CN101023778A - 制备富含igf－1的柞蚕粉作为仔猪饲料添加剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备富含IGF－1的柞蚕粉作为仔猪饲料添加剂，是将IGF－1基因构建成转化元件重组到柞蚕的丝线基因中，使得外源基因得以表达，并将富含IGF－1的柞蚕制成柞蚕粉，用作仔猪饲料添加剂。本发明产品口感细腻，易于摄食，生物利用度高，将其添加到动物饲料中，可以提高动物采食量和饲料转化率，增加动物生产性能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，利用柞蚕丝腺作为生物反应器制备富含类胰岛素生长因子-1(IGF-1)的柞蚕粉，作为一种提高动物生产性能的饲料添加剂。
背景技术
胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种由70个氨基酸组成的蛋白质，相对分子量为7649道尔顿，等电点pH约8.2，其结构与胰岛素原(proinsulin)相似，有3个二硫键，将肽链紧密的连接起来。几乎所有动物类型组织中都含有IGF-1，但主要来源于肝脏循环过程中。IGF-1的生理功能：一是提高组织摄取葡萄糖的能力，二是抑制肝糖原的分解并促进肝糖原及肌糖原的合成。IGF-1本身又是生长激素的介质，具有促进生长的作用。现已发现IGF-1具有自分泌(autocrine)或旁分泌(paracrine)功能。许多肝外组织细胞能分泌IGF-1作用于自身或相邻的组织细胞，促进DNA的合成和表达，促进细胞生长和分裂。
研究表明，经口摄入的IGF-1在动物胃和十二指肠中稳定。IGF-1可促进胃肠道发育，给未吮乳初生仔猪喂以牛奶为基础的添加2靏/ml的重组人IGF-1的婴儿配方乳24小时结果显示，添加IGF-1的配方乳与不添加IGF-1的配方乳相比，可使胃、胰腺的DNA、RNA含量增加，胰腺重量以及小肠隐窝细胞增殖速率显著增加，表明口服IGF-1刺激了小肠隐窝细胞的增殖。高剂量的IGF-1可使小肠的重量、蛋白质和DNA浓度有较大幅度的提高，而正常浓度的IGF-1可显著刺激仔猪回肠绒毛生长。IGF-1可刺激胃肠道功能的成熟，正常水平的IGF-1可提高乳糖酶和麦芽糖酶的比活性。目前的各种报道普遍认为，IGF-I能显著刺激小肠前部刷状缘酶的活性。IGF-1大部分是由肝脏合成，主要存在于血液中，而血清中的IGF-1含量极低，100L血浆IGF-1的含量不到1mg，6000kg血浆IGF-1的含量仅为38mg。且IGF-1蛋白极不稳定，纯化困难。正因为如此，我们采用生物工程的方法，来大量生产IGF-1。
IGF-1在大肠杆菌表达系统中表达易形成包涵体，且无翻译后修饰；在酵母表达系统中表达也不稳定，且只能进行简单的后加工修饰；动物细胞、哺乳动物乳腺和植物表达系统等虽然克服了原核表达系统的缺陷，在产品的抗原性、免疫源性和功能与天然蛋白质最接近，能够进行糖基化等后加工的特点，但是还存在着表达水平较低等缺点。
昆虫表达系统与其它表达系统相比，具有以下特点：(1)转基因昆虫所生产的蛋白质能够被糖基化；(2)有些药物，如抗血栓形成药物和血液稀释剂用转基因昆虫来生产可能更好，因为没有生物交叉反应；(3)由于昆虫的特殊生物学特性(世代周期短，群体大，生产水平高和维持费用低)，利用昆虫作为生物反应器生产药物相对来讲成本低廉。尤其是蚕类丝腺作为生物反应器生产目的蛋白，具有表达量高、分离纯化工艺相对简单等优点。
柞蚕是完全变态的绢丝类昆虫，生长至五龄后期合成并分泌一种丝素蛋白，约占蚕丝的80％。柞蚕丝素蛋白在结构上与家蚕不同，家蚕丝素蛋白是由两条多肽链通过二硫键连接而成，而柞蚕丝素蛋白是由一条多肽链构成。根据柞蚕丝素蛋白这一特点，构建了柞蚕丝素基因转移表达载体，利用同源重组生产外源蛋白产物。如上所述，因为IGF-1具有促生长的作用和柞蚕作为表达宿主的特点，我们利用柞蚕生产IGF-1，并将其加工，制成富含IGF-1的仔猪饲料添加剂。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种利用柞蚕作为生物反应器大量表达外源基因的方法，在柞蚕丝腺中表达IGF-1，并加工成柞蚕粉，作为仔猪的饲料添加剂应用于动物生产中，达到促进断奶仔猪的肠道发育和促进仔猪生长的目的。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现：
本发明的技术方案是：克隆柞蚕染色体上丝素基因的5’端和3’端调控区DNA序列，以此DNA片段为同源序列，构建柞蚕丝素基因为靶点的转移表达载体。将IGF-1基因插入到转移表达载体上构建IGF-1转化元件。将IGF-1转化元件用脂质体包埋，直接注射到柞蚕雌蛾的交配囊或雄蚕蛹的睾丸内，交配产卵后外源基因通过同源重组整合到柞蚕染色体上。筛选含有外源基因的转基因柞蚕，使其在体内大量表达IGF-1。最后将表达IGF-1的柞蚕加工成柞蚕粉，制成饲料添加剂，用于仔猪生产。
本发明制备的IGF-1与天然产物相似，生产工艺简单，具有较高的生物学活性，制成的饲料添加剂低剂量添加到仔猪日粮中，可显著提高动物采食量和饲料转化率，增加生产性能，是一种高效的饲料添加剂。
本发明的优点和效果是：
1、柞蚕的世代周期短，易于繁殖。
2、柞蚕个体大、表达量高，可大量表达外源蛋白。
3、柞蚕丝腺作为生物反应器能够对所表达的蛋白质进行糖基化、磷酸化等修饰作用，与IGF-1天然结构相似，具有高生物活性。
附图说明：
图1是PCR扩增柞蚕丝素基因5’端调控区图片，其中
1：蚕丝素基因5’端调控区DNA序列，
M：DL-2000 Marker；
图2是PCR扩增柞蚕丝素基因3’端调控区图片，其中
1：蚕丝素基因3’端调控区DNA序列，
M：DL-2000 Marker；
图3是Southern杂交结果图片，其中
1：l-Hind III DNA Marker，
2~5：基因组DNA；
图4是Western杂交结果图片，其中
M：蛋白Marker，1：IGF-1蛋白；
图5、6是100x电镜观察小肠绒毛生长结果图片，其中
图5为空白对照，图6为柞蚕粉2；
图7是构建IGF-1转化元件示意框图。
图8、9是250X电镜观察小肠绒毛生长结果图片，
图8为空白对照，图9为柞蚕粉2。
具体实施方式：
实施例1：IGF-1基因的获得
根据IGF-1基因序列，设计并合成IGF-1基因的引物：
IGF1-F：5’-atg gga ccg gag acg ctc tgc ggg gct gag-3’；
IGF1-R：5’-tct aga tta cta agc tga ctt ggc agg ctt gag-3’；
提取猪肝脏组织基因组DNA，用上述引物进行PCR扩增获得IGF-1基因，PCR扩增条件为：94℃预变性1min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，最后72℃延伸5min。
实施例2：钓取柞蚕丝素基因5’端和3’端非编码区序列
(1)柞蚕DNA的提取
取柞蚕蛹脂肪组织0.5g，液氮研磨成粉状，加入提取缓冲液和5U/ml蛋白酶K，65℃水浴4h，分别用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次，经乙醇沉淀，干燥后溶于200μl缓冲液中，加5U/ml RNase，37℃保温1h。用酚/氯仿抽提1次，上清用异丙醇沉淀，干燥后溶于400靗ddH2O中，备用。
(2)柞蚕丝素基因5’端DNA片段的克隆
根据柞蚕丝素基因5’端DNA序列，设计并合成一对引物5’-gtc gtt gat ttt gtt gtaggc att-3’和5’-ggt tat gag agc tgg aac cga act g-3’。以柞蚕基因组DNA为模板，PCR扩增出柞蚕丝素基因5’端1.9kb长的DNA片段(图1)。经测序分析所钓取的DNA为柞蚕丝素基因5’端调控区序列。
(3)钓取柞蚕丝素基因的3’端DNA序列
根据柞蚕丝素基因3’端DNA序列，设计并合成一对引物，5’-aat acg aat gtg att tccttt ata ttt gac cg-3’和5’-ctg aaa agg gaa aac cat gct tga-3’。以柞蚕基因组DNA为模板，PCR扩增出柞蚕丝素基因3’端1.5kb长的DNA片段(图2)。经测序分析所钓取的DNA为柞蚕丝素基因3’端调控区序列。
实施例3：构建IGF-1转化元件
将实施例2中钓取的5’端和3’端PCR扩增产物，经低熔点琼脂糖凝胶电泳法回收、纯化，采用PCR技术和连接酶连接的方法，把他们构建成如图7所示转化元件，转化元件经测序鉴定用于转化。
实施例4：外源基因导入柞蚕卵
柞蚕滞育蛹经过体表消毒后解剖，找到雄蚕睾丸，将2靗经过脂质体处理的转化元件(1靏DNA+30靗脂质体，混匀后室温放置30min)，注射到睾丸内，涂上抗生素(抑菌)用蜡将体表伤口密封，使其正常发育，采用常规方法与雌蛾交配制种。产卵后孵化养蚕，检测个体是否携带外源基因。
将转化元件经过脂质体处理(1μgDNA+30脂质体，混匀后室温放置30min)，取2μl注射到处女蛾交配囊，再与雄蛾交配，使其产卵孵化。检测其所产卵孵化而成的后代个体是否携带外源基因。
实施例5：检测携带外源基因的后代个体及表达产物
取5龄期柞蚕，提取基因组DNA(参见实施例2)，用双酶切，以IGF-1基因序列作为探针进行Southern杂交(图3)，鉴定外源基因的整合。
取5龄期柞蚕丝腺在液氮中碾成粉末，提取蛋白质，通过Western杂交对表达产物进行鉴定(图4)。由以上结果可知，IGF-1基因已被重组到柞蚕的丝素基因中。
实施例6：柞蚕粉饲料添加剂的制备
将转基因柞蚕进行脱水、风干处理，然后粉碎制成柞蚕粉，用作饲料添加剂。
柞蚕粉的要求如下：
感官指标：色泽一致，无霉变、结块和异味、异臭；
水分：不高于10％；
有毒有害物质：铅含量不高于40mg/kg，砷含量不高于10mg/kg(添加有机砷制剂不高于100mg/kg)，沙门氏菌不得检出；
卫生指标：产品和原料符合GB13078执行。
实施例7：仔猪饲养试验
选择品种一致、胎次接近、窝仔数10-12头的7d仔猪12窝，随机分为4组，每组3窝，自仔猪7天起进行补饲。试验采用完全随机化设计进行，试验处理见表1。
表1添加剂用量表
| 组别 | 用量(g/kg) |
| 柞蚕粉1 | 3.0 |
| 柞蚕粉2 | 5.0 |
| 柞蚕粉3 | 10.0 |
| 对照组(C) | 0.0 |
将表1中处理的添加物加入到基础日粮(表2)中进行饲养试验，试验期为5周。
表2基础日粮表
| 原料 | 配比(％) | |
| 7d 28d(断乳) | 29d 42d | |
| 玉米(膨化) | 47.27 | 56.20 |
| 豆粕(膨化) | 31.00 | 27.00 |
| 鱼粉(进口) | 4.00 | 4.00 |
| 玉米蛋白粉 | 1.00 | 1.00 |
| 乳清粉 | 10.00 | 5.00 |
| 石粉 | 1.00 | 0.50 |
| 磷酸氢钙 | 1.90 | 1.90 |
| 食盐 | 0.15 | 0.15 |
| 大豆油 | 2.50 | 2.00 |
| 酶制剂 | 0.0175 | 0.0175 |
| 酸化剂 | 0.0625 | 0.0625 |
| 胆碱 | 0.10 | 0.10 |
| 复合添加剂预混料 | 1.00 | 1.00 |
| 合计 | 100.00 | 100.00 |
断乳及其后2周仔猪体重及日增重见表3。
表3断乳及其后2周仔猪体重及日增重
| 项目及组别 | 仔猪初生重(kg) | 断乳仔猪体重(kg) | 断乳前日增重(kg) | 断乳2周后(42d)仔猪体重(kg) | 断乳2周后仔猪日增重(kg) |
| 柞蚕粉1 | 1.43±0.15 | 6.76±0.99 | 0.190±0.039 | 8.94±1.50 | 0.158±0.064 |
| 柞蚕粉2 | 1.41±0.17 | 6.87±0.65 | 01.97±0.232 | 9.75±0.47 | 0.208±0.043 |
| 柞蚕粉3 | 1.34±0.05 | 6.80±0.42 | 01.95±0.017 | 9.15±1.80 | 0.168±0.039 |
| C | 1.35±0.09 | 6.70±0.11 | 0.173±0.089 | 7.58±0.66 | 0.091±0.054 |
上述结果可知，在断乳仔猪饲料中添加富含IGF-1的柞蚕粉，可显著提高仔猪的体重和日增重，促进仔猪生长。
电镜观察柞蚕粉2与对照组小肠绒毛生长状况可见，小肠绒毛数量和粗细度比对照组明显，
由表4可知，各试验处理间21d仔猪小肠长度与体重差异显著，柞蚕粉各添加组均高于空白对照组(p＜0.05)；厚度也以柞蚕粉2为最高。42d断乳仔猪的各指标也具有类似趋势(表5)
表4柞蚕粉对断乳前仔猪(21d)肠道发育的影响
| 组别项目 | 柞蚕粉1 | 柞蚕粉2 | 柞蚕粉3 | 对照组 |
| 体重(kg) | 6.38±0.63 | 6.70±1.20 | 6.48±0.96 | 6.16±0.45 |
| 小肠长度(cm) | 461.8±40.5 | 462.9±144.8 | 458.4±67.5 | 359.7±25.9 |
| 小肠厚度g/cm2 | 0.189±0.018 | 0.203±0.005 | 0.178±0.046 | 0.136±0.006 |
表5柞蚕粉对断乳后2周仔猪(42d)肠道发育的影响
| 组别项目 | 柞蚕粉1 | 柞蚕粉2 | 柞蚕粉3 | 对照组 |
| 体重(kg) | 8.92±0.58 | 9.73±0.45 | 9.155±0.89 | 7.88±0.66 |
| 小肠长度(cm) | 770.6±19.5 | 782.6±20.4 | 776.3±16.8 | 671.7±21.5 |
| 小肠厚度g/cm2 | 0.246±0.002 | 0.276±0.047 | 0.259±0.004 | 0.217±0.024 |
Claims (7)
1.制备富含IGF-1的柞蚕粉作为仔猪饲料添加剂，其特征在于以柞蚕染色体DNA丝素基因的5’端与3’端非翻译区及部分结构基因作为同源序列，构建柞蚕丝素基因转移表达载体的转化元件，并导入柞蚕中，在柞蚕体丝腺中表达外源蛋白，并将其作为饲料添加剂应用于生产实践。
2.根据权利要求1所述的一种制备富含IGF-1的柞蚕粉作为仔猪饲料添加剂，其特征还在于利用柞蚕染色体DNA丝素基因的5’端与3’端非翻译区及部分结构基因作为同源序列，线性DNA片段包括各种基因的5’端调控区域与3’端终止区域及部分结构基因；也包括与该基因相邻的其它基因片段。
3.根据权利要求1所述的一种制备富含IGF-1的柞蚕粉作为仔猪饲料添加剂，其特征在于转化元件中的外源基因为IGF-1基因。
4.根据权利要求1所述的一种制备富含IGF-1的柞蚕粉作为仔猪饲料添加剂，其特征还在于利用柞蚕染色体DNA丝素基因的5’端与3’端非翻译区及部分结构基因作为同源序列。
5.根据权利要求1所述的一种制备富含IGF-1的柞蚕粉作为仔猪饲料添加剂，其特征还在于利用柞蚕染色体DNA丝素基因的5’端与3’端非翻译区及部分结构基因作为同源序列进行同源重组，将外源基因转移到柞蚕染色体上。
6.根据权利要求1所述的一种制备富含IGF-1的柞蚕粉作为仔猪饲料添加剂，其特征在于以下组建步骤：
a)构建含有外源基因的柞蚕丝素基因转移表达载体转化元件，该载体含有柞蚕丝素基因5’端与3’端非翻译区及部分结构基因序列；
b)将步骤a)中的转移表达载体转化元件脂质体包埋后直接注射到柞蚕雌蛾的交配囊或雄蚕幼虫的睾丸内，交配后获得蚕卵；
c)通过正常的发育，孵化；
d)对转基因柞蚕进行鉴别，获得表达IGF-1的转基因柞蚕。
e)将表达IGF-1的转基因柞蚕或蛹制成粉状添加剂用于饲料中。
7.根据权利要求1所述的一种制备富含IGF-1的柞蚕粉作为仔猪饲料添加剂，其特征是将IGF-1基因导入柞蚕个体获得转基因柞蚕品种及后代。
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