CN101035530B - Vegf抑制 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于抑制受试者中VEGF产生或分泌的方法，包括向受试者给药有效量的式I化合物。本发明还提供用于治疗或预防与VEGF产生或分泌的异常水平相关的病症的方法。

Description

VEGF抑制
技术领域
本发明大体上涉及对与VEGF的产生和/或分泌的异常水平相关的病症的治疗。
背景技术
血管内皮生长因子[VEGF；也称为血管通透性因子(VPF)]是一种高度保守的、有效的多功能的细胞因子。VEGF的产生和或分泌的异常水平与多种病理性病症有关。例如，已在癌症患者的胸水和腹水中检测到高浓度的具有生物活性的VEGF(Zebrowski等，1999a，b)。
腹水是在腹腔中积累的液体，可由多种病症——包括肿瘤和其它病状例如慢性肝病——导致。多数情况下产生腹水的原因是肝硬化，并且预后通常较差。
恶性腹水的积累是腹膜癌患者发病和死亡的重要原因。形成恶性腹水的原因包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌(Smith和Jayson，2003)。例如，卵巢癌的恶变主要限于腹腔内，并且通常发展至腹水形式(Ozols等，1980)。肿瘤增大和腹水积累都不利于存活(hasumi等，2002)。对晚期卵巢癌患者的现有治疗性治疗方法结合细胞减灭术与全身性化学疗法，目前认为紫杉醇与顺铂的结合是针对III期和IV期的初期化学治疗(Burbridge等，1999)。但是三分之二的患者在诊断时已经为疾病晚期，其预后差与腹水的迅速积累以及高度扩散的多形性细胞表型有关。需要一种有效的方法用于治疗腹水以及与腹水相关的病症。
腹水与腹膜以及肿瘤微血管的通透性过高有关，一些研究已经指出VEGF通过增加血管通透性而在腹水形成中起作用。更一般的情况下，VEGF对血管内皮具有许多重要影响，包括促使新血管形成。VEGF具有很强的提高血管通透性的活性，VEGF的产生或分泌的异常水平会导致微血管的通透性过高。现认为VEGF是肿瘤生长所需的一个关键因素，并且VEGF涉及许多其它的病状，例如糖尿病、关节炎包括类风湿性关节炎、牛皮癣、子宫内膜异位、脑水肿、动脉粥样硬化、缺血性心脏病以及视网膜疾病例如年龄相关性黄斑变性。
肿瘤分泌VEGF对腹水积累有重要作用。肿瘤细胞通常作为VEGF的主要来源，但与肿瘤相关的间质也是VEGF产生的重要部位。通过例如使用VEGF抑制剂阻断肿瘤细胞的VEGF产生或分泌，在动物研究中已显示出对腹水形成的抑制作用(Zebrowski等，1999a，b；Xu等，2000)。也有越来越多的证据表明VEGF的产生和分泌并不只限于实体肿瘤，各种白血病和其它血液病性恶性肿瘤中也表达出VEGF和VEGF受体。
因此，VEGF对于治疗性介入而言是一个有吸引力的目标，已经寻求了一些阻断VEGF活性的方法，包括单克隆抗体、VEGF受体拮抗剂、酪氨酸激酶拮抗剂以及可溶性VEGF受体(VEGF陷阱(VEGF-trap))。但还需要有效的方法抑制VEGF产生和/或分泌以及对与VEGF产生和/或分泌相关的病症进行治疗。
本发明基于发明人的令人惊讶的发现：苯并咪唑氨基甲酸酯阿苯哒唑(albendazole)对体外人卵巢癌细胞分泌VEGF的水平和体内的VEGF水平有强效作用，并对多种与VEGF水平异常相关的病症具有显著的抑制效果。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供一种抑制受试者体内VEGF的产生或分泌的方法，该方法包括向受试者给药有效量的式I化合物或其代谢物、衍生物或类似物：
Figure G05829258320070302D000021
其中R1选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、-SR7、-SOR8、-SO2R9、-SCN、B’(CH2)nBR10、-C(O)-R11或-OR12、COOR13、-NO2、NR13aCOOR13b、异硫氰基或-CN，其中R7至R13b彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基，B和B’彼此独立地选自O、S、S(O)或SO2，n为1至4；
R2选自H，或者被取代或未被取代的烷基；
R3选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、五元或六元杂环——所述五元或六元杂环的杂原子选自一个或多个O、S和/或N、-SR14、-OR15、-SOR16、-SO2R17、-SCN、-C(O)-R18、-OR19、NR20COOR21，其中R15至R21彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基或芳基烷基。
在一种实施方式中R1取代发生在5或6位。
化合物可以为式II的苯并咪唑氨基甲酸酯：
Figure G05829258320070302D000031
其中R1选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、-SR7、-SOR8、-SO2R9、-SCN、B’(CH2)nBR10、-C(O)-R11或-OR12、COOR13、-NO2、NR13aCOOR13b、异硫氰基或-CN，其中R7至R13b彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基，B和B’彼此独立地选自O、S、S(O)或SO2，n为1至4；
R21为H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基或芳基烷基。
化合物可以为式III化合物：
Figure G05829258320070302D000041
其中R1选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、-SR7、-SOR8、-SO2R9、-SCN、B’(CH2)nBR10、-C(O)-R11或-OR12、COOR13、-NO2、NR13aCOOR13b、异硫氰基或-CN，其中R7至R13b彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基，B和B’彼此独立地选自O、S、S(O)或SO2，n为1至4；
化合物可选自阿苯哒唑、阿苯哒唑亚砜(albendazolesulphoxide)、甲苯咪唑(mebendazole)、氟苯哒唑(flubendazole)、三氯苯哒唑(triclabendazole)、奥芬达唑(oxfenbendazole)、芦斯苯达唑(luxabendazole)、噻苯咪唑酯(cambendazole)、奥苯达唑(oxibendazole)、丁苯咪唑(parbendazole)、噻苯咪唑(thiabendazole)、环苯达唑(cyclobendazole)、吹苯达唑(dribendazole)、依替苯达唑(etibendazole)和硫苯达唑(fenbendazole)。
在一种实施方式中，化合物为阿苯哒唑或其代谢物、衍生物或类似物。
VEGF可由肿瘤细胞产生或分泌。肿瘤细胞可以是卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、肝肿瘤、胰肿瘤、胃肿瘤、子宫内膜肿瘤、肾肿瘤或其它原发性或转移性肿瘤细胞。
VEGF的产生或分泌可与液体在体腔中的积累相关，例如与腹水或胸腔积液相关。
VEGF的产生或分泌可与视网膜性新血管形成，例如增殖性视网膜病或黄斑变性中的视网膜性新血管形成相关。
根据本发明的第二方面，提供一种治疗或预防与受试者中VEGF的产生或分泌的异常水平相关的病症的方法，该方法包括向受试者给药有效量的式I化合物或其代谢物、衍生物或类似物：
Figure G05829258320070302D000051
其中R1选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、-SR7、-SOR8、-SO2R9、-SCN、B’(CH2)nBR10、-C(O)-R11或-OR12、COOR13、-NO2、NR13aCOOR13b、异硫氰基或-CN，其中R7至R13b彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基，B和B’彼此独立地选自O、S、S(O)或SO2，n为1至4；
R2选自H，或者被取代或未被取代的烷基；
R3选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、五元或六元杂环——所述五元或六元杂环的杂原子选自一个或多个O、S和/或N、-SR14、-OR15、-SOR16、-SO2R17、-SCN、-C(O)-R18、-OR19、NR20COOR21，其中R15至R21彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基或芳基烷基。
在一种实施方式中，化合物为阿苯哒唑或其代谢物、衍生物或类似物。
所述病症可与血管通透性增加相关。所述病症可选自：腹水、肝硬化、胸膜积液、脑水肿、肺水肿、缺血性心脏病、黄斑变性、增殖性视网膜病、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、牛皮癣、子宫内膜异位以及关节炎例如类风湿性关节炎。
化合物的给药根据所治疗的病症的性质可以是全身性的或者区域性的。给药方式可以为腔内给药、膀胱内给药、肌内给药、动脉内给药、静脉内给药、皮下给药、外用或口服。腔内给药可以为腹腔内给药或胸腔内给药。
根据本发明的第三方面，提供一种治疗或预防受试者中腹水或与腹水相关的病症的方法，该方法包括向受试者给药有效量的式I化合物或其代谢物、衍生物或类似物：
Figure G05829258320070302D000061
其中R1选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、-SR7、-SOR8、-SO2R9、-SCN、B’(CH2)nBR10、-C(O)-R11或-OR12、COOR13、-NO2、NR13aCOOR13b、异硫氰基或-CN，其中R7至R13b彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基，B和B’彼此独立地选自O、S、S(O)或SO2，n为1至4；
R2选自H，或者被取代或未被取代的烷基；
R3选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、五元或六元杂环——所述五元或六元杂环的杂原子选自一个或多个O、S和/或N、-SR14、-OR15、-SOR16、-SO2R17、-SCN、-C(O)-R18、-OR19、NR20COOR21，其中R15至R21彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基或芳基烷基。
在一种实施方式中，化合物为阿苯哒唑或其代谢物、衍生物或类似物。
腹水可以是恶性腹水。与腹水相关的病症可以是肝硬化。
化合物可以进行全身给药或区域给药。化合物可以进行腹腔内给药。
根据本发明的第四方面，提供一种治疗或预防受试者的视网膜疾病的方法，该方法包括向受试者给药有效量的式I化合物或其代谢物、衍生物或类似物：
Figure G05829258320070302D000071
其中R1选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、-SR7、-SOR8、-SO2R9、-SCN、B’(CH2)nBR10、-C(O)-R11或-OR12、COOR13、-NO2、NR13aCOOR13b、异硫氰基或-CN，其中R7至R13b彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基，B和B’彼此独立地选自O、S、S(O)或SO2，n为1至4；
R2选自H，或者被取代或未被取代的烷基；
R3选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、五元或六元杂环——所述五元或六元杂环的杂原子选自一个或多个O、S和/或N、-SR14、-OR15、-SOR16、-SO2R17、-SCN、-C(O)-R18、-OR19、NR20COOR21，其中R15至R21彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基或芳基烷基。
在一种实施方式中，化合物为阿苯哒唑或其代谢物、衍生物或类似物。
所述视网膜疾病可选自增殖性视网膜病、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病或黄斑变性。
根据上述任何一方面以及实施方式，化合物可以以与一种或多种可药用载体、辅剂或稀释剂的组合物形式给药。
根据本发明的第五方面，提供一种用于抑制细胞的VEGF产生或分泌的组合物，其中组合物包括式I化合物和一种或多种可药用的载体、稀释剂或辅剂。
根据本发明的第六方面，提供一种用于治疗或预防腹水或与腹水相关的病症的组合物，其中组合物包括式I化合物和一种或多种可药用的载体、稀释剂或辅剂。
根据本发明的第七方面，提供一种用于治疗或预防视网膜疾病的组合物，其中组合物包括式I化合物和一种或多种可药用的载体、稀释剂或辅剂。
根据本发明的第八方面，提供一种用于治疗或预防与VEGF的产生或分泌相关的病症的组合物，其中组合物包括式I化合物和一种或多种可药用的载体、稀释剂或辅剂。
根据本发明的第九方面，提供一种用于为受试者设计苯并咪唑氨基甲酸酯治疗方案的方法，该方法包括在一种或多种候选苯并咪唑氨基甲酸酯存在和不存在的情况下监测受试者中VEGF的血清浓度并调整苯并咪唑氨基甲酸酯的种类和/或剂量以实现VEGF血清浓度的降低。
根据本发明的第十方面，提供一种用于治疗如下受试者的方法，所述受试者需要使用根据第九方面设计的苯并咪唑氨基甲酸酯治疗方案进行治疗。
异构体也拟包括在上述各方面和实施方式中，所述异构体包括式I、II、III化合物的立体异构体和几何异构体，以及其互变异构形式。
定义
在本说明书中，术语“包括”意为“主要包括，但并非须仅包括”。此外，词语“包括”的各种变化形式，例如分别作为单数或复数主语的谓语的“包括”，具有相应变化的含义。
本申请中所用的关于VEGF水平的术语“抑制”意为阻止、减少或者改善VEGF的产生或分泌。例如，根据具体情况——包括所治疗的病症的性质，抑制不一定意味着完全阻断VEGF的产生或分泌，而是将VEGF的产生降低到足以获得所需的效果的程度。
本申请中所使用的术语“治疗”，无论是名词还是动词，均指通过无论任何方法医治一种病症或症状、预防一种病症或疾病的产生、或者阻止、妨碍、延缓、逆转一种病症或疾病或其它不良症状的发展的任何及全部用途。
本申请中使用的术语“与腹水相关的病症”指至少部分地与腹腔中过多的液体积累相关的病症。所述病症可以以这种积累为特征，可以作为这种积累的直接或间接的结果，或者其本身导致腹腔中过多的液体积累。一种示例性的与腹水相关的病症是肝硬化。
本申请中使用的术语“有效量”在其含义内包括无毒但足够提供所需效果的试剂或化合物的量。所需的确切的量随受试者的不同而变化，取决于如下因素，例如所治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、所治疗病症的严重性、所给药的具体试剂以及给药方式等。因此，不可能指定确切的“有效量”。但是，对于任何给定的情况，可以由本领域的普通技术人员仅使用常规实验方法确定合适的“有效量”。
本申请中使用的术语“烷基”在其含义内包括一价的饱和的直链和支链烃基。
本申请中使用的术语“烯基”在其含义内包括一价的直链和支链的具有至少一个双键的烃基。
本申请中使用的术语“芳基”在其含义内包括一价的、单环或多环的、共轭的和稠合的芳烃基。
附图说明
现结合以下附图对本发明进行说明，这些附图仅为示例性的：
图1阿苯哒唑腹腔内治疗(每周150mg/kg×3次，治疗4周)对生有OVCAR-3腹膜肿瘤的裸小鼠的腹水的产生的影响。该图示出了对照小鼠和阿苯哒唑(ABZ)治疗小鼠的腹水体积(ml)。各数值代表6至8个测定值的平均值±标准误差。
图2阿苯哒唑对从生有肿瘤的裸小鼠中抽出的腹水中OVCAR-3细胞数目的影响。各数值代表6至8个测定值的平均值±标准误差。
图3阿苯哒唑对裸小鼠的腹膜肿瘤的总重量的影响。各数值代表6至8个测定值的平均值±标准误差。
图4阿苯哒唑对生有OVCAR-3肿瘤的裸小鼠中CA-125水平的影响。各数值代表6至8个测定值的平均值±标准误差。
图5生有OVCAR-3腹膜肿瘤的裸小鼠的腹水中的VEGF水平。各数值代表6至8个测定值的平均值±标准误差。
图6阿苯哒唑对生有OVCAR-3肿瘤的裸小鼠中VEGF血浆水平的影响。各数值代表6至8个测定值的平均值±标准误差。
图7显示了从生有OVCAR-3腹膜肿瘤的裸小鼠的腹水液或腹膜洗液中抽取的细胞中提取的各种VEGF mRNA同种型的RT-PCR。A-C为对照动物的细胞，D-F为从阿苯哒唑腹腔内治疗(每周150mg/kg×3次，治疗4周)的动物中提取的细胞。
图8阿苯哒唑治疗6小时对体外SKOV-3细胞中VEGF的产生的影响。各数值代表4个测定值的平均值±标准误差。A.不同浓度(μM)的阿苯哒唑下的VEGF水平(pg/105个细胞)。B.使用6ng/ml的MMP-9进行联合治疗后不同浓度(μM)阿苯哒唑下的VEGF水平(pg/105个细胞)。
图9用DMSO、PBS或不同浓度的阿苯哒唑(2μl中含有0.1μg、1μg或10μg阿苯哒唑)治疗后在正常含氧量和高含氧量(75％O2)的条件下小鼠的视网膜新生血管形成(血管计数)。
图10注射含有阿苯哒唑的DMSO(A)或单独注射DMSO(B)后，用苏木精和曙红染色的小鼠视网膜切片(50μm)的光显微照片。
具体实施方式
苯并咪唑氨基甲酸酯化合物是广谱驱虫药，广泛用于防治哺乳动物、包括人的寄生肠虫(helminth parasite)。认为苯并咪唑氨基甲酸酯的主要作用对象是微管蛋白，该化合物具有抑制微管蛋白的聚合并使微管不稳定的作用。一种上述苯并咪唑氨基甲酸酯是阿苯哒唑(5-丙基硫代-1H-苯并咪唑-2-基-氨基甲酸甲酯)。其它苯并咪唑氨基甲酸酯包括甲苯咪唑、氟苯哒唑、三氯苯哒唑、奥芬达唑、芦斯苯达唑、噻苯咪唑酯、奥苯达唑、丁苯咪唑、噻苯咪唑、环苯达唑、吹苯达唑、依替苯达唑和硫苯达唑。
发明人之前已在动物模型和临床研究中发现阿苯哒唑对一系列体外癌细胞系和癌具有抗增殖作用(WO 02/076454，其公开内容以引用的方式纳入本申请中)。如本申请的公开内容所示，发明人现已证明阿苯哒唑对体外人卵巢癌细胞分泌VEGF的水平、对腹水产生、视网膜新生血管形成以及对体内的VEGF水平具有强效作用。
因此，本发明一方面涉及一种抑制受试者细胞产生或分泌VEGF的方法，该方法包括向受试者给药有效量的式I化合物或者其类似物、代谢物或衍生物：
Figure G05829258320070302D000111
其中R1选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、-SR7、-SOR8、-SO2R9、-SCN、B’(CH2)nBR10、-C(O)-R11或-OR12、COOR13、-NO2、NR13aCOOR13b、异硫氰基或-CN，其中R7至R13b彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基，B和B’彼此独立地选自O、S、S(O)或SO2，n为1至4；
R2选自H，或者被取代或未被取代的烷基；
R3选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、五元或六元杂环——所述五元或六元杂环的杂原子选自一个或多个O、S和/或N、-SR14、-OR15、-SOR16、-SCN、-SO2R17、-C(O)-R18、-OR19、NR20COOR21，其中R15至R21彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基或芳基烷基。
典型的化合物为式II的苯并咪唑氨基甲酸酯或者为式III化合物：
Figure G05829258320070302D000112
其中R1选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、-SR7、-SOR8、-SO2R9、-SCN、B’(CH2)nBR10、-C(O)-R11或-OR12、COOR13、-NO2、NR13aCOOR13b、异硫氰基或-CN，其中R7至R13b彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基，B和B’彼此独立地选自O、S、S(O)或SO2，n为1至4；
R21为H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基或芳基烷基，
Figure G05829258320070302D000121
其中R1选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基、-SR7、-SOR8、-SO2R9、-SCN、B’(CH2)nBR10、-C(O)-R11或-OR12、COOR13、-NO2、NR13aCOOR13b、异硫氰基或-CN，其中R7至R13b彼此独立地选自H、被取代或未被取代的直链或支链的烷基、烯基、烯基烷基、环烷基、环烷基烷基、环烯基烷基、芳基、芳基烷基，B和B’彼此独立地选自O、S、S(O)或SO2，n为1至4。
本领域技术人员可容易地认识到可以存在上述化合物的异构体，包括立体异构体和几何异构体，并且使用这些异构体也包括在本发明的范围内。此外，也可以考虑使用上述化合物的互变异构体形式。例如在许多互变异构体形式中可以存在被取代的苯并咪唑基团，包括R1取代基在4位至7位中的任意一个位置上的取代形式。
阿苯哒唑或其代谢物、衍生物或类似物(例如阿苯哒唑亚砜或阿苯哒唑砜)是一种对于本发明的方法和组合物而言特别有用的苯并咪唑氨基甲酸酯。但本领域的技术人员应很容易认识到也可以使用其它苯并咪唑氨基甲酸酯。其它合适的苯并咪唑氨基甲酸酯包括但不限于甲苯咪唑、氟苯哒唑、三氯苯哒唑、奥芬达唑、芦斯苯达唑、噻苯咪唑酯、奥苯达唑、丁苯咪唑、噻苯咪唑、环苯达唑、吹苯达唑、依替苯达唑和硫苯达唑。
病症
上述化合物可以在进行治疗的受试者体内起抑制细胞的VEGF产生和/或抑制细胞的VEGF分泌的作用。因此，本发明提供使用上述化合物治疗或预防下述病症的方法和组合物，所述病症与异常的、一般为升高的VEGF产生或分泌水平相关，包括与增加的血管通透性相关的病症。本发明的方法和组合物适用的病症包括但不限于腹水、肝硬化和其它与腹水相关的病症、胸膜积液、脑水肿、肺水肿、缺血性心脏病、黄斑变性例如年龄相关性黄斑变性、增殖性视网膜病、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、牛皮癣、子宫内膜异位以及关节炎例如类风湿性关节炎。
本申请中公开的发明人的发现证明阿苯哒唑的腹腔内给药迅速降低VEGF的血清水平。因此，监测VEGF的血清水平使得能够设计并实现对需要苯并咪唑氨基甲酸酯治疗的病人进行适当的这种治疗。因此，本发明的一种实施方式为受试者提供一种设计苯并咪唑氨基甲酸酯疗法的方法，包括在一种或多种候选的苯并咪唑氨基甲酸酯存在和不存在的情况下监测受试者中VEGF的血清浓度，并调整苯并咪唑氨基甲酸酯的种类和/或剂量以实现肿瘤减少或VEGF的血清浓度降低。
组合物和给药途径
本发明的实施方式涉及用于抑制受试者中VEGF的产生或分泌并治疗或预防与VEGF的产生或分泌的异常水平相关的病症的组合物。
根据本发明的方法，化合物和组合物可以通过任何合适的途径全身给药、区域给药或局部给药。在任何给定的情况下具体的给药途径取决于多种因素，包括所治疗的病症的性质、病症的严重性和范围、具体化合物所需的递送剂量以及化合物可能的副作用。
例如，对于需要将适当浓度的所需化合物直接递送到待治疗的躯体部位的情况下，给药可为区域性的而不是全身性的。区域给药使得能够向所需部位递送局部浓度非常高的所需化合物，从而适于达到所需的治疗或预防效果同时避免使躯体中其它器官暴露于化合物中，从而有效地减少副作用。
例如，依据本发明实施方式的给药可以通过任何标准途径实现，包括腔内给药、膀胱内给药、肌内给药、动脉内给药、静脉内给药、眼内给药、皮下给药、外用或口服。腔内给药可以为腹腔内给药或胸腔内给药。例如，在治疗腹水时，所需的化合物可以进行腹腔内给药，治疗胸膜积液时，可以进行胸腔内给药。
通常，适合的组合物可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备，并且可以包括可药用的稀释剂、辅剂和/或赋形剂。稀释剂、辅剂和赋形剂必须为“可药用的”，即与组合物中的其它成分相容并且对其接受者无害。
可药用的稀释剂的实例为去矿质水或蒸馏水；盐水溶液；植物油例如花生油(peanut oil)、红花油、橄榄油、棉子油、玉米油、芝麻油、花生油(arachis oil)或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如聚甲基硅氧烷、聚苯基硅氧烷和聚甲基苯基硅氧烷；挥发性硅酮(silicone)；矿物油例如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇(aralkanol)；低级聚二醇或低级烷撑二醇例如聚乙二醇、聚丙二醇、1，2-亚乙基二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或丙三醇；脂肪酸酯例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜聚糖；黄蓍树胶或阿拉伯树胶，以及矿脂。载体一般占组合物重量的1％到99.9％。
对于可注射溶液或可注射悬浮液的给药，无毒的可胃肠外用的稀释剂或载体可包括林格溶液、中链甘油三酯(MCT)、等渗盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、乙醇和1，2-丙二醇。
一些适用于口服的载体、稀释剂、赋形剂和辅剂的实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯树胶、黄蓍树胶、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、明胶和卵磷脂。此外这些口服制剂可以含有合适的调味剂和着色剂。当以胶囊形式使用时，胶囊可以用延迟崩解的的化合物，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯进行包衣。
辅剂一般包括润滑剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。
用于口服给药的固体形式可包含人和兽的医药实践中可药用的粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。适合的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍树胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。适合的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、天冬甜素或糖精。适合的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜耳胶、黄原酸胶、膨润土、海藻酸或琼脂。适合的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露糖醇、葡萄糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。适合的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃味、橙味或木莓味调味剂。适合的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、紫胶或谷蛋白。适合的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。适合的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。适合的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于口服给药的液体形式除了包含上述试剂外还可以包含液态载体。适合的液态载体包括水、油例如橄榄油、花生油(peanut oil)、芝麻油、葵花子油、红花油、花生油(arachis oil)、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙三醇、脂肪醇、甘油三酯或这些液态载体的混合物。
用于口服给药的悬浮液可以进一步包括分散剂和/或悬浮剂。适合的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰醇。适合的分散剂包括卵磷脂，脂肪酸例如硬脂酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯山梨糖醇的单油酸或二油酸、硬脂酸或月桂酸的酯，聚氧乙烯脱水山梨醇的单油酸或二油酸、硬脂酸或月桂酸的酯等。
用于口服给药的乳状液可进一步包括一种或多种乳化剂。适合的乳化剂包括以上例举的分散剂或天然树胶例如瓜耳胶、阿拉伯树胶或黄蓍树胶。
用于制备可胃肠外给药的组合物的方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的，在例如Remington’s Pharmaceutical Science，15thed，Mack Publishing Company，Easton，Pa.中有详细描述，这里通过引用的方式将其纳入本申请中。
组合物可以包括任何适合的表面活性剂例如阴离子、阳离子或非离子的表面活性剂，例如脱水山梨醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可以包括悬浮剂例如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料例如二氧化硅质硅石(silicaceous silica)、以及其他成分例如羊毛脂。
组合物还可以以脂质体形式给药。脂质体通常衍生自磷脂或其他脂类物质，由分散在水性介质中的单层或多层水合液晶(hydrated liquidcrystal)构成。可以使用任何无毒的、生理可接受的并可代谢的、能构成脂质体的脂类。脂质体形式的组合物可包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂类为天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法在本领域中已知，关于这一点具体参考：Prescott，Ed，Methods in Cell Biology，Volume XIV，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，33页及以后内容等等，其内容以引用的方式纳入本申请中。
本文中公开的化合物和组合物既可进行治疗性给药也可进行预防性给药。在治疗应用中，将化合物和组合物以足以治愈或至少部分抑制病症及其症状和/或并发症的量给药至已患有病症的患者。化合物或组合物应提供足以有效治疗患者的量的活性化合物。
对于任何具体的受试者，所给药的化合物的有效剂量水平取决于多种因素，包括：所治疗的病症的种类和病症的发展阶段；所用的化合物的活性；所用的组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；化合物的螯合(sequestration)速度；治疗时间；治疗中联合使用或同时使用的药物，以及药学中其他已知的相关的因素。
本领域技术人员能够通过常规实验确定治疗适用症所需的有效的无毒的剂量。这通常依具体病例而定。
通常，预计有效剂量在约0.0001mg至约1000mg/kg体重/24小时范围内；典型地，为约0.001mg至约750mg/kg体重/24小时；约0.01mg至约500mg/kg体重/24小时；约0.1mg至约500mg/kg体重/24小时；约0.1mg至约250mg/kg体重/24小时；或约1.0mg至约250mg/kg体重/24小时。更典型地，预计有效剂量在约10mg至约200mg/kg体重/24小时范围内。
或者，有效剂量可最高至约5000mg/m2。通常，预计有效剂量在约10至约5000mg/m2范围内，典型地，在约10至约2500mg/m2范围内，在约25至约2000mg/m2范围内，在约50至约1500mg/m2范围内，在约50至约1000mg/m2范围内，或约75至约600mg/m2范围内。
此外，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是可以通过所治疗的病症的性质和范围，给药的形式、途径和部位，以及所治疗的具体个体的性质确定各次给药的最佳量和间隔。也可以通过常规技术确定这种最佳条件。
对于本领域普通技术人员显而易见的还有最佳的治疗过程，例如对于确定的天数，组合物每天的给药次数可由本领域技术人员通过治疗确定试验的常规过程来确定。
现参照下列具体实施例进一步更详细地描述本发明，这些实施例不应以任何方式解释为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1-对生有OVCAR-3腹膜肿瘤的裸小鼠的阿苯哒唑治疗
细胞系NIH：OVCAR-3(ATCC入藏登记号HTB 161)的细胞具有在雌性无胸腺裸小鼠腹腔内生长的能力。进行腹腔内注射后，动物形成与临床的卵巢癌表现相似的转移扩散。病情进行的特征在于产生大量腹水、大范围的腹腔内肿瘤并转移到肺。恶性腹水细胞表达卵巢癌相关的抗原CA-125。小鼠模型显示出与人卵巢癌一致的组织病理学和胚胎学特征，与人类疾病类似的可再现的转移模式，跟踪治疗应答的适合标记，以及与人卵巢癌类似的药物敏感性曲线(Hamilton等，1984)。
将体外培养的OVCAR-3细胞(13×106)皮下注射到裸小鼠中。八周后将肿瘤解剖、切碎并在PBS中洗涤3次。将培养的细胞悬浮在含有0.3％Bacto琼脂的RPMI中使细胞密度达到5×106细胞/ml，所述RPMI中还添加了20％的马血清、青霉素(100u/ml)、链霉素(2mg/ml)和胰岛素3u/ml、EGF 100ng/ml、天冬酰胺(0.1mg/ml)和DEAE葡聚糖0.5mg/ml。加入浓度为50μM的2-巯基丙醇，然后将细胞接入平板。将一份(1ml)所得的混合物加入到合并有0.2ml条件化培养基的饲养层上，所述培养基由在0.5％Bacto琼脂中矿物油致敏的BALB/c小鼠的贴壁脾细胞进行条件化处理。在37℃下、在5％CO2中培育培养物。5天后，将0.8ml含有EGF(10ng/ml)的生长培养基铺在琼脂糖表面。3周后，收集全部细胞集落并平铺在75cm2烧瓶中。然后将这些细胞皮下注射到小鼠中。将收集自这些皮下肿瘤的50×106个肿瘤细胞悬浮在1ml培养基中并腹腔内注射到各载体裸小鼠中。收集腹水，将其用无菌盐水洗涤，并在4℃下以300g的转速离心处理5分钟。
将从腹水中收集到的并悬浮在1.0ml培养基(RPMI 1640)中的10×106个活体肿瘤细胞腹腔内注射到各试验动物中。对于全部实验，使用6-8周龄雌性无胸腺Balb c nu/nu裸小鼠(Animal Resources Centre，Perth，西澳大利亚)作为试验动物。在New South Wales大学的Biological Resouces Centre将这些动物圈入无病原体的隔离环境中，并任意饲以经过高压灭菌的压缩饲料和水。每天检查动物的一般健康情况。所用的全部试验方案经New South Wales大学的Animal EthicsCommittee批准。
按上述方法进行腹腔内接种的小鼠被随机分配到阿苯哒唑治疗组或对照组。进行药物治疗(每周3次，进行4周)。对全部接受治疗的动物以150mg/kg的剂量给药悬浮在羧甲基纤维素中的0.5％的阿苯哒唑。对于口服给药，制备15mg/ml的悬浮液(0.1ml/10g体重)，对于腹腔内治疗，使用3mg/ml的悬浮液(3mg/1ml/20g小鼠)。
将动物用戊巴比通麻醉并通过心脏穿刺收集血样，之后立即进行安乐死。通过使用过量的麻醉药使动物安乐死。对于腹水的收集，将2ml生理盐水注射到腹腔内并通过揉捏使腹腔的内容物混合。然后回收腹水，记录其体积(图1)并统计尚存的活体肿瘤细胞的个数(图2)。将血浆和除去细胞的腹水贮存在-80℃以待后续的分析。
将腹腔中的肿瘤解剖、称重(图3)并贮存以待后续分析。还检查了向动物的肺、肝、脾、胃和胰的转移情况(数据未显示)。由St GeorgeHospital生物化学实验室分析了肿瘤标记(CA-125)水平(图4)。使用Elisa试剂盒(Quantikine R&D系统)测定了腹水中(图5)和血浆中(图6)的VEGF浓度。
所得的结果证明了对生有OVCAR-3肿瘤的小鼠进行腹腔内阿苯哒唑治疗使得腹水体积和VEGF水平大幅度降低。
VEGF同种型
用RT-PCR检测从生有肿瘤的裸小鼠的腹水中分离出的OVCAR-3细胞(如上所述)的各种VEGF同种型(VEGF121、VEGF165、VEGF180、VEGF206)的mRNA表达。通过离心(1500rpm下分离5分钟)将细胞分离，使用High Pure RNA Isolation Kit(Roche Diagnostics公司)按照制造者提供的方法将总RNA从剩余的细胞片状沉淀中分离。使用石英分光光度计比色皿(BioRad)在分光光度计中在260nm的波长下测量RNA的浓度。
VEGF扩增的引物建立在Pellizzaro等，2002中发表的序列的基础上；VEGF有义链：5’-CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC-3’(序列号：1)；VEGF反义链：5’-CCG CCT CGG CTT GTC ACA T-3’(序列号：2)。这些引物将扩增以下产物：100bp的VEGF121、230bp的VEGF165、300bp的VEGF189和320bp的VEGF206。使用以下引物将β-Actin基因用作内部对照(202bp)：β-Actin有义链：5’-CTT CCT GGG CAT GGA GTC CT-3’(序列号：3)；β-Actin反义链：5’-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TT-3’(序列号：4)(Marchini等，1996)。
使用SuperScripTM一步RT-PCR法和
Figure G05829258320070302D000191
Taq(Invitrogen)，将250ng/50ng总RNA用于扩增VEGF/β-Actin。对于一个RT-PCR反应，用DEPC处理过的水将RNA稀释到11μl的最终体积。将2份12.5μl反应混合物(Reaction Mix)(最终浓度1x)、1μl引物混合物(PrimerMix)(40μl DEPC-水、5μl 100μM有义引物、5μl 100μM反义引物；最终引物浓度为0.2μM)和0.5μl RT/
Figure G05829258320070302D000192
Taq加入RNA稀释物中(一个反应的总体积＝25μl)。为保持酶(RNAse&Taq)无活性，所有移液步骤均在冰上进行。在54℃下进行30分钟初始cDNA合成并在94℃下进行5分钟变性之后，在掌上扩增仪(Palm Cycler)(CorbettResearch)中进行扩增。之后进行27次循环(在94℃下进行1分钟变性，在60℃下进行1分钟引物退火，72℃下进行45秒引物延伸)，最后在72℃下进行10分钟终末延伸。
通过在含有溴化乙锭的1×TAE缓冲液中对2％琼脂糖凝胶进行电泳(25分钟，120V)使RT-PCR产物显示出来。为对产物的大小进行量化，将样品与100bp的DNA梯度电泳(Invitrogen)。结果如图7所示，证明了腹腔内阿苯哒唑给药使得VEGF mRNA的表达显著降低。
实施例2-阿苯哒唑对体外VEGF分泌的影响
使来自American Type Culture Collection(ATCC入藏登记号HTB77)的SKOV-3人类囊腺癌细胞系在McCoy’s 5a培养基中生长，所述培养基含有1.5mM左旋谷酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素并添加有10％的FCS。使细胞生长至汇合并通过使用0.25mg/ml胰蛋白酶/EDTA对其进行胰蛋白酶化而将其收集起来，在接入平板之前将其悬浮在培养基中。然后将这些细胞接种(2×105)到Corning塑料6孔培养平板上。培养物保存在37℃保温箱中，放置在含有95％O2和5％CO2的潮湿空气中。24小时后，去除培养基。用磷酸盐缓冲液将分会合培养物洗涤三次，然后使用含有不同浓度的溶解在1％乙醇中的阿苯哒唑(0、0.1、0.25和1.0μM)的培养基培养6小时。处理过程结束后，分别收集各孔中的培养基并使用酶联免疫吸附法(ELISA)分析VEGF浓度，检测可溶的VEGF121和VEGF165同种型(Quantikine R&D系统，Minneapolis，美国)。
在另一系列实验中，保持其他条件不变，在使用阿苯哒唑进行治疗之前用基质金属蛋白酶MMP-9(6ng/ml)刺激细胞以增加VEGF的产生。有证据表明MMP-9可导致在卵巢肿瘤细胞的培养基中和生有卵巢肿瘤的小鼠的腹水中释放出具有生物活性的VEGF(Belotti等，2003)。使SKOV-3细胞暴露于直接加至含有不同浓度阿苯哒唑的细胞培养基中的、重组激活形式的MMP-9中。
图8中显示了两组实验的结果。从这些结果可以清楚地看出使用各种浓度的阿苯哒唑对SKOV-3细胞(组成型释放出VEGF)进行治疗导致VEGF分泌的剂量依存性降低。使用血细胞计数器和台盼(Trypan)蓝排除法，检测各个孔中的细胞存活性(治疗期结束后)并计算VEGF的浓度，以皮克/105个细胞表示。尽管由于阿苯哒唑的抗增殖作用，细胞培养不能超过6小时，但仍然观察到VEGF浓度的剂量依存性降低。未使用MMP-9且使用最高浓度的阿苯哒唑(1.0μM)时，VEGF的浓度降低了64％(图8A)。使用MMP-9刺激细胞导致6小时内VEGF浓度升高了44.8％(图8B)。用阿苯哒唑治疗经过MMP-9刺激的细胞使得VEGF浓度显著降低；在用1μM阿苯哒唑治疗过的细胞中，VEGF的浓度降低了65％。在所述条件下，0.1μM阿苯哒唑阻断了这些细胞中由MMP-9刺激导致的VEGF的过量分泌。
这些结果清楚地显示出阿苯哒唑显著降低体外SKOV-3人类卵巢癌细胞的VEGF分泌。
实施例3-抑制增殖性视网膜病的鼠类模型中的新生血管形成
在完善建立的、与年龄相关性黄斑变性(AMD)相关的视网膜新生血管形成、ROP(早产儿视网膜病)的鼠类模型中评价了阿苯哒唑作为AMD的潜在抑制剂的能力。
下述实验经过UNSW Animal Care and Ethics Committee批准。
将出生后6天(P6)的C57BL/6小鼠在高含氧量环境中在Quantum-Air Maxi-Sealed笼(Hereford，UK)中放置4天。将P10小鼠返回正常含氧量环境，麻醉(17mg/kg氯胺酮和2.5mg/kg甲苯噻嗪)并在玻璃体内快速浓注2μl含有0.1、1或10μg阿苯哒唑的DMSO；使用配备在微量调节注射器上的26号斜角计量注射针(beveled needle)(SGE International Melbourne，澳大利亚)单独施用DMSO或1×PBS。再将小鼠在室内含氧量下放置7天，然后取下眼球并固定在10％福尔马林/PBS中。使用苏木精和曙红将系列切片(50微米)染色。在光学显微镜(400×)下统计各组的血管数并用平均值±SEM表示。
如图9所示，高含氧量-正常含氧量导致视网膜新生血管形成增加2-3倍。在玻璃体内进行单次药剂注射后，阿苯哒唑显著地抑制了高含氧量导致的视网膜血管生成。抑制作用为剂量依存性的，并在低至1μg的量时也可观察到。单独使用DMSO(阿苯哒唑载体)不影响处于高含氧量下的小鼠的血管形成，因为血管数量与PBS组中的结果没有差别。
通过异方差双尾学生t检验(表1)获得图9中图表显示的结果的统计分析。
表1：阿苯哒唑治疗的统计显著性
  DMSOv10ug阿苯哒唑  P＝0.000651889
  DMSOv1ug阿苯哒唑  P＝0.000117785
  DMSOv0.1ug阿苯哒唑  P＝0.305488779
  1ugv10ug阿苯哒唑  P＝0.654672771
  1ugv0.1ug阿苯哒唑  P＝0.0000853701
苏木精和曙红染色的切片(图10)显示出除了新生血管之外，在只注射DMSO的组(图10B)和注射阿苯哒唑+DMSO的组(图10A)之间没有可检测到的形态差异，表明在本研究的范围内，对于阿苯哒唑和/或其载体DMSO没有不利的或有毒的反应。
实施例4-用于治疗的组合物
根据本申请中提供的具体实施方式部分，概括出以下具体组合物。以下组合物应解释为仅仅是本发明组合物的说明性实例，而不是以任何方式对本发明范围的限制。
实施例4(A)-胃肠外给药的组合物
用于胃肠外注射的组合物可以制备成在10ml至21的1％的羧甲基纤维素中含有0.05mg至5g式I化合物(例如阿苯哒唑)。
类似地，静脉输注的组合物可以包括250ml的无菌林格溶液和0.05mg至5g的式I化合物。
适于注射给药的组合物也可以制备为将1重量％的化合物与10体积％的丙二醇和水混合。溶液可通过过滤进行灭菌。
实施例4(B)-口服给药的组合物
可以通过将500mg粉末形式的式I化合物、100mg的乳糖、35mg的滑石粉和10mg的硬脂酸镁填入标准两部分式硬明胶胶囊中制备胶囊形式的式I化合物的组合物。
实施例4(C)-外用给药的组合物
以外用软膏形式递送的典型组合物包括1.0g的式I化合物，以及100.0g白软石蜡，将其分散以获得光滑的均匀的产品。
实施例4(D)-滴眼剂组合物
以滴眼剂形式递送的典型组合物概括如下：
适合的化合物             0.3g
羟基苯甲酸甲酯           0.005g
羟基苯甲酸丙酯           0.06g
纯化水补至约             100.00ml。
在75℃下将羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯溶于70ml纯化水中，将所得溶液冷却。然后加入所述化合物，通过使用膜过滤器(孔径0.22μm)过滤将溶液灭菌，然后无菌地装入无菌容器中。
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Figure IYZ000001807485200011

Claims (4)

1.化合物阿苯哒唑用于制备治疗或预防恶性腹水的药物的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述化合物进行全身给药或区域给药。
3.权利要求2的用途，其中给药为腔内给药、膀胱内给药、肌内给药、动脉内给药、静脉内给药、眼内给药、皮下给药、外用或口服。
4.权利要求3的用途，其中腔内给药为腹腔内给药或胸腔内给药。
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