CN101056988B - 确定胰腺用于胰岛分离的合适性的评分方法 - Google Patents
确定胰腺用于胰岛分离的合适性的评分方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101056988B CN101056988B CN2005800390622A CN200580039062A CN101056988B CN 101056988 B CN101056988 B CN 101056988B CN 2005800390622 A CN2005800390622 A CN 2005800390622A CN 200580039062 A CN200580039062 A CN 200580039062A CN 101056988 B CN101056988 B CN 101056988B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pancreas
- islet
- pancreas islet
- minute
- assigned
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 title claims abstract description 120
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title 1
- 238000013077 scoring method Methods 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000002310 reflectometry Methods 0.000 claims description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 6
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 6
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276707 Tilapia Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000013059 nephrectomy Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 210000004706 scrotum Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- UOFGSWVZMUXXIY-UHFFFAOYSA-N 1,5-Diphenyl-3-thiocarbazone Chemical compound C=1C=CC=CC=1N=NC(=S)NNC1=CC=CC=C1 UOFGSWVZMUXXIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102100029469 WD repeat and HMG-box DNA-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710097421 WD repeat and HMG-box DNA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N acetoacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(O)=O WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000011928 denatured alcohol Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002481 ethanol extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000162 organ preservation solution Substances 0.000 description 1
- 210000000277 pancreatic duct Anatomy 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
- G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
- G16H50/20—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for computer-aided diagnosis, e.g. based on medical expert systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Primary Health Care (AREA)
- Databases & Information Systems (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Data Mining & Analysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及评估胰腺作为治疗上有用的胰岛的来源的方法。本发明阐述了一类评分系统，并列出了五个指标。如果其中有三个指标是正值，那么该胰腺是治疗上有用的胰岛的合适来源。
Description
相关申请
本申请要求在2004年11月18日申请的序列号为60/629,227申请的优先权，该专利通过引用以整体并入本文。
技术领域
本发明涉及改进胰岛生产的产量和质量的方法。胰岛存在于动物的胰腺，本发明涉及确定胰腺是否将以优良产率提供胰岛的方法。
背景技术
现在已确定胰岛置换疗法是一种治疗患有各种疾病的患者的可行方法。其中包括接受上腹器官摘除术的癌症患者(Tzakis，et al.，Lancet，336：402-405(1990))；胰腺炎(Clayton，et al.，Transplantation，76：92-98(2003)；Farney，et al.，Surgery，110：427-437(1991)；Fontes，et al.，Transplant Proc，24：2809(1992)；Obenholzer，et al.，Transplantation，69：1115-1123(2000)；Robertson，et al.，Diabetes，50：47-50(2001))和胰岛素依赖性患者，在此胰岛移植是一种治疗选择(Goss，et al.，Transplantation，74：1761-1766(2002)；Ricordi，et al.，Transplantation，75：1524-1527(2003)；Ryan，et al.，Diabetes，50：710-719(2001)；Shapiro，et al.，N.Engl.J.Med，343：230-238(2000))。
由于胰岛在治疗中的有用性，如上文所示，显然人们有兴趣开发分离它们的方法。尽管有许多有关应用自动化方法分离胰岛的报道(Brandhorst，et al.，Exp.Clin.Endocrinol Diabetes，103Suppl.2：3-14(1995)；Cui，et al.，Cell Transplant，6：48-54(2001)；Marchetti，etal.，Transplantation，52：209-213(1991)；Miyamoto，et al.，Cell Transplant，7：397-402(1998)；Nielsen，et al.，Comp.Med.，52：127-135(2002)；Swanson，et al.，Hum.Immunnol，62：739-749(2001)；Toomey，et al.，Brit.J.Surg.，80：240-243(1993)；Toso，et al.，Cell Transplant，9：297-305(2000)；Wennberg，et al.，Transplant.Proc.，33：2537(2001))，胰岛的分离仍然具有众所周知的困难。例如，Bosta，et al.，J.Investig.Med，43：555-566(1995)；Krickhahn，et al.，Cell Transplant，11：827-838(2002)；Krickhahn，et al.，Ann Transplant，6：48-54(2001)，O’Neil，et al.，Cell Transplant，10：235-246(2001)，和White，et al.，Horm.Metab.Res，31：579-524(1999)，均探讨了有关于此的问题。
在以下内容中所公开的本发明是有关使成功获得胰岛产物的可能性最大化的方法。现已确定，通过使用本文中提出的得分系统，能够使得在任意给定的从胰腺分离胰岛的过程中，确保以优良产率获得胰岛的机会最大化。
以下公开内容将说明此过程是如何实现的。
附图说明
图1A是胰腺的显微照片，其按照本发明所示方法的得分为+3分，被判定为有用胰腺，图1B是一张得分为-1的胰腺的显微照片，该胰腺被判定为不合格。
具体实施方式
实施例1
以下实施例中所使用的动物为两岁以上且已生育多个后代的母猪。用电击昏动物并放血。随后取出内脏以供胰腺的分离。从电击昏到将胰腺放置于冷的Hank’s平衡盐溶液(“HBSS”)之间的时间通常是10～15分钟。冷缺血时间为15～20分钟。
为详细描述此过程，取出整个胰腺，接着在左右胰叶间的连接处横向地切下围绕门静脉的环形圈(annular ring)，以提供约2～5mm厚的活组织检查切片。
根据Ricordi，et al.，ed.PancreaticIslet Cell Transplantation(Austin：R.G.Landes Company，1992)，132-142，将活组织检查的组织切片切成两半，并置于HBSS溶液或双硫腙溶液(“DTZ”)中。
接下来将胰腺置于加入了2％热失活的猪血清(“PS”)的HBSS溶液中，随后送至进行胰岛分离的实验室。
然后对胰腺活组织检查样品进行评估，以确定它们是否适合进行胰岛分离。评估五个变量。其中，每一变量的得分被赋值为+1或-1，下文将具体解释。
首先，确定热缺血时间，其定义为从放血开始到胰腺被放入冷的保存溶液之间的时间。如果此过程在小于或等于15分钟内完成，则得分为+1，如果大于15分钟，得分为-1。尽管有时热缺血时间高达20分钟的情况下也能够得到优良的胰岛产物，但其获得成功的机会仍低于热缺血时间为15分钟的情况。
第二个指标为观测胰腺的颜色，胰腺间的颜色变化可能是多种因素的结果。例如，如果胰腺中静脉血管堵塞，例如因动物被电死或者应激反应所致，那将会导致该胰腺达不到作为所期望胰岛供体的质量。以上两种情况均会造成血液集中在胰腺中、血红蛋白的释放并扩散到细胞外空间。继而造成了器官颜色的改变，通常为褐色或紫色。
胰腺颜色可以主观观测，熟练的技术人员可以鉴别深色胰腺(其不合要求，得分为-1)，和浅色胰腺(其合乎要求，得分为+1)；但是，更加客观的测定使用色度计，其根据反射光与入射光的比值即“反射比”检测颜色。如果反射比小于约60，得分为-1，若在约60以上，则得分为+1。
用于器官的第三个指标是脂肪含量。为测定此指标，将约2×2×0.5cm的活组织检查样本浸入DTZ约5分钟。染色之后，该组织在放大倍数为10倍的解剖镜下观察。胰岛显红色，脂肪组织显绿色。选择观察视野，评估整个绿色部分的百分比。如果总脂肪含量在约25％以上，则该器官得分为-1，而脂肪含量小于约25％时得分为+1。
可以理解的是，当然也存在其他用来判定器官脂肪含量的方法，所有这些方法都能在此处使用。
所采用的第四个指标是胰岛分界。对于此参数，使用同样的染色和观测方法。用直径大于50μm的胰岛来评估胰岛分界。详细地说，如果两组或多组DTZ染色的胰岛细胞自胰岛中心呈放射性，并超出了正常情况下平滑清晰分界的胰岛外部边界/平面，则判定为分界不佳。如果超过50％的胰岛是分界优良的，该指标被赋值为+1，如果低于50％，得分为-1。
最后一个指标是胰岛的大小，以其直径相对于所研究动物物种的平均胰岛直径作为判定指标。所研究器官中胰岛的平均直径是否大于该物种的平均值是作为评分目的的决定因素。对于很多物种，平均胰岛直径大约是100微米。鼠、猪、人以及其他许多物种的胰岛均是如此。如果如上述所测量的大部分胰岛的直径超过100μm，则得分为+1，否则得分为-1。另外一方面，如果胰岛的平均直径与猪的不同，则采用该物种的胰岛平均直径作为参照值。例如，众所周知，一种叫做罗非鱼的鱼类，拥有非常大的胰岛，直径平均大约是5mm。当研究罗非鱼的胰腺时，其判断点应为5mm，如果胰岛的平均直径大于5mm则应该给予正分。
将所检测的每一个胰腺的这五个指标的得分列表，如果总分大于或等于+1，该器官被认为是合适的胰岛供体。
下表列出了总分大于或等于+1的十个器官的典型结果。
表1
个别供体胰腺的活组织检查得分
为了比较，在图1A和1B的照片中给出了得分为+3的胰腺(图1A)和得分为-1的胰腺(图1B)的显微照片。在图1A中，大的胰岛(>100μm)是明显的，其良好分界也很清楚。相对的，图1B中所示的胰腺显示出小的且分界不佳的胰岛。
根据本文中所描述方案的标准，图1B中所示的胰腺将不进行进一步处理，但是，出于作为对照的目的，对它也继续进行了处理，在以下实施例中会论及。
实施例2
按照实施例1中提出的评价指标，对得分大于或等于+1的胰腺以及作为对照的得分为-1的胰腺进行了下一步的处理。对腺体的脂肪和结缔组织进行整理，接着在主胰管中插入一根16g的钝头不锈钢针管。在30℃条件下，将含有浓度为1.5-2.0g/l胶原蛋白酶P的HBSS溶液以50ml/mm的速率灌入，每克胰腺提供2ml溶液。
接下来，在30℃条件下，用500ml HBSS和2％PS与200ml胶原蛋白酶溶液一起浸过胰腺。使用39℃的外循环水将器官缓慢升温到37℃，并保持消化温度在36～37℃。当该器官显示解离、并对手动压力的抵抗力很小时(大约10～20分钟总时间之后，在达到37℃之后大约5～10分钟)，终止消化。
收集消化物并离心，吸走上清，将所得沉淀悬浮在10％PS和器官保存溶液中。接着，在含有添加2％PS的HBSS溶液的50ml试管中，用浓度梯度为1.105、1.095、1.085、1.05g/cm3的不连续Ficoll纯化胰岛。试管在650g、4℃条件下离心，收集含有胰岛的分层，并用含有10％PS的HBSS溶液洗三遍，其后借助于解剖镜将它们从非胰岛组织中手工纯化出来。重悬这些胰岛，取两个各0.5ml的样品用于胰岛产物的计数。
以图1A和图1B所示的胰腺为例，对于得分为+3的胰腺，胰岛产量为105,000EIN(胰岛当量数，由Ricordi，et al.定义，见上文)，纯度为98.8％。相比之下，图1B所示器官的产量为44,000EIN。
实际上，表1中的10个胰腺的平均产量为130,000EIN，平均每克消化后的组织为1,101EIN。所有样本的纯度均高于90％，其中9个器官的胰岛活力高于89％，测定方法如下文所述。
实施例3
在分离胰岛之后，测定各种参数，其中包括纯度、活力，如上文所提及。
纯度是通过用DTZ对大约500EIN的胰岛染色10分钟来确定的，然后使用解剖镜和数码相机进行标准图像分析。
活力是通过用双乙酸荧光素(FDA)和溴化乙锭(EB)对样本染色来测定的。详细地说，将大约500EIN胰岛样本加入含10％PS、1％抗生素/抗真菌素(“A/A”)的1ml RPMI溶液中。然后，将由10mg的FDA和1ml丙酮制成的20μl FDA染剂、由30μl EB和1ml PBS制成的200μl EB加入。对胰岛避光染色7分钟，然后随机选取10-50个胰岛的样品，在荧光显微镜下观察，拍照，从而使用标准图像分析方法来测定其活力。
也通过将大约500EIN胰岛置于酸性乙醇提取溶液(7.2ml1N盐酸，400ml100％变性乙醇)中来测量胰岛的胰岛素含量。所述样本存放在-20℃，并实施胰岛素RIA。
表2
实施例4
本实施例及后续实施例将阐明如上所述鉴定为有用并分离出的胰岛是否能用于大珠子。
将纯化的胰岛重悬在RPMI1640+10％PS+1％A/A溶液中，达到2000EIN/ml的容积。将这些胰岛平均分配在试管中，使得每个试管包含1ml含有2000EIN的悬浮液。
经重力沉降后，去除上清，向每个样品中加入0.5ml50℃的在最小必需培养基加2.5％HEPES缓冲液中制备的1.5％琼脂糖，，搅拌均匀。接着，将悬浊液在无菌矿物油下排出，形成四个具有光滑表面和均匀胰岛分布的珠子。
取出大珠子，洗两遍(RPMI+5％PS+1％A/A)。这些大珠子在5％湿润二氧化碳的条件下，在同样的溶液中培养5～7天，之后，用RPMI+1％A/A洗三遍，接着进行第二次琼脂糖包被。为此目的，用移液器将60℃的0.5ml含有5％琼脂糖的HEPES缓冲液加MEM转移到无菌的塑料勺中，将每个大珠子滚动3～5次从而产生均匀的、第二琼脂糖包被。将它们移入无菌矿物油从而产生光滑的表面，取出大珠子，用RPMI+2.5％PS+1％A/A洗两遍，在37℃含5％湿润二氧化碳的空气中培养。
包含封装了胰岛的大珠子经检测可以保持活力超过六个月，在此之后，放射性免疫测定显示它们能继续产生高水的胰岛素。
实施例5
本实施例描述的实验用于阐述根据如上所述分离得到的胰岛是否能在体内发挥功能。
采用雄性，非肥胖型糖尿病CB17-PrKdc<scid>/J小鼠，年龄7～9周。适应一周后，动物接受275mg/kg链脲霉素，其将诱导糖尿病。9天后，当它们血液中平均葡萄糖水平超过480mg/dl时，开始使用胰岛素疗法。
在施用链脲霉素后的34～35天，动物接受大约1000EIN的猪胰岛，其是按照Bowen，et al.，Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.，58：441-447(1980)中的方法在血栓中移植的，该文献通过参考并入本文中。简单地说，将胰岛从悬浮液中沉淀下来，吸去培养基。然后，从动物体内取出大约5～10μl的血液，将之加入胰岛中，并使之凝结成血栓。用等体积的克他命(167mg/l)、甲苯噻嗪(33mg/ml)和生理盐水麻醉受体动物。所述混合物以0.5ml/100g的剂量皮下施用。然后，在左侧腰窝切开一个小口以暴露肾，利用解剖镜在肾囊上切开一个小口，将肾囊与肾分离开，将上述胰岛/血栓放置于囊下，缝合切口，使动物恢复。
在移植后第38～39天对动物施行肾切除术。简单的说，在麻醉之后，将接受移植物的肾暴露，结扎肾血管，摘除每个动物的肾。5天之后，处死动物，收集胰腺用于在组织学上确定全部胰岛β细胞被破坏。
组织样本在10％中性缓冲液甲醛溶液中放置24小时，然后转移到70％乙醇中。
接下来，用石蜡包埋组织，将5μm的切片用苏木精和伊红染色。胰腺和移植后的肾的切片用标准方法对含胰岛素与胰高血糖素的细胞染色，然后进行研究。
所有小鼠在胰岛移植后血糖恢复正常。肾切除术后，所有小鼠在四天内均变为表现出高血糖。
前述实施例阐明了本发明的特征，本发明是用来评估胰腺以确定由其来源的胰岛是否具有临床可用性的方法。本方法涉及检测五种指定指标中的至少三种以及对每一个指标赋值。根据上述的描述，数值选择可以是+1或-1。如果实行三种检测后，该器官得分是+3，则测试可以终止，因为即使后两个指标均为-1，该器官的总分也不会小于+1。
如果五种指标中的三种被检测后器官得分为+1，则对第四种指标进行检测，因为三种检测后得分为+1并不能保证最后的总分为+1或更高。如果第四种指标的检测结果是+1，那么可以考虑结束测试，这同样是因为如果四种检测之后得分为+2，那么该器官最后的总分不可能小于+1。
如果，在四种检测后，器官得分为0，那么应该进行第五种检测以获得决定性的结果。
相反的，如果在三种检测后器官得分为-3，就没有必要继续检测了，同样，四种检测后得分为-2也不需要做最后的检测。(注意，根据本发明，三种检测后可能的得分只有+3，+1，-1，-3，四种测试后可能的得分只有+4，+2，0，-2，-4；但是，+4和-4的得分本排除了继续检测的必要性。所以，尽管期望进行进一步检测，但却不是必需的。)
选择先进行哪三个检测取决于熟练的技术人员；但是，热缺血时间是一项研究人员可控的指标，可以被优选作为首先检测的三项指标之一。剩下的两项检测将取决于熟练技术人员的选择。
本文中阐述的方法可被用于任何物种的胰腺，包括、但是不限于以下物种：牛、猪、绵羊、鼠、灵长类，人，鱼或者另外的物种。
从根据本发明所选择的胰腺中获得的胰岛可以“照原样”被用于如实施例中所示的情形，或者可以例如如U.S.Patent Nos5,643,569和Re38,027中所述以被包膜的大珠形式应用，以上均通过引用并入本文。
本发明的其他方面对于本领域的技术人员来说是清楚的，不需进一步详细阐述。
所采用的术语和表达方式被用作描述性的术语，但不具有限制性，在使用这些术语和表达方式时，无意排除本发明或其中一部分所显示和所描述的特征的任何等效物，并且应该承认各种修饰在本发明的范围内是有可能的。
Claims (13)
1.一种用于确定分离的胰腺是否可作为治疗上有用的胰岛的来源的方法，其包括以下各项检测：
(i)确定所述分离的胰腺的热缺血时间，和以下的至少两项：
(ii)确定所述分离的胰腺的颜色，
(iii)确定所述分离的胰腺的脂肪含量，
(iv)确定所述分离的胰腺中胰岛的分界，和
(v)确定从所述分离的胰腺中分离出的胰岛的平均大小，其中：
(a)在(i)中，热缺血时间少于约15分钟的被赋值为+1分，而大于约15分钟的被赋值为-1分；
(b)所述颜色的反射比在约60以上的被赋值为+1分，在约60以下的被赋值为-1分；
(c)脂肪含量在约25％以下的被赋值为+1分，在约25％以上的被赋值为-1分；
(d)胰岛分界在约50％以上的被赋值为+1分，在约50％以下的被赋值为-1分，并且
(e)胰岛的平均直径等于或者大于所述物种的平均值的被赋值为+1分，在所述物种的平均值以下的被赋值为-1分，由此
如果所述胰腺在三项检测后得分为+3，或
如果所述胰腺在四项检测后得分为+2，或
如果所述胰腺在五项检测后得分为正分，
则所述胰腺是治疗上有用的胰岛的来源。
2.根据权利要求1的方法，其包括(i)和(ii)-(v)中的至少三项。
3.根据权利要求1的方法，其包括(i)-(v)的所有项。
4.根据权利要求1的方法，其包括(i)、(ii)和(iii)。
5.根据权利要求1的方法，其包括(i)、(ii)和(iv)。
6.根据权利要求1的方法，其包括(i)、(ii)和(v)。
7.根据权利要求1的方法，其包括(i)、(iii)和(iv)。
8.根据权利要求1的方法，其包括(i)、(iii)和(v)。
9.根据权利要求1的方法，其包括(i)、(iv)和(v)。
10.根据权利要求2的方法，其包括(i)-(iv)。
11.根据权利要求2的方法，其包括(i)、(ii)、(iii)和(v)。
12.根据权利要求2的方法，其包括(i)、(ii)、(iv)和(v)。
13.根据权利要求2的方法，其包括(i)和(iii)-(v)。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62922704P | 2004-11-17 | 2004-11-17 | |
| US60/629,227 | 2004-11-17 | ||
| PCT/US2005/041219 WO2006055501A2 (en) | 2004-11-17 | 2005-11-14 | Scoring method for determining pancreas suitability for islet isolation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101056988A CN101056988A (zh) | 2007-10-17 |
| CN101056988B true CN101056988B (zh) | 2011-06-15 |
Family
ID=36407670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2005800390622A Expired - Fee Related CN101056988B (zh) | 2004-11-17 | 2005-11-14 | 确定胰腺用于胰岛分离的合适性的评分方法 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7413871B2 (zh) |
| JP (1) | JP4704439B2 (zh) |
| KR (1) | KR100890375B1 (zh) |
| CN (1) | CN101056988B (zh) |
| AT (1) | ATE472608T1 (zh) |
| AU (1) | AU2005306676B2 (zh) |
| CA (1) | CA2587695C (zh) |
| DE (1) | DE602005022093D1 (zh) |
| DK (1) | DK1812583T3 (zh) |
| ES (1) | ES2344796T3 (zh) |
| HK (1) | HK1104324A1 (zh) |
| HR (1) | HRP20100472T1 (zh) |
| IL (1) | IL182853A0 (zh) |
| NZ (1) | NZ554964A (zh) |
| PT (1) | PT1812583E (zh) |
| RS (1) | RS51392B (zh) |
| RU (1) | RU2355404C2 (zh) |
| WO (1) | WO2006055501A2 (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL1928249T3 (pl) * | 2005-09-26 | 2012-11-30 | The Rogosin Inst Inc | Makroperełki zawierające komórki wydzielnicze obejmujące agarozę Seakem Gold i ich zastosowanie |
| CN117063921A (zh) * | 2023-10-17 | 2023-11-17 | 成都中科奥格生物科技有限公司 | 一种胰腺保存液及其制备方法和胰腺保存方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU782683B2 (en) * | 2000-01-19 | 2005-08-18 | University Of North Carolina At Chapel Hill, The | Liver tissue source |
-
2005
- 2005-11-14 NZ NZ554964A patent/NZ554964A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-11-14 JP JP2007543161A patent/JP4704439B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-14 CA CA2587695A patent/CA2587695C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-14 KR KR1020077011167A patent/KR100890375B1/ko active IP Right Grant
- 2005-11-14 RS RSP-2010/0355A patent/RS51392B/en unknown
- 2005-11-14 WO PCT/US2005/041219 patent/WO2006055501A2/en active Application Filing
- 2005-11-14 AT AT05849755T patent/ATE472608T1/de active
- 2005-11-14 PT PT05849755T patent/PT1812583E/pt unknown
- 2005-11-14 RU RU2007122628/15A patent/RU2355404C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-11-14 DK DK05849755.3T patent/DK1812583T3/da active
- 2005-11-14 AU AU2005306676A patent/AU2005306676B2/en not_active Ceased
- 2005-11-14 CN CN2005800390622A patent/CN101056988B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-14 US US11/273,737 patent/US7413871B2/en active Active
- 2005-11-14 ES ES05849755T patent/ES2344796T3/es active Active
- 2005-11-14 DE DE602005022093T patent/DE602005022093D1/de active Active
-
2007
- 2007-04-29 IL IL182853A patent/IL182853A0/en not_active IP Right Cessation
- 2007-11-21 HK HK07112725.0A patent/HK1104324A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-08-30 HR HR20100472T patent/HRP20100472T1/hr unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KRICKHAHN et al.The Morphoplogy of Islets within the Porcine Donor PancreasDetermines the Isolation Result:Successful Isolation ofPancreatic Islets Can Now Be Achieved from Young MarketPigs.Cell Transplantion11.2002,11827-832. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2005306676A2 (en) | 2006-05-26 |
| RU2355404C2 (ru) | 2009-05-20 |
| KR100890375B1 (ko) | 2009-03-25 |
| ATE472608T1 (de) | 2010-07-15 |
| JP2008520240A (ja) | 2008-06-19 |
| AU2005306676B2 (en) | 2010-02-11 |
| PT1812583E (pt) | 2010-10-12 |
| US20060121445A1 (en) | 2006-06-08 |
| KR20070084295A (ko) | 2007-08-24 |
| CN101056988A (zh) | 2007-10-17 |
| US7413871B2 (en) | 2008-08-19 |
| ES2344796T3 (es) | 2010-09-07 |
| CA2587695A1 (en) | 2006-05-26 |
| DK1812583T3 (da) | 2010-08-02 |
| AU2005306676A1 (en) | 2006-05-26 |
| JP4704439B2 (ja) | 2011-06-15 |
| CA2587695C (en) | 2014-07-15 |
| HRP20100472T1 (hr) | 2010-10-31 |
| RU2007122628A (ru) | 2008-12-27 |
| WO2006055501A2 (en) | 2006-05-26 |
| WO2006055501A3 (en) | 2006-07-13 |
| HK1104324A1 (en) | 2008-01-11 |
| IL182853A0 (en) | 2007-08-19 |
| NZ554964A (en) | 2008-11-28 |
| DE602005022093D1 (de) | 2010-08-12 |
| RS51392B (en) | 2011-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109749986A (zh) | 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法 | |
| US20150284687A1 (en) | Cell therapy: a method and a composition for treating diabetes | |
| CN101056988B (zh) | 确定胰腺用于胰岛分离的合适性的评分方法 | |
| JP2013540276A (ja) | 創傷を治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞、およびその使用方法 | |
| CN107648267A (zh) | 通过人成肌细胞移植的疾病预防和缓解 | |
| SA515361161B1 (ar) | العلاج بالخلايا: طريقة وتركيبة لعلاج السكري | |
| Ayenehdeh et al. | Introducing a new experimental islet transplantation model using biomimetic hydrogel and a simple high yield islet isolation technique | |
| CN101272690B (zh) | 包含思科姆金琼脂糖的含有分泌细胞的大珠及其用途 | |
| EP1812583B1 (en) | Scoring method for determining pancreas suitability for islet isolation | |
| CN117721082B (zh) | 来源于初发胶质瘤的人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用 | |
| CN112616775B (zh) | 一种采用复合因子法建立健康sd雄性大鼠肝纤维化方法 | |
| Akumtoh et al. | Onchocerca ochengi male worms implanted in SCID mice and Gerbil: Relationship between microfilaridermia status of cows, nodular worm viability and fertility and worm survival in the rodents | |
| MX2007005917A (en) | Scoring method for determining pancreas suitability for islet isolation | |
| Zhao et al. | Islet Transplantation in Mice | |
| Quiterio Serras Rito Brandao | Establishment of a protocol for the isolation of feline pancreatic islets of Langerhans | |
| CN116603063A (zh) | 质子泵抑制剂的新用途 | |
| CN117721082A (zh) | 来源于初发胶质瘤的人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用 | |
| Reach et al. | 15th Workshop of the Study Group Artificial Insulin Delivery Systems | |
| Fraga et al. | Developing a Stable Diabetic Model for Human Islet Assessment in the NOD-scid Mouse | |
| JP2003052363A (ja) | ヒトガストリノーマを担持した動物モデル |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1104324 Country of ref document: HK |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1104324 Country of ref document: HK |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110615 Termination date: 20191114 |