螺旋，其两边为带有电荷的短的β链环结构，再两边是各有3个转角的α₁和α₃螺旋。古菌组蛋白单体是不稳定的，在溶液中它可以形成稳定的异二聚体或同二聚体。结构分析表明，两个组蛋白的α螺旋反向平行，以疏水作用紧密结合，对这种二聚体的形成和稳定起着主要的作用。

古菌组蛋白与真核组蛋白在氨基酸的序列上十分相似，只是比真核组蛋白要小，真核组蛋白一般由100-140个氨基酸组成，而古菌组蛋白大多只有60-70个氨基酸。古菌组蛋白保留真核组蛋白的核心结构，缺少真核组蛋白的N端和C端的某些序列，这些序列与蛋白调控，组蛋白乙酰化修饰有关，并参与染色体高级结构的组装，但它们对于核小体的组装并不是必需。古菌染色体结构和组装、组蛋白和DNA相互作用以及古菌组蛋白对染色体的亲和等特殊性质，都引起人们极大的兴趣。

发明内容

本发明的第一个目的是提供主动运载外源基因的重组蛋白载体PEAII-HphA核心基因片段，它是由PEA毒素跨膜转位区PEAII的基因和超嗜热古菌组蛋白HPhA的基因组成，即：PEAII-HphA。

所述的PEA毒素跨膜转位区PEAII的基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1或截短的，但必须包含序列表中SEQ ID NO.1中第87至第93位碱基的任何片段。

所述的超嗜热古菌组蛋白HPhA的基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2。

本发明的第二个目的是提供主动运载外源基因的重组蛋白载体是由导向分子-PEA毒素跨膜转位区PEAII-超嗜热古菌组蛋白HphA组成的蛋白；

也就是说它是主动运载外源基因的重组蛋白载体核心区PEAII-HphA与导向分子组成完整的主动运载外源基因的载体蛋白，即：导向分子-PEAII-HphA；

所述的导向分子是与核心区共价连接的可以将整个重组蛋白连同其携带的外源基因引至靶细胞表面部分，可与细胞表面相应配基或受体结合的成分均可作为导向分子。也就是说能将携带外源基因的重组蛋白载体引至靶细胞表面，并与相应的配基或受体结合的成分。

所述的导向分子可以是抗体或细胞因子或激素和/或细胞表面分子。

所述的导向分子是PEAIa、IL-4、IL-6、IL-15、表皮生长因子EGF、转化生长因子(TGF)、促性腺激素释放激素GnRH、α-促黑素和/或可以和细胞表面蛋白结合的任何抗原结合的单链抗体的任意一种。

所述的PEAII为包括PEA的第253～364 aa(SEQ ID NO.1)，其碱基序列可以是以第279位Arg和第280位Gly为中心向外延伸直至达到第253～364aa的多种组合序列。

其中重点描述的是序列表中SEQ ID NO.1或截短的PEAII包括PEA的第253～358aa，和/或进一步截短PEAII包括PEA的第253～345aa，和/或进一步截短PEAII包括PEA的第279～280aa。

所述的HPhA其由超嗜热古菌60-70个氨基酸组成的组蛋白。

本发明的第三个目的是提供主动运载外源基因的重组蛋白载体核心区PEAII-HPhA的基因制备方法，包括以下步骤：

1、以含有PEA全长基因序列的pCDPT₂为模板扩增PEAII基因片段；

2、PEAII基因片段与HPhA基因片段连接，得PEAII-HPhA重组基因；

3、重组基因片段克隆入适当的表达载体中；

本发明的第四个目的是提供主动运载外源基因的重组蛋白载体PEAII-HPhA(导向分子-PEAII-HphA)的制备方法：

1、以含有PEA全长基因序列的pCDPT₂为模板扩增PEAIa+II基因片段；

2、PEAIa+II基因片段与HPhA连接，得PEAIa+II-HPhA重组基因；

3、利用PCR技术把PEAIa替换成所述的导向分子，得重组基因片段；

4、重组基因片段在原核细胞中表达，得主动运载外源基因的重组蛋白载体PEAII-HPhA。

本发明的第五个目的是主动运载外源基因的重组蛋白载体PEAII-HphA，携带目的基因至人或动物体内靶细胞，作为基因治疗药物进行疾病治疗或在转基因动物中的应用。

本发明人针对病毒载体的免疫原性与安全性使其应用受到限制，非病毒载体可以克服这些问题，但它的转染效率低，靶向性差影响着基因治疗的缺点，利用了HphA分子量小，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2，稳定性好，耐热性高，DNA结合及组装能力强，并参与染色体高级结构的组装；以及对PEA结构和功能的认识--从早期的PEA免疫毒素将毒性分子通过共价键直接与抗体相连接，到大量的对PEA靶向结合区的置换及其衍生物应用，PEA重组毒素的应用范围也不断扩大，但主要应用于抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病和抗移植排斥反应。我们打破常规对PEA免疫毒素的研究，利用基因工程的方法将PEA的毒性区和导向分子PEAIa进行置换，用能与外源DNA相结合的古菌组蛋白HPhA基因代替PEA的毒性区，用目的导向分子代替PEAIa，与绿脓杆菌外毒素A的转运区PEAII构成一系列基因运载工具用于核酸输送，其核心区PEAII+HPhA碱基序列如序列表中SEQ ID NO.3。重组蛋白具有如下特点：在导向分子的引导下，通过受体结合介导的内吞作用穿越细胞膜体现了其靶向性，通过PEAII跨膜转运主动进入细胞内，体现了其主动性，HphA结合DNA能力强，与细胞核有天然的亲和能力，使外源基因很方便地到达核区，增加其表达效率。我们成功地构建了原核重组表达质粒pET26b-PEAIa+II-HPhA，通过表达获得了主动运载外源基因的转运系统。

重组蛋白PEAIa+II-HPhA，PEAIa碱基序列如序列表中SEQ ID NO.4，PEAIa+II-HPhA氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5，具有与HPhA相同的生物学功能，能够与DNA相结合，形成PEAa+II-HPhA-DNA复合物。并能够提高线性质粒DNA在凝胶电泳中的迁移率。

体外细胞实验证明，PEAIa+II-HPhA对Hela细胞没有毒性；并与PEA竞争Hela细胞表面受体，PEAIa+II-HPhA浓度为PEA浓度的6.25倍时，对PEA受体结合活性有阻断作用，当浓度为25倍时可完全阻断PEA受体结合活性。

免疫组化方法证明重组蛋白PEAIa+II-HPhA可以主动进入细胞内。体外细胞转运实验证实它能携带pEGFP基因进入细胞，荧光显微镜下可见绿色荧光，说明它能介导细胞转染，并可在细胞上观察到明显荧光亮点，分析是外源基因在高尔基体或是内质网上有高表达。与脂质体相比较，有效地提高转运效率，并对细胞没有毒性。由于PEAIa能与低密度脂蛋白受体结合，这样使PEAIa+II-HPhA能够介导多种细胞的基因转运。

主动运载外源基因的重组蛋白载体PEAIa+II-HPhA可作为输送任何DNA的载体，还可以利用基因工程的技术修改PEA的受体结合区，根据不同的外源基因，改变导向部分，替换导向分子，见中国专利：01138706.8，来减少基因治疗的毒性作用，同时组蛋白HPhA与染色体有特异性的亲合能力，可提高外源基因在目的细胞内的整合效率。使其具有非专一性载体结合能力，也可使DNA输送融合蛋白具有特定细胞的专一性载体结合能力，进入细胞内效率也大为提高，同时此输送系统可以介导多种细胞转运，与病毒载体相比，对细胞无毒性，更安全，与脂质体相比较，有效地提高转运效率，更加广泛地应用在基因治疗及转基因动物的研究上。

附图说明

图1是重组质粒pET26b-PEAIa+II-HPhA的构建策略图

图2为PCR扩增PEAIa+II区电泳结果；其中1.DNA marker DL2000 2.Ia区及II区PCR产物

图3为pET26b-PEAIa+II双酶切鉴定结果其中：1.DNA marker DL2000  2.Nde I和EcoR I双酶切质粒pET26b-PEAIa+II

图4为组蛋白HPhAPCR产物电泳结果；其中：1.DNA marker DL2000  2.PCR扩增HPhA基因。

图5pET26b-PEAI_a+II-HPhA双酶切鉴定结果；其中1.EcoR I和HindIII双酶切质粒pET26b-PEAIa+II-HPhA。2.DNA marker DL2000

图6重组蛋白表达形式鉴定：其中1.空菌蛋白，2.超声裂解上清，3.超声裂解沉淀，4.蛋白质Marker，5.全菌蛋白。

图7PEA-HPhA携带pEGFP转染CHO细胞，作用48h荧光显微镜下照相结果，左：可见光200倍，右：荧光200倍。

图8脂质体携带pEGFP转染CHO细胞，作用48h荧光显微镜下照相结果，左：可见光200倍，右：荧光200倍。

图9pEGFP报告基因作用CHO细胞48h，荧光显微镜下照相结果，左：可见光200倍，右：荧光200倍。

图10空白对照CHO细胞48h荧光显微镜下照相结果，左：可见光200倍，右：荧光200倍。

具体实施方式

实施例1：PEAIa区及II区基因扩增与pET26b载体连接

通过GenBank检索PEAIa区及II区序列，为其设计扩增引物，上游引物标为P1，下游引物标为P2。并在Ia区及II区片段N端引入NdeI酶切位点和C端引入EcoRI酶切位点。以pCDPT₂(含有PEA全基因序列)为模板，P1和P2为引物进行扩增反应，得到的PCR产物标为PEAIa+II；

P1(28bp)：5′GGAATTCCATATGGCCGAGGAAGCCTTC 3′含NdeI酶切位点

P2(23bp)：5′CGGAATTCCGCGCCGGCCTCGTC 3′含EcoRI酶切位点

由于PEAIa区及II区基因序列GC含量较高，所以选择LaTaq酶进行PCR反应，PCR扩增得到的基因片断；进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2.所示，可见到大小约为1086bp的目的基因，与预期的大小相符；

将去磷酸化的载体质粒pET26b大片段和酶切后纯化回收的PCR产物用T₄ DNA连接酶连接，得到重组质粒pET26b-PEAIa+II，转化大肠杆菌JM105感受态细胞，含kan抗性的琼脂糖平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒提取质粒，用限制性内切酶Nde I和EcoR I进行双酶切鉴定，并进行序列的测定。可见质粒经双酶切后在1000bp上有目的基因带(见图3)，证明Ia区及II区基因已经连接到载体上，成功的构建了重组质粒pET26b-PEAIa+II。

实施例2：重组质粒pET26b-PEA Ia+II与HPhA的连接

Pyrococcus horikoshii OT3的全部基因序列已经被测定，其中含有组蛋白基因PHS051，根据该基因的序列设计了两段带有酶切位点的引物来扩增目的基因；上游引物标为P3，下游引物标为P4；并在HPhA N端引入EcoR I酶切位点和C端引入HindIII酶切位点；以质粒pET11a-HPhA为模板，P3和P4为引物进行扩增反应，得到的PCR产物标为HPhA；

P3(26bp)：5′CGGAATTCGTGTGGATGATGGGAGAA  3′含EcoR I酶切位点

P4(28bp)：5′CCCAAGCTTTCAGCTCTTAATAGCGAGC 3′含HindIII酶切位点

用常规PCR方法扩增得到HPhA的基因片断，琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图4.所示，可见到大小约为213bp的目的基因，与预期的大小相符；

将回收纯化的组蛋白HPhA基因片段用EcoR I和HindIII双酶切连接到去磷酸化的载体质粒pET26b-PEAIa+II大片段，得到重组质粒pET26b-PEAIa+II-HPhA，转化大肠杆菌JM105感受态细胞，含kan抗性的琼脂糖平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养。提取质粒，用限制性内切酶EcoR I和HindIII进行双酶切鉴定，并进行序列的测定(图谱略)。双酶切重组质粒，可在250bp左右见有目的基因带，见图5，证明HPhA基因已经连接到载体上，成功的构建了重组质粒pET26b-PEAIa+II-HPhA。

实施例3：重组蛋白PEAIa+II-HPhA表达产物的SDS-PAGE结果及免疫印迹分析

将重组质粒pET26b-PEAIa+II-HPhA转化表达菌-大肠杆菌BL21-Codon Plus，IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示：重组蛋白PEA-HPhA在48.98KD左右处有一明显表达带，大小与理论值相符；见图6；

将重组蛋白表达菌裂解液上清和沉淀同时做SDS-PAGE电泳，结果显示，目的蛋白绝大多数在上清中，沉淀中相应位置也存在少量目的蛋白，认为通过诱导条件的优化，在适宜的诱导环境下能够以可溶形式表达。

实施例4：

根据本发明人的中国专利：01138706.8，结合现有技术，可将重组蛋白PEAIa+II-HPhA的基因片段的导向分子PEAIa，替换为其它的所有导向分子，它们可以是抗体或细胞生长因子或激素和/或细胞表面分子；根据治疗疾病和转基因动物的研究目的不同来选则不同的导向分子，利用实施例3表达主动运载外源基因的重组蛋白载体导向分子-PEAII-HPhA，运载DNA。

实施例5：检测重组蛋白PEAIa+II-HPhA对细胞的毒性

利用消化液将生长状态良好的Hela细胞株和BHK细胞株消化，用RPMI-1640完全培养基配成单个细胞悬液，以每孔1×10⁴个细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔体积200μl；将细胞培养板移入CO₂孵箱中，在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下，培养24小时；

首先加160μl和80μl PEAIa+II-HPhA重组蛋白，然后补加RPMI-1640完全培养基至200μl；另加含有梯度稀释的PEAIa+II-HPhA40μl、20μl、10μl、5μl、3μl，用PBS缓冲液补终体积40μl，再补加160μl RPMI-1640完全培养基。同时对照组加入上述等体积的不含PEAIa+II-HPhA的PBS缓冲液；移去细胞上清液，稀释好的样品用排枪加到96孔板中，继续培养24小时；选用具有PEA表面受体的BHK和Hela细胞来做毒性实验，加入不同浓度的重组蛋白PEAIa+II-HPhA观察细胞生长情况，结果发现加入80μl(50μg/ml)、40μl(25μg/ml)、20μl(12.5μg/ml)、10μl(6.25μg/ml)、5μl(3.175μg/ml)、3μl(1.6μg/ml)重组蛋白的各孔细胞生长状态与空白对照没有区别，用到最大量160μl(100μg/ml)时，与空白对照相比，有个别细胞固缩，绝大多数细胞仍然保持良好的生长状态，而与加入同体积PBS的细胞孔比较，没有区别。分析可能是由于加入细胞培养孔中缓冲液体积过多，使胞外盐浓度过高造成的。所以并不能说明个别细胞的固缩是重组蛋白的毒性所致。可以说PEAIa+II-HPhA对Hela细胞没有毒性。

实施例6：

1、PEAIa+II-HPhA介导的细胞转染

选脂质体作为介导转染的对照，选择了有LDL受体的CHO作为转染细胞，选择pEGFP作为报告基因，

取接种好CHO细胞的6孔培养板，轻轻吸去培养基。将PEAIa+II-HPhA与2μg报告质粒pEGFP以不同的质量比25℃共浴制成复合物后，直接加入到1.4ml RPMI-1640完全培养

基中，形成转染用混合物。将混合物加入到细胞中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养12小时后，轻轻吸去上清液，加入2ml RPMI-1640完全培养基，继续培养40小时之后，通过荧光显微镜观察转染情况，确定最佳转染条件。然后，用最佳转染条件分别作用细胞24h、48h、72h，荧光显微镜观察转染情况。同时用脂质体+质粒，质粒及空白孔作对照，观察转染效率，并用免疫组化的方法检测结果。

Lipofectamine介导的细胞转染

按照试剂盒操作说明，将Lipofectamine(3μl)(脂质体)与报告质粒pEGFP(2μg)分别加入到装有100μl RPMI-1640培养基的干净试管中，轻微混合，然后在室温下保温30分钟。在此试管中加入1.4ml无血清培养基，混合后加入到细胞中，37℃，5％CO₂培养箱中培养12小时，用2ml RPMI-1640完全培养基取代转染混合液，继续培养40小时之后，荧光显微镜观察转染情况。

通过实验确定转染最佳条件为：当PEAIa+II-HPhA与pEGFP质量比为2∶1，转染时间为48h时，转染效率最高，结果在荧光显微镜下看到绿色荧光，见图7。脂质体携带报告基因pEGFP作用CHO细胞48h后荧光显微镜下发出绿色荧光，见图8。质粒直接作用于细胞也可见零星荧光，见图9。而空白孔没有荧光，见图10。

重组蛋白PEAIa+II-HPhA通过PEA的N端(Ia区)的受体结合区与CHO细胞表面受体结合，迅速聚集到包涵体包被区，此区向内凹陷形成内吞体，进入内吞囊泡中，胞内质子泵迅速使胞内酸化，在低pH环境下，被Arg279-Gly280之间的肽键被蛋白酶切开，包含II区和HPhA片段由内膜体移位至细胞质中，完成转膜功能，进入细胞质后可与高尔基体或与内质网结合，随着蛋白质的合成，pEGF报告基因翻译成绿色荧光蛋白。

从图7能够看出有些发出绿色荧光的细胞内，有荧光亮点，依据上面分析的PEA-HPhA的转膜过程，判断报告基因是在高尔基体或是在内质网上有高表达，致使细胞局部发出强亮点。

图7证明重组蛋白PEAIa+II-HPhA对细胞的生长没有任何影响，而Lipofectamine则可见活细胞数量减少并有死细胞存在，见图8。镜下观察由PEAIa+II-HPhA介导的转染绿色荧光的亮度要高于Lipofectamine介导的转染，说明PEAIa+II-HPhA介导的体外转染效率比脂质体更高，二者均高于裸DNA质粒的转染效率。可能是因为重组蛋白PEAIa+II-HPhA与质粒DNA形成复合物后，是将DNA主动运载到靶细胞中，而使外源基因可以在细胞内得以表达的缘故。这对于今后研究体内基因转染是极为关键的。

                     SEQUENCE  LISTING

<110>中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所

<120>主动运载外源基因的重组蛋白载体PEAII-HPhA及其制备方法和应用

<160>5

<210>1

<211>345

<212>DNA

<213>人工

<400>1

ggatccgagg gcggcag cct ggccgcgctg accgcgcacc aggcctgcca cctgccgctg    60

gagaccttca cccgtcatcg ccagccgcgc ggctgggaac aactggagca gtgcggctat   120

ccggtgcagc ggctggtcgc cctctacctg gcggcgcggc tgtcgtggaa ccaggtcgac   180

caggtgatcc gcaacgccct ggccagcccc ggcagcggcg gcgacctggg cgaagcgatc   240

cgcgagcagc cggagcaggc ccgtctggcc ctgaccctgg ccgccgccga gagcgagcgc   300

ttcgtccggc agggcacagg caacgacgag gccggcgcgg aattc                   345

<210>2

<211>216

<212>DNA

<213>人工

<400>2

gtgtggatga tgggagaatt accaattgcc ccagttgacc gtcttattgg taaggcaggt   60

gccgagcgtg tcagcgagca agctgcaaag gttctcgccg agtaccttga agagtacgca  120

atcgagattg caaagaaggc cgttgagttt gcacgtcacg ctggacgtaa gaccgtcaag  180

gttgaggaca ttaagctcgc tattaagagc tgataa                            216

<210>3

<211>561

<212>DNA

<213>人工

<400>3

ggatccgagg gcggcag cct ggccgcgctg accgcgcacc aggcctgcca cctgccgctg   60

gagaccttca cccgtcatcg ccagccgcgc ggctgggaac aactggagca gtgcggctat  120

ccggtgcagc ggctggtcgc cctctacctg gcggcgcggc tgtcgtggaa ccaggtcgac  180

caggtgatcc gcaacgccct ggccagcccc ggcagcggcg gcgacctggg cgaagcgatc  240

cgcgagcagc cggagcaggc ccgtctggcc ctgaccctgg ccgccgccga gagcgagcgc  300

ttcgtccggc agggcacagg caacgacgag gccggcgcgg aattcgtgtg gatgatggga  360

gaattaccaa ttgccccagt tgaccgtctt attggtaagg caggtgccga gcgtgtcagc  420

gagcaagctg caaaggttct cgccgagtac cttgaagagt acgcaatcga gattgcaaag  480

aaggccgttg agtttgcacg tcacgctgga cgtaagaccg tcaaggttga ggacattaag  540

ctcgctatta agagctgata a                                            561

<210>4

<211>756

<212>DNA

<213>人工

<400>4

Atggccgagg aagccttcga cctctggaac gaatgcgcca aggcctgcgt gctcgacctc   60

aaggacggcg tgcgttccag ccgcatgagc gtcgacccgg ccatcgccga caccaacggc  120

cagggcgtgc tgcactactc catggtcctg gagggcggca acgacgcgct caagctggcc  180

atcgacaacg ccctcagcat caccagcgac ggcctgacca tccgcctcga aggtggcgtc  240

gagccgaaca agccggtgcg ctacagctac acgcgccagg cgcgcggcag ttggtcgctg  300

aactggctgg tgccgatcgg ccacgagaag ccttcgaaca tcaaggtgtt catccacgaa  360

ctgaacgccg gtaaccagct cagccacatg tcgccgatct acaccatcga gatgggcgac  420

gagttgctgg cgaagctggc gcgcgatgcc accttcttcg tcagggcgca cgagagcaac  480

gagatgcagc cgacgctcgc catcagccat gccggggtca gcgtggtcat ggcccaggcc  540

cagccgcgcc gggaaaagcg ctggagcgaa tgggccagcg gcaaggtgtt gtgcctgctc  600

gacccgctgg acggggtcta caactacctc gcccagcagc gctgcaacct cgacgatacc  660

tgggaaggca agatctaccg ggtgctcgcc ggcaacccgg cgaagcatga cctggacatc    720

aagcccacgg tcatcagtca tcgcctgcat ttcccc                              756

<210>5

<211>432

<212>PRT

<213>人工

<400>5

Met Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys

1                5                  10                  15

Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp

            20                  25                  30

Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met

        35                   40                 45

Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala

    50                  55                  60

Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val

65                  70                  75                  80

Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly

                85                  90                  95

Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser

            100                 105                 110

Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser

        115                 120                 125

His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala

    130                 135                 140

Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn

145                 150                 155                 160

Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val

                165                 170                 175

Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala

            180                 185                 190

Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn

        195                 200                 205

Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys

    210                 215                 220

Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile

225                 230                 235                 240

Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Gly Ser Glu Gly

                245                 250                 255

Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu

            260                 270                 275

Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro  Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu

        280                 285                 290

Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala

    295                 300                 305

Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala

310                 315                 320                 315

Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro

                320                 325                 330

Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg

            335                 340                 345

Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Glu Phe Val

        350                 355                 360

Trp Met Met Gly Glu Leu Pro Ile Ala Pro Val Asp Arg Leu Ile Gly

    365                 370                 375

Lys Ala Gly Ala Glu Arg Val Ser Glu Gln Ala Ala Lys Val Leu Ala

380                 385                 390                 395

Glu Tyr Leu Glu Glu Tyr Ala Ile Glu Ile Ala Lys Lys Ala Val Glu

                400                 405                 410

Phe Ala Arg His Ala Gly Arg Lys Thr Val Lys Val Glu Asp Ile Lys

            415                 420                 425

Leu Ala Ile Lys Ser

        430     432

Claims (10)

1、主动运载外源基因的重组蛋白载体PEAII-HphA核心基因片段，它是由PEA毒素跨膜转位区PEAII的基因和超嗜热古菌组蛋白HPhA的基因组成。

2、权利要求1主动运载外源基因的重组蛋白载体PEAII-HphA核心基因片段，所述的PEA毒素跨膜转位区PEAII的基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1或截短的，但必须包含序列表中SEQ ID NO.1中第87至第93位碱基的任何片段。

3、权利要求1主动运载外源基因重组蛋白载体PEAII-HphA核心基因片段，所述的超嗜热古菌组蛋白HPhA的基因其碱基序列如序列表SEQ ID NO.2。

4、主动运载外源基因的重组蛋白载体PEAII-HphA是由导向分子-PEA毒素跨膜转位区PEAII-超嗜热古菌组蛋白HphA组成的蛋白；所述的导向分子是与核心区共价连接的可以将整个重组蛋白连同其携带的外源基因引至靶细胞表面部分，可与细胞表面相应配基或受体结合的成分。

5、权利要求4主动运载外源基因重组蛋白载体PEAII-HphA所述的导向分子可以是抗体或细胞因子或激素和/或细胞表面分子。

6、权利要求4主动运载外源基因重组蛋白载体PEAII-HphA所述的导向分子是PEAI a、IL-4、IL-6、IL-15、表皮生长因子EGF、转化生长因子TGF、促性腺激素释放激素GnRH，α-促黑素以及可与细胞表面任何抗原结合的单链抗体中的任意一种。

7、权利要求4主动运载外源基因重组蛋白载体PEAII-HphA所述的超嗜热古菌组蛋白HPhA其由超嗜热古菌60-70个氨基酸组成的组蛋白。

8、权利要求4、5、6、7主动运载外源基因重组蛋白载体PEAII-HphA，所述的PEAII为包括PEA的第253～364aa其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1，其碱基序列也可以是以第279位Arg至第280位Gly为中心向外延伸直至达到第253～364aa的多种组合序列。

9、主动运载外源基因重组蛋白载体PEAII-HPhA制备方法，包括以下步骤：

a、以含有PEA全长基因序列的pCDPT₂为模板扩增PEAIa+II基因片段；

b、PEAIa+II基因片段与HPhA连接，得PEAIa+II-HPhA重组基因；

c、利用PCR技术把PEAIa替换成所述的导向分子，得重组基因片段；

d、重组基因片段在原核细胞中表达，得主动运载外源基因重组蛋白载体PEAII-HPhA。

10、主动运载外源基因重组蛋白载体PEAII-HphA在制备基因治疗药物或转基因动物的应用。

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