CN101037465B

CN101037465B - 皂苷化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN101037465B
Application number: CN2006100650429A
Authority: CN
Inventors: 李向日; 林瑞超
Original assignee: BEIJING TONGRENTANG Co Ltd
Current assignee: Beijing TRT Pharma Co., Ltd.
Priority date: 2006-03-15
Filing date: 2006-03-15
Publication date: 2010-04-21
Anticipated expiration: 2026-03-15
Also published as: CN101037465A

Abstract

本发明涉及一种新的皂苷及含有该皂苷的零陵香提取物，所述的皂苷化合物在该提取物中的重量百分比含量至少为0.1％，以及一种制备该零陵香提取物的方法和其在抗炎抑菌方面的用途。

Description

皂苷化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种化合物(本发明中称为零陵香皂苷B)和含有该化合物的中药零陵香提取物，以及该提取物的提取方法，所述化合物和含有该化合物的零陵香提取物具有抑菌和抗炎药理作用。

背景技术

零陵香为报春花科珍珠菜属植物灵香草Lysimachia ofenum-graecumHance的干燥地上部分，主产于广西、广东、四川、云南、贵州等地。其始载于《本草纲目拾遗》，目前零陵香为《广西中药材标准》收载，又名香草、蕙草、广零陵香、熏草。零陵香味辛、甘，性平，无毒；归肺，胃经；具有解表，止痛，行气，驱蛔的功效，民间传统主要治疗感冒头痛，咽喉肿痛，牙痛，胸腹胀满，蛔虫病等。

在药用方面，零陵香可以和其他多种药物进行配伍，如具有祛暑避秽，开窍止痛功效的避瘟散，零陵香为其中的主要成分之一，现收载于《中华人民共和国药典》2005年版一部；另外，零陵香临床上多治疗夏季暑邪引起的头目眩晕，头痛鼻塞，恶心，呕吐，晕车晕船等；同时因有浓郁香味，零陵香又作为香料在食品工业、烟草行业有广泛的应用。

目前对零陵香的化学成分及药理作用研究主要集中于以下方面：

化学成分研究：全草中含有挥发油，油中主要是酯类、有机酸、烷烃等；楼凤昌等人从零陵香的乙醚提取物中分得了二十九烷、三十一烷、豆甾醇、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷和α-菠甾醇。

药理及毒理研究：药理实验证明其抑制流感病毒作用；毒理学和抗生育研究表明不妨碍生育能力，也无致畸作用，为低毒安全中药。

因为零陵香是一种具有较高经济价值的药用和香料植物，而现代对其研究较少，所以有关零陵香的具体药用价值、药用部位及其活性成分，有待于进一步深入开发研究。

发明内容

本发明人经过大量的实验摸索，结合现代先进的提取工艺，从零陵香中药中提取分离出了一种新的化合物(本发明中称为零陵香皂苷B)，以及含有零陵香皂苷B的提取物，实验证明，该提取物及其有效成分具有明显的抑菌、抗炎作用，极大地推动了对零陵香的研究。

本发明的目的在于提供一种化合物，其为一种新的皂甙类化合物，即，零陵香皂苷B，该化合物具有明显的抑菌、抗炎效果。

本发明的目的还在于提供一种含有零陵香皂苷B的零陵香提取物。

本发明的目的还在于提供一种含有零陵香皂苷B的零陵香提取物的提取方法，该方法工艺条件确凿，方法简便易行，可以使提取物中的零陵香皂苷B的含量至少为0.1％。

本发明还提供了含零陵香皂苷B的零陵香提取物的抑菌、抗炎功效。

本发明提供了一种化合物，即零陵香皂苷B，其具有下式(I)的结构：

本发明还提供含有零陵香皂苷B的零陵香提取物，零陵香皂苷B在提取物中重量百分含量至少为0.1％，优选0.1％～15％，更优选0.3％～10％。

本发明提供了一种含有零陵香皂苷B的零陵香提取物的制备方法，该方法包括将零陵香植物用醇提取，提取液上大孔吸附树脂，树脂再用乙醇洗脱的过程；具体为：将零陵香植物用60～70％的乙醇加热(优选加热回流)提取，提取液用非极性有机溶剂例如用石油醚、二氯甲烷依次萃取至无色，浓缩成浸膏R，将浸膏R上大孔吸附树脂，用浓度为30～70％的乙醇洗脱，洗脱液回收得到零陵香提取物。

本发明还提供了具有式I结构的化合物的制备方法，其中包括，将上述得到的零陵香提取物上硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇(19∶1～19∶10)为洗脱剂洗脱，优选配比为19∶3～19∶8，将洗脱液用高效液相色谱以10-50％的甲醇水溶液洗脱分离即得到式I结构的化合物(零陵香皂苷B)。

在本发明的优选实施方案中，含有零陵香皂苷B的零陵香提取物的制备方法为：零陵香药材，切碎，用70％乙醇加热提取，提取液浓缩，得乙醇浸膏，控制相对密度在1.2左右；乙醇浸膏稀释，以非极性有机溶剂石油醚、二氯甲烷依次萃取至无色后，将其剩余部分(极性部分)浓缩至干，得浸膏R，浸膏R的收率约5％-30％(一般为15～20％)；将R浸膏用水溶解上大孔吸附树脂柱(例如苯乙烯型大孔吸附树脂)，用低浓度(不超过30％)乙醇洗脱近无色除去杂质后，再用较高浓度(30～70％)乙醇洗脱近无色后，30～70％的乙醇洗脱液回收至干得到浸膏R1，浸膏R1相对于浸膏R的收率约5％-30％(一般10-20％)。浸膏R1就是零陵香提取物，以上就是含有零陵香皂苷B的提取物的制备方法。

将浸膏R1用硅胶柱层析分离，以二氯甲烷-甲醇比例为90∶10-60∶40的混合液洗脱，并用制备高效液相，C18反相色谱柱(制备型)，以甲醇-水比例为10∶90-50∶50的混合液洗脱，得到零陵香皂苷B。

零陵香皂苷B具有下列理化数据：为白色粉末，m.p：270℃-272℃(甲醇-水)，易溶于甲醇。Liebemann-Burchard反应阳性，点样于硅胶G板，喷以香草醛浓硫酸溶液，并于105℃加热5分钟，斑点为紫红色；MOLISH反应阳性。

分子式为C₆₀H₉₆O₂₅，MALDI-TOF MS m/z 1239[M+Na]⁺，1255[M+K]⁺，高分辨质谱m/z 1239.6157[M+Na]⁺。¹HNMR(氢谱)(500Hz，pyridine-d5)：6.33(H-21，d，10.5Hz)、δ4.19(H-28，2H)、1.91(当归酰基CH3，3H)、δ5.86(烯氢)、δ1.95(乙酰基CH3，3H)、四个糖端基质子信号[δ6.24，5.26，5.08，4.92]。

¹³C-NMR(碳谱)数据见下表。

NOE谱中阿拉伯糖质子(δ4.92)H-1/H-4(δ4.53)，(δ4.92)H-1/H-3(δ3.11，母核C-3)之间观察到NOE，说明阿拉伯糖为β-D-型，并与母核C-3β-羟基相连；葡萄糖质子(δ5.08)H-1/H-3(δ4.12)，(δ5.08)H-1/H-5(δ3.72)之间观察到NOE，说明为β-D-型；葡萄糖质子(δ5.26)H-1/H-3(δ4.27)，(δ5.26)H-1/H-5(δ3.98)之间观察到NOE，说明为β-D-型；鼠李糖质子(δ6.24)H-1/H-4(δ4.15)之间观察到NOE，说明羟基为α型；(δ4.65)H-16/H-28(δ4.19)之间观察到NOE，说明H-16为β型；H-21δ6.33(1H，d，J＝10.0Hz)，因此可以确定H-21为α位，H-22为β位。

表1.零陵香皂苷B的¹³C-NMR(碳谱)(125Hz，pyridine-d5)数据

零陵香皂苷B在提取物中的含量测定：采用高效液相色谱法测定。

1.仪器、试药及对照品

高效液相色谱仪Agilent 1100(四元泵、在线脱气、自动进样、恒温箱、DAD检测器)；超声波清洗器(型号SK5200H，功率200W，频率59KHz，上海科导超声仪器有限公司)；Milipore超纯水器。

乙腈(色谱纯，Fischer)，其余试剂均为分析纯(北京化工厂生产)。

2.对照品溶液的制备

精密称取零陵香皂苷B 2.1mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密吸取1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

3.供试品溶液的制备

精密称取提取物2g，置250ml具塞锥形瓶中，加入甲醇100ml，超声处理1小时，滤过，取续滤液取得。

4.色谱条件

流动相：乙腈-水(40∶60)

检测器：蒸发光散射检测器(40℃、2.0bar)

流速：1.0ml/分钟

色谱柱：C18(5mm，4.6×250mm)

5.方法学研究

(1)线性范围

精密量取对照品溶液2、4、6、8、10ul，注入上述色谱条件测定并回归，得到回归曲线Y＝821.74X-110.56 r＝0.9991，零陵香皂苷B在0.042-0.21ug峰面积与样品量之间成良好线性范围。

(2)精密度、稳定性考察

取样品供试液5ul，进样测定6次，RSD为1.2％；每间隔一定时间测定，48小时内测定峰面积基本一致。

(3)回收率考察

加样回收，回收率为100.3％(n＝3)，RSD＝1.2％。

6.含量测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液5ul，注入液相色谱仪。根据被测组分峰面积，用外标法计算含量。结果见表。

零陵香皂苷B含量	RSD％
零陵香皂苷B含量	RSD％	0.19％	1.5％

根据零陵香药材和产收季节不同，零陵香皂苷B在提取物中的含量也不同，经试验测得，零陵香皂苷B在提取物中重量百分比含量至少为0.1％，一般不超过15％，即0.1～15％，优选0.1 5～15％，更优选0.3～10％。

药理药效学实验

一、零陵香提取物抑菌作用研究

1.实验材料

1.1动物昆明种小鼠，Wistar大鼠，清洁级，雌雄各半。合格证号SCXK-(军)2002-001，以上动物均购于军事医学科学院实验动物中心。

1.2药物零陵香皂苷B：临用前用蒸馏水稀释，配成所需浓度的混悬液，体外抑菌实验中，需经100℃30min流通蒸汽灭菌。

止咳橘红口服液，北京同仁堂股份有限公司同仁堂药厂出品，批号3260113。

庆大霉素，中国药品生物制品检定所出品，批号0326-9713。

2.实验方法和结果

2.1体外抑菌试验

2.1.1菌种6个菌种，共30株，由解放军总医院微生物科提供

肺炎链球菌：临床分离菌4株；ATCC 49619 1株

金黄色葡萄球菌(简称金葡)：临床分离菌4株；ATCC 25923 1株

表皮葡萄球菌(简称表葡)：临床分离菌4株；ATCC 12228 1株

绿脓杆菌：临床分离菌4株；ATCC 27853 1株

大肠杆菌：临床分离菌4株；ATCC 25922 1株

肺炎克雷伯菌(简称肺克)：临床分离菌4株；ATCC 13883 1株

2.1.2方法：采用琼脂稀释法，零陵香皂苷B(pH6.5，用前均经100℃30分钟流通蒸汽灭菌；)以无菌生理盐水进行倍比稀释，分别加入琼脂培养基混匀，倾入平皿(肺炎链球菌平皿内加入10％羊血)，备用。

2.1.3结果：见表2。

表2体外抑菌实验结果

结果表明，该药对表葡有明显的抑制作用，最小抑菌浓度为21.4ug/ml，对肺炎链球菌标准菌的最小抑菌浓度亦为21.4ug/ml。

2.2体内抑菌实验

通过预试，分别采用小鼠90％死亡率的金黄色葡萄球菌增毒菌液浓度和表皮葡萄球菌增毒菌液浓度进行试验。

(注：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌均为临床分离株，由解放军总医院微生物科提供，本院微生物室培养，金黄色葡萄球菌浓度为1.8×10⁶cfu/ml，表皮葡萄球菌浓度为1.8×10⁵cfu/ml，用前于每10ml菌液中加入1g干酵母粉，即为增毒菌液)

2.2.1对致死性金黄色葡萄球菌腹腔感染小鼠的死亡保护作用

昆明种小鼠，雌雄各半，按体重分层后随机分为阴性对照(给等容积蒸馏水)、阳性对照药(止咳橘红口服液5.0ml/kg，人临床剂量10倍)、提取物等3组。各组连续3天按剂量灌胃给药或给水，第4天给药给水1小时后，腹腔注射1.8×10⁶cfu/ml金黄色葡萄球菌酵母增毒液0.2ml/20g体重，观察小鼠72小时内死亡情况。计算死亡率，经X2检验对结果进行统计。

结果见表3。

表3对致死性金黄色葡萄球菌感染小鼠的死亡保护作用

注：与阴性对照比，X²-检验，^*P＜0.05，^**P＜0.01，P＜0.001^***

由表3可见，皂苷B1.00mg/kg剂量下均对金黄色葡萄球菌感染小鼠具有明显的保护作用。

2.2.2对致死性表皮葡萄球菌腹腔感染小鼠的死亡保护作用

动物分组给药同前，第4天给药给水1小时后，腹腔注射表皮葡萄球菌浓度为1.8×10⁵cfu/ml酵母增毒液0.2ml/20g体重，观察小鼠72小时内死亡情况。计算死亡率，经X²检验对结果进行统计。结果见表4。

表4对致死性表皮葡萄球菌感染小鼠的死亡保护作用

注：与阴性对照比，X²-检验，^*P＜0.05，^**P＜0.01

由表4可见，皂苷B1.00g/kg剂量下均对表皮葡萄球菌感染小鼠具有明显的保护作用。表明该提取物对呼吸道一些常见菌均有一定的抑制作用。

二、抗炎作用研究

1实验材料

1.1动物：SPF级ICR小鼠，雄性，购自北京维通利华实验动物中心，合格证号SCXK(京)2002-0003。

1.2试药

零陵香皂苷B分别为0.25、0.50、1.00g/kg组。临用前用蒸馏水稀释，配成所需浓度的混悬液，体外抑菌实验中，需经100℃30min流通蒸汽灭菌。

阿斯匹林肠溶片，北京太阳药业有限公司生产，批号20021102，实验时研成细粉，以蒸馏水配制成混悬液。

2.实验方法和结果

2.1对急性渗出性炎症(二甲苯所致小鼠耳肿胀)的影响

ICR小鼠，体重19-21g，按体重随机均分8组，即空白对照组、阿司匹林0.2g/kg组、零陵香皂苷B0.25、0.50、1.00g/kg组，每组10只，连续灌胃给药4天，0.4ml/20g，空白对照组给相同体积的蒸溜水，于末次给药1h后，将60μl二甲苯均匀涂于每鼠右耳两面，40min后将小鼠颈椎脱臼处死，用直径8mm巩膜穿孔器取下左右耳片称重，求出两耳重量差、计算肿胀率，t检验比较组间差异，结果见表5。

肿胀率＝[(右耳重-左耳重)/左耳重]×100％。

表5对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响(X±SD)

注：与空白对照组比较^*P＜0.05 ^**P＜0.01

结果表明：零陵香皂苷B对二甲苯所致小鼠耳肿胀有明显抑制作用，与空白对照组比较P＜0.05-0.01，表明该药有明显抑制急性炎症渗透的作用。

上述实验表明：零陵香皂苷B对呼吸道一些常见菌均有一定的抑制作用，并对二甲苯所致小鼠渗出性炎症有明显的抑制作用。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行详细阐述，但并非用以限定本发明。

实施例1：

零陵香药材4.5Kg，切碎，用70％乙醇回流提取2次，每次2小时，乙醇提取液浓缩至近干，得乙醇浸膏约1.4Kg，控制相对密度在1.2左右；乙醇浸膏加水分散，以石油醚、二氯甲烷依次萃取至无色后，将其剩余部分浓缩至干，得浸膏R。取R浸膏用水溶解后上101型大孔吸附树脂，树脂用10％的乙醇和30％的乙醇洗脱近无色后弃去，再用70％乙醇洗脱至近无色，收集洗脱液回收至干，得到浸膏R1，即是含有零陵香皂苷B的提取物。

将浸膏R1反复上硅胶柱(柱层析用硅胶200目)，以19∶3～19∶8的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂洗脱，随行薄层TLC检测，合并相同的洗脱液，再用高效液相色谱，C18反相色谱柱，以甲醇-水比例为10∶90-50∶50的混合液梯度洗脱，检测波长为210nm，t_R为35-40分，得到零陵香皂苷B。

按照所述含测方法，根据被测组分峰面积，用外标法计算含量，经实验检测零陵香提取物中零陵香皂苷B的含量为0.5％。

实施例2：

零陵香药材(与实施例1的采收季节不同)4.5Kg，方法同实施例1，乙醇的浓度为60％，只是没有萃取的过程，得到零陵香提取物，按照所述含测方法，根据被测组分峰面积，用外标法计算含量，经实验检测零陵香提取物中零陵香皂苷B的含量为0.1％。

实施例3：

零陵香药材(与实施例1和2的产地不同)4.5Kg，方法同实施例1，得到零陵香提取物，按照所述含测方法，根据被测组分峰面积，用外标法计算含量，经实验检测零陵香提取物中零陵香皂苷B的含量为0.8％。

实施例4：

零陵香药材(与实施例1～3的产地和采收季节均不同)4.5Kg，方法同实施例1，乙醇的浓度为70％，只是增加了反复萃取除杂的步骤，得到零陵香提取物，按照所述含测方法，根据被测组分峰面积，用外标法计算含量，经实验检测零陵香提取物中零陵香皂苷B的重量百分比含量为7％。

实施例5：

零陵香药材(与实施例1～4的产地和采收季节均不同)4.5Kg，方法同实施例1，乙醇的浓度为60％，只是没有萃取的过程，得到零陵香提取物，按照所述含测方法，根据被测组分峰面积，用外标法计算含量，经实验检测零陵香提取物中零陵香皂苷B的重量百分比含量为0.1％。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims

1.一种具有式I结构的化合物：

2.一种零陵香提取物，其特征在于该提取物中含有权利要求1所述的式I结构的化合物，所述式I化合物在该提取物中的重量百分比含量至少为0.1％，且该提取物是通过以下方法得到的：将零陵香植物用醇提取，提取液上大孔吸附树脂，树脂再用乙醇洗脱，收集洗脱液即为零陵香提取物。

3.权利要求2所述的零陵香提取物，其中所述式I化合物在该提取物中的重量百分比含量为0.1％～15％。

4.权利要求3所述的零陵香提取物，其中所述式I化合物在该提取物中的重量百分比含量为0.15～15％。

5.权利要求2所述的零陵香提取物的制备方法，其中包括，将零陵香植物用醇提取，提取液上大孔吸附树脂，树脂再用乙醇洗脱，得到洗脱液即为零陵香提取物。

6.权利要求5所述的零陵香提取物的制备方法，其中包括，将零陵香植物用60～70％的乙醇加热提取，提取液用石油醚、二氯甲烷依次萃取至无色，浓缩成浸膏，将浸膏上大孔吸附树脂，用浓度为30～70％的乙醇洗脱，洗脱液回收得到零陵香提取物。

7.权利要求1所述的化合物的制备方法，其中包括，将零陵香植物用醇提取，提取液上大孔吸附树脂，树脂再用乙醇洗脱得到零陵香提取物，该提取物再上硅胶柱，以重量配比为19∶1～19∶10的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂洗脱，将洗脱液用高效液相色谱以10-50％的甲醇水溶液洗脱分离。

8.权利要求5-7任一项所述的制备方法，其中所述的大孔吸附树脂为苯乙烯型大孔吸附树脂。

9.权利要求1所述的化合物在制备抗炎和抑菌药物中的用途。